專利名稱：疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含HIV融合蛋白(具體地說為本文稱為F4的HIV融合蛋白)和穩(wěn) 定劑的新組合物；制備所述組合物的方法以及治療和/或預(yù)防HIV-I感染和/或獲得性免 疫缺陷綜合征AIDS的用途。HIV-I是AIDS的病因，而AIDS是世界上主要的健康問題之一。需要預(yù)防和/或治 療HIV感染的疫苗。
背景技術(shù)：
HIV-I是逆轉(zhuǎn)錄病毒科的RNA病毒。HIV基因組編碼至少9種蛋白，它們被分為3 類主要結(jié)構(gòu)蛋白Gag、Pol和Env，調(diào)節(jié)蛋白Tat和Rev，以及附屬蛋白Vpu、Vpr、Vif和Nef。 HIV基因組表現(xiàn)出所有逆轉(zhuǎn)錄病毒的5' LTR-gag-pol-env-LTR3'組織。HIV包膜糖蛋白gpl20是用于附著宿主細(xì)胞的病毒蛋白。該附著由結(jié)合至輔助T細(xì) 胞和巨噬細(xì)胞的兩個表面分子介導(dǎo)，這兩個表面分子稱為CD4和兩個趨化因子受體CCR-5 或CXCR-4之一。gpl20蛋白最初表達(dá)為較大的前體分子(gpl60)，然后其被翻譯后切割，產(chǎn) 生gpl20和gp41。gpl20蛋白通過連接gp41分子保留在病毒體表面上，gp41分子插入到 病毒膜中。gpl20蛋白是中和抗體的主要靶，但遺憾的是，gpl20蛋白的主要免疫原性區(qū)(V3 環(huán))也是蛋白的最易變部分。因此，認(rèn)為使用gpl20(或其前體gpl60)作為激發(fā)中和抗體 的疫苗抗原對于廣泛保護(hù)性疫苗的作用是有限的。gpl20蛋白的確也含有被細(xì)胞毒性T淋 巴細(xì)胞(CTL)識別的表位。這些效應(yīng)細(xì)胞能夠消除病毒感染的細(xì)胞，并因此構(gòu)成第二種主 要抗病毒免疫機(jī)制。與中和抗體的目標(biāo)區(qū)相反，某些CTL表位似乎在不同HIV株中相對保 守。為此，gpl20和gpl60可能是疫苗中的有用抗原性組分，所述疫苗例如包含抗原/組分 的混合物，其目的在于引發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)(特別是CTL)。HIV-I的非包膜蛋白包括例如內(nèi)部結(jié)構(gòu)蛋白，如Gag和pol基因的產(chǎn)物，和其它非 結(jié)構(gòu)蛋白，如 Rev、Nef、Vif 和 Tat (Green 等人，New England J. Med，324，5，308 及以下等 (1991)和 Bryant 等人(Ed. Pizzo)，Pediatr. Infect. Dis. J.，11，5，390 及以下等(1992)。HIV Nef在感染早期且沒有結(jié)構(gòu)蛋白的情況下表達(dá)。Nef基因編碼早期輔助HIV蛋白，其已經(jīng)顯示出具有若干活性。例如，已知Nef蛋 白引起⑶4、HIV受體和細(xì)胞表面的MHC I類分子的下調(diào)，但是關(guān)于這些功能的生物學(xué)重要 性還沒有確定。此外，Nef與T細(xì)胞信號途徑相互作用，并誘導(dǎo)活性狀態(tài)，這又可促進(jìn)更有 效的基因表達(dá)。某些HIV分離株在該區(qū)具有突變，這使它們不編碼功能性蛋白，且嚴(yán)重危害 它們在體內(nèi)的復(fù)制和致病性。Gag基因被翻譯為前體多聚蛋白，其被蛋白酶裂解，產(chǎn)生產(chǎn)物，所述產(chǎn)物包括基質(zhì) 蛋白(P 17)、衣殼(P24)、核衣殼(p9)、p6和兩個間隔肽p2和pi。Gag基因產(chǎn)生55千道爾頓(kD)的Gag前體蛋白，也稱作p55，其由未剪接的病毒 mRNA表達(dá)。在翻譯過程中，p55的N末端被肉豆蔻?；?，引發(fā)它與細(xì)胞膜的胞質(zhì)面相結(jié)合。 膜結(jié)合的Gag糖蛋白募集病毒基因組RNA的兩個拷貝連同引發(fā)病毒顆粒從感染細(xì)胞表面出芽的其它病毒蛋白和細(xì)胞蛋白。出芽后，在病毒成熟為4種被稱作MA(基質(zhì)[pl7])、CA(衣 殼[p24])、NC(核衣殼[p9])和p6的較小蛋白的過程中，p55被病毒編碼的蛋白酶(pol基 因的產(chǎn)物)裂解。除了 3種主要的Gag蛋白以外，所有Gag前體還含有若干其它區(qū)，它們被裂解出 來，并作為各種大小的肽保留在病毒體中。這些蛋白具有不同的作用，例如，P2蛋白具有調(diào) 節(jié)蛋白酶活性的預(yù)期作用，并有助于蛋白水解加工的正確定時。pl7(MA)多肽來源于p55的N末端的肉豆蔻?