專利名稱：抗-間皮素抗體及其用途的制作方法
抗-間皮素抗體及其用途本發(fā)明提供了特異于膜錨定的，40kDa間皮素多肽的重組抗原結(jié)合區(qū)和包含所述 抗原結(jié)合區(qū)的抗體和功能片段，所述間皮素多肽在若干種腫瘤中過表達(dá)，例如胰腺和卵巢 腫瘤，間皮瘤和肺癌細(xì)胞。相應(yīng)地，這些抗體可用于治療這些和其它病癥和狀況。本發(fā)明 的抗體還可用于診斷領(lǐng)域，以及用于進(jìn)一步研究間皮素在與癌癥相關(guān)的病癥的進(jìn)展中的作 用。本發(fā)明還提供了編碼前述抗體的核酸序列，包含其的載體，藥物組合物和具有使用說明 的試劑盒。
背景技術(shù)：
基于抗體的治療證明在治療多種癌癥，包括實體腫瘤中是非常有效的。例如， HERCEPTIN 已經(jīng)成功地用于治療乳癌。成功的基于抗體的治療的開發(fā)的中心是分離 針對發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞上優(yōu)先表達(dá)的細(xì)胞表面蛋白的抗體。間皮素前體多肽是糖磷脂酰 肌醇(GPI)-錨定的，糖基化的細(xì)胞表面蛋白，其被蛋白水解裂解為30kDa的N-末端分 泌的多肽和40kDa的C-末端多肽，后者主要以膜結(jié)合的，GPI-錨定的形式存在(Chang， K. and I. Pastan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1996)93(1) : 136)，并且其在此命名為間皮 素(mesothelin)。間皮素被某些腫瘤細(xì)胞優(yōu)先表達(dá)，特別是間皮瘤細(xì)胞，胰腺腫瘤細(xì)胞和 卵巢癌細(xì)胞，而其表達(dá)在正常組織中受限，使得它成為用于腫瘤治療的理想靶標(biāo)(Argani， P. et al.，Clin. Cancer Res. (2001)7(12) 3862 ；Hassan，R.，et al.，Clin. Cancer Res. (2004) 10(12 Pt 1) :3937)。間皮素的功能是未知的，并且在間皮素基因表達(dá)缺陷的小鼠中 沒有觀察到明顯的生殖，血液學(xué)，或解剖學(xué)異常(Bera，T. K. and I. Pastan,Mo 1. Cell. Biol. (2000)20(8) :2902)。針對表達(dá)間皮素的癌細(xì)胞的基于抗體的，靶向的治療已經(jīng)被提出用于治療肺，卵 巢和胰腺癌。Mab Kl是已被描述的針對膜結(jié)合間皮素多肽的第一個抗體(Chang，K.，et al.，Int. J. Cancer, (1992)50(3) :373)。Mab Kl通過免疫小鼠產(chǎn)生。由于該抗體的低親 合力和弱的內(nèi)化速率，由與假單胞菌屬外毒素A的化學(xué)修飾的截短形式相連的Mab Kl組成 免疫毒素被認(rèn)為不適于臨床開發(fā)(Hassan, R.，et al.，J. Immunother. (2000)23(4) 473 ； Hassan, R. , et al. ,Clin. Cancer Res. (2004) 10(12 Pt 1) :3937)。結(jié)果，開發(fā)了具有更高 親合力的單鏈抗體，包括SSl-(dsFv)-PE38，其顯示了體外殺傷腫瘤細(xì)胞活性(Hassan，R.， etal. , Clin. Cancer Res. (2002)8(11) 3520)以及在表達(dá)人類間皮素的腫瘤的鼠模型中 的效力(Fan, D. , et al.，Mol. Cancer Ther. (2002) 1(8) :595)。這些數(shù)據(jù)證實了間皮素為 用于多種癌癥的免疫治療的適合的靶標(biāo)。然而，在臨床實驗中，SSl-(dsFv)-PE38是免疫原 性的，阻止了對大多數(shù)患者的第二次給藥。而且，SSl-(dsFv)-PE38已經(jīng)顯示出具有快速的 血液清除并且已經(jīng)報道了通過將該融合蛋白peg化來提高分子量的嘗試(Filpula，D.，et al.，Bioconjugate Chem. (2007) 18(3) :773)。MS-1，MS_2和MS-3是間皮素結(jié)合抗體，其由于它們的人類IgGl同種型在細(xì)胞表面 引發(fā)免疫效應(yīng)物活性，并且內(nèi)化入間皮素表達(dá)細(xì)胞(W0 2006/099141 A2)。這些抗體之一， 未綴合的IgG抗-間皮素抗體MOR Ab 009當(dāng)前在用于治療胰腺癌的治療效果的臨床實驗 中測試。
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用于免疫毒素癌癥治療的臨床結(jié)果的異種移植鼠癌癥模型的預(yù)測價值通常受限 于缺少治療抗體與它們的鼠同系物的交叉反應(yīng)性，這導(dǎo)致降低的與正常組織的非特異性結(jié) 合。另一方面，中和在用鼠或嵌合抗體治療的患者中形成的抗_小鼠Fv抗體可導(dǎo)致劑量限 制性毒性或減小的治療效力。因此，為完全利用在癌癥治療中特異間皮素表達(dá)的潛力，需要 如下的靶向抗體，其組合了提高的親合力和降低的與完全人類可變鏈形式的締合速率，和 鼠交叉反應(yīng)性的優(yōu)點。新抗體的進(jìn)一步的必要特征是對在它們表面表達(dá)間皮素的不同癌細(xì)胞系的不變 的親合力。間皮素是高度可變的蛋白，經(jīng)歷了翻譯后蛋白水解消化和在多個位點的糖基化 (Hassan, R.，et al.，Clin. CancerRes. (2004) 10(12 Pt 1) :3937)?？