專(zhuān)利名稱：用于給藥蛋白質(zhì)和肽的局部用組合物的制作方法
用于給藥蛋白質(zhì)和肽的局部用組合物技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明的各個(gè)方面涉及用于穩(wěn)定、儲(chǔ)存和輸送蛋白質(zhì)和肽(特別是肝細(xì)胞生長(zhǎng)因 子(HGF)及其變異體)的組合物和方法，以及使用該穩(wěn)定化的組合物抑制、改善或治療人體 疾病(例如皮膚潰瘍和皮膚癌或癌前病癥)的方法。
背景技術(shù)：
基于蛋白質(zhì)/肽的藥物存在給藥的獨(dú)特問(wèn)題。蛋白質(zhì)/肽易于在胃腸道變性使其 不利于經(jīng)口施用。因此基于蛋白質(zhì)/肽的藥物通常通過(guò)無(wú)菌注射溶液的形式進(jìn)行全身施 用。由于蛋白質(zhì)/肽在血流中具有非常短的藥代動(dòng)力學(xué)半衰期、很快被代謝和清除掉，所以 腸外施用也是無(wú)效的。因此，許多研究者試圖開(kāi)發(fā)替代的方法來(lái)穩(wěn)定化、儲(chǔ)存和輸送基于蛋 白質(zhì)/肽的藥劑。
在傳統(tǒng)的創(chuàng)傷治療(例如，術(shù)后或治療皮膚潰瘍)中，是將包含蛋白質(zhì)/肽的無(wú)菌 溶液注入創(chuàng)傷位點(diǎn)。在這些應(yīng)用中，溶液的低粘度使給藥變得復(fù)雜，并且溶解的蛋白質(zhì)/肽 容易降解，在儲(chǔ)存過(guò)程中尤其是如此。已經(jīng)描述了制造這樣的基于蛋白質(zhì)/肽的藥劑，其中 有效成分以固體粉末的形式存在，其在接觸到液體時(shí)會(huì)形成半固體制劑(例如，參見(jiàn)美國(guó) 專(zhuān)利No. 5，192，743，其全文以引用的方式明確地并入本文)。然而，目前包含敏感蛋白質(zhì)/ 肽的重構(gòu)形式的產(chǎn)品通常穩(wěn)定性較差，當(dāng)產(chǎn)品在室溫下儲(chǔ)存時(shí)尤其是如此。
本領(lǐng)域的研究者要面對(duì)的另一個(gè)難題涉及這些產(chǎn)品對(duì)開(kāi)放性傷口的臨床應(yīng)用。也 就是說(shuō)，許多開(kāi)放性傷口(包括皮膚潰瘍、磨損、美容損傷或裂傷)包含有各種病原體(例 如細(xì)菌、真菌或其他病菌或微生物)，其中一些對(duì)傳統(tǒng)治療方法(例如抗生素治療)具有耐 藥性。病原體的種類(lèi)往往是“病患來(lái)源”，并不會(huì)引起全身性感染，但病原體的存在足以防止 創(chuàng)傷愈合。例如，其中一些病原體產(chǎn)生的蛋白酶能降解藥劑中存在的蛋白質(zhì)/肽。
基于蛋白質(zhì)/肽的產(chǎn)品的穩(wěn)定性較差與制劑中存在的脂質(zhì)和表面活性劑有關(guān)， 該脂質(zhì)和表面活性劑與蛋白質(zhì)或肽相互作用，從而改變分子結(jié)構(gòu)，并且降低或抑制蛋白質(zhì) 或肽的功能。少量脂質(zhì)和表面活性劑可以改變蛋白質(zhì)或肽的三維結(jié)構(gòu)，從而降低產(chǎn)品功 效。例如，已經(jīng)證實(shí)嬰兒配方乳中存在的甘油一酸酯可以降低產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性(例如，參見(jiàn) McSweeney 等，F(xiàn)ood Hydrocolloids，第 22 卷，第 5 期，2008 年 7 月，第 888-898 頁(yè))。
基于蛋白質(zhì)/肽的產(chǎn)品的穩(wěn)定性較差也使人們很難準(zhǔn)確地提供治療劑量的該產(chǎn) 品。也就是說(shuō)，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)或肽(有效成分)的降解和不穩(wěn)定速度可能因患者不同而不同， 所以難以配制安全有效的基于蛋白質(zhì)/肽的產(chǎn)品。通常情況下，這些問(wèn)題通過(guò)提供更多有 效成分(過(guò)量)解決，但是這種方法是有害的，在其中產(chǎn)品的藥理學(xué)活性在有效成分濃度增 加時(shí)與低濃度時(shí)表現(xiàn)不同的制劑中尤其是如此。
目前包含肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)的產(chǎn)品就是這種情況。已知HGF能促進(jìn)正常上皮 細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且能提高細(xì)胞活力(例如，參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利似.5，342，831;1994年8月30日 授權(quán))。雖然包含HGF的創(chuàng)傷治療產(chǎn)品已經(jīng)被研究了近20年，但這些產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)一直受到 分子的穩(wěn)定性較差及其獨(dú)特生物學(xué)性質(zhì)所阻礙。HGF是一種相對(duì)不穩(wěn)定的分子，其在血液中的半衰期只有大約10分鐘(例如，參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No. 7，247，620 ；2007年7月M日授權(quán))。 HGF的刺激活性似乎是濃度依賴的，其中，所觀察的最大細(xì)胞增殖濃度是2. 5和5ng/ml，并 且據(jù)報(bào)道更高濃度是無(wú)效的(例如，參見(jiàn)Bussolino等J.of Cell Biol.第119卷，第3期， 629-641(1992))。這些因素導(dǎo)致本領(lǐng)域內(nèi)的人員得出的結(jié)論是特異性的、有效的施用HGF 蛋白的方法，有效劑量等還尚未被發(fā)現(xiàn)(例如，參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No. 7，247, 620 ；2007年7月M 日授權(quán))。因此，顯然應(yīng)開(kāi)發(fā)穩(wěn)定化的基于蛋白質(zhì)/肽的藥劑的新制劑，特別是包含HGF的 穩(wěn)定化制劑。
發(fā)明概述
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可以通過(guò)包含有效量的結(jié)晶性甘油一酸酯(例如α或β-結(jié)晶性甘油 一酸酯)來(lái)穩(wěn)定基于蛋白質(zhì)/肽的藥劑、特別是包含HGF的制劑中的蛋白質(zhì)/肽(“有效成 分”)，所述結(jié)晶性甘油一酸酯可以具有10、11、12、13、14、15、16、17或18碳的碳鏈長(zhǎng)度，最 好是10-16碳(例如12、13、14、15或16碳)的碳鏈長(zhǎng)度，優(yōu)選12、13或14碳的碳鏈長(zhǎng)度， 最優(yōu)選12或14碳的碳鏈長(zhǎng)度。因此，本文所描述的發(fā)明的各方面涉及一種組合物，其包含 蛋白質(zhì)或肽(例如，HGF分子，如全長(zhǎng)HGF或dHGF(HGF的天然五氨基酸截短型)或其他天然 HGF分子或其變異體(例如NK1、dNKl、NK2、dNK2、NK3、dNK3、NK4或dNK4))，以及一種或多 種甘油一酸酯的混合物，該甘油一酸酯在溫度大于或等于15°C、最好大于或等于20°C、優(yōu) 選大于或等于23°C時(shí)保持為結(jié)晶形式，所述甘油一酸酯例如為α和/或結(jié)晶甘油一酸 酯，其在溫度大于或等于 15°C、16°C、17°C、18°C、19°C、20°C、2rC、22°C、23°C、24°C、25°C、 26 °C >27 °C >28 °C >29 °C >30 °C >31 °C >32 °C >33 °C >34 °C >35 °C >36 °C >37 °C >38 °C >39 °C >40 °C > 41°〇或421時(shí)基本上保持為結(jié)晶形式，例如，結(jié)晶大于或等于50%、55%、60%、65%、 70 %、75 %、80 %、85 %、90 %或95 %。換句話說(shuō)，本文公開(kāi)的所述組合物和方法利用基于蛋 白質(zhì)/肽的制劑(例如，包含HGF蛋白的制劑，所述HGF蛋白例如為重組天然全長(zhǎng)HGF或 dHGF或其重組天然變異體，例如NK1、dNKl、NK2、dNK2、NK3、dNK3、NK4或dNK4)，以及一種 或多種甘油一酸酯(例如，α和/或β-結(jié)晶性甘油一酸酯，其具有10、11、12、13、14、15、 16、17或18碳的碳鏈長(zhǎng)度，優(yōu)選12或14碳的碳鏈長(zhǎng)度)的混合物，所述甘油一酸酯在溫 度小于或等于421、411、401、391、381、371、361、351、341、331、321、311、301、 29°C、28°C、27°C、26°C、25°C、24°C、23°C、22°C、2rC、20°C、19°C、18°C、17°C、16°C 或 15°C、 優(yōu)選為皮膚溫度時(shí)保持為結(jié)晶形式。本發(fā)明還涵蓋制備和使用上述組合物的方法(例如， 改善、改良或促進(jìn)創(chuàng)傷或皮膚癌或癌前疾病治愈的方法)。
一些實(shí)施方案還包含局部麻醉藥(例如布比卡因)，以便與結(jié)晶性甘油一酸酯組 合來(lái)增強(qiáng)抗菌效果。也就是說(shuō)，在一些制劑中，可以預(yù)期到在包含結(jié)晶性甘油一酸酯的含蛋 白質(zhì)/肽的產(chǎn)品中加入局部麻醉藥(例如布比卡因)能夠提供增強(qiáng)或協(xié)同的抗菌效果，以 及更穩(wěn)定化的蛋白質(zhì)/肽，其中所述甘油一酸酯例如為α或β-結(jié)晶性甘油一酸酯，其可 具有10、11、12、13、14、15、16、17或18碳的碳鏈長(zhǎng)度，最好是10-16碳(例如12、13、14、15 或16碳)的碳鏈長(zhǎng)度，優(yōu)選12、13或14碳的碳鏈長(zhǎng)度，最優(yōu)選12或14碳的碳鏈長(zhǎng)度。優(yōu) 選的是，所含局部麻醉劑的量低于所需的局部麻醉劑的量。換句話說(shuō)，在一些實(shí)施方案中， 本文所公開(kāi)的組合物和方法利用基于蛋白質(zhì)/肽的制劑(例如，包含HGF蛋白的制劑，所 述HGF蛋白例如為重組天然的全長(zhǎng)HGF或dHGF或其重組天然變異體，例如NKl、dNKl、NK2、 dNK2、NK3、dNK3、NK4或dNK4)，以及一種或多種甘油一酸酯(例如，α禾口 /或β -結(jié)晶性甘油一酸酯，其具有10、11、12、13、14、15、16、17或18碳的碳鏈長(zhǎng)度，優(yōu)選12或14碳的碳 鏈長(zhǎng)度)的混合物，所述甘油一酸酯在溫度小于或等于42°C、4rC、40°C、39°C、38°C、37°C、 36 °C >35 °C >34 °C >33 °C >32 °C >31 °C >30 °C >29 °C >28 °C >27 °C >26 °C >25 °C >24 °C >23 °C >22 °C > 21°C、20°C、19°C、18°C、17°C、16°C或15°C、優(yōu)選為皮膚溫度時(shí)保持為結(jié)晶形式，并且，其還包含治療量的局部麻醉藥(例如布比卡因)，該局部麻醉藥的濃度可以為或低于局部麻醉所需的量。
