專利名稱：用于治療陰道感染和致病性陰道生物被膜的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體涉及用于治療陰道感染和致病性陰道生物被膜的組合物和方法。
背景技術(shù)：
依照疾病控制中心(CDC)，陰道炎是育齡婦女極常見的診斷疾病，致使每年有超過 1千萬人去診所看病。絕大多數(shù)的陰道炎病例涉及三種感染之一細菌性陰道病(BV)、外 陰陰道念珠菌病(VVC)(亦稱為"陰道酵母感染")和毛滴蟲病。細菌性陰道病占所有感 染的約40-45%，而VVC和毛滴蟲病分別占約20-25%和15-20%。在某些情況下，陰道炎 的病因可混合。不幸的是，陰道炎的全國性監(jiān)視數(shù)據(jù)缺乏，因為無可報告的疾?。蝗欢?，由 National Health and Nutrition ExaminationSurvey^BV l^f^iff^ll^i^^H^ 齡在14-49歲之間的人口中近三分之一(29% )的婦女呈該感染陽性。雖然許多FDA批準的療法可用于治療陰道炎，但是由于抗治療生物體和復(fù)發(fā)和持 續(xù)感染的比率增加，常常使治療具有挑戰(zhàn)性并進一步復(fù)雜化。此外，有不斷增加的科學(xué)證據(jù) 鑒定這些感染為更嚴重的健康并發(fā)癥的重要危險因素，尤其在懷孕期間。據(jù)報導(dǎo)，去診所看 病和自我治療陰道炎的直接費用估計是每年多于10億美元；然而，涉及繼發(fā)性并發(fā)癥(例 如，在懷孕中發(fā)病、盆腔炎癥性疾病和手術(shù)后感染)和喪失勞動能力的間接費用遠遠更大。因此，這些感染的公共健康含意是明顯的，并對改善的治療方法存在需要。生物被膜相關(guān)性感染于1978年首次描述，現(xiàn)在認為是多于60 %的人類感染尤其 是其持續(xù)性感染和復(fù)發(fā)性感染的誘發(fā)因素。對于由細菌和真菌生物引起的寬范圍的慢性 感染，包括皮膚創(chuàng)傷和燒傷、中耳炎、牙周病、心內(nèi)膜炎、泌尿道感染和裝置相關(guān)性感染(例 如，導(dǎo)管、心臟瓣膜)，已經(jīng)描述了生物被膜，但是不認為在陰道感染的病因中是重要的，因 此，實際上陰道炎治療領(lǐng)域的技術(shù)人員還沒有解決這一問題。生物被膜是嵌入保護性表多糖(即，碳水化合物)基質(zhì)的高度組織的微生物群體， 該基質(zhì)通過粘附蛋白附著至無活性和活的膜表面(即，固著的群)。與其自由漂浮的或"浮 游生物的“微生物相反，眾所周知生物被膜相關(guān)性微生物耐抗微生物治療_最高達1000倍 或更大_是許多復(fù)發(fā)性感染和頑固性感染的病源。認為其持續(xù)性部分涉及基因的上調(diào)，該 基因賦予高度不同的和抗藥的生物被膜表型，該生物被膜表型維持生物被膜群落的生長和 存活。這包括生物被膜基質(zhì)材料的形成，這限制了抗微生物劑的滲透，干擾正常宿主的防御 機制，并產(chǎn)生基本上不耐殺滅的〃耐藥株(persister)"生物。生物被膜在固體表面上遷移離開高應(yīng)力區(qū)域的能力-稱為群游的能力-及其慢生 長速率也被認為有助于其致病性和持續(xù)性。證據(jù)進一步表明，建立的生物被膜通過用作保 護這些生物體不被免疫系統(tǒng)和常規(guī)抗微生物治療破壞的屏蔽貯器，而在其它次級病原體例 如病毒的持續(xù)性中起作用。硼酸(Boric acid)或硼酸(boracic acid) [B(OH)3]是有弱抗微生物性質(zhì)的弱 無機酸。在體外，硼酸對白色念珠菌(C. albicans)以及非白色念珠菌種屬包括熱帶念珠 菌(C. tropicalis)、光滑念珠菌(C. glabrata)和近平滑念珠菌(C. parapsilosis)的臨 床分離株具有弱的抑制真菌能力(Shubair, 1990 ；Prutting 1998)。同時，硼酸也在體外顯示對常見的細菌性病原體包括葡萄球菌和鏈球菌、綠膿稈菌(P. aeruginosa)、大腸桿菌 (E. coli)和變形菌(Proteus)、克雷伯氏菌(Klebsiella)和腸桿菌(Enterobacter)屬具 有抑菌活性(Meers 1990)，硼酸的抗菌作用起效慢，這與許多抗生素相反，似乎獨立于細胞 生長，因為已經(jīng)顯示分裂期細胞和靜止期細胞同樣受影響(Meers 1990)。硼酸的弱抗微生 物性質(zhì)使它令人驚訝，硼酸將對陰道感染的治療有效，尤其是天然抗藥的、持續(xù)的和復(fù)發(fā)的 那些陰道感染。硼酸也顯示其它生物作用。例如，已經(jīng)顯示硼酸在鈣的調(diào)節(jié)中起作用，并通過作用 于胞外基質(zhì)形成和生長因子合成(Dzondo 2002)而刺激創(chuàng)傷愈合。也已經(jīng)顯示硼酸在前 列腺癌細胞系中具有抗增殖作用，且在胃損傷的動物模型中具有細胞保護作用(Barranco 2006) ； (Alsaif2004)。也有證據(jù)進一步表明，硼酸具有抗病毒活性，尤其是對單純皰疹病毒 (Skinner 1979 ；Rodu 1988)。