勺冃匝由斓睫D(zhuǎn)錄水 平，因為三種不同的剪接變體已被檢測到，盡管轉(zhuǎn)錄變體1(NM_005823)似乎代表了在目前 為止測試的腫瘤細(xì)胞系中存在的主要種類(Muminova，Ζ. Ε.，et al.，BMC Cancer (2004)4 19 ；Hellstrom,I. ,et al. ,Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. (2006) 15(5) :1014)。因 此，有效的抗-間皮素抗體必須不變地結(jié)合來自不同患者的腫瘤細(xì)胞呈遞的表位，獨立于 個體變異，包括但不限于，糖基化模式的變異，其導(dǎo)致不同形式的間皮素的表達(dá)。本文提供了抗體，其抗原結(jié)合抗體片段，或其變體，其以高并且不變的親合力結(jié)合 間皮素，有效地內(nèi)化，并且其優(yōu)選與來自其它物種的間皮素交叉反應(yīng)。還提供了基于抗體的 用于癌癥的治療，特別是用于表達(dá)間皮素的腫瘤，例如胰腺，卵巢或肺癌，其使用促進(jìn)治療 活性試劑向癌細(xì)胞的遞送的抗體，其抗原結(jié)合抗體片段，或其變體。發(fā)明概述本發(fā)明的一個目標(biāo)是提供人類和人源化抗體，或其抗原結(jié)合抗體片段，或其變體， 其對于間皮素前體多肽的40kDa的C-末端細(xì)胞外部分具有高度選擇性，并且其可用于檢測 間皮素表達(dá)的方法中，間皮素表達(dá)與疾病狀態(tài)例如胰腺，卵巢，和肺癌相關(guān)，和用于治療所 述疾病狀態(tài)。為了這些目的，本發(fā)明的一個目標(biāo)是提供分離的人類抗體，或其抗原結(jié)合抗體 片段，其特異性結(jié)合間皮素多肽(SEQ ID NO 370)上存在的表位，其被表達(dá)間皮素的癌細(xì) 胞系不變地呈遞，并且其被具有相當(dāng)?shù)挠H合力的這些抗體結(jié)合。如本文使用的，術(shù)語表位的 “不變的呈遞”指被寬范圍的表達(dá)間皮素腫瘤細(xì)胞系上的特定抗體識別的表位的存在，所述 腫瘤細(xì)胞系表達(dá)不同形式的間皮素。如本文使用的，間皮素的不同“形式”包括但不限于經(jīng) 歷不同的翻譯和翻譯后修飾的不同糖形，不同同種型或間皮素多肽。如本文使用的，術(shù)語 “相當(dāng)?shù)挠H合力”指通過結(jié)合表達(dá)不同形式間皮素的細(xì)胞的抗體的FACS數(shù)據(jù)的Scatchard 分析獲得的半最大抗體效力(EC5tl)值，其差別不超過10倍，或優(yōu)選5倍，或甚至更優(yōu)選2倍。本發(fā)明的另一目標(biāo)是提供對于人類給藥是安全的抗體，或其抗原結(jié)合抗體片段， 或其變體。本發(fā)明的另一目標(biāo)是提供結(jié)合人類間皮素并且對其它物種的間皮素是交叉反應(yīng) 性的抗體，或其抗原結(jié)合抗體片段，或其變體。優(yōu)選地，所述其它物種是嚙齒類動物，例如小 鼠或大鼠。最優(yōu)選地，所述抗體，或其抗原結(jié)合抗體片段，或其變體結(jié)合人類間皮素并且對 鼠間皮素是交叉反應(yīng)性的。本發(fā)明的另一目標(biāo)是提供以相當(dāng)?shù)挠H合力不變地結(jié)合不同的表達(dá)間皮素的細(xì)胞 系的抗體，或其抗原結(jié)合抗體片段，或其變體。如本文使用的，術(shù)語特定抗體與間皮素的“不 變的結(jié)合”指它結(jié)合表達(dá)不同形式的間皮素的寬范圍的表達(dá)間皮素的癌細(xì)胞系上的間皮素的能力。不變的結(jié)合可由但不限于以下事實引起，即抗體，或其抗原結(jié)合抗體片段，或其變 體識別沒有被其它細(xì)胞外抗原掩蔽的間皮素表位，所述抗原例如癌癥抗原125(CA125)，其 與間皮素相互作用。本發(fā)明的另一目標(biāo)是通過利用本發(fā)明的一種或更多種抗體或其變體，提供結(jié)合不 同的表達(dá)間皮素的癌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞并且引發(fā)針對表達(dá)間皮素的癌細(xì)胞的免疫效應(yīng)物活 性(例如ADCC或CDC)的抗體或其變體。本發(fā)明的另一目標(biāo)是提供在結(jié)合表達(dá)間皮素的細(xì)胞之后被內(nèi)化的抗體，或其抗原 結(jié)合抗體片段，或其變體。本發(fā)明的另一目標(biāo)是提供用于治療疾病的方法，其通過遞送細(xì)胞 毒性藥物或釋放藥物的酶到表達(dá)間皮素的癌細(xì)胞，通過利用本發(fā)明的一種或更多種抗體， 或其抗原結(jié)合抗體片段，或其變體。本發(fā)明的另一目標(biāo)是提供構(gòu)成診斷惡性或發(fā)育不良的狀況的工具的抗體，所述狀 況中間皮素表達(dá)相對于正常組織提高。提供了與可檢測標(biāo)記綴合的抗-間皮素抗體。優(yōu)選 的標(biāo)記是放射標(biāo)記，酶，發(fā)色團(tuán)或熒光劑。本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明抗體的多核苷酸，表達(dá)本發(fā)明抗體的細(xì)胞，用于生產(chǎn)本 發(fā)明抗體的方法，利用該抗體用于抑制發(fā)育不良細(xì)胞的生長的方法，和利用該抗體用于治 療和檢測癌癥的方法。本發(fā)明提供了與Mab Kl，SSI, MS-1，MS-2和MS-3區(qū)別在于以下的抗體它們a) 不變地結(jié)合間皮素b)與鼠間皮素交叉反應(yīng)c)以低親合力結(jié)合間皮素d)有效內(nèi)化到表達(dá) 間皮素的細(xì)胞，和e)包含人類可變區(qū)。