除了所述局部麻醉藥(例如，布比卡因)之外或代替所述局部麻醉藥，其他實(shí)施方 案還包含至少一種抗病原化合物以及所述的至少一種結(jié)晶性甘油一酸酯。在本發(fā)明的某 些方面，布比卡因本身就是抗病原化合物，并且沒(méi)有提供其他抗菌劑；在其他制劑中，提供 了布比卡因以外的其它抗病原化合物。在一些實(shí)施方案中，除了布比卡因以外或代替布比 卡因，上述組合物還包含這樣的抗病原化合物，其選自由酰胺型局部麻醉藥、尿素、咪唑衍 生物、硝基咪唑衍生物、具有3-6個(gè)碳原子的二醇、抗生素以及抗真菌組合物所組成的組。 也就是說(shuō)，本發(fā)明的各方面除了包含結(jié)晶性甘油一酸酯(例如，α或β-結(jié)晶性甘油一酸 酯，其具有10、11、12、13、14、15、16、17或18碳的碳鏈長(zhǎng)度，最好是10-16碳(例如12、13、 14、15或16碳)的碳鏈長(zhǎng)度，優(yōu)選12、13或14碳的碳鏈長(zhǎng)度，最優(yōu)選12或14碳的碳鏈長(zhǎng) 度)的含蛋白質(zhì)/肽的產(chǎn)品外，還包含抗病原化合物，該抗病原化合物選自由酰胺型局部麻 醉藥、尿素、咪唑衍生物、硝基咪唑衍生物、具有3-6個(gè)碳原子的二醇、抗生素和抗真菌組合 物所組成的組，并且所述的方面還可任選地包含局部麻醉藥(例如布比卡因)。換句話說(shuō)， 在一些實(shí)施方案中，本文公開(kāi)的組合物和方法利用基于蛋白質(zhì)/肽的制劑(例如，包含HGF 蛋白的制劑，所述HGF蛋白例如重組天然全長(zhǎng)HGF或dHGF或其重組天然變異體，例如NKl、 dNKl、NK2、dNK2、NK3、dNK3、NK4或dNK4)，以及一種或多種甘油一酸酯(例如，α和/或 β-結(jié)晶性甘油一酸酯，其具有12、13、14、15、16、17或18碳的碳鏈長(zhǎng)度)的混合物，所述 甘油一酸酯在溫度小于或等于421、411、401、391、381、371、361、351、341、331、 32 0C >310C >30 0C >29 0C >28 0C >27 0C >26 0C >25 0C >24 0C >23 0C >22 0C >210C >20 0C >19 0C >18 0C > 17°C、16°C或15°C、優(yōu)選皮膚溫度時(shí)保持為結(jié)晶性形式，并且所述的組合物和方法除了局部 麻醉藥(例如布比卡因)之外或代替局部麻醉藥，還包括抗病原化合物，其選自由酰胺型局 部麻醉藥、尿素、咪唑衍生物、硝基咪唑衍生物、具有3-6個(gè)碳原子的二醇、抗生素和抗真菌 組合物所組成的組。
一些實(shí)施方案還包含一種或多種增粘劑。優(yōu)選的增粘劑包括(但不限于)選自 由羥乙基纖維素、甲基纖維素、羥丙基纖維素、羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素(E464)和 羥乙基甲基纖維素組成的組中的纖維素衍生物。也就是說(shuō)，一些實(shí)施方案除了包含結(jié)晶性 甘油一酸酯(例如，α或β-結(jié)晶性甘油一酸酯，其可具有10、11、12、13、14、15、16、17或 18碳的碳鏈長(zhǎng)度，最好是10-16碳(例如12、13、14、15或16碳)的碳鏈長(zhǎng)度，優(yōu)選12、13 或14碳的碳鏈長(zhǎng)度，最優(yōu)選12或14碳的碳鏈長(zhǎng)度)的含蛋白質(zhì)/肽的產(chǎn)品外，還包括增 粘劑，例如選自由羥乙基纖維素、甲基纖維素、羥丙基纖維素、羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖 維素(Ε464)和羥乙基甲基纖維素組成的組中的纖維素衍生物，該實(shí)施方案還可任選地包 含局部麻醉藥(例如布比卡因)和/或抗病原化合物，該抗病原化合物選自由酰胺型局部 麻醉藥、尿素、咪唑衍生物、硝基咪唑衍生物、具有3-6個(gè)碳原子的二醇、抗生素和抗真菌組 合物所組成的組。換句話說(shuō)，在一些實(shí)施方案中，本文公開(kāi)的所述組合物和方法利用基于蛋白質(zhì)/肽的制劑(例如，包含HGF蛋白的制劑，如重組天然全長(zhǎng)HGF或dHGF或其重組天然 變異體，例如NKl、dNKl、NK2、dNK2、NK3、dNK3、NK4或dNK4)，以及一種或多種甘油一酸酯 (例如，α和/或β-結(jié)晶性甘油一酸酯，其具有10、11、12、13、14、15、16、17或18碳，優(yōu) 選12或14碳的碳鏈長(zhǎng)度)的混合物，所述甘油一酸酯在溫度小于或等于42°C、4rC、40°C、 39 °C >38 °C >37 °C >36 °C >35 °C >34 °C >33 °C >32 °C >31 °C >30 °C >29 °C >28 °C >27 °C >26 °C >25 °C > 、23°C、22°C、21°C、20°C、19°C、18 °C、17°C、16°C 或 15°C、優(yōu)選皮膚溫度時(shí)保持為結(jié)晶形 式，并且所述組合物或方法還包括增粘劑，例如選自由羥乙基纖維素、甲基纖維素、羥丙基 纖維素、羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素(E464)和羥乙基甲基纖維素組成的組中的纖維 素衍生物，并且其任選地包括抗病原化合物(其選自由酰胺型局部麻醉藥、尿素、咪唑衍生 物、硝基咪唑衍生物、具有3-6個(gè)碳原子的二醇、抗生素和抗真菌組合物所組成的組)和/ 或可任選的局部麻醉藥(例如布比卡因)。
在許多實(shí)施方案中，所述組合物是干態(tài)粉末，在其他實(shí)施方案中，所述組合物是重 構(gòu)凝膠或乳膏。在一些實(shí)施方案中，所述重構(gòu)凝膠或乳膏通過(guò)混合包含至少一種結(jié)晶性甘 油一酸酯和增粘劑的干態(tài)粉末與包含蛋白質(zhì)/肽、優(yōu)選為HGF蛋白的液體而獲得，其中，所 述HGF蛋白例如為重組天然全長(zhǎng)HGF或dHGF (HGF的五氨基酸截短型)或其重組天然變異 體(例如NKl、dNKl、NK2、dNK2、NK3、dNK3、NK4或dNK4)，并且所述結(jié)晶性甘油一酸酯例如 為α和/或β-結(jié)晶性甘油一酸酯，其具有10、11、12、13、14、15、16、17或18碳的碳鏈長(zhǎng) 度，最好是10-16碳(例如12、13、14、15或16碳)的碳鏈長(zhǎng)度，優(yōu)選12、13或14碳的碳鏈 長(zhǎng)度，最優(yōu)選12或14碳的碳鏈長(zhǎng)度，并且所述結(jié)晶性甘油一酸酯在溫度小于或等于42°C、 41 °C >40 °C >39 °C >38 °C >37 °C >36 °C >35 °C >34 °C >33 °C >32 °C >31 °C >30 °C >29 °C >28 °C >27 °C > 26°C、25°C、24°C、23°C、22°C、21°C、20°C、19°C、18°C、17°C、16°C 或 15°C、優(yōu)選皮膚溫度時(shí)保 持為結(jié)晶形式。
在其他實(shí)施方案中，所述重構(gòu)是在多室設(shè)備內(nèi)部進(jìn)行的，其中通過(guò)以下的包封設(shè) 備使組合物的干態(tài)部分與組合物的液體部分相接觸，所述包封設(shè)備被構(gòu)造為允許不同室的 內(nèi)容物之間在需要時(shí)(例如在擠壓、反轉(zhuǎn)或破壞封口時(shí))接觸而禁止其與環(huán)境接觸(例如 保持封閉/無(wú)菌體系)。一種預(yù)期的設(shè)備是帶有兩個(gè)內(nèi)部小室的袋子，其在壓力下可破裂， 從而允許小室中的成分混合并且啟動(dòng)重構(gòu)反應(yīng)。
本發(fā)明的多個(gè)方面還包括制備和使用上述組合物的方法。作為一種方法，通過(guò)提 供包含蛋白質(zhì)或肽和至少一種甘油一酸酯(例如α和/或結(jié)晶性甘油一酸酯，其具有 10、11、12、13、14、15、16、17或18碳，優(yōu)選12或14碳的碳鏈長(zhǎng)度)的溶液、并且干燥所述溶 液以形成干顆粒，來(lái)制備本文所述的組合物，其中所述干燥過(guò)程保持甘油一酸酯的結(jié)晶結(jié) 構(gòu)，所述蛋白質(zhì)或肽例如為HGF蛋白，如全長(zhǎng)HGF或dHGF(HGF的五氨基酸截短型)或其變 異體(例如NKl、dNKl、NK2、dNK2、NK3、dNK3、NK4或dNK4)，所述甘油一酸酯在和/或低于 體溫時(shí)保持為結(jié)晶形式，并且在溫度小于或等于42°C、41°C、40°C、39°C、38°C、37°C、36°C、 35 °C >34 °C >33 °C >32 °C >31 °C >30 °C >29 °C >28 °C >27 °C >26 °C >25 °C >24 °C >23 °C >22 °C >21 °C > 20°C、19°C、18°C、17°C、16°C或15°C，優(yōu)選皮膚溫度時(shí)保持為結(jié)晶形式?？梢允褂煤芏嗫捎?的干燥方法來(lái)制備本文所述的一種或多種制劑。優(yōu)選的是，干燥過(guò)程中的溫度不超過(guò)甘油 一酸酯晶體的熔點(diǎn)。在一些方法中，方法中使用的所述溶液還包含增粘劑，例如選自由羥乙 基纖維素、甲基纖維素、羥丙基纖維素、羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素(E464)和羥乙基甲基纖維素組成的組中的纖維素衍生物。一些實(shí)施方案的方法還使用這樣的溶液，其包含 至少一種單獨(dú)的或與所述至少一種結(jié)晶性甘油一酸酯組合的抗病原化合物。在優(yōu)選的方法 中，所述抗病原化合物是布比卡因；然而，所述抗病原化合物可選自由酰胺型局部麻醉藥、 尿素、咪唑衍生物、硝基咪唑衍生物和具有3-6個(gè)碳原子的二醇組成的組。