在分子水平上，硼酸結(jié)合順式-二醇化合物，包括涉及細胞代 謝和信號傳導(dǎo)的膜多糖和核酸的碳水化合物部分(例如，RNA、NAD、ATP)，這可部分解釋所 報導(dǎo)的硼酸對膜和細胞功能的作用(Kim 2006)；而硼酸與乙二胺四乙酸(EDTA)的組合已 經(jīng)證明，在體外對角膜的膜滲透性具有獨特的協(xié)同作用(Kikuchi2005)。發(fā)明概述本發(fā)明總體涉及意外的發(fā)現(xiàn)，由于其作為陰道生物被膜破壞者的角色，硼酸可用 于治療和/或預(yù)防陰道感染。我們假定，生物被膜在陰道感染中，尤其在陰道炎中，更具體 地講，在細菌性陰道病(BV)、外陰陰道念珠菌病(VVC)(亦稱為"陰道酵母感染")和毛滴 蟲病中起重要作用。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及藥用組合物，該組合物用于治療和/或預(yù)防陰道 感染和/或致病性陰道生物被膜，包含硼酸和乙二胺四乙酸(EDTA)。在本發(fā)明藥用組合物中，硼酸的量優(yōu)選為約0. Olmg-約10g，更優(yōu)選約0. Img-約 Ig,甚至更優(yōu)選約Img-約250mg。在本發(fā)明藥用組合物中，EDTA的量優(yōu)選為約0. OOlmg-約lg，更優(yōu)選約0. Olmg-約 250mg。在一個實施方案中，硼酸對EDTA的相對量以重量計為約1 1-約1000 1。在另一個實施方案中，EDTA與硼酸的相對量為約2 1-100 1。在另一個實施方案中，本發(fā)明的藥用組合物還包含一種或多種生物活性劑，該生 物活性劑選自香檸檬油、茶樹油或其它精油、鋅離子和鎵。在另一個實施方案中，本發(fā)明的藥用組合物還包含至少一種添加劑，該添加劑選 自膠凝齊 、緩沖劑、防腐齊 、表面活性劑、去污齊 、油、醇、乳化劑、增溶齊 、濕潤劑和生物粘附 劑。在一個實施方案中，本發(fā)明的藥用組合物還包含適用于陰道和/或外陰給藥的藥 學(xué)上可接受的載體。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及治療和/或預(yù)防陰道感染和/或致病性陰道生 物被膜的方法，該方法包括在無任何治療量的乙酸存在下，將治療有效量的硼酸給予有需 要的患者。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及治療和/或預(yù)防陰道感染和/或致病性陰道生 物被膜的方法，該方法包括將治療有效量的包含硼酸和EDTA的藥用組合物給予有需要的^^ ο在一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括將藥用組合物每日一次至每日三次施用至 陰道和/或外陰。在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括將藥用組合物間斷地例如每周兩次施用 至陰道和/或外陰，作為預(yù)防性治療。在另一個實施方案中，將本發(fā)明的藥用組合物局部施用至患者的陰道和/或外 陰。藥用組合物可以以下的形式施用栓劑、乳膏劑、軟膏劑、固體(例如，片劑、膠囊 劑、胚珠制劑(ovule)、栓劑)、溶液劑、混懸劑、凝膠劑、泡沫劑、膜或脂質(zhì)體組合物。藥用組 合物也可包含在陰道環(huán)、棉塞、栓劑、海綿、枕墊、粉撲或滲透泵系統(tǒng)內(nèi)。本發(fā)明的藥用組合物可以與其它藥物活性化合物例如與甲硝唑共給藥 (co-administered)0也可利用各種聚合物、纖維、樹脂、蠟、油或藥物化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員所使用的其 它藥物賦形劑，將藥用組合物的劑型配制成緩釋形式，以產(chǎn)生藥用組合物活性組分的延長 釋放。在一個實施方案中，陰道感染是細菌感染。在另一個實施方案中，陰道感染是外陰陰道念珠菌病。在還另一個實施方案中，陰道感染是毛滴蟲病。在還另一個實施方案中，陰道感染是病毒感染。如果不適當(dāng)?shù)闹委?，那么陰道感染可能?dǎo)致泌尿道感染。因此，在另一個實施方案 中，本發(fā)明涉及泌尿道感染的治療和預(yù)防。在還另一個實施方案中，陰道感染由選自細菌、真菌、寄生蟲和病毒的兩種或多種 病原體引起，并稱為混合感染。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及制品，該制品包含包裝材料和在該包裝材料內(nèi) 的本發(fā)明藥用組合物。藥用組合物以足以治療患者的陰道感染或致病性陰道生物被膜的 量，優(yōu)選以相當(dāng)于至少一個單位劑量的量存在。包裝材料包含標簽，該標簽指示藥用組合物 可以用于治療陰道感染和相關(guān)的致病性陰道生物被膜。優(yōu)選標簽包括其它印刷標記例如成 分列表、制造商的名稱和地址等。優(yōu)選包裝材料也包括印刷的插入物，包括負責(zé)藥品管理的 政府機構(gòu)可能要求的關(guān)于組合物的詳細信息、其用于治療陰道感染和致病性生物被膜的給 藥方法、副作用、禁忌癥等標記。附圖簡述