本發(fā)明的這些和其它目標(biāo)在本文中更完整地描述。在一個方面，本發(fā)明提供包含特異于40kDa間皮素多肽的表位的抗原結(jié)合區(qū)的分 離的抗體或功能性抗體片段。所述抗體或其功能片段可包含抗原結(jié)合區(qū)，所述抗原結(jié)合區(qū)包含SEQ ID NO 67-98所述的H-CDR3區(qū)；所述抗原結(jié)合區(qū)可進(jìn)一步包括SEQ ID NO :31_66所述的H-CDR2 區(qū)；并且所述抗原結(jié)合區(qū)還可包含SEQ ID NO 1-30所述的H-⑶R1區(qū)。本發(fā)明的所述間皮 素-特異抗體可包含抗原結(jié)合區(qū)，所述抗原結(jié)合區(qū)包含SEQ ID NO: 160-197所述的L-⑶R3 區(qū)；所述抗原結(jié)合區(qū)可進(jìn)一步包括SEQ ID NO 99-128所述的L-⑶R1區(qū)；并且所述抗原結(jié) 合區(qū)還可包含SEQ ID NO 129-159所述的L-CDR2區(qū)。本文公開的序列的多肽變體也被本發(fā)明包括。相應(yīng)地，本發(fā)明包括抗_間皮素抗 體，所述抗_間皮素抗體具有重鏈氨基酸序列，所述重鏈氨基酸序列具有在CDR區(qū)中與SEQ ID NO: 1-197所述CDR區(qū)至少60%的序列同一性；和/或在CDR區(qū)中與SEQ ID NO 1-197 所述⑶R區(qū)至少80%的序列同源性。還包括的是抗-間皮素抗體，所述抗-間皮素抗體具 有輕鏈氨基酸序列，所述輕鏈氨基酸序列具有在CDR區(qū)中與SEQ ID NO: 1-197所述CDR區(qū) 至少60%的序列同一性；和/或在CDR區(qū)中與SEQ ID NO 1-197所述CDR區(qū)至少80%的序 列同源性。例如，本發(fā)明的抗體可以是IgG(例如，Igh)，而抗體片段可以是Fab或scFv。發(fā) 明的抗體片段，相應(yīng)地，可以是，或可以包含以一個或更多個如本文所述方式發(fā)揮作用的抗
原結(jié)合區(qū)。本發(fā)明還涉及分離的核酸序列，其每種可編碼特異于間皮素表位的人類抗體或其功能片段的抗原結(jié)合區(qū)。所述核酸序列可編碼抗體的可變重鏈并且包括選自SEQ ID N0S 284-326的序列或在高度嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO :284_326的互補鏈雜交的核酸序列。所 述核酸可編碼分離的抗體或其功能片段的可變輕鏈，并且可包含選自SEQ IDN0S 327-369 的序列，或在高度嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO 327-369的互補鏈雜交的核酸序列。本發(fā)明的核酸適于重組生產(chǎn)。因此，本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明核酸序列的載體和 宿主細(xì)胞。本發(fā)明的組合物可用于治療或預(yù)防應(yīng)用。本發(fā)明因此包括包含發(fā)明的抗體(或功 能性抗體片段)和用于其的藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑的藥物組合物。在相關(guān)的方面， 本發(fā)明提供了用于治療與表達(dá)間皮素的細(xì)胞的不期望的存在相關(guān)的病癥或狀況的方法。所 述方法包含給予有此需要的受試者有效量的藥物組合物的步驟，所述藥物組合物包含本文 所述或預(yù)期的發(fā)明的抗體。本發(fā)明還提供了用于使用抗體文庫來分離所述文庫的特異性并且不變地結(jié)合間 皮素的一種或更多種成員的說明。附圖描述

圖1顯示了通過Biacore配對結(jié)合分析的抗-間皮素抗體表位分組?？贵w對的競 爭性結(jié)合通過下列來確定將抗體固定于傳感器芯片，將可溶性間皮素與該抗體結(jié)合，并且 立即將第二抗體與間皮素結(jié)合。識別間皮素上相同或重疊表位的抗體對不能同時結(jié)合。測 試了抗體對的所有組合。顯示了對于MF-T的代表性數(shù)據(jù)(A)。B欄描繪了其中抗-間皮素 抗體的表位的相對位置，其中通過重疊圓圈描繪了競爭。圖2顯示了本發(fā)明抗體識別的不同形式的間皮素。1和2 結(jié)合于0VCAR-3細(xì)胞提 取物中的間皮素的MF-J ；3和4 結(jié)合于CH0-A9細(xì)胞提取物中的間皮素的MF-J ；5 結(jié)合于 NCI-H226細(xì)胞提取物中的間皮素的MF-J ；6 結(jié)合于重組的去糖基化的間皮素的MF-J ；7 結(jié)合于0VCAR-3細(xì)胞提取物的M0R06635 ；和8 結(jié)合于NCI-H226細(xì)胞提取物的M0R06635。圖3顯示了當(dāng)癌抗原125 (CA125)結(jié)合包括M0R06640和MF-T的間皮素抗體亞組 時它結(jié)合間皮素，而其它抗體，例如MF-226，與CA125競爭間皮素結(jié)合。顯示的數(shù)據(jù)是通過 SECTOR光成像儀(Meso Scale Discovery)檢測的相對光單位(RLU)。平板用所述間皮素 抗體包被。間皮素以所示濃度添加并且被向低滴定(titrate down) 0 CA125隨后以恒定濃 度結(jié)合。用小鼠抗-CA125抗體和MSD Sulfo標(biāo)簽標(biāo)記的抗小鼠FAB抗體進(jìn)行檢測。圖4提供了在表達(dá)間皮素的CH0-A9細(xì)胞上1251-抗-間皮素抗體內(nèi)化的數(shù)據(jù)。