；┒?。大多數(shù)MA分子保持附著于 病毒體脂質(zhì)雙層的內(nèi)表面，使顆粒穩(wěn)定。一部分MA被募集到病毒體深層內(nèi)，它在那里變成 復(fù)合體的一部分，所述復(fù)合體運(yùn)送病毒DNA到細(xì)胞核。這些MA分子利于病毒基因組的核轉(zhuǎn) 運(yùn)，因?yàn)镸A上的親核信號可被細(xì)胞核輸入機(jī)器識別。該現(xiàn)象使HIV感染未分裂細(xì)胞，這是 逆轉(zhuǎn)錄病毒與眾不同的性質(zhì)。p24(CA)蛋白形成病毒顆粒的圓錐形核心。親環(huán)蛋白A已被證實(shí)與p55的p24區(qū) 相互作用，導(dǎo)致其摻入到HIV顆粒中。Gag與親環(huán)蛋白A之間的相互作用是必需的，因?yàn)榄h(huán) 孢菌素A所致該相互作用的破壞抑制病毒復(fù)制。Gag的NC區(qū)負(fù)責(zé)特異性識別所謂的HIV包裝信號。該包裝信號由位于病毒RNA 5'末端附近的4個莖環(huán)結(jié)構(gòu)組成，且足以介導(dǎo)異源RNA摻入到HIV-I病毒體中。NC通過由 兩個鋅指基序介導(dǎo)的相互作用與包裝信號結(jié)合。NC也促進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄。p6多肽區(qū)介導(dǎo)p55Gag與輔助蛋白Vpr之間的相互作用，導(dǎo)致Vpr摻入到組裝中 的病毒體中。P6區(qū)還含有所謂的晚期結(jié)構(gòu)域，其是從感染細(xì)胞有效釋放出芽病毒體所需要 的。Pol基因編碼含有早期感染中病毒所需的兩種活性的兩種蛋白，即RT和病毒DNA 整合到細(xì)胞DNA中所需的整合酶蛋白。Pol的初級產(chǎn)物被病毒體蛋白酶裂解，產(chǎn)生氨基末 端RT肽，其含有DNA合成所需的活性(RNA和DNA依賴性DNA聚合酶活性以及RNA酶H功 能)，并產(chǎn)生羧基末端整合酶蛋白。HIV RT是全長RT(p66)和缺少羧基末端RNA酶H結(jié)構(gòu) 域的裂解產(chǎn)物(P51)的異二聚體。RT是由逆轉(zhuǎn)錄基因組編碼的保守性最高的蛋白之一。RT的兩種主要活性是DNA Pol和核糖核酸酶H。RT的DNA Pol活性可互換地利用RNA和DNA作為模板，且與所有已知 的DNA聚合酶一樣，不能啟動DNA從頭合成，而是需要預(yù)先存在的分子作為引物(RNA)。隨著DNA合成進(jìn)行，所有RT蛋白固有的RNA酶H活性在除去RNA基因組的復(fù)制早 期起重要作用。其選擇性降解所有RNA-DNA雜種分子的RNA。在結(jié)構(gòu)上，聚合酶和核糖核酸 H占據(jù)分開的、不重疊的結(jié)構(gòu)域，其中Pol覆蓋Pol三分之二的氨基。p66催化亞單位折疊成5個不同的亞結(jié)構(gòu)域。它們的氨基末端23具有帶RT活性 的部分。這些的羧基末端是RNA酶H結(jié)構(gòu)域。WO 2006/013106描述了包含Nef或其免疫原性片段或衍生物和pl7Gag和/或 p24Gag或其免疫原性片段或衍生物的融合蛋白，其中當(dāng)pl7和p24Gag均存在時，它們之間 存在至少一種HIV抗原或免疫原性片段。在一個實(shí)施方案中，所述融合蛋白稱為F4。該類型的蛋白，尤其是F4，對沉淀、聚集、pH、光、攪拌、吸附和/或氧化敏感。這可 能是正確的，即便在抗原被凍干儲存以便隨后在臨用前用例如液體佐劑復(fù)溶時。這些現(xiàn)象， 尤其是沉淀、聚集和/或氧化，可能導(dǎo)致喪失有利的生物特性，例如免疫原性和/或抗原性，或者可能導(dǎo)致所述制劑產(chǎn)生其它不需要的特性。而且，人用藥物必須被充分表征，是穩(wěn)定且 安全的。硫柳汞已被用作防腐劑，以避免在某些制劑中的微生物生長，亞硫酸鈉已被用于 穩(wěn)定某些抗原。然而，這些試劑存在一些相關(guān)的缺點(diǎn)，具體地說，某些配方設(shè)計師不愿意使 用硫柳汞，因?yàn)樗麄兿Ｍ谝呙缰胁话衔?。亞硫酸鈉被認(rèn)為具有引起某些個體變 態(tài)反應(yīng)的可能性。因此，如果制劑中含有亞硫酸鈉，則需要在標(biāo)簽上警示，因?yàn)樗鲋苿┛?能不適用于所有個體。本發(fā)明人研究了向制劑加入諸如檸檬酸三鈉鹽、蘋果酸鈉鹽、葡萄糖和L-甲硫氨 酸的試劑，但這些試劑不具有所期望的作用。盡管如此，本發(fā)明人現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)，在沒有使用 亞硫酸鈉的情況下，所述蛋白，尤其是F4，可以是穩(wěn)定的。發(fā)明_既述因此，本發(fā)明提供HIV疫苗的原液制劑或組分，其包含a)免疫原性融合蛋白，其包含Nef或其免疫原性片段或衍生物，和pl7Gag和/或 p24Gag或其免疫原性片段或衍生物，其中當(dāng)pl7和p24Gag均存在時，它們之間存在至少一 種HIV抗原或免疫原性片段，和b)為含有硫醇官能團(tuán)的抗氧化劑的穩(wěn)定劑，其例如選自谷胱甘肽、一硫代甘油、半 胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸或其混合物。附圖簡述