圖1是說明BV病原體共生關(guān)系的圖；圖2是用生物被膜負荷的log對數(shù)減少對未治療的生物被膜對照，來舉例說明硼 酸和EDTA對白色念珠菌(C. albicans)生物被膜的作用的圖。圖3是用生物被膜負荷的log對數(shù)減少對未治療的生物被膜對照，來舉例說明硼 酸和EDTA對陰道加德納氏菌(G. vaginalis)生物被膜的作用的圖。圖4是Kaplan-Meier圖，該圖舉例說明用硼酸治療的頑固性BV婦女的治愈概率。發(fā)明詳述定義
當(dāng)用于本文時，“生物被膜"是指表面附著、高度結(jié)構(gòu)的一種或多種微生物群體， 其陷入促進在表面例如陰道粘膜上附著、建群和生長的自產(chǎn)生外泌多糖基質(zhì)內(nèi)，并顯示不 同的生物被膜表型。當(dāng)作為活性劑涉及化合物時，申請人打算使術(shù)語"化合物"或"活性劑"不僅包 括具體的分子實體，而且還包括其藥學(xué)上可接受的藥理活性鹽。當(dāng)用于本文時，術(shù)語〃治療〃和〃處理〃是指導(dǎo)致癥狀的嚴重性和/或頻率降 低、癥狀和/或潛在原因消除、防止癥狀和/或其潛在原因的發(fā)生和/或改善。因此，用本 發(fā)明所述組合物"治療"患者包括在易感個體中預(yù)防特定的病癥，以及處理有臨床癥狀的 個體，以抑制或引起病癥或疾病的消退。治療可以包括預(yù)防、治療或治愈。例如，生物被膜 的治療包括在對生物被膜的發(fā)育敏感的患者中預(yù)防生物被膜形成，以及通過抑制、控制或 引起潛在疾病的消退來治療具有生物被膜的患者。當(dāng)用于本文時，術(shù)語"陰道"將包括陰道區(qū)域，一般也包括外陰、前庭和子宮頸。術(shù)語"陰道感染"包括任何陰道區(qū)域包括外陰、前庭和子宮頸的任何感染性病 癥，包括生物被膜相關(guān)性感染。該術(shù)語也包括多重陰道感染。術(shù)語"破壞"將包括對生物被膜施加任何和所有的損害。本發(fā)明藥用組合物的術(shù)語"治療有效量"是指以可適用于任何藥物治療的合理 的利益/風(fēng)險比，組合物足以治療病癥的量。然而，應(yīng)理解，本發(fā)明組合物的每日總用量將 由主治醫(yī)師在可靠的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)決定。用于任何特定患者的具體有效劑量水平將取決 于各種因素，包括被治療的病癥和病癥的嚴重性；所使用的特定化合物的活性；所使用的 特定組合物；患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食；所使用的特定化合物的給藥 時間、給藥途徑和排泄速率；療程；與所使用的特定化合物組合或同時使用的藥物；和在醫(yī) 學(xué)領(lǐng)域中熟知的相似因素。例如，組合物的起始劑量低于達到預(yù)期療效所需的水平，并逐漸 增加劑量直至達到預(yù)期效果，這完全在本領(lǐng)域的技能范圍內(nèi)。當(dāng)用于本說明書和權(quán)利要求書時，單數(shù)形式"一"和"該"包括復(fù)數(shù)指示物，除 非上下文另外清楚地指明。因此，例如，涉及"生物活性劑"包括兩種或多種生物活性劑的 混合物，涉及"藥學(xué)上可接受的賦形劑"包括此類賦形劑的混合物等。本發(fā)明涉及用于治療和/或預(yù)防陰道感染和/或致病性陰道生物被膜的藥用組合 物，該組合物包含硼酸和EDTA。在本發(fā)明的藥用組合物中，硼酸的量優(yōu)選為約0. 0Img-約10g，更優(yōu)選為約 0. Img-約lg，甚至更優(yōu)選為約Img-約250mg。在本發(fā)明的藥用組合物中，EDTA的量優(yōu)選為約0. OOlmg-約lg，更優(yōu)選約 0. Olmg-約 250mg。在一個實施方案中，硼酸對EDTA的相對量以重量計為約1 1_約1000 1。在另一個實施方案中，EDTA與硼酸的相對量為約2 1-100 1。本發(fā)明的藥用組合物還可包含一種或多種生物活性劑，該生物活性劑選自香檸檬 油、茶樹油或其它精油、鋅離子和鎵。這些生物活性劑可增強和/或補充硼酸和EDTA的生 物被膜破壞作用。例如，可將鎵添加至藥用組合物，以通過靶向致病性微生物的鐵代謝，并用其在生 物被膜形成中的信號傳導(dǎo)角色進行干擾，來增強硼酸和EDTA的生物被膜破壞作用。
可添加鋅離子或其鹽，以增強硼酸和EDTA的生物被膜破壞作用。可將表面活性劑添加至藥用組合物。表面活性劑可通過進一步降低表面張力，并 促進活性物質(zhì)的分散，來提供組合物與陰道粘膜的更佳的表面接觸，或可具有抗生物被膜 性質(zhì)，這可補充所述硼酸和EDTA組合物的那些性質(zhì)。可添加的表面活性劑包括但不限于 十二烷基硫酸鹽和滌波(te印ol)等。本發(fā)明的藥用組合物還可包含其它添加劑，例如膠凝劑、緩沖劑、防腐劑、去污劑、 油、醇、乳化劑、增溶劑、濕潤劑和生物粘附劑。本發(fā)明的藥用組合物還包含適用于陰道和/或外陰給藥的藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的組合物可包括生理上可耐受的防腐劑。