七 種抗-間皮素mabs，包括商業(yè)化的陽性對照K1，在沒有(A)和有⑶穩(wěn)定化的第二抗體時 的相對內(nèi)化。使用MF-226加上第二抗體，顯示了在37°C下隨時間(C)的解離的，表面結(jié)合 的和內(nèi)化的抗體的相對量的代表性數(shù)據(jù)與0°C的非允許溫度時的數(shù)據(jù)⑶比較。發(fā)明詳述本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)特異于間皮素或具有對間皮素的高親合力的新抗體，所述新抗體 可給予受試者治療益處。本發(fā)明的抗體，其可以是人類的或人源化的，可在許多環(huán)境下使 用，其在本文中更完整地描述。定義“人類”抗體或功能性人類抗體片段在此定義為不是嵌合的(例如，不是“人源化 的”)并且不是來自(整體或部分)非人物種的。人類抗體或功能性抗體片段可來源于人類或可以是合成的人類抗體?！昂铣傻娜祟惪贵w”在此定義為具有整體或部分在計算機(jī)芯片上 地來源于基于已知人類抗體序列的分析的合成序列的序列。人類抗體序列或其片段的在計 算機(jī)芯片上的設(shè)計可例如通過以下實現(xiàn)分析人類抗體或抗體片段序列的數(shù)據(jù)庫，并且利 用獲于其的數(shù)據(jù)設(shè)計多肽序列。人類抗體或功能性抗體片段的另一實例是分離自人類來源 的抗體序列文庫的核酸編碼的抗體或功能性抗體片段(即，所述文庫基于取自人類天然來 源的抗體)。人類抗體的實例包括HuCAL抗體，如Knappik et al.，J. Mol. Biol. (2000)296 57和美國專利號6，300，064所述?！叭嗽椿贵w”或功能性人源化抗體片段在本文中定義為如下(i)來源于非人類 來源(例如，具有異源免疫系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因小鼠)，所述抗體基于人種系序列；或(ii)嵌合 的，其中可變結(jié)構(gòu)域來源于非人類來源并且恒定結(jié)構(gòu)域來源于人類來源或(iii)CDR-移植 的，其中可變結(jié)構(gòu)域的CDR來自非人類來源，而可變結(jié)構(gòu)域的一個或更多個框架是人類來 源的并且恒定結(jié)構(gòu)域(如果有的話)是人類來源的。如本文使用的，如果抗體能夠區(qū)別抗原與一種或更多種參考抗原，則該抗體“特異 性結(jié)合于”，“特異于”或“特異性識別”該抗原(本文中，間皮素)，因為結(jié)合特異性不是絕對 的，而是相對的性質(zhì)。在它的大多數(shù)一般形式中(并且當(dāng)沒有提到定義的參考時)，“特異性 結(jié)合”是指抗體區(qū)別感興趣的抗原與不相關(guān)抗原的能力，例如根據(jù)下列方法之一所確定的。 所述方法包括但不限于Western印跡，ELISA-, RIA-, ECL-, IRMA-測試和肽掃描。例如，可 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)ELISA測定?？赏ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)顯色(例如，第二抗體與辣根過氧化物酶和四甲基聯(lián)苯 胺與過氧化氫)進(jìn)行評分。在某些孔中的反應(yīng)通過例如在450nm的光學(xué)密度評分。典型的 背景(=陰性反應(yīng))可以是0. IOD ；典型的陽性反應(yīng)可以是10D。這意味著陽性/陰性的差 異可以超過10倍。典型地，結(jié)合特異性的確定通過利用不是單個參考抗原，而是一組大約 3到5個不相關(guān)抗原，例如奶粉，BSA，轉(zhuǎn)鐵蛋白等而進(jìn)行。然而，“特異性結(jié)合”還可指抗體區(qū)別靶抗原和一種或更多種緊密相關(guān)抗原(其用 作參考點)的能力。另外，“特異性結(jié)合”可涉及抗體區(qū)別其靶抗原不同部分的能力，例如， 間皮素的不同結(jié)構(gòu)域或區(qū)，例如間皮素的N-末端或C-末端區(qū)中的表位，或區(qū)別間皮素氨基 酸殘基的一個或更多個關(guān)鍵氨基酸殘基或段的能力。而且，如本文使用的，“免疫球蛋白”由此定義為屬于IgG，IgM, IgE, IgA，或IgD類 (或任何其亞類)的蛋白，并且包括其所有通常已知的抗體和功能片段?？贵w/免疫球蛋白 的“功能片段”或“抗原結(jié)合抗體片段”由此定義為保持抗原結(jié)合區(qū)的抗體/免疫球蛋白的 片段(例如，IgG的可變區(qū))?？贵w的“抗原結(jié)合區(qū)”通常發(fā)現(xiàn)于抗體的一個或更多個超變區(qū)， 即，⑶R-I，-2和/或-3區(qū)；然而，可變“框架”區(qū)也可在抗原結(jié)合中起重要作用，例如通過提 供CDR的骨架。優(yōu)選，“抗原結(jié)合區(qū)”至少包含可變輕(VL)鏈的氨基酸殘基4至103和可變重 (VH)鏈的5至109，更優(yōu)選VL的氨基酸殘基3至107和VH的4至111，并且特別優(yōu)選的是完 整的VL和VH鏈(VL的氨基酸位點1至109和VH的1至113 ；編號根據(jù)WO 97/08320)。用于 本發(fā)明的免疫球蛋白的優(yōu)選種類是IgG。本發(fā)明的“功能片段”包括Fab，F(xiàn)ab' ,F(ab' )2， 和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(scFv)；和從抗體片段形成的多特異性抗體 (C. A. K Borrebaeck, editor (1995)Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology),Oxford University Press ；R. Kontermann & S·Duebel，editors(2001)Antibody Engineering (Springer Laboratory Manual), Springer Verlag)。