作為另一種合成方法，將包含至少一種在體溫時(shí)和/或低于體溫時(shí)保持為結(jié)晶形 式的甘油一酸酯的溶液與增粘劑(例如羥乙基纖維素、甲基纖維素、羥丙基纖維素、羧甲基 纖維素、羥丙基甲基纖維素(E464)或羥乙基甲基纖維素)相組合，并且將該混合物以保持 甘油一酸酯的β-結(jié)晶結(jié)構(gòu)的方式干燥，以形成干顆粒，其中所述甘油一酸酯例如為α或 β-結(jié)晶性甘油一酸酯，其可具有10、11、12、13、14、15、16、17或18碳的碳鏈長(zhǎng)度，最好是 10-16碳(例如12、13、14、15或16碳)的碳鏈長(zhǎng)度，優(yōu)選12、13或14碳的碳鏈長(zhǎng)度，最優(yōu) 選12或14碳的碳鏈長(zhǎng)度。接下來(lái)，提供包含蛋白質(zhì)或肽(例如HGF蛋白，如全長(zhǎng)HGF或 dHGF (HGF的五氨基酸截短型))或其變異體(例如NKl、dNKl、NK2、dNK2、NK3、dNK3、NK4或 dNK4)的液體，并且在保留所述至少一種甘油一酸酯的結(jié)晶結(jié)構(gòu)的條件下，將包含蛋白質(zhì)或 肽的所述液體與包含所述至少一種甘油一酸酯和增粘劑的干顆粒組合。作為一些方法，該 方法使用了增粘劑，所述增粘劑為選自由羥乙基纖維素、甲基纖維素、羥丙基纖維素、羧甲 基纖維素、羥丙基甲基纖維素(E464)和羥乙基甲基纖維素組成的組中的纖維素衍生物?？?任選的是，這些方法中使用的溶液還包含至少一種單獨(dú)的或與所述至少一種結(jié)晶性甘油一 酸酯組合的抗病原化合物。優(yōu)選的是，所述抗病原化合物是布比卡因；然而，所述抗病原化 合物可選自由酰胺型局部麻醉藥、尿素、咪唑衍生物、硝基咪唑衍生物和具有3-6個(gè)碳原子 的二醇組成的組。
本文所述的組合物能夠用于改善或改良皮膚狀況，或恢復(fù)對(duì)象的青春外貌的方法 中。作為一種方法，確認(rèn)需要改善或改良皮膚狀況或恢復(fù)所述對(duì)象的青春外貌的制劑的對(duì) 象，并且將一種或多種上述的組合物提供給所確認(rèn)的對(duì)象?？赏ㄟ^(guò)臨床評(píng)價(jià)或診斷測(cè)試或 觀察來(lái)確認(rèn)需要改善或改良皮膚狀況或恢復(fù)所述對(duì)象的青春外貌的制劑的對(duì)象，如本領(lǐng)域 常規(guī)進(jìn)行的那樣。在一些實(shí)施方案中，本文所述組合物被用于治療、預(yù)防、改善或改良皮膚 狀況，例如慢性糖尿病性皮膚潰瘍、裂傷、創(chuàng)傷、褥瘡、褥瘡性潰瘍、壓迫性壞疽或美容缺陷。 在更多實(shí)施方案中，本文所述組合物被用于改善對(duì)象的青春外貌，或改良對(duì)象的皺紋?？扇?選的是，在應(yīng)用一種或多種所實(shí)施的組合物之后，可以通過(guò)對(duì)皮膚狀況或青春外貌的改善 或改良狀況進(jìn)行常規(guī)的診斷或臨床評(píng)價(jià)或觀察，來(lái)測(cè)量皮膚狀況的改善或改良情況，或青 春外貌的恢復(fù)情況。
因此，在本發(fā)明的一些方面中，還考慮了使用包含蛋白質(zhì)或肽、結(jié)晶性甘油一酸 酯、可任選的增粘劑以及可任選的酰胺型局部麻醉藥、尿素、咪唑衍生物、硝基咪唑衍生物 或具有3-6個(gè)碳原子的二醇(例如布比卡因)的混合物，來(lái)制備用于改善、改良或治療皮膚 疾病或用于恢復(fù)青春外貌(例如潰瘍、糖尿病性潰瘍、裂傷、穿刺、磨損、美容磨損、褥瘡、褥 瘡性潰瘍、壓迫性壞疽、燒傷、術(shù)后創(chuàng)傷、美容重建、牛皮癬、毛發(fā)生長(zhǎng)、除皺、皮膚張緊、皮膚 腫瘤形成、基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌、黑色素瘤或癌前皮膚疾病，如光化性角化病)的藥物， 其中所述蛋白或肽例如為HGF蛋白，如全長(zhǎng)HGF或dHGF(HGF的五氨基酸截短型)或其變異 體(例如NKl、dNKl、NK2、dNK2、NK3、dNK3、NK4或dNK4)，所述結(jié)晶性甘油一酸酯例如為α 或β-結(jié)晶性甘油一酸酯，其具有10、11、12、13、14、15、16、17或18碳的碳鏈長(zhǎng)度，最好是10-16碳(例如12、13、14、15或16碳)的碳鏈長(zhǎng)度，優(yōu)選12、13或14碳的碳鏈長(zhǎng)度，最優(yōu) 選12或14碳的碳鏈長(zhǎng)度，并且所述增粘劑例如為羥乙基纖維素、甲基纖維素、羥丙基纖維 素、羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素(E464)或羥乙基甲基纖維素。
因此，本文所述的一些實(shí)施方案包括穩(wěn)定化的蛋白質(zhì)組合物，其包含具有生物活 性的蛋白質(zhì)或肽，以及至少一種熔融溫度大于或等于20°C的甘油一酸酯。在一些實(shí)施方案 中，所述蛋白質(zhì)是天然的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)的重組形式，并且在一些實(shí)施方案中，所述 天然的HGF的重組形式是HGF的五氨基酸截短型(dHGF)，或選自由NKl、dNKl、NK2、dNK2、 NK3、dNK3、NK4或dNK4組成的組中的天然HGF。在一些上述組合物中，甘油一酸酯的熔融溫 度大于或等于25°C、大于或等于30°C或大于或等于35°C。在一些上述實(shí)施方案中，除了至 少一種甘油一酸酯以外，所述組合物還包含抗病原劑。在一些實(shí)施方案中，抗病原劑選自由 酰胺型局部麻醉藥、尿素、咪唑衍生物、硝基咪唑衍生物和具有3-6個(gè)碳原子的二醇組成的 組，并且在一些實(shí)施方案中，抗病原劑是布比卡因。上述組合物還可包含增粘劑，例如選自 由羥乙基纖維素、甲基纖維素、羥丙基纖維素、羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素(E464)和 羥乙基甲基纖維素組成的組中的纖維素衍生物，并且在上述的一些實(shí)施方案中，至少一種 甘油一酸酯具有10、11、12、13、14、15或16碳的碳鏈長(zhǎng)度，優(yōu)選12或14碳的碳鏈長(zhǎng)度。
本文所述的多個(gè)實(shí)施方案涉及穩(wěn)定化的蛋白質(zhì)組合物，其包含配制有β -結(jié)晶性 甘油一酸酯(其具有10、11、12、13、14、15或16碳，優(yōu)選12或14碳的碳鏈長(zhǎng)度)的dHGF 蛋白，其中所述dHGF在穩(wěn)定化的蛋白質(zhì)組合物中的濃度小于或等于50ng/ml。在其中一些 實(shí)施方案中，所述制劑包含單月桂酸1-甘油酯或單肉豆蔻酸1-甘油酯或這二者，并且該制 劑還可包含增粘劑和/或抗菌劑。在一些實(shí)施方案中，所述增粘劑是羥乙基纖維素且抗菌 劑是布比卡因。在本文所述的一些實(shí)施方案中，dHGF在穩(wěn)定化的蛋白質(zhì)組合物中的濃度小 于或等于lOng/ml。
本發(fā)明的多個(gè)方面涉及一種穩(wěn)定化的蛋白質(zhì)組合物，其包含配制有單月桂酸 1-甘油酯和單肉豆蔻酸1-甘油酯的HGF或HGF變異蛋白。在一些實(shí)施方案中，所述組合 物還包含增粘劑(例如羥乙基纖維素)，并且一些上述組合物還包含抗病原劑(例如布比 卡因)。在其中一些組合物中，所述HGF或HGF變異蛋白選自由NKl、dNKl、NK2、dNK2、NK3、 dNK3、NK4或dNK4或與所述HGF或HGF變異蛋白具有至少80 %、85 %、90 %、95 %、96 %、 97^^98%或99% (或在85%-99%內(nèi)的任意百分比)的序列相似性或同源性的蛋白質(zhì)組 成的組，條件是所述相似的或同源的蛋白質(zhì)保留屬于HGF或HGF變異蛋白的功能，例如結(jié)合 cMet受體、上皮細(xì)胞促進(jìn)作用、細(xì)胞擴(kuò)散、誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制上皮細(xì)胞促進(jìn)作用、抑制細(xì)胞 擴(kuò)散或抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。
本發(fā)明的多個(gè)方面還涉及一種穩(wěn)定化的蛋白質(zhì)組合物，其包含配制有單月桂酸 1-甘油酯和單肉豆蔻酸1-甘油酯的dHGF蛋白。在一些實(shí)施方案中，這些組合物還包含增 粘劑(例如羥乙基纖維素)，并且一些上述組合物還包含抗病原劑(例如布比卡因)。另外 的實(shí)施方案包括穩(wěn)定化的蛋白質(zhì)組合物，其包含配制有單月桂酸1-甘油酯和單肉豆蔻酸 1-甘油酯的HGF、NKl、dNKl、NK2、dNK2、NK3、dNK3、NK4或dNK4，并且這些組合物可任選地包 含增粘劑(例如羥乙基纖維素)，并且一些上述組合物還包含抗病原劑(例如布比卡因)。
本發(fā)明的多個(gè)方面還包括制備上述組合物的方法，其中所述方法是通過(guò)以下過(guò)程 實(shí)施的提供包含dHGF蛋白和至少一種熔融溫度大于30°C的甘油一酸酯的溶液，并且干燥所述溶液，以形成干態(tài)顆粒，其中所述干燥過(guò)程保持甘油一酸酯的結(jié)晶結(jié)構(gòu)。在其中一 些方法中，所述溶液還包含增粘劑。在其中一些方法中，增粘劑是選自由羥乙基纖維素、甲 基纖維素、羥丙基纖維素、羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素(Ε464)和羥乙基甲基纖維素 組成的組中的纖維素衍生物，并且在其中一些方法中，至少一種甘油一酸酯具有10、11、12、 13、14、15或16碳，優(yōu)選12或14碳的碳鏈長(zhǎng)度。在其中一些方法中，所述溶液還包含至少 一種單獨(dú)的或與所述至少一種結(jié)晶性甘油一酸酯組合的抗病原化合物，并且在其中一些方 法中，所述抗病原化合物是布比卡因。在其中一些方法中，所述抗病原化合物選自由酰胺型 局部麻醉藥、尿素、咪唑衍生物、硝基咪唑衍生物和具有3-6個(gè)碳原子的二醇組成的組。