圖1顯示了在F4的還原條件下的SDS-PAGE分析。圖2顯示了 F4的溶解度測定。圖3顯示了密碼子優(yōu)化的F4的考馬斯染色凝膠和蛋白質(zhì)印跡。圖4顯示了密碼子優(yōu)化的P51RT的考馬斯染色凝膠和蛋白質(zhì)印跡。圖5顯示了 RT/p55和RT/p66的溶解度測定。圖6顯示了在還原條件下多種F4蛋白的SDS-PAGE分析。圖7顯示了 F4co和羧酰胺化F4co純化之后的SDS-PAGE研究。以4_12% SDS凝 膠分離在F4co或F4C0Ca純化過程中收集的5 μ g的每種級分。凝膠以考馬斯藍(lán)染色。1 勻漿；2 =CM hyperZ洗脫液；3 =Q瓊脂糖洗脫液；4 純化的原液。圖8，依據(jù)純化方法I或方法II純化的F4、F4co和F4coca的SDS-PAGE分析。5 μ g 的每種蛋白在4-12% SDS凝膠上以還原條件(左側(cè))或非還原條件(右側(cè))分離。凝膠以 考馬斯藍(lán)染色。1 方法II-F4co ；2 方法II-F4coca ；3 方法I_F4coca ；4 方法I-F4 ；5 方 法I-羧酰胺化的F4。圖9，在非還原條件下通過SDS PAGE篩選螯合劑。圖10，非還原條件下的SDS-PAGE 含谷胱甘肽和一硫代甘油的制劑的T15天、4°C
最終原液穩(wěn)定性。圖11，非還原條件下的SDS-PAGE 含半胱氨酸和乙酰半胱氨酸的制劑的T15天、 4°C最終原液穩(wěn)定性。圖12，非還原條件下的SDS-PAGE 包含谷胱甘肽和一硫代甘油的凍干抗原(餅 塊)的復(fù)溶液。圖13，非還原條件下的SDS-PAGE 包含半胱氨酸和乙酰半胱氨酸的餅塊的復(fù)溶液。圖14，還原條件下的SDS-PAGE分析以包含MPL和QS21的脂質(zhì)體佐劑復(fù)溶包含 半胱氨酸和乙酰半胱氨酸的餅塊，于25°C 4小時后(離心前和離心后)。發(fā)明詳述有利的是，依據(jù)本發(fā)明使用以上b)部分列出的至少穩(wěn)定劑一硫代甘油或N-乙酰 半胱氨酸被認(rèn)為提供了與亞硫酸鈉相等或比亞硫酸鈉更好的穩(wěn)定性。也就是說，當(dāng)使用亞 硫酸鈉穩(wěn)定所述蛋白/抗原分子內(nèi)氧化時，觀察到似乎被終止但有些聚集，被認(rèn)為是由于 分子間氧化(即通過在分子間形成二硫鍵)。相比之下，當(dāng)以合適的水平使用一硫代甘油、 半胱氨酸或N-乙酰半胱氨酸中的一種或多種時，則沒有觀察到聚集，由此提供比亞硫酸鈉 更好的穩(wěn)定性。而且，抗原的溶解度得以保持/保留。盡管不希望被理論束縛，但一般認(rèn)為抗氧化劑中的硫醇官能團(tuán)連接蛋白中的硫醇 基團(tuán)，和/或優(yōu)先氧化，由此預(yù)防蛋白中的氧化。而且，在本發(fā)明的制劑中可以保持所需的蛋白特性，例如免疫原性和/或抗原性寸。一方面，所述穩(wěn)定劑為一硫代甘油。一方面，所述穩(wěn)定劑為半胱氨酸。一方面，所述穩(wěn)定劑為N-乙酰半胱氨酸。一方面，所述穩(wěn)定劑為谷胱甘肽。在至少一個方面，最終原液或液體制劑基本上沒有堿金屬亞硫酸鹽，例如亞硫酸 鈉。另一方面，最終原液或液體制劑基本沒有硫柳汞。所述穩(wěn)定劑可以以0.001% -2. 5%重量/體積的量存在，例如0.01%、0. 1%、 0. 2%,0. 3%,0. 4%,0. 5%,0. 6%、0. 7%、0. 8%、0. 9%或 1 %重量 / 體積，尤其是 0. 5%重
量/體積。可以如下制備抗氧化劑溶液-粉末或液體稱重-溶解于注射用水中，例如約80ml-將水加至預(yù)定限，例如至IOOml-用IMNaOH調(diào)節(jié)pH,例如至約pH 7. 5在本發(fā)明使用的構(gòu)建體和如本文所述的本發(fā)明組合物中，Nef可以為全長Nef。在一個實(shí)施方案中，Nef為非肉豆蔻?；?。在本發(fā)明使用的構(gòu)建體中，pl7Gag和p24Gag例如分別為全長pl7和p24。在一個實(shí)施方案中，所用的多肽包含pl7和p24Gag這二者或其免疫原性片段。在 這樣的構(gòu)建體中，p24Gag組分和pl7Gag組分由至少一種另外的HIV抗原或免疫原性片段 分隔，例如Nef和/或RT或其免疫原性片段或衍生物。