合適的生理上可耐受的防腐劑包括抑菌劑、防腐劑、抑制劑等，例如對羥基苯甲酸 甲酯、乙酯、丙酯和丁酯(對羥基苯甲酸酯類)；沒食子酸丙酯；山梨酸及其鈉鹽和鉀鹽；丙 酸及其鈣鹽和鈉鹽；6-乙酰氧基_2，4-二甲基-m-二Pl烷；2-溴-2-硝基丙烷-1，3-二醇； 水楊酰苯胺例如二溴水楊酰苯胺和三溴水楊酰苯胺、1-(3_氯烯丙基-3，5，7-三氮雜-1-氮 雜金剛烷(azanidadamantane)氯化物的順式異構(gòu)體；六氯苯；苯甲酸鈉；酚類化合物例如 丁基羥基苯甲醚、丁基羥基甲苯、氯代甲酚和溴代甲酚和氯代與溴代-oxylenols;季銨類 化合物例如苯扎氯銨；芳族醇類例如2-苯基乙醇和苯甲醇；氯代丁醇；喹啉衍生物例如碘 代氯代羥基喹啉等。優(yōu)選，基于組合物的總重量計，所包含防腐劑的量約0.05%重量-約 0. 2%重量?？砂ㄓ诒景l(fā)明藥用組合物中的藥學(xué)上可接受的賦形劑包括例如在本領(lǐng)域中熟 知的生理上可耐受的表面活性劑、溶劑、潤膚劑、著色劑、香料等。優(yōu)選組合物具有在約 3. 5-約7范圍內(nèi)的pH值，更優(yōu)選在約4-4. 5的范圍內(nèi)。本發(fā)明也涉及治療和/或預(yù)防陰道感染和/或致病性陰道生物被膜的方法，該方 法包括將治療有效量的硼酸給予有需要的患者。本發(fā)明也涉及治療和/或預(yù)防陰道感染和/或致病性陰道生物被膜的方法，該方 法包括將治療有效量的硼酸和EDTA給予有需要的患者。不受任何具體理論的束縛，認為硼酸可通過以下機理起作用優(yōu)先與致病性生 物被膜基質(zhì)的順式_ 二醇碳水化合物組分結(jié)合，并刺激蛋白酶的合成，從而破壞生物被膜 的結(jié)構(gòu)完整性和其與陰道粘膜的粘附。硼酸也可在BV生物被膜中提供另外的優(yōu)點，因為 其通過形成硼酸銨而具有化學(xué)"俘獲"氨的能力(Thiex NJ等，2002)。該關(guān)聯(lián)性涉及 所述陰道加德納氏菌(G. vaginalis) (BV生物被膜的主要細菌成分)與二路普雷沃氏菌 (P.bivia)(—種次級BV病原體)的共生關(guān)系(Pybus 1997)。體外研究表明，陰道加德納 氏菌(G. vaginalis)利用二路普雷沃氏菌(P.bivia)代謝的氨副產(chǎn)物而茁壯成長，同時二 路普雷沃氏菌(P. bivia)利用陰道加德納氏菌(G. vaginalis)代謝的氨基酸副產(chǎn)物而茁壯 成長。圖1用圖顯示該共生關(guān)系。因此，硼酸的陰道給藥可通過俘獲氨，并耗盡細菌生長和 生物被膜形成與存活所需的必需BV營養(yǎng)物質(zhì)的陰道微環(huán)境，而中斷該共生關(guān)系。本發(fā)明也涉及治療和/或預(yù)防陰道感染的方法，該方法包括將治療有效量的藥用 組合物給予患者，所述組合物包含硼酸和EDTA。在本發(fā)明的藥用組合物中，硼酸的量優(yōu)選為約0. 0Img-約10g，更優(yōu)選為約 0. Img-約lg，甚至更優(yōu)選為約Img-約250mg。
7
在本發(fā)明的藥用組合物中，EDTA的量優(yōu)選為約0. OOlmg-約lg，更優(yōu)選約 0. Olmg-約 250mg。在一個實施方案中，硼酸對EDTA的相對量以重量計為約1 1-約1000 1。在另一個實施方案中，EDTA與硼酸的相對量為約2 1-100 1。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括將藥用組合物每日一次至每日三次施用至 陰道和/或外陰。在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括將藥用組合物間斷地例如每周兩次施用 至陰道和/或外陰，作為預(yù)防性治療。本發(fā)明的藥用組合物局部施用至患者的陰道和/或外陰。所述藥用組合物可以以下的形式施用栓劑、乳膏劑、軟膏劑、固體(例如，片劑、 膠囊劑、胚珠制劑和栓劑)、溶液劑、混懸劑、凝膠劑、泡沫劑、膜或脂質(zhì)體組合物。乳膏劑和 軟膏劑可例如用水性或油性基質(zhì)來配制，且添加合適的增稠劑和/或膠凝劑。施用本發(fā)明 組合物的一種技術(shù)是利用單次使用的小包(packet)(例如小信封樣結(jié)構(gòu)等)，該小包含預(yù) 定的單一單位劑量。小包最初密封，但在使用時，通過撕裂、切割等，在小包中期望或計劃好 的位置打開，然后，如標記的那樣可直接給予內(nèi)容物。藥用組合物也可包含在陰道環(huán)、棉塞、栓劑、海綿、枕墊、粉撲(puff)或滲透泵系 統(tǒng)內(nèi)。本發(fā)明的藥用組合物可以與其它藥用組合物，例如與甲硝唑共給藥。也可利用各種聚合物、纖維、樹脂、蠟、油或藥物化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員所使用的其 它藥物賦形劑，將藥用組合物的劑型配制成緩釋形式，以產(chǎn)生藥用組合物活性成分的延長 釋放。在一個實施方案中，陰道感染是細菌感染。 在另一個實施方案中，陰道感染是外陰陰道念珠菌病。在還另一個實施方案中，陰道感染是毛滴蟲病。在還另一個實施方案中，陰道感染是病毒感染。如果不適當(dāng)治療，陰道感染可能導(dǎo)致泌尿道感染。因此，在另一個實施方案中，本 發(fā)明涉及泌尿道感染的治療和預(yù)防。