本發(fā)明的多個(gè)方面還包括制備上述組合物的方法，其包括提供包含至少一種熔 融溫度大于30°C的結(jié)晶性甘油一酸酯和增粘劑的溶液；冷凍噴霧干燥所述溶液以形成干 態(tài)顆粒，其中所述冷凍干燥過(guò)程保持所述甘油一酸酯的結(jié)晶結(jié)構(gòu)；提供包含天然HGF 蛋白的重組形式的液體；以及在保留至少一種甘油一酸酯的結(jié)晶結(jié)構(gòu)的條件下，將包含所 述HGF蛋白的所述液體與包含所述至少一種甘油一酸酯和增粘劑的所述干態(tài)顆粒相組合。 在其中一些方法中，所述天然HGF蛋白的重組形式是dHGF，并且在其中一些方法中，所述增 粘劑是選自由羥乙基纖維素、甲基纖維素、羥丙基纖維素、羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維 素(E464)和羥乙基甲基纖維素組成的組的纖維素衍生物。在其中一些方法中，至少一種甘 油一酸酯具有10、11、12、13、14、15或16碳，優(yōu)選12或14碳的碳鏈長(zhǎng)度，并且在其中一些 方法中，所述溶液還包含至少一種單獨(dú)的或與所述至少一種甘油一酸酯組合的抗病原化合 物。在其中一些方法中，所述抗病原化合物是布比卡因，并且在其中一些方法中，所述抗病 原化合物選自由酰胺型局部麻醉藥、尿素、咪唑衍生物、硝基咪唑衍生物和具有3-6個(gè)碳原 子的二醇組成的組。
本發(fā)明的多個(gè)方面還包括使用上述組合物來(lái)改善或改良對(duì)象的皮膚疾病的方法， 該方法包括確認(rèn)需要改善或改良皮膚疾病的制劑的對(duì)象；并且將本文所述的所述組合物 提供給所述對(duì)象。在其中一些方法中，所述皮膚疾病是慢性糖尿病性皮膚潰瘍、裂傷、創(chuàng)傷、 美容缺陷、皮膚腫瘤或基底細(xì)胞癌?？扇芜x的是，上述方法還可包括測(cè)量皮膚疾病的改善或 改良情況。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明


圖1示出乳膏ALL07001的熔融曲線，以及一種干態(tài)粉末(ALL07005C)和兩種重構(gòu) 粉末(ALL07005A和ALL07005F)的典型曲線。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)說(shuō)明
本文所述的許多實(shí)施方案涉及包含穩(wěn)定化的被輸送藥劑(例如蛋白質(zhì)或其片段 和/或核酸如DNA或RNA)的局部用組合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物包含至少一 種結(jié)晶甘油一酸酯，例如在溫度等于或低于421、411、401、391、381、371、361、351、 34 0C >33 0C >32 0C >310C >30 0C >29 0C >28 0C >27 0C >26 0C >25 0C >24 0C >23 0C >22 0C >210C >20 0C > 19°C、18°C、17°C、16°C或15°C，優(yōu)選等于或低于皮膚溫度時(shí)保持結(jié)晶形式的甘油一酸酯。在 更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述甘油一酸酯為晶態(tài)。所述“晶態(tài)”是指在全部三個(gè)維度重復(fù) 出現(xiàn)的結(jié)構(gòu)，但是在全部三個(gè)方向上的重復(fù)功能不必相同。β-結(jié)晶甘油一酸酯包含固態(tài)層 狀結(jié)構(gòu)的固體甘油一酸酯，其碳鏈不熔融而是固態(tài)的。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述組合物還包含至少一種單獨(dú)的或與所述結(jié)晶性甘11油一酸酯組合的抗病原化合物(例如抗菌化合物、抗真菌劑、殺菌劑或抑菌劑或抗生素)， 以及可任選的賦形劑。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物還包含懸浮劑或增粘劑 (例如纖維素衍生物，如羥丙基纖維素、羥甲基纖維素、羥乙基纖維素(例如Natrosol )、 甲基纖維素、羧甲基纖維素或羥丙基甲基纖維素)。
在一些實(shí)施方案中，所述局部用組合物被制備成具有液體吸收能力的干態(tài)粉末， 其與液體(例如水、油或乳液)接觸后產(chǎn)生半固體制劑。該再生的半固體產(chǎn)品能夠局部應(yīng) 用，以誘導(dǎo)被輸送藥劑(例如蛋白質(zhì)或其片段，核酸(如DNA或RNA)，或其組合)的表皮、真 皮、透皮或皮內(nèi)給藥。在一些實(shí)施方案中，有效成分以液體形式存在(例如在適合的緩沖劑 中)，并且將包含有效成分的水性溶液加入到含有膠凝劑或增粘劑的干燥粉末中，以制備穩(wěn) 定化產(chǎn)品的最終制劑。在對(duì)已被確認(rèn)為需要有效成分的對(duì)象提供穩(wěn)定化的組合物之前，可 將包含有效成分的水性溶液與包含膠凝劑的干燥粉末稍作混合。
這些穩(wěn)定化的被輸送藥劑的制劑可用于使對(duì)象(例如動(dòng)物、家養(yǎng)動(dòng)物、爬行動(dòng)物、 鳥(niǎo)類(lèi)或哺乳動(dòng)物如狗、貓、馬、豬或人)的健康和幸福獲益。一些制劑可用于治療、改良或改 善對(duì)象的皮膚疾病(例如促進(jìn)或加速潰瘍、創(chuàng)傷或皮膚腫瘤的治愈)。例如，一些實(shí)施方案 被配制為用于治療、改善或改良美容狀況，或促進(jìn)動(dòng)物的健康和幸福。一些實(shí)施方案能夠用 于在動(dòng)物、優(yōu)選哺乳動(dòng)物(例如人)中治療、改善、改良潰瘍、糖尿病性潰瘍、褥瘡、褥瘡性潰 瘍、壓迫性壞疽、裂傷、穿刺、磨損、美容磨損、燒傷、術(shù)后創(chuàng)傷、皮膚腫瘤、基底細(xì)胞癌、鱗狀 細(xì)胞癌、黑色素瘤、光化性角化病、美容重建、牛皮癬、毛發(fā)生長(zhǎng)、除皺、皮膚張緊和/或青春 外貌。
若干實(shí)施方案涉及包含、由或基本上由有效成分或被輸送藥物(如蛋白質(zhì)，編碼 蛋白質(zhì)的核酸或蛋白質(zhì)片段或編碼所述蛋白質(zhì)片段的核酸)組成的局部用組合物?？?在本文所述的制劑或產(chǎn)品中用作被輸送藥物的示例性蛋白質(zhì)包括(但不限于)生長(zhǎng)激 素，包括人生長(zhǎng)激素(hGH)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子或擴(kuò)散因子(HGF)和去-N-甲硫氨酰基人 生長(zhǎng)激素；甲狀旁腺激素；促甲狀腺激素；甲狀腺素；脂蛋白；α 1-抗胰蛋白酶；胰島素 α -鏈；胰島素β -鏈；胰島素原；凝血因子，如VIIIC因子、IX因子、組織因子和馮維勒 布蘭德氏(von ffillebrands)因子；抗凝血因子，如蛋白C ；心鈉肽；肺表面活性劑；纖溶 酶原激活物，如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)；蛙皮素；凝血酶；造血生 長(zhǎng)因子；腫瘤壞死因子(TNF) α和β ；腦啡肽；血清白蛋白如人血清白蛋白；繆勒管抑制 (mullerian-inhibiting)物質(zhì)；松弛素A鏈；松弛B鏈；松弛素原；DNA酶；抑制素；激活 素；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；激素或生長(zhǎng)因子受體；整合素；血小板生成素；蛋白質(zhì)A或D ；類(lèi)風(fēng) 濕因子；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，如骨源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3、-4、-5或_6(NT_3、 NT-4、NT-5或NT-6)；或神經(jīng)生長(zhǎng)因子如NGF-β ；血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)；成纖維細(xì)胞 生長(zhǎng)因子如aFGF和bFGF ；表皮生長(zhǎng)因子(EGF)；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)如TGF-α和TGF-β， 包括TGF-β 1、丁6卩-0 2、了6卩-0 3、了6卩-0 4或了6卩-丫 ；胰島素樣生長(zhǎng)因子I和II (IGF-I和 IGF-II)；胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白；⑶蛋白如⑶-3、⑶-4、⑶-8和⑶-19 ；促紅細(xì)胞生 成素；骨誘導(dǎo)因子；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)；促生長(zhǎng)素；干擾素(IFN)如IFN-α、IFN-β和 IFN- γ ；集落刺激因子(CSF)如 M-CSF、GM-CSF 和 G-CSF ；白介素(IL)如 IL-1 至 IL-10 ； 超氧化物歧化酶；T細(xì)胞受體；表膜蛋白；衰變加速因子；歸巢受體；稟呈素；調(diào)節(jié)蛋白或抗 體。
加入到本文所述的一種或多種組合物中的特別優(yōu)選的有效成分包括重組產(chǎn)生或 天然分離的HGF蛋白，例如全長(zhǎng)HGF或dHGF (HGF的天然五氨基酸截短型)或其天然變異體 (例如NK1、dNKl、NK2、dNK2、NK3、dNK3、NK4或dNK4)，以及結(jié)晶性甘油一酸酯(例如α和 /或β -結(jié)晶性甘油一酸酯，其具有10、11、12、13、14、15、16、17或18碳，優(yōu)選12或14碳 的碳鏈長(zhǎng)度，并且在溫度小于或等于 42°C、41°C、40°C、39°C、38°C、37°C、36°C、35°C、34°C、 33 °C >32 °C >31 °C >30 °C >29 °C >28 °C >27 °C >26 °C >25 °C >24 °C >23 °C >22 °C >21 °C >20 °C >19 °C > 18°C、17°C、16°C或15°C，優(yōu)選皮膚溫度時(shí)保持為結(jié)晶形式)。本發(fā)明的多個(gè)方面還包括含 有被輸送藥劑的制劑，其中所述被輸送藥劑包含、基本上由或由編碼和/或干擾上述所列 的多肽或其突變體種的任意一種的核酸(例如DNA、RNA，包括干擾RNA如RNAi)組成。多 個(gè)實(shí)施方案包括上述所列多肽的片段和編碼和/或干擾所述片段的核酸(例如DNA、RNA, 包括干擾RNA如RNAi)。