“雙特異性，，或“雙功會邑性”抗體之外的抗體被理解為其每個結(jié)合位點是相同的?？梢愿脑霧(ab’)2或？油來最小 化或完全除去分子間二硫化物相互作用，這發(fā)生于Cm和Q結(jié)構(gòu)域之間。本發(fā)明的抗體可來源于重組抗體文庫，所述重組抗體文庫基于在計算機(jī)芯片上設(shè) 計并且被合成產(chǎn)生的核酸編碼的氨基酸序列。在計算機(jī)芯片上設(shè)計抗體序列例如通過分 析人類序列數(shù)據(jù)庫并且利用從其獲得的數(shù)據(jù)設(shè)計多肽序列來獲得。用于設(shè)計和獲得在計 算機(jī)芯片上產(chǎn)生的序列的方法描述于例如，Knappik et al.，J. Mol. Biol. (2000)296 57 ； Krebs et al.，J. Immunol. Methods. (2001) 254 :67 ；和授予 Knappik et al.的美國專利號 6，300，064，其全文通過引用由此并入。如本文使用的，抗原，例如間皮素的不同“形式”，由此定義為產(chǎn)生于不同翻譯和翻 譯后修飾，例如但不限于，初級間皮素轉(zhuǎn)錄物剪接的不同，糖基化的不同和翻譯后蛋白水解 切割的不同，的不同蛋白分子。如本文使用的，術(shù)語特定抗體與間皮素的“不變的結(jié)合”指它結(jié)合在寬范圍的表 達(dá)間皮素的癌細(xì)胞系上的間皮素的能力，所述癌細(xì)胞系表達(dá)不同形式的間皮素。對于不變 地結(jié)合的抗體，通過在兩種不同癌細(xì)胞系上的FACS滴定測定的EC50值可能差別不超過10 倍，或優(yōu)選5倍，并且最優(yōu)選1和3倍之間。如本文使用的，術(shù)語“表位”包括能夠特異性結(jié)合免疫球蛋白或T-細(xì)胞受體的任 何蛋白決定簇。表位決定簇通常由分子例如氨基酸或糖側(cè)鏈的化學(xué)活性表面分組組成，并 且通常具有特異性的三維結(jié)構(gòu)特征，以及特異性電荷特征。如果通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知 的任何方法，一種抗體在競爭性結(jié)合實驗中顯示與第二種抗體競爭，則兩種抗體被稱為“結(jié) 合相同表位”。本發(fā)明的抗體本發(fā)明涉及通過提供抗_間皮素抗體抑制間皮素陽性癌細(xì)胞生長和腫瘤疾病進(jìn) 展的方法。提供了人類單克隆抗體，其抗原結(jié)合抗體片段，和該抗體和片段的變體，其特異 性結(jié)合間皮素前體多肽的40kDa的C-末端結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO 370)，其在本文中命名為“間
皮素”。本發(fā)明的抗體，抗原結(jié)合抗體片段，和該抗體和片段的變體包含輕鏈可變區(qū)和重 鏈可變區(qū)。本發(fā)明中預(yù)期的所述抗體或抗原結(jié)合抗體片段的變體是這樣的分子，其中所述 抗體或抗原結(jié)合抗體片段對于間皮素的結(jié)合活性被保持。貫穿本文獻(xiàn)，參考下列本發(fā)明的代表性抗體"MF-J，，，"M0R07265，，，"M0R06631，，，"M0R06635，，，"M0R06669，，，"M0R07111，，， "M0R06640，，，"M0R06642，，，"M0R06643，，，” MF-226，，，"M0R06626，，，"M0R06638，，，"MF-A，，， "M0R06657，，，"MF_T，，，"MF1，，，"MF_5，，，"MF_8，，，"MF-24，，，"MF-25，，，"MF-27，，，"MF-73，，， "MF-78，，，"MF-84，，，"MF-101", “MF-230，，，“MF-236，，，“MF-252，，，“MF-257，，，“MF-423，，， "MF-427，，，"MF-428，，，MF-C，，，"MF-I，，，"MF-L，，，"MF-M，，，"MF-P，，，"MF-Q，，，MF-S，，，"MF-V，，， “MF-W”，禾口 “MF-Y”。MF-J 代表具有對應(yīng)于 SEQID NO 284 (DNA)/SEQ ID N0:198(蛋白)的 可變重區(qū)和對應(yīng)于SEQ IDNO 327 (DNA)/SEQ ID N0:241(蛋白)的可變輕區(qū)的抗體。MOR 07265代表具有對應(yīng)于SEQ ID NO 285 (DNA)/SEQ ID N0:199(蛋白)的可變重區(qū)和對應(yīng)于 SEQ ID NO 328 (DNA)/SEQ ID N0:242(蛋白)的可變輕區(qū)的抗體。MOR 06631代表具有對應(yīng) 于SEQ ID NO 286 (DNA)/SEQID N0:200(蛋白)的可變重區(qū)和對應(yīng)于SEQ ID NO 329 (DNA)/