在還另一個實施方案中，陰道感染由選自細菌、真菌、寄生蟲和病毒的兩種或多種 病原體引起。當(dāng)用于治療與生物被膜形成相關(guān)的陰道感染時，此類方法和藥用組合物可以與其 它抗微生物療法，包括抗細菌藥、抗真菌藥、抗寄生蟲藥或抗病毒藥組合使用，以增強其抗 微生物效力和/或減少其劑量需要。此外，也可將本發(fā)明的方法和藥用組合物用作其它藥物，例如抗生素、抗真菌藥、 抗寄生蟲藥和抗炎藥的載體材料，因此進一步拓寬了組合物的藥物效力。給予人或低等動物的本發(fā)明組合物的每日總劑量可以為約IOOmg/天-約15g/ 天。更優(yōu)選的劑量可以為約500mg/天-約5g/天。如果需要，為了給藥的目的，可以將每 日有效劑量分成多個劑量；因此，單劑量組合物可包含此類量或其約數(shù)，以組成每日劑量。本發(fā)明也涉及制品，該制品包含包裝材料和在該包裝材料內(nèi)的本發(fā)明藥用組合 物。藥用組合物以足以治療患者的陰道感染和/或破壞致病性陰道生物被膜的量，優(yōu)選以相當(dāng)于至少一個單位劑量的量存在。包裝材料包含標簽，該標簽指示藥用組合物可以用于 治療陰道感染和/或破壞致病性陰道生物被膜。優(yōu)選，標簽包括其它印刷標記例如成分列 表、制造商的名稱和地址等。優(yōu)選包裝材料也包括印刷的插入物，包括負責(zé)藥品管理的政府 機構(gòu)可能要求的關(guān)于組合物的詳細信息、其用于治療致病性陰道生物被膜和陰道感染的給 藥方法、副作用、禁忌癥等標記。如實施例所示，提供的組合物和方法證明本發(fā)明方法和藥用組合物的意外的有利 性質(zhì)。提供的實施例僅用于舉例說明的目的，無意限制本發(fā)明，除非在權(quán)利要求中另外說 明。實施例1通過硼酸和EDTA來破壞白餼念珠菌(C. albicans)和陰道加德納氏菌 (G. vaginalis)牛物被膜A)實驗方法使用CDC 生物膜反應(yīng)器(Biosurface Technologies Corporation)，在體外研究硼 酸和EDTA在各種試驗濃度下，單獨和組合對白色念珠菌(C. albicans)和陰道加德納氏菌 (G. vaginalis)生物被膜的生物被膜破壞作用。實驗在Bozeman，Montana的生物被膜工程 中心進行?；谄渲噩F(xiàn)性和提供抗微生物劑評價所需的一致生物被膜樣品和生長條件的能 力，來選擇CDC生物膜反應(yīng)器方法。作為生物被膜實驗的前奏，利用標準的MIC方法，建立 硼酸和EDTA對兩種試驗生物的浮游生物(即自由漂浮的對生物被膜相關(guān)的)MIC值。與白 色念珠菌(C. albicans)相反，硼酸和EDTA對陰道加德納氏菌(G. vaginalis)的浮游生物 MIC值以前沒有報導(dǎo)。⑶C反應(yīng)器由懸掛于汽門蓋(ported lid)的8個聚碳酸酯取樣管支持器組成。各 支持器容納3個分開的取樣管。將具有取樣管支持器和取樣管的蓋子(Iid)(共24個)裝 入有側(cè)壁排卸孔的1升玻璃容器內(nèi)。通過使液體生長培養(yǎng)基循環(huán)經(jīng)過容器來形成生物被 膜，而混合和剪切力由通過磁性攪拌板旋轉(zhuǎn)的磁性攪拌棒/葉片產(chǎn)生。在與本發(fā)明有關(guān)的生物被膜實驗的制備中，通過將ImL冷凍的儲液添加至9mL生 長培養(yǎng)基(在50% BHI肉湯+1%淀粉中的陰道加德納氏菌(G. vaginalis) ATCC#14018，或 在50% SD肉湯+1%蔗糖中的白色念珠菌(C. albicans) ATCC#96113)，并在37°C溫育24小 時，來制備白色念珠菌(C. albicans)和陰道加德納氏菌(G. vaginalis)的過夜培養(yǎng)物。白 色念珠菌(C. albicans)在常壓條件下生長，而陰道加德納氏菌(G. vaginalis)在加入5% CO2的情況下生長?！┻^夜培養(yǎng)物準備好，就將24個聚碳酸酯取樣管置于⑶C生物膜反應(yīng)器取樣管 支持器內(nèi)，并使用活動扳手固定。然后將流入/流出的管端阻止并夾住，使整個容器高壓 滅菌20分鐘。將合適的培養(yǎng)基直接加入反應(yīng)器內(nèi)，到流出側(cè)臂(約350mL)。反應(yīng)器然后 用4mL的過夜培養(yǎng)物接種。為了有助于最佳的生物被膜生長，使白色念珠菌(C. albicans) 反應(yīng)器在常壓條件下在37°C溫育，且按最低的設(shè)置連續(xù)攪拌24小時。將陰道加德納氏菌 (G. vaginalis)反應(yīng)器置于5% CO2恒溫箱中，且按最低的設(shè)置連續(xù)攪拌120小時。該生物 被膜形成期稱為"分批模式"。在分批模式完成之后，生長培養(yǎng)基開始按lmL/min流動，再 通過蠕動泵持續(xù)流動24小時。下一步，將24個生物被膜覆蓋的取樣管從⑶C反應(yīng)器中無菌移除，并置于24孔板內(nèi)，且各孔含有2mL的試驗溶液。使試驗溶液按一式三份運行，并包括不同濃度的硼酸(BA) 和EDTA或其組合?；谀壳爸委煒藴实挠糜诟髯愿腥镜纳L對照和活性劑對照也包括在 內(nèi)。