例如，在一些實(shí)施方案中使用的被輸送藥劑或有效成分包括在局部應(yīng)用于組織 (例如皮膚)時(shí)具有治療、改良或改善效果的蛋白質(zhì)或編碼該蛋白質(zhì)的核酸，例如HGF (肝 細(xì)胞生長(zhǎng)因子或擴(kuò)散因子)、hGH、TGF-α、TGF-β、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、表皮生長(zhǎng) 因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1和2 (IGF-I和/或IGF-2)、 t-PA、因子VIII、松弛素、胰島素、IFN-γ和/或TGF-Y。一些實(shí)施方案可包含上述蛋白質(zhì) 的片段或突變體或編碼所述片段或突變體的核酸。
在一些實(shí)施方案中，制劑包含編碼一種或多種蛋白質(zhì)或其片段的核酸(例如除了 所述蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段之外，或替代所述蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段)。例如，在一些實(shí)施方案 中，根據(jù)本文所述的教導(dǎo)將編碼HGF、HGF片段或HGF突變形式或HGF片段的突變形式(例 如全長(zhǎng)HGF或dHGF (HGF的五氨基酸截短型)或其變異體(例如NKl、dNKl、NK2、dNK2、NK3、 dNK3、NK4或dNK4))的核酸，以及β結(jié)晶性甘油一酸酯配制在局部用產(chǎn)品中，其中所述β 結(jié)晶性甘油一酸酯例如為α或β-結(jié)晶性甘油一酸酯，其具有10、11、12、13、14、15、16、17 或18碳的碳鏈長(zhǎng)度，最好是10-16碳(例如12、13、14、15或16碳)的碳鏈長(zhǎng)度，優(yōu)選12、 13或14碳的碳鏈長(zhǎng)度，最優(yōu)選12或14碳的碳鏈長(zhǎng)度，并且所述制劑還可包含HGF蛋白、 HGF蛋白片段、或HGF蛋白或其片段的突變體(例如全長(zhǎng)HGF或dHGF(HGF的五氨基酸截短 型)或其變異體(例如離1、(1離1、離2、(1離2、離3、(1離3、離4或(1離4))。也就是說(shuō)，在一些 實(shí)施方案中，編碼蛋白質(zhì)(例如HGF蛋白或HGF蛋白突變體或其片段)的DNA可配制在本 文所述的含有或不含有HGF蛋白或HGF蛋白突變體或其片段的組合物中?？梢詫⑦@些核酸 加入到適合于特別對(duì)象的表達(dá)質(zhì)粒中(例如特別適合在人、貓、狗、馬、豬或雞中指導(dǎo)表達(dá) 的質(zhì)粒)。此外，所述DNA被輸送藥劑能夠?yàn)樘貏e對(duì)象(例如人、貓、狗、馬、豬或雞)進(jìn)行密 碼子優(yōu)化，以便在對(duì)象內(nèi)提供改善的肽產(chǎn)品。例如，可根據(jù)本文的教導(dǎo)將密碼子優(yōu)化的HGF 或突變體HGFDNA (例如全長(zhǎng)HGF或dHGF (HGF的五氨基酸截短型)或其變異體(例如NKl、 dNKl、NK2、dNK2、NK3、dNK3、NK4或dNK4))配制在局部用凝膠中，并且可以將所述密碼子優(yōu) 化的HGF或突變體HGF DNA (例如編碼全長(zhǎng)HGF或dHGF (HGF的五氨基酸截短型)或其變異 體(例如離1、(1離1、離2、(1離2、離3、(1離3、離4或(1離4)的核酸)在狗、貓、馬、豬或人中進(jìn) 行優(yōu)化表達(dá)。
能夠在本文所述制劑中使用的蛋白質(zhì)/肽包括所有天然的和合成的蛋白質(zhì)/肽， 無(wú)論其是通過(guò)天然來(lái)源、化學(xué)合成獲得的，還是通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生的均是如此。在一些實(shí)施方案中，所述白質(zhì)/肽可為糖蛋白、磷蛋白、碘蛋白、硫蛋白、甲基化蛋白、未修飾的蛋白 質(zhì)/肽、或包含其他修飾的蛋白質(zhì)/肽。盡管可以將本文所述的組合物配制成包含寬泛范 圍的蛋白質(zhì)濃度，或者可以將其配制為輸送寬泛范圍的蛋白質(zhì)濃度，但是根據(jù)適合于治療 效果的特定蛋白質(zhì)/肽的量，優(yōu)選將組合物配制為使得這些包含于產(chǎn)品中或通過(guò)產(chǎn)品輸送 的蛋白質(zhì) / 肽的濃度小于或等于 10mg/ml、5mg/ml、2mg/ml、lmg/ml、0. 5mg/ml、0. 2mg/ml、 0. lmg/ml、50 μ g/ml、25 μ g/ml、10 μ g/ml、5 μ g/ml、2 μ g/ml、1 μ g/ml、0. 5 μ g/ml、0· 2 μ g/ ml、0· 1 μ g/ml、50ng/ml、25ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2ng/ml 或 lng/ml0 換句話說(shuō)，本文所 述組合物和方法能包含或利用一定濃度的蛋白質(zhì)或肽，或輸送一定濃度的蛋白質(zhì)或肽，該 濃度足以達(dá)到治療目的，并且根據(jù)蛋白質(zhì)/肽或預(yù)期的治療，該濃度小于、在其之間或等 于 9-1Omg/ml、8_9mg/ml、7_8mg/ml、6_7mg/ml、5_6mg/ml、4_5mg/ml、3_4mg/ml、2_3mg/ml、 l-2mg/ml、0. 5-lmg/mUO. 25-0. 5mg/ml、0. 1-0. 25mg/ml、0. 05-0. lmg/mUO. 02-0. 05mg/ ml、10-20 μ g/ml>9-10 μ g/ml>8-9 μ g/ml>7-8 μg/ml>6-7 μ g/ml、5_6y g/ml>4-5 μg/ πι1、3-4μ g/ml>2-3 μ g/ml>1-2 μ g/mUO. 5-1 μ g/mUO. 3-0. 5 μ g/mUO. 1-0. 3 μ g/ml、 0. 05-0. 1 μ g/ml、0. 02-0. 05 μ g/ml、10-20ng/ml、9-10ng/ml、8-9ng/ml、7-8ng/ml、6-7ng/ ml、5-6ng/ml、4_5ng/ml、3_4ng/ml、2_3ng/ml、l_2ng/ml 中的任一數(shù)值。
對(duì)于眾多用于改善、改良或治療皮膚疾病(例如創(chuàng)傷、潰瘍和皮膚腫瘤)的局部用 組合物，優(yōu)選的是，產(chǎn)物中包含的制劑的有效成分(例如全長(zhǎng)HGF或dHGF(HGF的五氨基酸 截短型)或其變異體(例如NKl、dNKl、NK2、dNK2、NK3、dNK3、NK4或dNK4))的濃度或者由產(chǎn) 物輸送的有效成分濃度小于或等于5 μ g/ml,4 μ g/ml,3 μ g/ml,2 μ g/mlU μ g/ml、0. 5 μ g/ ml、0· 2 μ g/ml、100ng/ml、95ng/ml、90ng/ml、85ng/ml、80ng/ml、75ng/ml、70ng/ml、65ng/ ml、60ng/ml、55ng/ml、50ng/ml、45ng/ml、40ng/ml、35ng/ml、30ng/ml、25ng/ml、20ng/ml、 20ng/ml、19ng/ml、18ng/ml、17ng/ml、16ng/ml、15ng/ml、14ng/ml、13ng/ml、12ng/ml、llng/ ml、10ng/ml、9ng/ml、8ng/ml、7ng/ml、6ng/ml、5ng/ml、4ng/ml、3ng/ml、2ng/ml 或 lng/ml 中 的任一數(shù)值。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將所述蛋白質(zhì)/肽配制為作為包含凝膠形成化合物的制劑 的一部分用于局部給藥?？梢詫⑷魏螒腋┗蛟稣硠┯迷谒鲋苿┲?，該懸浮劑或增粘劑 包括(但不限于)阿拉伯膠、瓊脂、藻酸、單硬脂酸鋁、膨潤(rùn)土、純化膨潤(rùn)土、膨潤(rùn)土巖漿、卡 波姆934p、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉、羧甲基纖維素鈉12、角叉膠、微晶纖維素和 羧甲基纖維素鈉纖維素、糊精、明膠、瓜爾膠、羥乙基纖維素(例如Natrosol )、羥丙基纖 維素、羥丙基甲基纖維素、硅酸鋁鎂、甲基纖維素、果膠、聚環(huán)氧乙烷、聚乙烯醇、聚維酮、海 藻酸丙二醇酯、二氧化硅、膠體二氧化硅、海藻酸鈉、黃蓍膠和黃原膠。在優(yōu)選的實(shí)施方案 中，將纖維素衍生物(其包括但不限于羥乙基纖維素(例如Natrosol )、羥丙基纖維素、 羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素(E464)和羥乙基甲基纖維素)用作凝膠形成化合物。所 述凝膠形成化合物優(yōu)選為能提供半固體產(chǎn)品的量。凝膠形成化合物的例子包括纖維素衍生 物，例如上述的那些。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，此處所設(shè)想的制劑包含在溫度低于皮膚溫度時(shí)為固體晶態(tài) 的脂質(zhì)。在優(yōu)選實(shí)施方案中使用的脂質(zhì)具有有助于脂質(zhì)在溫度低于42°C時(shí)保持為固態(tài)的 脂質(zhì)鏈熔融溫度。也就是說(shuō)，能在本文所述組合物或方法中使用的結(jié)晶性甘油一酸酯具有 這樣的熔融溫度，其小于或等于421、411、401、391、381、371、361、；351、；341、331、32 0C >310C >30 0C >29 0C >28 0C >27 0C >26 0C >25 0C >24 0C >23 0C >22 0C >210C >20 0C >19 0C >18 0C > 17°C、16°C或15°C。脂質(zhì)化合物作為干燥產(chǎn)品的一部分應(yīng)該具有的含量為約90%至約1%， 優(yōu)選約85 %至約5 %，更優(yōu)選約80 %至約10 %，更加優(yōu)選約75 %至約15 %，還更優(yōu)選約 70%至約20%，更優(yōu)選約65%至約25%并且優(yōu)選約60至約40%。本文所用優(yōu)選脂質(zhì)的例 子包括脂肪酸的結(jié)晶性甘油一酸酯。所述脂肪酸包括(但不限于)具有最優(yōu)選為12或14 個(gè)碳，優(yōu)選10至16個(gè)碳原子，并且最好是10至18個(gè)碳原子的飽和脂肪酸(也就是說(shuō)，具 有至少為或等于或?yàn)?0、11、12、13、14、15、16、17或18之間的任何數(shù)值的碳原子)。優(yōu)選的 組合物包含具有10、11、12、13、14、15或16碳的碳鏈長(zhǎng)度的結(jié)晶性甘油一酸酯，其包括單月 桂酸1-甘油酯，單肉豆蔻酸1-甘油酯，單棕櫚1-甘油酸酯和單硬脂酸1-甘油酯。最優(yōu)選 的是，組合物包含具有12或14個(gè)碳的結(jié)晶性甘油一酸酯。如市售可得的那樣，結(jié)晶性 甘油一酸酯可以以均態(tài)或非均態(tài)存在。本文所述組合物和方法中使用的優(yōu)選的甘油一酸酯 包括單月桂酸甘油酯和/或單肉豆蔻酸1-甘油酯。