或者，pl7或p24Gag可以分別提供。在另一個實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的多肽構(gòu)建體進(jìn)一步包含Pol或Pol衍生物，例 如RT或其免疫原性片段或衍生物。適用于本發(fā)明的RT的特定片段是這樣的片段其中RT 在C末端被截短，例如使得它們沒有羧基末端RNA酶H結(jié)構(gòu)域。一種這樣的沒有羧基末端RNA酶H結(jié)構(gòu)域的片段是本文所述的p51片段。本文所述的融合蛋白中的RT或免疫原性片段例如可以為P66RT或p51RT。用于本發(fā)明的融合蛋白或組合物的RT組分任選地包含在592位的突變，或者在非 HXB2菌株中的等同突變，使得甲硫氨酸通過突變?yōu)榱硪环N殘基如賴氨酸而被除去。該突變 的目的是除去在原核表達(dá)系統(tǒng)中用作內(nèi)部起始位點(diǎn)的位點(diǎn)。RT組分還可以或者備選地可以包含突變，以除去酶活性(逆轉(zhuǎn)錄酶)。因此，可以 存在K231來代替W。在用于本發(fā)明的包含p24和RT的融合蛋白中，其可以合理地使用其中p24在RT 之前的構(gòu)建體，因?yàn)楫?dāng)所述抗原在大腸桿菌中單獨(dú)表達(dá)時，觀察到P24的表達(dá)比RT好。本發(fā)明的具體構(gòu)建體包括以下1. p24-RT-Nef_pl7(在本文也稱為 F4)2. p24-RT*-Nef_pl73. p24-p51RT-Nef-pl74. p24-p51RT*-Nef_pl7*代表RT甲硫氨酸592突變?yōu)橘嚢彼嵋环矫?，所述融合蛋白為F4。在本發(fā)明的又一方面，所用的F4或其它融合蛋白可被化學(xué)處理，以幫助純化和/ 或保留所需的生物學(xué)特性。合適的化學(xué)處理包括羧甲基化、羧酰胺化、乙?；蛴萌?例如甲醛或戊二醛)處理。一方面，所述融合蛋白為F4co，其中編碼所述蛋白或其部分的多核苷酸已被密碼 子優(yōu)化。免疫反應(yīng)可通過適宜的免疫學(xué)測定檢測，例如ELISA (用于抗體反應(yīng))或使用適用 于細(xì)胞標(biāo)記和細(xì)胞因子的染色的流式細(xì)胞術(shù)(用于細(xì)胞反應(yīng))。用于本發(fā)明的HIV抗原的多肽構(gòu)建體能夠在體外系統(tǒng)中表達(dá)，包括原核生物系 統(tǒng)，例如大腸桿菌。有利的是，它們可通過常規(guī)純化方法純化。本文所述的融合蛋白當(dāng)在選定的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)時，可以是可溶性的，即它們以 顯著的量存在于表達(dá)系統(tǒng)的粗提物的上清液中。粗提物中融合蛋白的存在情況可以通過常 規(guī)方法檢測，例如在SDS凝膠上電泳、考馬斯染色和通過密度檢測檢查適宜的條帶。依據(jù)本 文實(shí)施例中所述的技術(shù)檢測，本發(fā)明的融合蛋白例如為至少50%可溶的，例如至少70%可 溶的，尤其是90%或以上可溶的。改善重組表達(dá)的蛋白的溶解度的技術(shù)是已知的，例如在原 核表達(dá)系統(tǒng)中，溶解度通過降低誘導(dǎo)基因表達(dá)時的溫度進(jìn)行改善。如本文所述的免疫原性片段將包含至少一種抗原表位，并展示出HIV抗原性，且 能夠在以適宜的構(gòu)建體提呈時(例如當(dāng)融合至其它HIV抗原或在載體上提呈時)產(chǎn)生針對 天然抗原的免疫應(yīng)答。通常，免疫原性片段包含來自HIV抗原的至少20個，例如50個、例 如100個連續(xù)氨基酸。所述組分可以作為液體組分提供，例如以1劑或2劑或作為冷凍干燥的(凍干的) 餅塊。組分制劑
8
一方面，提供液體制劑，其包括a)如本文所述的融合蛋白，b)任選的液體載體，例如注射用水，和c)穩(wěn)定劑，其選自谷胱甘肽、一硫代甘油、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸或其混合 物。以上內(nèi)容中的液體制劑可以指原液或一劑或兩劑的組分。液體制劑例如可以包含糖，例如蔗糖、葡萄糖、甘露醇或果糖，尤其是蔗糖。糖的量 以最終制劑的重量計例如可以為-10%，例如4%-5% (重量/重量)，例如4% (重量