選擇8 μ g/mL濃度的氟康唑作為白色念珠菌(C. albicans)的治療對照。這表示在生物 流體和組織包括陰道分泌物和組織中達到的藥物水平范圍的較高端(4. 12-8. 08 μ g/mL)， 然后以400mg的最大日劑量口服給予氟康唑(超過目前FDA批準用于陰道念珠菌病的劑 量的兩倍)。用于陰道加德納氏菌(H. vaginalis)的活性劑對照是192 μ g/mL濃度的甲硝 唑。該濃度部分基于在該研究中發(fā)現(xiàn)的甲硝唑?qū)﹃幍兰拥录{氏菌(G. vaginalis)的浮游生 物MIC值(128yg/mL)，并表示落在由其它研究者報導(dǎo)的MIC值的較高端的保守水平。也應(yīng) 注意，該水平比用批準的750mg BV方案(Flagyl ER )所達到的甲硝唑的峰全身水平高超 過8倍。將各試驗溶液溶于適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)，并在使用前過濾滅菌。然后，使板在適當(dāng)?shù)纳L條 件下溫育24小時。在24小時處理期之后，通過除去孔內(nèi)的溶液并添加2mL的無菌磷酸鹽 緩沖鹽水(PBS)，來沖洗所有的取樣管。重復(fù)該操作，總共沖洗兩次。然后，將取樣管無菌轉(zhuǎn) 移至含IOmL無菌PBS的15mL無菌錐形瓶。將管旋渦振蕩30秒，超聲處理2分鐘，然后再 旋渦振蕩30秒。將細胞懸液連續(xù)稀釋，并接種在瓊脂上(白色念珠菌(C. albicans)為SD 瓊脂，陰道加德納氏菌(G. vaginalis)為BHI+1%淀粉)。將板溫育24-48小時，菌落計數(shù)。 結(jié)果報告為每cm2菌落形成單位(cfu)的數(shù)目，和相對于未治療的生物被膜對照，生物被膜 負荷中平均log對數(shù)減少。B)生物被膜破壞在這些實驗中，硼酸和EDTA對已建立的生物被膜顯示顯著的影響，完全超出了活 性劑對照所觀察到的結(jié)果，并始終在有效殺滅所需的3-log閾值以上(即，殺菌活性對抑菌 活性)。事實上，活性劑對照_兩種FDA批準的抗微生物劑-對各自的致病性生物被膜均沒 有可感知的影響。對于白色念珠菌(C. albicans)，如圖2所示，硼酸和EDTA的組合觀察到協(xié)同作用。圖2是舉例說明硼酸和EDTA對白色念珠菌(C. albicans)生物被膜的作用的圖。 如圖2所示，當(dāng)硼酸和EDTA按其浮游生物MIC值(分別為1. 56mg/mL和0. 78mg/mL)組合 時，與較高濃度的各活性劑單獨相比，達到了 3. 67cfu/cm2的生物被膜負荷的最大log對數(shù) 減少。這表示與未治療的生物被膜對照相比，生物被膜負荷減少99. 8%，并顯示硼酸，尤其 是當(dāng)與EDTA組合時，給予抗白色念珠菌(C. albicans)生物被膜的殺真菌活性。這些發(fā)現(xiàn) 是值得注意的，基于硼酸抗浮游生物細胞的弱抑制真菌活性是完全出乎意料的，且意外地 與FDA批準的抗微生物劑抗易感浮游生物病原體所報告的log殺滅率的數(shù)值相符_ 一般在 約2-41og減少的范圍內(nèi)。用硼酸與EDTA的組合抗陰道加德納氏菌(G. vaginalis)生物被膜獲得了清楚的 協(xié)同作用，顯示出甚至更令人印象深刻的結(jié)果。圖3是以生物被膜負荷中l(wèi)og對數(shù)減少來 說明該作用的數(shù)據(jù)圖。40mg/mL濃度的硼酸與10mg/mL濃度的EDTA組合導(dǎo)致陰道加德納 氏菌(G. vaginalis)生物被膜的完全根除，而這些活性劑按其低浮游生物MIC值-分別為 3. 125mg/mL和0. 19mg/mL的組合-與未治療的生物被膜對照比較，導(dǎo)致生物被膜負荷降 低99.7%。形成鮮明的對比，甲硝唑活性劑對照對陰道加德納氏菌(G. vaginalis)生物被 膜幾乎沒有影響，與硼酸和EDTA組合相比，差異相當(dāng)顯著。并且，這些發(fā)現(xiàn)是無先例的，基于硼酸的弱抗微生物性質(zhì)和為該研究建立的這些活性劑抗陰道加德納氏菌(G. vaginalis) 的浮游生物MIC值是不能預(yù)測到的。當(dāng)認為殺菌劑(例如β -內(nèi)酰胺類抗生素)需要其浮游生物的MIC高達1000倍 (或以上)的濃度，以有效抑制按生物被膜生長模式的易感生物時，用本發(fā)明活性劑抗假絲 酵母(Candida)和加德納菌(Gardnerella)生物被膜兩者的浮游生物MIC值獲得的意外的 協(xié)同作用是值得注意的。這些發(fā)現(xiàn)支持所提出的硼酸作為生物被膜破壞劑的作用機制。根據(jù)以下事實，結(jié)果相當(dāng)值得注意基于這些活性劑的相對弱的抗微生物活性和 在該研究中首次建立的抗陰道加德納氏菌(G. vaginalis)的浮游生物MIC值，將不會預(yù)測 到生物被膜破壞。這些數(shù)據(jù)的治療相關(guān)性在于三個方面1)與可利用的療法相比，抗生物被膜相關(guān) 性陰道感染的出色臨床效力；2)由于極低的活性劑濃度和急劇降低的局部和全身暴露風(fēng) 險，患者的安全性改善；和3)發(fā)展繼發(fā)性感染(尤其是外陰陰道念珠菌病)的可能性低，該 繼發(fā)性感染常使陰道炎治療復(fù)雜化。