結(jié)晶性甘油一酸酯的混合物也可用于一些制劑中。因此，一些實(shí)施方案包括一種 或多種結(jié)晶性甘油一酸酯(例如α或結(jié)晶性甘油一酸酯)的混合物，所述結(jié)晶性甘油 一酸酯可具有10、11、12、13、14、15、16、17或18碳的碳鏈長(zhǎng)度，最好是10-16碳(例如12、 13、14、15或16碳)的碳鏈長(zhǎng)度，優(yōu)選12、13或14碳的碳鏈長(zhǎng)度，最優(yōu)選12或14碳的碳鏈 長(zhǎng)度。示例性的比例包括 1 1、1 2、1 3、1 4、1 5、1 6、1 7、1 8、1 9、 1 10、1 11、1 12、1 13、1 14、1 15、1 16、1 17、1 18、1 19 或 1 20 或更多。優(yōu)選的組合物包括比例為1 9或9 1的單月桂酸1-甘油酯和單肉豆蔻酸1-甘 油酯的混合物。
由于產(chǎn)品是半固體的，所以能夠調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)/肽的給藥速度。這個(gè)可通過(guò)改變凝 膠形成化合物的量和脂質(zhì)的量來(lái)實(shí)現(xiàn)。所期望的給藥速度取決于所用的蛋白質(zhì)/肽，并且 所述組合物可以針對(duì)各種蛋白質(zhì)/肽進(jìn)行調(diào)制。α或結(jié)晶性甘油一酸酯的結(jié)晶百分比 對(duì)特定制劑也是重要的，并且能根據(jù)商業(yè)來(lái)源、純度、異質(zhì)性而不同。因此，一些實(shí)施方案包 括一定量的α或結(jié)晶性甘油一酸酯，其中α或結(jié)晶性甘油一酸酯含有的結(jié)晶性 甘油一酸酯分子大于或等于50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%或 這些百分比之間的任意數(shù)值。在本文所用的某些方面中，術(shù)語(yǔ)結(jié)晶性甘油一酸酯是指這樣 的甘油一酸酯，其中在特定溫度下以晶態(tài)存在的甘油一酸酯的百分比大于非晶態(tài)的甘油一 酸酯。例如，結(jié)晶性甘油一酸酯可為α或β-結(jié)晶性甘油一酸酯，其在小于或等于42°C、 41 °C >40 °C >39 °C >38 °C >37 °C >36 °C >35 °C >34 °C >33 °C >32 °C >31 °C >30 °C >29 °C >28 °C >27 °C > 26°C、25°C、24°C、23°C、22°C、21°C、20°C、19°C、18°C、17°C、16°C 或 15°C 時(shí)，晶態(tài)分子百分比 大于非晶態(tài)分子的百分比?？捎刹钍緬呙枇繜岱?DSC)確定在任何特定的α或結(jié)晶 性甘油一酸酯中的結(jié)晶化形式的百分比。
另外的實(shí)施方案涉及這樣的方法，其中將本文所述的一種或多種重構(gòu)凝膠或乳膏 制劑提供給需要其的對(duì)象(例如，諸如狗、貓、馬、豬或人等對(duì)象)，以治療、改良或改善下列 疾病潰瘍、糖尿病性潰瘍、褥瘡、褥瘡性潰瘍、壓迫性壞疽、裂傷、穿刺、磨損、美容磨損、燒 傷、術(shù)后創(chuàng)傷、皮膚腫瘤、基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌、黑色素瘤、美容重建、牛皮癬、毛發(fā)生長(zhǎng)、 除皺、皮膚緊硬和/或青春外貌。在這樣的方法中，所述對(duì)象優(yōu)選經(jīng)確認(rèn)為需要治療、改良 或改善以下?tīng)顩r中的一種或多種的組合物的對(duì)象潰瘍、糖尿病性潰瘍、褥瘡、褥瘡性潰瘍、壓迫性壞疽、裂傷、穿刺、磨損、美容磨損、燒傷、術(shù)后創(chuàng)傷、皮膚腫瘤、基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞 癌、黑色素瘤、光化性角化病、美容重建、牛皮癬、毛發(fā)生長(zhǎng)、除皺、皮膚緊硬和/或青春外 貌。可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的臨床或診斷評(píng)價(jià)進(jìn)行所述確認(rèn)操作，所述臨床或診斷評(píng)價(jià)包括 醫(yī)生、外科醫(yī)生或其他保健服務(wù)提供者咨詢或進(jìn)行診斷測(cè)試或活檢?？扇芜x的或可供選用 的是，這樣的對(duì)象被確認(rèn)為需要誘導(dǎo)上皮細(xì)胞增殖和/或在創(chuàng)傷位點(diǎn)形成肉芽的制劑或抑 制癌細(xì)胞增殖或擴(kuò)散的制劑的對(duì)象。同樣，可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的臨床或診斷評(píng)價(jià)進(jìn)行所 述的確認(rèn)操作，所述臨床或診斷評(píng)價(jià)可包括醫(yī)生、外科醫(yī)生或其他保健服務(wù)提供者咨詢或 進(jìn)行診斷測(cè)試或活檢。
一旦對(duì)象被確認(rèn)，可向他們提供或施用一種或多種本文所述的組合物。優(yōu)選的 是，通過(guò)提供以下的組合物實(shí)施所述方法，所述組合物被配制為使得包含于產(chǎn)品中或通過(guò) 產(chǎn)品輸送的蛋白質(zhì)/肽的濃度小于或等于10mg/ml、5mg/ml、2mg/ml、lmg/ml、0. 5mg/ml、 0. 2mg/ml、0. lmg/ml>50 μ g/ml、25 μ g/ml、10 μ g/ml、5 μ g/ml、2 μ g/ml、lμ g/ml、0. 5 μ g/ ml、0. 2 μ g/ml、0. 1 μ g/ml、50ng/ml、25ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2ng/ml 或 lng/ml。換句 話說(shuō)，一旦對(duì)象被確認(rèn)為需要特定治療劑的患者，可向他們提供或施用一種或多種本文所 述的組合物，根據(jù)蛋白質(zhì)/肽和治療目的，其可包含或利用足以達(dá)到治療目的濃度的蛋白 質(zhì)或肽，或輸送足以達(dá)到治療目的濃度的蛋白質(zhì)或肽，根據(jù)蛋白質(zhì)/肽或預(yù)期的療法，所 述濃度例如為小于、在其之間或等于9-10mg/ml、8-9mg/ml、7-8mg/ml、6-7mg/ml、5_6mg/ ml、4-5mg/ml、3-4mg/ml、2-3mg/ml、l_2mg/ml、0· 5-lmg/ml>0. 25-0. 5mg/ml、0. 1-0. 25mg/ ml、0. 05-0. lmg/ml、0. 02-0. 05mg/ml、10—20 μ g/ml、9_10y g/ml、8_9y g/ml、7_8y g/ml、 6-7 μ g/ml、5-6 μ g/ml>4-5 μ g/ml、3-4 μ g/ml、2-3 μ g/ml>1-2 μ g/ml>0. 5-1 μ g/ml、 0. 3-0. 5 μ g/ml、0. 1-0. 3 μ g/ml>0. 05-0. 1 μ g/ml、0. 02-0. 05 μ g/ml、10-20ng/ml、9_10ng/ ml、8_9ng/ml、7_8ng/ml、6_7ng/ml、5_6ng/ml、4_5ng/ml、3_4ng/ml、2_3ng/ml、或 l_2ng/ml 中的任一數(shù)值。
在一些優(yōu)選方法中，提供基于HGF的制劑，例如，包含全長(zhǎng)HGF或dHGF (HGF的五氨 基酸截短型)或其變異體(例如離1、(1離1、離2、(1離2、離3、(1離3、離4或(1離4)的組合物，所 提供的組合物被配制為使得上述有效成分包含于產(chǎn)品中或通過(guò)產(chǎn)品輸送的濃度小于或等 于 5 μ g/ml、4 μ g/ml、3 μ g/ml、2 μ g/ml、lμ g/ml、0. 5 μ g/ml、0. 2 μ g/ml、100ng/ml、95ng/ ml、90ng/ml、85ng/ml、80ng/ml、75ng/ml、70ng/ml、65ng/ml、60ng/ml、55ng/ml、50ng/ml、 45ng/ml、40ng/ml、35ng/ml、30ng/ml、25ng/ml、20ng/ml、20ng/ml、19ng/ml、18ng/ml、17ng/ ml、16ng/ml、15ng/ml、14ng/ml、13ng/ml、12ng/ml、1lng/ml、lOng/ml、9ng/ml、8ng/ml、7ng/ ml、6ng/ml、5ng/ml、4ng/ml、3ng/ml、2ng/ml 或 lng/ml 中的任一數(shù)值。
給藥方案、施用頻率和給藥時(shí)間可以由醫(yī)師或其他保健服務(wù)提供者考慮所期望的 應(yīng)用和患者或?qū)ο鬆顩r的細(xì)節(jié)來(lái)確定。在一些實(shí)施方案中，每?jī)商焯峁┮环N或多種本文所 述的組合物，并且相應(yīng)地對(duì)患者的改善情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)和/或測(cè)量。也就是說(shuō)，可以任選地 通過(guò)本領(lǐng)域已知的臨床或診斷評(píng)價(jià)來(lái)測(cè)量或監(jiān)測(cè)所述對(duì)象的恢復(fù)情況或其標(biāo)志物，如血管 生成、肉芽組織形成、出現(xiàn)治療后組織的、創(chuàng)傷滲出、恢復(fù)健康組織、腫瘤病變或角化病的消 失。