8SEQ IDNO :243(蛋白)的可變輕區(qū)的抗體。MOR 06669代表具有對應(yīng)于SEQID NO 287 (DNA)/ SEQ ID N0:201(蛋白)的可變重區(qū)和對應(yīng)于 SEQ IDNO 330 (DNA)/SEQ ID N0:244(蛋白) 的可變輕區(qū)的抗體。MOR 07111代表具有對應(yīng)于SEQ ID NO 288 (DNA)/SEQ ID N0:202(蛋 白)的可變重區(qū)和對應(yīng)于SEQ ID NO 331(DNA)/SEQ ID N0:245(蛋白)的可變輕區(qū)的抗 體。MOR 06640代表具有對應(yīng)于SEQ ID NO 289 (DNA)/SEQID N0:203(蛋白)的可變重區(qū)和 對應(yīng)于SEQ ID NO 332 (DNA)/SEQ IDNO :246(蛋白)的可變輕區(qū)的抗體。MOR 06642代表 具有對應(yīng)于SEQID NO 290 (DNA)/SEQ ID N0:204(蛋白)的可變重區(qū)和對應(yīng)于SEQ IDNO 333 (DNA) /SEQ ID N0:247(蛋白)的可變輕區(qū)的抗體。MOR 06643代表具有對應(yīng)于SEQ ID NO 291(DNA)/SEQ ID N0:205(蛋白)的可變重區(qū)和對應(yīng)于 SEQ ID NO 334(DNA)/SEQ ID N0:248(蛋白)的可變輕區(qū)的抗體。MF-226代表具有對應(yīng)于SEQ ID NO 292 (DNA)/SEQ ID NO 206 (蛋白)的可變重區(qū)和對應(yīng)于SEQ ID NO 335 (DNA)/SEQ ID NO 249 (蛋白)的可變 輕區(qū)的抗體。MOR 06626代表具有對應(yīng)于SEQ IDNO 293 (DNA)/SEQ ID N0:207(蛋白)的可 變重區(qū)和對應(yīng)于SEQ IDNO 336 (DNA)/SEQ ID NO :250 (蛋白)的可變輕區(qū)的抗體。M0R06635 代表具有對應(yīng)于SEQ ID NO 294 (DNA)/SEQ ID NO :208 (蛋白)的可變重區(qū)和對應(yīng)于SEQ ID NO 337 (DNA)/SEQ ID N0:251(蛋白)的可變輕區(qū)的抗體。MOR 06638代表具有對應(yīng)于SEQ ID NO 295 (DNA)/SEQ ID N0:209(蛋白)的可變重區(qū)和對應(yīng)于 SEQ ID NO 338 (DNA)/SEQ ID N0:252(蛋白)的可變輕區(qū)的抗體。MF-A代表具有對應(yīng)于SEQ ID NO 296 (DNA)/SEQ ID N0:210(蛋白)的可變重區(qū)和對應(yīng)于SEQ ID NO 339 (DNA)/SEQ ID N0:253(蛋白)的可變 輕區(qū)的抗體。MOR 06657代表具有對應(yīng)于SEQ ID NO 297 (DNA)/SEQ ID N0:211(蛋白)的 可變重區(qū)和對應(yīng)于SEQ ID NO 340 (DNA)/SEQ ID N0:254(蛋白)的可變輕區(qū)的抗體。MF-T 代表具有對應(yīng)于SEQ ID NO 298 (DNA)/SEQ ID NO :212 (蛋白)的可變重區(qū)和對應(yīng)于SEQ ID NO 341(DNA)/SEQ ID N0:255(蛋白)的可變輕區(qū)的抗體。MF-L代表具有對應(yīng)于SEQ ID NO 299 (DNA)/SEQ ID N0:213(蛋白)的可變重區(qū)和對應(yīng)于 SEQ ID NO 342 (DNA)/SEQ ID N0:256(蛋白)的可變輕區(qū)的抗體。MF-I代表具有對應(yīng)于SEQ ID NO 300 (DNA)/SEQ ID N0:214(蛋白)的可變重區(qū)和對應(yīng)于SEQ ID NO 343 (DNA)/SEQ ID N0:257(蛋白)的可 變輕區(qū)的抗體。MF-5代表具有對應(yīng)于SEQ ID NO 301 (DNA)/SEQID N0:215(蛋白)的可變 重區(qū)和對應(yīng)于SEQ ID NO 344(DNA)/SEQID N0:258(蛋白)的可變輕區(qū)的抗體。MF-8代表 具有對應(yīng)于SEQ IDNO 302 (DNA)/SEQ ID N0:216(蛋白)的可變重區(qū)和對應(yīng)于SEQ IDNO 345 (DNA) /SEQ ID N0:259(蛋白)的可變輕區(qū)的抗體。MF-24代表具有對應(yīng)于SEQ ID NO: 303 (DNA) /SEQ ID N0:217(蛋白)的可變重區(qū)和對應(yīng)于 SEQ ID NO 346 (DNA)/SEQ ID NO: 260 (蛋白)的可變輕區(qū)的抗體。MF-25代表具有對應(yīng)于SEQ ID NO 304 (DNA)/SEQ IDNO 218 (蛋白)的可變重區(qū)和對應(yīng)于SEQ ID NO 347 (DNA)/SEQ IDNO :261(蛋白)的可變輕區(qū) 的抗體。MF-27代表具有對應(yīng)于SEQ IDNO 305 (DNA)/SEQ ID N0:219(蛋白)的可變重區(qū) 和對應(yīng)于SEQ IDNO 348 (DNA)/SEQ ID N0:262(蛋白)的可變輕區(qū)的抗體。MF-73代表具 有對應(yīng)于SEQ ID NO 306 (DNA)/SEQ ID N0:220(蛋白)的可變重區(qū)和對應(yīng)于SEQ ID NO: 349 (DNA) /SEQ ID N0:263(蛋白)的可變輕區(qū)的抗體。MF-78代表具有對應(yīng)于SEQ ID NO: 307 (DNA) /SEQ IDNO :221 (蛋白)的可變重區(qū)和對應(yīng)于 SEQ ID NO 350 (DNA)/SEQ IDNO 264 (蛋白)的可變輕區(qū)的抗體。MF-84代表具有對應(yīng)于SEQ IDNO 308 (DNA)/SEQ ID NO: 222 (蛋白)的可變重區(qū)和對應(yīng)于SEQ IDNO 351 (DNA)/SEQ ID NO 265 (蛋白)的可變輕區(qū)