/重量)。液體制劑例如可以包含精氨酸。每劑的精氨酸的合適量在200_400mM的范圍內(nèi)， 例如300-375mM，具體地說是在每個最終劑量中提供300mM。液體制劑還可以包含螯合劑，例如檸檬酸三鈉鹽、蘋果酸鈉鹽、葡萄糖、L-甲硫氨 酸或EDTA 二鈉(乙二胺四乙酸)，例如每劑在0. 5-2mM的范圍內(nèi)，例如1_1. 25mM,尤其是提 供每個最終劑量ImM。所述液體制劑還可以包含非離子表面活性劑，例如吐溫，如吐溫80。最終劑量中的 適宜量在0. 005%重量/體積至約0. 05%重量/體積的范圍內(nèi)，例如0. 012% -0. 015%重 量/體積，尤其是0. 012%重量/體積。吐溫用作溶解劑。然而，人們認(rèn)為吐溫可能包含殘余的過氧化物，其催化抗原的聚 集和/或降解。有利的是，本發(fā)明的抗氧化劑的用途被認(rèn)為猝滅該反應(yīng)。所述液體制劑還可以包含磷酸鹽(PO4),例如磷酸鈉，例如在最終劑量中l(wèi)_50mM， 例如 IOmM,如 4mM 或 5mM，如 4mM。本發(fā)明的液體制劑還可以包含痕量的其它組分，例如其可以為生產(chǎn)過程的殘余 物，例如tris HCL0因此，一方面，提供HIV疫苗的最終原液或組分，其包含a)免疫原性融合蛋白，其包含Nef或其免疫原性片段或衍生物，和pl7Gag和/或 p24Gag或其免疫原性片段或衍生物，其中當(dāng)pl7和p24Gag均存在時，在它們之間存在至少 一種HIV抗原或免疫原性片段，b)穩(wěn)定劑，其為包含硫醇官能團(tuán)的抗氧化劑，例如選自谷胱甘肽、一硫代甘油、半 胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸或其混合物，c) 重量/體積或以下的非離子表面活性劑，d)200_450mM 精氨酸，e)0. 5-2. OmM 螯合劑，和f)l-50mM 緩沖液。一方面，本發(fā)明的組分或最終制劑還含有防腐劑，例如硫柳汞。當(dāng)一起提供兩劑或 更多劑(例如10劑)時可能有需要。在本發(fā)明上下文中的硫醇官能團(tuán)意指相關(guān)分子中的至少一個-SH基。在本說明書上下文中的最終原液涉及純化的抗原、載體和其它賦形劑，但一般不 包括佐劑組分/賦形劑。原液是指給定容器中存在兩劑以上。因此，最終原液是包含抗原 和所有賦形劑但沒有佐劑且在分裝為單劑之前的制劑。
9
純化原液意指抗原，最少的賦形劑，例如懸浮在磷酸鹽緩沖液中的純化抗原。本文的HIV疫苗的組分是指一劑或兩劑抗原和除佐劑賦形劑之外的所有賦形劑 組分。在本發(fā)明的一方面，純化原液在以下緩沖液中產(chǎn)生Tris 10mM、精氨酸 400mM(100mM,200mM 或 300mM)、亞硫酸鈉 10mM、EDTA ImM、殘余的吐溫 80，pH 為 8. 5。本發(fā)明還擴(kuò)展至含亞硫酸鹽的液體制劑，但其還包含帶有至少一個硫醇基團(tuán)的抗 氧化劑，如本發(fā)明所使用的。亞硫酸鹽例如可以或以下的水平存在，例如0.5%或以下， 具體地說是0. 或以下，尤其是0. 05%或以下(重量/重量或重量/體積)。在一個實(shí)施方案中，除去原液純化抗原(其是原液中的組分)中的任何殘余的亞 硫酸鹽穩(wěn)定劑，以提供沒有任何殘余亞硫酸鹽的最終原液。在該方面，最終原液將具有低于 0. 05%的亞硫酸鹽含量，例如低于0. 01 %，尤其是0。該原液可被冷凍干燥(凍干)得到凍干餅，其用佐劑復(fù)溶。在一個實(shí)施方案中，用625 μ 1佐劑復(fù)溶的500 μ 1人用劑量餅塊包含F(xiàn)410-30-90 μ g蔗糖4%精氨酸300mMN-乙酰半胱氨酸0. 5 %重量/體積EDTA 二鈉ImM吐溫800.012%重量/體積PO44mMTris-HCl殘余6. 1 士0.2(當(dāng)用佐劑復(fù)溶時，但如果pH 用注射用水復(fù)溶，則pH為約7. 5)在加入液體佐劑制劑之前最終液體制劑的pH可以為pH 6. 50-pH8. 5，例如約pH 7. 5，例如 7. 5 士0. 1。在另一個實(shí)施方案中，將最終原液分為含有一劑或兩劑液體制劑的單獨(dú)小瓶。該 液體制劑可以用如上所述的佐劑重構(gòu)，或者可以凍干，以便以后用例如佐劑或注射用水復(fù) 溶。因此，所述液體制劑可以包含所述抗原、穩(wěn)定劑和液體載體，例如注射用水，但一 般將包含除佐劑賦形劑/組分之外的所有賦形劑，例如就最終原液而言。在加入液體佐劑制劑之前本發(fā)明的重構(gòu)制劑的pH可以為例如pH6. 00至pH 7. 00， 例如約PH 6. 1。在一個實(shí)施方案中，提供最終的液體抗原制劑。在本說明書上下文中的最終液體 抗原制劑意指少于10劑抗原，例如1劑或2劑抗原，并具有除佐劑組分之外的所有賦形劑。因此，HIV疫苗的最終液體抗原制劑和組分在本文可交互使用。在本說明書上下文中的疫苗(或最終疫苗制劑)是適于注射入人類患者的制劑， 且例如可以為最終液體制劑加佐劑組分，或適宜時用佐劑重構(gòu)的凍干抗原。在一個實(shí)施方案中，提供本發(fā)明的最終疫苗制劑。本文的最終制劑是指包含所有 必需的疫苗組分(包括佐劑組分)的制劑。