比較實施例為了比較的目的，參考以下研究=Swidsinski等，在口服甲硝唑標準治療之后粘 附的陰道加德納氏菌(Gardnerella vaginalis)生物被膜持續(xù)在陰道上皮上。Am J Obstet Gynecol 2008 ；198(1) 97. el_6，該研究根據(jù)標準口服甲硝唑治療后的陰道活組織檢查評 價BV生物被膜特征。在該研究中，18個BV患者用甲硝唑，每日兩次，口服給予500mg，治 療7天，并使用標準臨床和微生物學(xué)方法評價，以證實診斷和評價臨床反應(yīng)。要求各患者返 回，以便單個跟蹤隨訪，在此她們進行陰道活組織檢查，這允許使用熒光原位雜交技術(shù)的陰 道生物被膜的直接顯影。在治療第3天或治療完成后第7、14、21、28或35天，這6個可能 的時間點之一，婦女被隨機指定返回，以進行跟蹤隨訪。結(jié)果證明，在各時間點，基于標準的臨床和微生物學(xué)方法的BV消退。然而，陰 道活組織檢查結(jié)果顯示了不同的圖像，顯示核心致病性細菌，尤其是陰道加德納氏菌(G vaginalis)和阿托波氏菌(Atopobium)，在粘附的生物被膜中持續(xù)累積，隨著時間變得更 加顯著。尤其是，采用常規(guī)的浮游生物MIC測試，從這些婦女獲得的所有陰道加德納氏菌 (G. vaginalis)分離株對甲硝唑顯示良好的敏感性。這可很好地解釋標準BV治療所報告的 低治愈率，并將這些結(jié)果與這些介入不能有效地破壞潛在的致病性生物被膜進一步聯(lián)系起 來。在該比較實施例中獲得的結(jié)果與在實施例中所顯示的結(jié)果形成明顯對比，顯示用硼酸 和EDTA的組合完全根除陰道加德納氏菌(G. vaginalis)生物被膜，并驗證了甲硝唑的最低 影響。實施例2BV 患、者在復(fù)發(fā)性BV患者組中，進行使用硼酸的回顧性病例調(diào)查。硼酸用作抗微生物劑， 作為6個月連續(xù)治療方案的一部分。為了有資格進行方案治療，所有婦女以前均失敗于甲 硝唑陰道凝膠劑的誘導(dǎo)和長期維持方案，并因此具有高度耐藥性感染。除硼酸之外，所使用的所有其它抗微生物劑也均被FDA批準用于BV。6個月的方 案如下1.誘導(dǎo)口服甲硝嗶或替硝嗶，每日兩次，持續(xù)7-10天
2.硼酸治療每日將600mg明膠膠囊插入陰道，持續(xù)21天3.維持甲硝唑陰道凝膠劑，每周兩次，持續(xù)5個月在6個月結(jié)束時結(jié)果顯示，臨床治愈77% (24/31)的患者-即，對于用于BV的 Amsel氏臨床標準來說無癥狀和陰性。在9個月(即，在維持之后3個月)67%保持治愈。 緩解的持續(xù)時間中位數(shù)是8. 7個月。值得注意的是，在硼酸治療期間沒有發(fā)生治療失敗，且 無患者經(jīng)歷二次酵母感染，或因為不良事件或?qū)Ψ桨傅娜魏谓M分不耐受而中斷。為了進一步驗證這些發(fā)現(xiàn)，在非常頑固性BV婦女中，進行使用硼酸的預(yù)期設(shè)計的 臨床研究。與回顧的病例組相似，硼酸用作抗微生物劑，作為連續(xù)治療方案的一部分；然而， 在該研究中登記的婦女不同于以下病例組中的那些在這些病例組中，她們的感染對治療 甚至更具有抗性_在登記之前的12個月內(nèi)，所有的婦女均在至少三種以前的抑制性方案中 失敗。同樣，所有患者均具有充分的感染癥狀，有惡臭排出物，并符合所有四種臨床診斷標 準(Amsel氏)，包括在陰道濕載片(mount)檢查中有彡20%的線索細胞。總共58個患者采用標準口服劑量的硝基咪唑治療(甲硝唑或替硝唑)，進行"開 放式(open label)“治療，每日兩次，持續(xù)7天，然后，每日將600mg硼酸明膠膠囊插入陰 道，持續(xù)21天。然后，將確定為臨床治愈的患者置于甲硝唑陰道凝膠劑的維持方案，每周兩 次，再持續(xù)最長達5個月。在硝基咪唑/硼酸誘導(dǎo)之后，8%的低臨床失敗率早就顯示令人印象深刻的結(jié)果。 類似地，在甲硝唑凝膠劑維持時，突破性感染格外低，僅12%。如圖4所示，在12、16和28 周之后，在這些頑固性病例中，累積的治愈比意外地高-分別是87%、78%和65%。同樣， 緩解的持續(xù)時間中位數(shù)是9個月，這與在初始病例組中所記錄的相似(8.7個月)。當(dāng)與用標準療法治療的原發(fā)性、非并發(fā)性BV婦女所報告的30% -70%短期治愈 率，和在9個月內(nèi)復(fù)發(fā)的高度可能性-最高達80%并列出現(xiàn)時，這些發(fā)現(xiàn)最令人印象深刻。比較實施例為了比較的目的，參考Sobel JD等，用0. 75%甲硝唑陰道凝膠劑抑制療法來預(yù)防 再發(fā)生細菌性陰道病，Am J Obstet Gynecol 2006 ;194 :1283_1290，該文獻報告了在復(fù)發(fā) BV的婦女中，更嚴格的甲硝唑陰道凝膠劑對照臨床研究的結(jié)果，使用與以上實施例所述相 似的治療方案，但不含硼酸。該研究涉及10天甲硝唑陰道凝膠劑誘導(dǎo)期，然后是4個月、每周兩次的維持方案， 和3個月無治療的跟蹤期。在4個月的維持期結(jié)束時，臨床治愈了 74. 5% (38/51)的患者。 