9的抗體。MF-101代表具有對應(yīng)于SEQ ID NO 309 (DNA)/SEQ ID N0:223(蛋白)的可變重區(qū) 和對應(yīng)于SEQ ID NO 352 (DNA)/SEQ ID N0:266(蛋白)的可變輕區(qū)的抗體。MF-230代表 具有對應(yīng)于SEQ ID NO 310 (DNA)/SEQ IDNO :224(蛋白)的可變重區(qū)和對應(yīng)于SEQ ID NO: 353 (DNA) /SEQ IDNO :267(蛋白)的可變輕區(qū)的抗體。MF-236代表具有對應(yīng)于SEQ IDNO 311 (DNA)/SEQ ID N0:225(蛋白)的可變重區(qū)和對應(yīng)于 SEQ IDNO 354 (DNA)/SEQ ID NO: 268(蛋白)的可變輕區(qū)的抗體。MF-252代表具有對應(yīng)于SEQ ID NO 312 (DNA)/SEQ ID NO: 226(蛋白)的可變重區(qū)和對應(yīng)于SEQ ID NO 355 (DNA)/SEQ ID N0:269(蛋白)的可變輕 區(qū)的抗體。MF-275代表具有對應(yīng)于SEQ ID NO 313 (DNA)/SEQ IDNO :227(蛋白)的可變重 區(qū)和對應(yīng)于SEQ ID NO 356 (DNA)/SEQ IDNO :270(蛋白)的可變輕區(qū)的抗體。MF-423代表 具有對應(yīng)于SEQ IDNO 314(DNA)/SEQ ID N0:228(蛋白)的可變重區(qū)和對應(yīng)于SEQ IDNO 357 (DNA) /SEQ ID N0:271(蛋白)的可變輕區(qū)的抗體。MF-427代表具有對應(yīng)于SEQ ID NO: 315 (DNA)/SEQ ID N0:229(蛋白)的可變重區(qū)和對應(yīng)于 SEQ ID NO 358 (DNA)/SEQ ID NO: 272(蛋白)的可變輕區(qū)的抗體。MF-428代表具有對應(yīng)于SEQ ID NO 316 (DNA)/SEQ ID N0: 230 (蛋白)的可變重區(qū)和對應(yīng)于SEQ ID NO 359 (DNA)/SEQ ID NO 273 (蛋白)的可變輕區(qū) 的抗體。MF-C代表具有對應(yīng)于SEQ ID NO 317 (DNA)/SEQ ID N0:231(蛋白)的可變重區(qū) 和對應(yīng)于SEQ ID NO 360 (DNA)/SEQ ID N0:274(蛋白)的可變輕區(qū)的抗體。MF-I代表具 有對應(yīng)于SEQ ID NO 318 (DNA)/SEQ ID N0:232(蛋白)的可變重區(qū)和對應(yīng)于SEQ ID N0: 361 (DNA)/SEQ ID N0:275(蛋白)的可變輕區(qū)的抗體。MF-M代表具有對應(yīng)于SEQ ID N0: 319 (DNA)/SEQ ID N0:233(蛋白)的可變重區(qū)和對應(yīng)于 SEQ ID NO 362 (DNA)/SEQ ID N0: 276(蛋白)的可變輕區(qū)的抗體。MF-P代表具有對應(yīng)于SEQ ID NO 320 (DNA)/SEQID N0: 234(蛋白)的可變重區(qū)和對應(yīng)于SEQ ID NO 363 (DNA)/SEQ IDNO :277(蛋白)的可變輕區(qū) 的抗體。MF-Q代表具有對應(yīng)于SEQ IDNO 321 (DNA)/SEQ ID N0:235(蛋白)的可變重區(qū) 和對應(yīng)于SEQ IDNO 364(DNA)/SEQ ID N0:278(蛋白)的可變輕區(qū)的抗體。MF-S代表具 有對應(yīng)于SEQ ID NO 322 (DNA)/SEQ ID N0:236(蛋白)的可變重區(qū)和對應(yīng)于SEQ ID N0: 365 (DNA) /SEQ ID N0:279(蛋白)的可變輕區(qū)的抗體。MF-U代表具有對應(yīng)于SEQ ID N0: 323 (DNA) /SEQ ID N0:237(蛋白)的可變重區(qū)和對應(yīng)于 SEQ ID NO 366 (DNA)/SEQ ID N0: 280 (蛋白)的可變輕區(qū)的抗體。MF-V代表具有對應(yīng)于SEQ ID NO 324 (DNA)/SEQ ID N0: 238 (蛋白)的可變重區(qū)和對應(yīng)于SEQ ID NO 367 (DNA)/SEQ ID N0:281(蛋白)的可變輕區(qū) 的抗體。MF-W代表具有對應(yīng)于SEQ ID NO 325 (DNA)/SEQ ID N0:239(蛋白)的可變重區(qū) 和對應(yīng)于SEQ ID NO 368 (DNA)/SEQ ID N0:282(蛋白)的可變輕區(qū)的抗體。MF-Y代表具 有對應(yīng)于SEQ ID NO 326 (DNA)/SEQ ID N0:240(蛋白)的可變重區(qū)和對應(yīng)于SEQ ID N0: 369 (DNA) /SEQ ID N0:283(蛋白)的可變輕區(qū)的抗體。在一個方面，本發(fā)明提供了結(jié)合氨基酸序列如SEQ ID NO 370所述的間皮素的表 位的抗體，所述表位與Mab Kl識別的間皮素表位不同。在一個方面，本發(fā)明提供了結(jié)合抗體MF-J或MF-T的表位的一個或更多個氨基酸 的抗體。在某些方面，所述抗體結(jié)合抗體MF-J或MF-T的表位的至少兩個，至少三個，至少 四個，至少五個或至少六個氨基酸。在某些方面，本發(fā)明的抗體結(jié)合抗體MF-J識別的表位 的一個或更多個氨基酸。在可選的方面，本發(fā)明的抗體結(jié)合抗體MF-T識別的表位的一個或 更多個氨基酸。