可能有利的是提供為單獨(dú)組分的疫苗制劑，例如在單獨(dú)小瓶中的兩種液體制劑 (液體抗原制劑和液體佐劑組分)，因?yàn)榕c其中疫苗制劑以存在的所有組分(包括佐劑組 分)提供的形式相比，抗原以該形式可具有更長的保存期。包含例如液體佐劑制劑的液體組分可能需要儲存于約4°C。在一個實(shí)施方案中，凍干本發(fā)明的抗原和穩(wěn)定劑。適當(dāng)?shù)膬龈煽赡苄枰嬖谔腔?其它賦形劑，例如本文所列的，如蔗糖。在該實(shí)施方案中，本文所述的一種或多種最終原液 制劑可以與本發(fā)明使用的穩(wěn)定劑一起凍干，所述穩(wěn)定劑例如N-乙酰半胱氨酸、半胱氨酸、 一硫代甘油或其混合物，例如N-乙酰半胱氨酸、半胱氨酸或一硫代甘油。如果是凍干制品，則其可具有提供長期非常穩(wěn)定的組分的優(yōu)勢，例如與最終液體 制劑相比。本文所述的凍干制品比沒有穩(wěn)定劑的相應(yīng)凍干制品更穩(wěn)定，尤其是在抗原以 “高”濃度/劑量存在時，例如超過50 μ g的劑量，例如60μ g、70y g、80y g、90y g或100μ g 以上。在凍干過程中，可以減少制劑中的組分的有效量，其在制備制品時必須被考慮到。 因此，當(dāng)本文使用術(shù)語最終劑量時，其是指適于或準(zhǔn)備用于給予患者的包含重構(gòu)劑量的疫 苗制劑，因此考慮由于凍干造成的任何損失。本發(fā)明還擴(kuò)展至包含最終液體制劑或以下組分的預(yù)充注射器a)包含本發(fā)明的抗原和穩(wěn)定劑的液體組分，或b)液體佐劑制劑。當(dāng)注射器含有包含抗原和穩(wěn)定劑的液體組分時，則可將佐劑吸入注射器中，以提 供最終制劑給予患者。包含抗原的預(yù)充注射器和包含佐劑的小瓶可以作為藥盒提供。或者，在佐劑預(yù)充入注射器中時，則液體抗原可被吸入到注射器中，以提供最終制 劑給予患者。包含佐劑的預(yù)充注射器和包含液體抗原或凍干抗原的小瓶可以作為藥盒提供。在 后一種情況下(即當(dāng)抗原被凍干時)，注射器中的佐劑可用于重構(gòu)小瓶中的抗原，然后該疫 苗制劑可根據(jù)需要被吸回到注射器中，并給予患者?；蛘?，藥盒可以以預(yù)充佐劑的小瓶和本發(fā)明的凍干抗原或液體抗原的獨(dú)立小瓶提{共。本發(fā)明還擴(kuò)展至凍干本發(fā)明的組分或組合物的方法或工藝。本發(fā)明還涉及通過混合以下組分形成疫苗的工藝a)本發(fā)明的液體抗原組分和液體佐劑制劑，以提供最終疫苗(例如1個最終劑量 的疫苗或2個最終劑量的疫苗)；或b)本發(fā)明的凍干抗原制劑和液體佐劑制劑，以提供最終疫苗。在一個實(shí)施方案中，使用未硅化的玻璃小瓶儲存最終原液。 在一個實(shí)施方案中，使用3mL硅化的玻璃小瓶裝本發(fā)明的抗原組分或最終疫苗制 劑。在本發(fā)明的一方面，用于儲存本發(fā)明的組分制劑或本發(fā)明的疫苗制劑的小瓶是琥 珀色的，以避光保護(hù)所述制劑。表達(dá)
11
多核苷酸可用于在選定的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)編碼多肽。至少一種HIV抗原，例如RT， 可由多核苷酸中的密碼子優(yōu)化序列編碼，也就是說，為了在選定的重組表達(dá)系統(tǒng)如大腸桿 菌中表達(dá)而對所述序列進(jìn)行了優(yōu)化?？梢允褂胮51RT多肽或其衍生物或編碼其的多核苷酸，其任選地被密碼子優(yōu)化， 以便在適宜的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，尤其是原核系統(tǒng)，例如大腸桿菌。p51RT多肽或多核苷酸可以單獨(dú)使用，或者與多肽或多核苷酸構(gòu)建體組合使用。工藝本文所述的多肽例如可以通過包括以下步驟的工藝純化i)提供包含未純化的多肽的組合物；ii)對組合物實(shí)施至少兩個層析步驟；iii)任選地羧酰胺化多肽；iv)進(jìn)行緩沖交換步驟，以提供在適于藥物制劑的緩沖液中的蛋白。羧酰胺化可在兩個層析步驟之間進(jìn)行。羧酰胺化步驟可以使用碘乙酰亞胺進(jìn)行。在一種工藝中，使用不超過兩個層析步驟。一方面，本發(fā)明提供制備最終原液或疫苗組分的方法，如以下的流程圖所示。組合物/處理方法本發(fā)明的穩(wěn)定的融合蛋白可以與以下物質(zhì)共給予和/或共配制 一種或多種其它的HIV多肽和/或HIV融合蛋白， 編碼用于本發(fā)明的融合蛋白的多核苷酸，和/或 病毒載體，例如編碼一種或多種HIV抗原(尤其是如本文所述的HIV抗原)的 腺病毒載體。