許多創(chuàng)傷或美容皮膚狀態(tài)會(huì)感染病原體或有感染病原體的風(fēng)險(xiǎn)。雖然存在于創(chuàng) 傷中的病原體的種類(lèi)通常是“病患來(lái)源”，但是這些生物體的存在并不總是會(huì)導(dǎo)致全身性感染。但是，許多病原體能夠產(chǎn)生可能會(huì)破壞某些蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的蛋白酶。在某些實(shí) 施方案中，向制劑中單獨(dú)或與結(jié)晶性甘油一酸酯和蛋白質(zhì)/肽有效成分(例如全長(zhǎng)HGF或 dHGF(HGF的五氨基酸截短型)或其變異體(例如NKl、dNKl、NK2、dNK2、NK3、dNK3、NK4或 dNK4))組合加入抗病原化合物(例如抗菌化合物、抗真菌劑、殺菌或抑菌劑或抗生素)，以 抑制、減少或治療存在于對(duì)象中的病原體。
在包含結(jié)晶性甘油一酸酯(優(yōu)選β -結(jié)晶性甘油一酸酯)的制劑中引入抗病原化 合物能夠協(xié)同地抑制、減少或治療病原體。也就是說(shuō)，在一些實(shí)施方案中，考慮到當(dāng)將所述 化合物與結(jié)晶性甘油一酸酯(優(yōu)選結(jié)晶性甘油一酸酯)一起應(yīng)用時(shí)，抗病原化合物能 協(xié)同抑制病原體(例如細(xì)菌或真菌)的增殖。在一些實(shí)施方案中，還考慮到包含抗病原劑、 結(jié)晶性甘油一酸酯(優(yōu)選結(jié)晶性甘油一酸酯)和蛋白質(zhì)的制劑在改良、改善或治療疾 病(例如皮膚疾病，如皮膚潰瘍)方面優(yōu)于包含單獨(dú)的蛋白質(zhì)/肽或與結(jié)晶性甘油一酸酯 (優(yōu)選β-結(jié)晶性甘油一酸酯)組合的蛋白質(zhì)/肽或與抗微生物化合物組合的蛋白質(zhì)/肽 的制劑，其中所述蛋白質(zhì)例如為全長(zhǎng)HGF或dHGF(HGF的五氨基酸截短型)或其變異體(例 如 NK1、dNKl、NK2、dNK2、NK3、dNK3、NK4 或 dNK4)。
如本文討論的那樣，特定的結(jié)晶性甘油一酸酯(優(yōu)選β-結(jié)晶性甘油一酸 酯)與某些特定組的化學(xué)物質(zhì)的組合能在抗菌性質(zhì)方面提供協(xié)同效果(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利 No. 5，550，145，其全文以引用的方式明確地并入本文)?？咕行Я康慕Y(jié)晶性甘油一酸酯 (優(yōu)選結(jié)晶性甘油一酸酯)和選自下列組中的至少一種化學(xué)物質(zhì)的組合能有效地賦予 抗菌性質(zhì)，其中所述結(jié)晶性甘油一酸酯包括(但不限于)月桂酸、肉豆蔻酸的甘油一酸酯或 其混合物，并且所述的組為i)酰胺型局部麻醉藥；ii)尿素；iii)抗菌、抗細(xì)菌、抗真菌物 質(zhì)，咪唑衍生物或硝基咪唑衍生物；以及iv)具有3-6個(gè)碳原子的二醇。
可用于本文所述制劑或方法中的特別優(yōu)選的酰胺型局部麻醉藥包括(但不限于) 利多卡因、丙胺卡因、甲哌卡因、辛可卡因、布比卡因、普魯卡因、地布卡因、丁卡因、丁氧普 魯卡因、奧西卡因和依替卡因。在本文所述的制劑或方法中使用的所述局部麻醉藥中，布比 卡因是特別優(yōu)選的物質(zhì)。
除了局部麻醉藥之外或代替局部麻醉藥，尿素化合物、磺胺胍、磺脲 (sulfanilylure)、脲類(lèi)衍生物、夫西地酸、頭孢菌素P也可用于本文所述的一種或多種制 劑或方法中。咪唑衍生物(其包括硝酸益康唑、硝酸咪康唑、聯(lián)苯芐唑和克霉唑)也可用于 本文所述的一種或多種制劑或方法中?？共≡镔|(zhì)(例如硝基咪唑化合物，包括替硝唑和 甲硝唑)也可用于本文所述的一種或多種制劑或方法中。具有3-6個(gè)碳原子的二醇化合物 包括(但不限于)丙二醇(如1，2_丙二醇(丙二醇)、1，3_丙二醇、2，2_ 二甲基_1，3丙 二醇)、丁二醇(如 1，2-丁二醇、1，3-丁二醇(丁二醇)、1，4_ 丁二醇，2，3-丁二醇)，戊二 醇(如1，2_戊二醇(戊二醇)、1，3-戊二醇、1，4-戊二醇、1，5-戊二醇、2，3-戊二醇，2，4 戊二醇)和己二醇(如1，2_己二醇，1，3己二醇、1，4-己二醇、1，5己二醇、1，6己二醇、2， 3-己二醇、2，4-己二醇和2，5-己二醇、環(huán)己二醇、1，2-環(huán)己二醇、1，4-環(huán)己二醇)，并且其 也可用于本文所述的一種或多種制劑或方法中。
在一些實(shí)施方案中，將制造過(guò)程設(shè)計(jì)為產(chǎn)生包含具有液體吸收能力的有效成分或 被輸送藥劑(例如全長(zhǎng)HGF或dHGF (HGF的五氨基酸截短型)或其變異體(例如NKl、dNKl、 NK2、dNK2、NK3、dNK3、NK4或dNK4))的干燥粉末。這種干燥粉末在接觸水或適合的緩沖劑后有產(chǎn)生半固體。所述制造過(guò)程包括溶解或分散組分的初始步驟，和之后干燥、除去液體， 以及形成適合重構(gòu)的顆粒的步驟。在制造過(guò)程中，在脂質(zhì)的結(jié)晶性結(jié)構(gòu)不改變的溫度下保 持脂質(zhì)是很重要的。例如，在制造過(guò)程中的溫度可低于脂質(zhì)的熔融溫度，例如不超過(guò)42°C。
在其他實(shí)施方案中，所進(jìn)行的制造過(guò)程產(chǎn)生只包含膠凝劑(例如Natrosol )和 甘油一酸酯的干燥粉末，并且該干燥粉末用包含有效成分或被輸送藥劑(例如全長(zhǎng)HGF或 dHGF(HGF的五氨基酸截短型)或其變異體(例如NKl、dNKl、NK2、dNK2、NK3、dNK3、NK4或 dNK4))的水性溶液(例如適合的緩沖劑)進(jìn)行重構(gòu)。如上所述，所述制造過(guò)程包括溶解或 分散結(jié)晶性甘油一酸酯(優(yōu)選結(jié)晶性甘油一酸酯)和膠凝劑的初始步驟，以及之后干 燥、除去液體，以及形成適合重構(gòu)的顆粒的步驟。優(yōu)選的是，保持溫度小于35°C，使得脂質(zhì)的 結(jié)晶性結(jié)構(gòu)保持不變?？稍谙蛐枰膶?duì)象提供產(chǎn)品之前將所述包含膠凝劑和結(jié)晶性甘油一 酸酯(優(yōu)選結(jié)晶性甘油一酸酯)的粉末進(jìn)行重構(gòu)，或可以將重構(gòu)材料儲(chǔ)存到使用，優(yōu)選 在低于室溫的溫度下儲(chǔ)存。下面提供了本發(fā)明各方面的非限制性的實(shí)施例。 實(shí)施例1本文所述的一些實(shí)施方案包括具有以下序列的重組人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(rhHGF) Imwvtkllpal Ilqhvllhll llpiaipyae gqrkrrntih efkksakttl ikidpalkik 61tkkvntadqc anrctrnkgl pftckafvfd karkqclwfp fnsmssgvkk efghefdlye 121nkdyirncii gkgrsykgtv sitksgikcq pwssmipheh sflpssyrgk dlqenycrnp 181rgeeggpwcf tsnpevryev cdipqcseve cmtcngesyr glmdhtesgk icqrwdhqtp 241hrhkflpery pdkgfddnyc rnpdgqprpw cytldphtrw eycaiktcad ntmndtdvpl 301etteciqgqg egyrgtvnti wngipcqrwd sqyphehdmt penfkckdlr enycrnpdgs 361espwcfttdp nirvgycsqi pncdmshgqd cyrgngknym gnlsqtrsgl tcsmwdknme 421dlhrhifwep dasklnenyc rnpdddahgp wcytgnplip wdycpisrce gdttptivnl 481dhpviscakt kqlrvvngip trtnigwmvs lryrnkhicg gslikeswvl tarqcfpsrd 5411kdyeawlgi hdvhgrgdek ckqvlnvsql vygpegsdlv lmklarpavl ddfvstidlp 601nygctipekt scsvygwgyt glinydgllr νahlyimgne kcsqhhrgkv tlneseicag 661aekigsgpce gdyggplvce qhkmrmvlgv ivpgrgcaip nrpgifvrva yyakwihkii 7211tykvpqs(SEQ. ID. NO. 1). 本文所述的更多實(shí)施方案包括具有以下序列的dHGF Imwvtkllpal Ilqhvllhll llpiaipyae gqrkrrntih efkksakttl ikidpalkik 61tkkvntadqc anrctrnkgl pftckafvfd karkqclwfp fnsmssgvkk efghefdlye 121nkdyirncii gkgrsykgtv sitksgikcq pwssmipheh syrgkdlqen ycrnprgeeg 181gpwcftsnpe vryevcdipq csevecmtcn gesyrglmdh tesgkicqrw dhqtphrhkf 241lperypdkgf ddnycmpdg qprpwcytld phtrweycai ktcadntmnd tdvplettec 301iqgqgegyrg tvntiwngip cqrwdsqyph ehdmtpenfk ckdlrenycr npdgsespwc 361fttdpnirvg ycsqipncdm shgqdcyrgn gknymgnlsq trsgltcsmw dknmedlhrh 421ifwepdaskl nenycrnpdd dahgpwcytg nplipwdycp isrcegdttp tivnldhpvi 481scaktkqlrv vngiptrtni gwmvslryrn khicggslik eswvltarqc fpsrdlkdye 541awlgihdvhg rgdekckqvl nvsqlvygpe gsdlvlmkla φ avlddfvs tidlpnygct 601ipektscsvy gwgytgliny dgllrvahly imgnekcsqh hrgkvtlnes eicagaekig
661sgpcegdygg plvceqhkmr mvlgvivpgr gcaipnrpgi fvrvayyakw ihkiiltykv
721pqs(SEQ. ID. NO. 2).