然而，在維持之后的3個月，保持治愈的概率僅為34%，且緩解的持續(xù)時間中位數(shù)為4-5個 月(相對于在實施例中8. 7-9個月)。在維持期期間發(fā)生的突破性感染比率是25%。這與 在實施例中所報告的(低于其一半，為12% )形成了鮮明的對比。此外，在比較實施例中， 59. 3%的婦女在研究期間的某一點需要VVC的抗真菌治療，而在病例組中，無婦女具有二 次酵母感染工。實施例與比較實施例之間的差異是顯著的，特別是考慮到這些患者中有許多是因 為甲硝唑陰道凝膠劑的更嚴格的對照維持研究失敗而招募的。在實施例中硼酸的相對貢獻 及其作用機制仍然未知，但給體外發(fā)現(xiàn)提供了臨床支持，在該體外發(fā)現(xiàn)中硼酸具有治療相 關(guān)性生物被膜破壞性質(zhì)，該性質(zhì)由于添加EDTA而增強。在實施例中記錄到的沒有并發(fā)VVC 可能與硼酸的抗真菌活性有關(guān)，并代表了硼酸優(yōu)于目前批準的BV療法的另一個重要優(yōu)點。
1說明在實施例的預(yù)期部分中，將一些患者置于預(yù)防性抗真菌治療中，這預(yù)先排 除了該并發(fā)癥的準確評價。
權(quán)利要求
一種用于治療和/或預(yù)防陰道感染和/或致病性陰道生物被膜的藥用組合物，所述藥用組合物包含硼酸和乙二胺四乙酸(EDTA)。
2.權(quán)利要求1的藥用組合物，所述藥用組合物還包含生物活性劑，所述生物活性劑選 自香檸檬油、茶樹油或其它精油、鋅離子和鎵。
3.權(quán)利要求1的藥用組合物，所述藥用組合物還包含添加劑，所述添加劑選自膠凝劑、 緩沖劑、防腐劑、表面活性劑、去污劑、油、醇、乳化劑、增溶劑、濕潤劑和生物粘附劑。
4.權(quán)利要求1的藥用組合物，所述藥用組合物還包含適用于陰道和/或外陰給藥的藥 學(xué)上可接受的載體。
5.權(quán)利要求1的藥用組合物，所述藥用組合物還包含另外的治療活性物質(zhì)。
6.權(quán)利要求1的藥用組合物，其中硼酸的量為約0.Olmg-約10g。
7.權(quán)利要求1的藥用組合物，其中硼酸的量為約Img-約250mg。
8.權(quán)利要求1的藥用組合物，其中EDTA的量為約0.OOlmg-約lg。
9.權(quán)利要求1的藥用組合物，其中EDTA的量為約0.Olmg-約250mg。
10.權(quán)利要求1的藥用組合物，其中硼酸對EDTA的相對量以重量計為約1 1-約 1000 1。
11.一種用于治療和/或預(yù)防陰道感染和/或致病性陰道生物被膜的方法，所述方法包 括在無任何治療量的乙酸存在下，將治療有效量的硼酸給予有需要的患者。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述硼酸治療感染，所述感染選自細菌感染、外陰陰道念 珠菌病、毛滴蟲病、病毒感染、混合感染和泌尿道感染。
13.權(quán)利要求11的方法，所述方法還包括給予生物活性劑，所述生物活性劑選自香檸 檬油、茶樹油或其它精油、鋅離子和鎵。
14.權(quán)利要求11的方法，其中將所述硼酸局部施用至陰道和/或外陰。
15.權(quán)利要求11的方法，其中所述硼酸以以下形式局部施用乳膏劑、軟膏劑、凝膠劑、 片劑、膠囊劑、胚珠制劑、栓劑、溶液劑、混懸劑、泡沫劑、膜或脂質(zhì)體組合物，或包含在陰道 環(huán)、棉塞、栓劑、海綿、枕墊、粉撲或滲透泵系統(tǒng)內(nèi)。
16.權(quán)利要求11的方法，所述方法還包括給予EDTA。
17.一種用于治療和/或預(yù)防陰道感染和/或致病性陰道生物被膜的方法，所述方法包 括將組合物給予有需要的患者，所述組合物包含治療有效量的硼酸和EDTA。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述組合物治療感染，所述感染選自細菌感染、外陰陰道 念珠菌病、毛滴蟲病、病毒感染、混合感染和泌尿道感染。
19.權(quán)利要求17的方法，所述方法還包括給予生物活性劑，所述生物活性劑選自香檸 檬油、茶樹油或其它精油、鋅離子和鎵。
20.權(quán)利要求17的方法，其中將所述硼酸局部施用至陰道和/或外陰。
21.權(quán)利要求18的方法，其中硼酸的量約為其用于感染的浮游生物MIC值，且EDTA的 量約為其用于感染的浮游生物MIC值。
22.—種制品，所述制品包括包裝材料和在所述包裝材料內(nèi)的權(quán)利要求1的藥用組合物。
全文摘要
本發(fā)明總體涉及用于治療致病性陰道生物被膜的方法和組合物。更具體地講，本發(fā)明涉及包含硼酸和二乙胺四乙酸(EDTA)組合的藥用組合物和使用此類組合物治療或預(yù)防生物被膜形成的方法，該生物被膜形成與陰道感染例如細菌性陰道病(BV)、外陰陰道念珠菌病(VVC)、毛滴蟲病或混合感染有關(guān)。
文檔編號A61K8/00GK101951868SQ200880126280
公開日2011年1月19日 申請日期2008年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月30日
發(fā)明者D·弗林, S·戈頓 申請人:托爾特克制藥有限責(zé)任公司