所述多核苷酸可存在于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的眾多遞送系統(tǒng)的任一種內(nèi)，包 括核酸表達(dá)系統(tǒng)，如質(zhì)粒DNA、細(xì)菌和病毒表達(dá)系統(tǒng)。許多基因遞送技術(shù)都是本領(lǐng)域熟知的， 如 Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15 :143_198，1998 和其中引用的參 考文獻(xiàn)所描述的那些。適宜的核酸表達(dá)系統(tǒng)含有在患者中表達(dá)必需的DNA序列(如適宜的 啟動子和終止信號)。當(dāng)表達(dá)系統(tǒng)是重組活微生物(如病毒或細(xì)菌)時，目標(biāo)基因可被插入到活的重組 病毒或細(xì)菌的基因組中。使用該活載體接種和體內(nèi)感染將導(dǎo)致抗原的體內(nèi)表達(dá)和免疫反應(yīng) 的誘導(dǎo)。用于該目的的病毒和細(xì)菌是例如痘病毒(例如牛痘、禽痘、金絲雀痘、修飾的痘病 毒，例如修飾的病毒Ankara(MVA))、甲病毒(新培斯病毒、Semliki Forest病毒、委內(nèi)瑞拉 馬腦炎病毒)、黃病毒(黃熱病病毒、登革熱病毒、日本腦炎病毒)、腺病毒、腺相關(guān)病毒、小 RNA病毒(脊髓灰質(zhì)炎病毒、鼻病毒)、皰疹病毒(水痘帶狀皰疹病毒等)、麻疹病毒(例如 麻疹，如Schwartz株或由其獲得的株)、李斯特菌、沙門氏菌、志賀氏菌、奈瑟氏菌、BCG。這 些病毒和細(xì)菌可以是有毒的，或以各種方式減毒，以獲得活疫苗。用作活載體的腺病毒包括例如Ad5或Ad35或非人來源的腺病毒，如非人靈長類動 物腺病毒，如猿腺病毒。一般而言，所述載體是復(fù)制缺陷的。通常，這些病毒含有El缺失， 且可在用El基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系上生長。適宜的猿腺病毒是分離自黑猩猩的病毒。具體而 言，C68(也稱作Pan 9)(見美國專利號6083716)和Pan 5、6和Pan 7 (W003/046124)對于 本發(fā)明的用途是優(yōu)選的?？刹僮鬟@些載體，以插入異源多核苷酸，使得所述多肽可在體內(nèi)表達(dá)。這類重組腺病毒載體的應(yīng)用、配制和制造詳述于WO 03/046142。本發(fā)明的組合物還可以包括在混合物中的其它HIV抗原，例如gpl20多肽、NefTat 融合蛋白，例如WO 99/16884所述。NefTat融合蛋白以及gpl20多肽/蛋白的制備描述于 WO 01/54719。在一個實(shí)施方案中，gpl20多肽/蛋白混合在本發(fā)明的制劑中。使用本發(fā)明組分的疫苗可用于對抗/針對HIV和/或AIDS (尤其是HIV)的預(yù)防 性和/或治療性免疫。本發(fā)明進(jìn)一步提供如本文所述的在制備用于對抗/針對HIV和/或AIDS (尤其是 HIV)的預(yù)防性和/或治療性免疫的疫苗中的任何方面的用途。疫苗制備通常描述于 New Trends and Developments in Vaccines, Voller 等人 編輯，University Park Press, Baltimore, Maryland, U. S. A. 1978。在脂質(zhì)體內(nèi)的包囊化 例如由Fullerton，美國專利4，235，877描述。蛋白與大分子的綴合例如由Likhite，美國 專利4，372，945和Armor等人，美國專利4，474，757公開。疫苗劑量中的蛋白量可以選擇這樣的量其在一般疫苗接種者中誘導(dǎo)適宜的免疫 應(yīng)答或免疫保護(hù)反應(yīng)，而沒有顯著的不利副作用。這樣的量將根據(jù)所用的具體免疫原和所 選擇的接種方案而有所變化。通常，預(yù)期各劑含有1-1000 μ g每種蛋白，例如2-200μ g每 種蛋白，如3-100 μ g每種蛋白，具體地說是10、20、30、40、50、60、70、80或90μ g多肽融合 體，尤其是10、30或90 μ g多肽融合體(在本文也稱為融合蛋白)。如果在制劑混合物中使用gpl20，則每劑的量例如將少于100 μ g，例如50 μ g或以 下，具體地說為 25μ g、20y g、10y g、5y g。具體疫苗的最佳量可通過標(biāo)準(zhǔn)研究確定，包括受試者的抗體效價和其它免疫反應(yīng) 的觀察。在初始接種后，受試者可于約4、5、6、7、8、9、10、11、12、16或24周接受加強(qiáng)，隨后 再于 4、5、6、7、8、9、10、11 或 12、16、20、24、28、32、36、40、44、48 或 50 周接受第二次加強(qiáng)。