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在另一方面，本發(fā)明提供了具有抗原結(jié)合區(qū)的抗體，所述抗原結(jié)合區(qū)可特異性結(jié) 合間皮素的一個或更多個區(qū)或具有對于間皮素的一個或更多個區(qū)的高親合力，所述間皮素 的氨基酸序列如SEQ ID N0:370所述。如果抗體親合力測量值為至少IOOnM(Fab片段的 單價親合力)，則該抗體被認(rèn)為具有對于抗原的“高親合力”。發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合區(qū)優(yōu) 選可以如下親合力結(jié)合間皮素小于約ΙΟΟηΜ，更優(yōu)選小于約60nM，并且仍然更優(yōu)選小于約 30nM。進(jìn)一步優(yōu)選的是以小于約ΙΟηΜ，并且更優(yōu)選小于約3nM的親合力結(jié)合間皮素的抗體。 例如，本發(fā)明抗體對間皮素的親合力可以為約10. OnM或0. 19nM(Fab片段的單價親合力)。表1提供了本發(fā)明的代表性抗體的解離常數(shù)和解離速率的概況，如通過在直接固 定的間皮素上的表面等離子體共振(Biacore)所測定的。表1 通過表面等離子體共振對于抗-間皮素Fabs測定的對間皮素的單價解離常 數(shù)和解離速率
權(quán)利要求
分離的人類或人源化抗體或其功能片段，包含特異于間皮素(SEQ ID NO370)的抗原結(jié)合區(qū)，其中所述抗體或其功能片段顯示出不變的間皮素結(jié)合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的分離的抗體的抗原結(jié)合區(qū)或其功能片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的分離的抗原結(jié)合區(qū)，其包含如表7所述的CDR區(qū)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的分離的抗原結(jié)合區(qū)，其包含選自以下構(gòu)成的組的重鏈或輕鏈氨基 酸序列⑴表7所述的SEQ ID NOS ；和(ii)在⑶R區(qū)中與表7所述SEQ ID NOS所述的⑶R區(qū)具有至少60%的序列同一性的序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的分離的抗體，其為IgG。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的分離的抗原結(jié)合區(qū)，其包含表7所述的一個或更多個序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求2的分離的功能片段，其為Fab或scFv抗體片段。
8.編碼根據(jù)權(quán)利要求1的人類抗體的抗原結(jié)合區(qū)或其功能片段的分離的核酸序列。
9.編碼分離的抗體的可變重鏈或其功能片段的核酸序列，其包含(i)選自表7所述SEQ ID NOS的序列或(ii)在高度嚴(yán)格條件下與表7所述的SEQ ID NO的互補鏈雜交的核酸序 列，其中所述抗體或其功能片段特異于間皮素表位。
10.包含根據(jù)權(quán)利要求9的任一的核酸序列的載體。
11.包含根據(jù)權(quán)利要求10的載體的分離的細(xì)胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的分離的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是細(xì)菌或哺乳動物細(xì)胞。
13.包含根據(jù)權(quán)利要求1的抗體或功能片段，及用于其的藥學(xué)上可接受的載體或賦形 劑的藥物組合物。
14.用于治療與不期望的間皮素存在相關(guān)的病癥或狀況的方法，包含給予有此需要的 受試者有效量的根據(jù)權(quán)利要求13的藥物組合物。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的人類抗體，其中所述人類抗體是合成的人類抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了特異于膜錨定的，40kDa間皮素多肽的重組抗原結(jié)合區(qū)和包含所述抗原結(jié)合區(qū)的抗體和功能片段，所述間皮素多肽在若干種腫瘤中過表達(dá)，例如胰腺和卵巢腫瘤，間皮瘤和肺癌細(xì)胞。相應(yīng)地，這些抗體可用于治療這些和其它病癥和狀況。本發(fā)明的抗體還可用于診斷領(lǐng)域，以及用于進(jìn)一步研究間皮素在與癌癥相關(guān)的病癥進(jìn)展中的作用。本發(fā)明還提供了編碼前述抗體的核酸序列，包含其的載體，藥物組合物和具有使用說明的試劑盒。
文檔編號A61K39/395GK101952319SQ200880125390
公開日2011年1月19日 申請日期2008年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月26日
發(fā)明者A·卡納特, D·施奈德, D·萊特, N·薩托扎瓦, R·帕里, S·斯泰德爾, T·R·海特納漢森, U·舒伯特 申請人:拜耳先靈制藥股份公司