實(shí)施例2
制造包含具有水吸收能力的dHGF的干燥粉末。所制造的組合物在干燥前包含大 約2. 5 μ g dHGF,37. 8g β -結(jié)晶性甘油一酸酯(單月桂酸1_甘油酯)、12. 6g β -結(jié)晶性 甘油一酸酯(單肉豆蔻酸1-甘油酯)、48g羥乙基纖維素(例如Natrosol )，以及將組合 物加至1200mL的水。
制備在水中的脂質(zhì)的混合物，其中將甘油一酸酯、單月桂酸1-甘油酯和單肉豆蔻 酸1-甘油酯與200g水混合，并加熱到70°C至75°C。在70°C至75°C下混合15分鐘后，將 脂質(zhì)溶液緩慢冷卻到20°C至30°C，以提供β-結(jié)晶性甘油一酸酯。采用其余部分的水溶解 凝膠形成化合物、羥乙基纖維素(例如Natrosol )，以及分散dHGF。將三種混合物或溶液 混合，并且噴霧干燥至最終含水量小于5% (例如在底層有液氮的容器中冷凍)。收集產(chǎn)品 的冷凍顆粒，并冷凍干燥至含水量小于5%。
實(shí)施例3
在其他實(shí)施方案中，制造只包含膠凝劑和甘油一酸酯的干燥粉末，并且將該干燥 粉末在包含dHGF的溶液(例如適合的緩沖劑)中重構(gòu)。所制造的組合物在干燥前包含 大約37. Sg單月桂酸1-甘油酯、12. 6g單肉豆蔻酸1-甘油酯、48g羥乙基纖維素(例如 Natrosol )、以及將組合物加至1200mL的水。
制備脂質(zhì)的混合物，其中將甘油一酸酯、單月桂酸1-甘油酯和單肉豆蔻酸1-甘油 酯與200g水混合，并加熱到70°C至75°C。在70°C至75°C下混合15分鐘后，將脂質(zhì)溶液緩 慢冷卻到20°C至30°C，以提供β-結(jié)晶性甘油一酸酯。采用其余部分的水溶解羥乙基纖維 素(例如Natrosol )。然后將所述兩種混合物或溶液(即甘油一酸酯混合物和羥乙基纖 維素混合物)混合，并且噴霧干燥至最終含水量小于5% (例如在底層有液氮的容器中冷 凍)。收集產(chǎn)品的冷凍顆粒，并冷凍干燥至含水量小于5%。然后將所述冷凍干燥粉末在包 含dHGF的溶液(例如包含大約2. 5 μ g dHGF的適合的緩沖劑)中重構(gòu)。所述重構(gòu)產(chǎn)品形 成準(zhǔn)備局部應(yīng)用于創(chuàng)傷的凝膠。
實(shí)施例4
在本試驗(yàn)中，通過(guò)使用差示掃描量熱法(DSC)分析制劑在加熱時(shí)的能量需求來(lái)確 定各種甘油一酸酯制劑的結(jié)晶度。
將包含β結(jié)晶性甘油一酸酯和水的乳膏ALL07001 (見(jiàn)表1)與粉末ALL07005A和 ALL07005F(見(jiàn)表2，其按照實(shí)施例2提出的方法制造并在DSC分析前重構(gòu))的結(jié)晶度進(jìn)行 比較。ALL07005C粉末沒(méi)有進(jìn)行重構(gòu)，并且將其包括其中作為對(duì)照。
表 1
乳膏組合物19
權(quán)利要求
1.一種穩(wěn)定化的蛋白質(zhì)組合物，其包含具有生物活性的蛋白質(zhì)或肽；以及至少一種甘油一酸酯，所述甘油一酸酯的熔融溫度大于或等于20°C。
2.權(quán)利要求1所述的組合物，其中蛋白質(zhì)為天然肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)的重組形式。
3.權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述的天然HGF的重組形式為HGF的五氨基酸截短 型(dHGF)。
4.權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述的天然HGF的重組形式選自由NK1、dNKl、NK2、 dNK2、NK3、dNK3、NK4 或 dNK4 組成的組。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述甘油一酸酯的熔融溫度大于或等于 25 °C。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述甘油一酸酯的熔融溫度大于或等于 30 "C。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述甘油一酸酯的熔融溫度大于或等于 35 "C。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述組合物還包含除了所述的至少一種 甘油一酸酯之外的抗病原劑。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述抗病原化合物選自由酰胺型局部麻 醉藥、尿素、咪唑衍生物、硝基咪唑衍生物和具有3-6個(gè)碳原子的二醇組成的組。
10.權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述抗病原劑是布比卡因。
11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的組合物，其還包含增粘劑。
12.權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述增粘劑為選自由羥乙基纖維素、甲基纖維素、 羥丙基纖維素、羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素(E464)和羥乙基甲基纖維素組成的組中 的纖維素衍生物。
13.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述的至少一種甘油一酸酯具有10、 11、12、13、14、15或16碳的碳鏈長(zhǎng)度。
14.一種穩(wěn)定化的蛋白質(zhì)組合物，其包含配制有具有10、11、12、13、14、15或16碳的碳鏈長(zhǎng)度的β -結(jié)晶性甘油一酸酯的dHGF 蛋白，其中所述dHGF在所述穩(wěn)定化的蛋白質(zhì)組合物中的濃度小于或等于50ng/ml。
15.權(quán)利要求14所述的組合物，其中所述制劑包含單月桂酸1-甘油酯或單肉豆蔻酸 1-甘油酯或這二者。
16.權(quán)利要求14-15中任一項(xiàng)所述的組合物，其還包含增粘劑。
17.權(quán)利要求14-16中任一項(xiàng)所述的組合物，其還包含抗菌劑。
18.權(quán)利要求17中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述增粘劑是羥乙基纖維素，并且所述 抗菌劑是布比卡因。
19.權(quán)利要求14-18中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述dHGF在所述穩(wěn)定化的蛋白質(zhì)組 合物中的濃度小于或等于lOng/ml。
20.一種制備權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)所述的組合物的方法，該方法包括提供包含dHGF蛋白和至少一種熔融溫度大于30°C的甘油一酸酯的溶液；并且干燥所述溶液以形成干顆粒，其中所述干燥過(guò)程保持所述甘油一酸酯的β -結(jié)晶性結(jié)構(gòu)。
21.權(quán)利要求20所述的方法，其中所述溶液還包含增粘劑。
22.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述增粘劑為選自由羥乙基纖維素、甲基纖維素、羥 丙基纖維素、羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素(E464)和羥乙基甲基纖維素組成的組中的 纖維素衍生物。
23.權(quán)利要求20-22中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述的至少一種甘油一酸酯具有10、 11、12、13、14、15或16碳的碳鏈長(zhǎng)度。
24.權(quán)利要求20-23中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述溶液還包含至少一種單獨(dú)的或與 所述至少一種甘油一酸酯組合的抗病原化合物。
25.權(quán)利要求M所述的方法，其中所述抗病原化合物是布比卡因。
26.權(quán)利要求M所述的方法，其中所述抗病原化合物選自由酰胺型局部麻醉藥、尿素、 咪唑衍生物、硝基咪唑衍生物和具有3-6個(gè)碳原子的二醇組成的組。
27.一種制備權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)所述的組合物的方法，該方法包括提供包含至少一種熔融溫度大于30°C的結(jié)晶性甘油一酸酯和增粘劑的溶液；冷凍噴霧干燥所述溶液以形成干顆粒，其中所述冷凍干燥過(guò)程保持所述甘油一酸酯的 β-結(jié)晶性結(jié)構(gòu)；提供包含天然HGF蛋白的重組形式的液體；以及在保留所述的至少一種甘油一酸酯的結(jié)晶性結(jié)構(gòu)的條件下，將包含所述HGF蛋白的所 述液體與包含所述至少一種甘油一酸酯和增粘劑的所述干顆粒相組合。
28.權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的天然HGF蛋白的重組形式是dHGF。
29.權(quán)利要求27或觀中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述增粘劑為選自由羥乙基纖維素、 甲基纖維素、羥丙基纖維素、羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素(E464)和羥乙基甲基纖維 素組成的組中的纖維素衍生物。
30.權(quán)利要求27-29中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述的至少一種甘油一酸酯具有10、 11、12、13、14、15或16碳的碳鏈長(zhǎng)度。
31.權(quán)利要求27-30中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述溶液還包含至少一種單獨(dú)的或與 所述至少一種甘油一酸酯組合的抗病原化合物。
32.權(quán)利要求31所述的方法，其中所述抗病原化合物是布比卡因。
33.權(quán)利要求31所述的方法，其中所述抗病原化合物選自由酰胺型局部麻醉藥、尿素、 咪唑衍生物、硝基咪唑衍生物和具有3-6個(gè)碳原子的二醇組成的組。
34.一種使用權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)所述的組合物來(lái)改善或改良對(duì)象的皮膚狀況的 方法，該方法包括確認(rèn)需要改善或改良皮膚狀況的制劑的對(duì)象；并且將權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)所述的組合物提供給所述對(duì)象。
35.權(quán)利要求34所述的方法，其中所述皮膚狀況是慢性糖尿病性皮膚潰瘍。
36.權(quán)利要求34所述的方法，其中所述皮膚狀況是裂傷。
37.權(quán)利要求34所述的方法，其中所述皮膚狀況是創(chuàng)傷。
38.權(quán)利要求34所述的方法，其中所述皮膚狀況是美容缺陷。
39.權(quán)利要求34所述的方法，其中所述皮膚狀況是皮膚腫瘤。
40.權(quán)利要求34所述的方法，其中所述皮膚狀況是基底細(xì)胞癌。
41.權(quán)利要求34-40中任一項(xiàng)所述的方法，該方法還包括測(cè)量所述皮膚狀況的改善或 改良情況。
42.一種穩(wěn)定化的蛋白質(zhì)組合物，其包含配制有單月桂酸1-甘油酯和單肉豆蔻酸1-甘油酯的HGF或HGF變異蛋白。
43.權(quán)利要求42所述的組合物，其還包含增粘劑。
44.權(quán)利要求43所述的組合物，其還包含抗病原劑。
45.權(quán)利要求43所述的組合物，其中所述增粘劑是羥乙基纖維素。
46.權(quán)利要求44所述的組合物，其中所述抗病原劑是布比卡因。
47.權(quán)利要求42-46中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述HGF或HGF變異蛋白選自由NK1、 dNKl、NK2、dNK2、NK3、dNK3、NK4 或 dNK4 或與所述 HGF 或 HGF 變異蛋白具有至少 80 %、85 %、 90 %、95 %、96 %、97 %、98 %或99 %的序列相似性或同源性的蛋白質(zhì)組成的組，條件是所述 相似的或同源的蛋白質(zhì)保留屬于所述HGF或HGF變異蛋白的功能，例如結(jié)合cMet受體、上 皮細(xì)胞促進(jìn)作用、細(xì)胞擴(kuò)散、誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制上皮細(xì)胞促進(jìn)作用、抑制細(xì)胞擴(kuò)散或抑制 細(xì)胞生長(zhǎng)。
48.一種穩(wěn)定化的蛋白質(zhì)組合物，其包含配制有單月桂酸1-甘油酯和單肉豆蔻酸1-甘油酯的dHGF蛋白。
49.權(quán)利要求48所述的組合物，其還包含增粘劑。
50.權(quán)利要求48所述的組合物，其中所述增粘劑是羥乙基纖維素。
51.權(quán)利要求48所述的組合物，其還包含抗病原劑。
52.權(quán)利要求48所述的組合物，其中所述抗病原劑是布比卡因。
53.一種穩(wěn)定化的蛋白質(zhì)組合物，其包含配制有單月桂酸1-甘油酯和單肉豆蔻酸1-甘油酯的恥 、離1、(1離1、離2、(1離2、離3、 dNK3、NK4 或 dNK4。
54.權(quán)利要求51所述的組合物，其還包含增粘劑。
55.權(quán)利要求53所述的組合物，其中所述增粘劑是羥乙基纖維素。
56.權(quán)利要求53所述的組合物，其還包含抗病原劑。
57.權(quán)利要求48所述的組合物，其中所述抗病原劑為布比卡因。
全文摘要
本發(fā)明的各個(gè)方面涉及用于穩(wěn)定化、儲(chǔ)存和輸送生物活性劑(特別是肽和核酸)的組合物和方法。特別優(yōu)選的實(shí)施方案包括包含重組天然人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)(如dHGF，一種五氨基酸截短型HGF變異體)、以及至少一種在體溫時(shí)保持為結(jié)晶形式的甘油一酸酯的組合物?？扇芜x的是，所述組合物可包含膠凝劑(例如乙基纖維素)、和/或抗病原化合物(例如布比卡因)。使用這些組合物來(lái)改善、改良或治療皮膚狀況的方法也是本發(fā)明的實(shí)施方案。
文檔編號(hào)A61K9/00GK102036651SQ200880127441
公開(kāi)日2011年4月27日 申請(qǐng)日期2008年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月2日
發(fā)明者阿克·林達(dá)爾 申請(qǐng)人:克霖固魯制藥股份有限公司