或者，受試者可于約4、5、6、7、8、9、10、11、12、16或24周接受加強(qiáng)，隨后再于4、8、 12、16、20、24、28、32、36、40、44、48 或 52 周接受第二次加強(qiáng)。適于給予的融合蛋白的最終疫苗制劑將包含佐劑。佐齊[J一般描述于 Vaccine Design-the Subunit and AdjuvantApproach, Powell 禾口 Newman 編輯，Plenum Press, New York, 1995。適宜的佐劑包括鋁鹽，如氫氧化鋁或磷酸鋁，但還可以是鈣、鐵或鋅鹽，或者可以 是?；野彼峄蝓；恰㈥栯x子或陰離子衍生的多糖、或聚磷腈的不溶性混懸液。在本發(fā)明的制劑中，適合的佐劑組合物是誘導(dǎo)優(yōu)先的Thl反應(yīng)的組合物。哺乳動物免疫應(yīng)答具有兩個關(guān)鍵部分體液應(yīng)答和細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答。體液應(yīng)答包括產(chǎn)生循環(huán)抗體，其將結(jié)合它們特異性針對的抗原，由此中和抗原，并 有利于其隨后通過涉及為細(xì)胞毒性或吞噬細(xì)胞的其它細(xì)胞的方法清除。B細(xì)胞負(fù)責(zé)產(chǎn)生抗 體(胞漿B細(xì)胞)，以及保持免疫體液記憶(記憶B細(xì)胞)，即例如通過接種首次接觸抗原 后數(shù)年識別抗原的能力。細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答包括無數(shù)不同類型的細(xì)胞的相互影響，T細(xì)胞是其中之一。T細(xì)胞 被分為眾多不同的亞型，主要是⑶4+和⑶8+T細(xì)胞。
13
諸如巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞的抗原提呈細(xì)胞(APC)用作免疫系統(tǒng)的警衛(wèi)，為機(jī)體屏 蔽外源抗原。當(dāng)APC檢測到胞外的外源抗原時，這些抗原被吞噬(吞沒)在APC內(nèi)部，在那 里它們被加工為較小的肽。這些肽隨后被提呈至APC表面的主要組織相容性復(fù)合物II類 (MHC II)分子上，在那里它們被表達(dá)⑶4表面分子的抗原特異性T淋巴細(xì)胞(⑶4+T細(xì)胞) 識別。T輔助⑶4+T細(xì)胞為活化B細(xì)胞提供幫助，以產(chǎn)生和釋放抗體。T輔助⑶4+T細(xì)胞 還可以參與活化抗原特異性CD8+T細(xì)胞。在適宜的共刺激信號存在下，當(dāng)⑶8+T細(xì)胞特異性肽被主要組織相容性I類(MHC I)分子提呈至宿主細(xì)胞表面時，⑶8+T細(xì)胞識別這些肽。為了被提呈至MHC I分子上，外源 抗原需要直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部(細(xì)胞溶質(zhì)或核)，例如當(dāng)病毒或胞內(nèi)細(xì)菌直接穿透宿主細(xì)胞 時或DNA接種后就是這種情況。在細(xì)胞內(nèi)部，抗原被加工為小肽，其被加載至MHC I分子上， MHC I分子被再引導(dǎo)至細(xì)胞表面。在活化時，CD8+T細(xì)胞分泌一系列細(xì)胞因子，例如干擾素 Y，其活化巨噬細(xì)胞和其它細(xì)胞。具體地說，這些CD8+T細(xì)胞中的一部分在活化時分泌溶細(xì) 胞分子和細(xì)胞毒性分子(例如顆粒酶、穿孔蛋白)。這樣的CD8+T細(xì)胞被稱為細(xì)胞毒性T細(xì) 胞。最近，已描述了替代的抗原提呈途徑，其包括將胞外抗原或其片段加載至MHC I復(fù) 合物上，被稱為“交叉提呈”。在⑶4+T細(xì)胞中，T輔助I(Thl)亞型和T輔助2(Th2)亞型可以由它們在抗原識別 后產(chǎn)生的應(yīng)答類型限定。在識別肽-MHC II復(fù)合物時，ThlCD4+T細(xì)胞分泌白介素和細(xì)胞因 子，例如干擾素Y、IL-2和TNF-α。相反，Th2CD4+T細(xì)胞一般分泌白介素，例如IL_4、IL_5 或 IL-13。已知某些疫苗佐劑尤其適于刺激Thl或Th2型細(xì)胞因子應(yīng)答。傳統(tǒng)上，接種或感 染后免疫應(yīng)答的Thl :Th2平衡的最佳指示包括直接測量用抗原再刺激后由T淋巴細(xì)胞在體 外產(chǎn)生的Thl或Th2細(xì)胞因子，和/或檢測抗原特異性抗體應(yīng)答的IgGl IgG2a比率。因此，Thl型佐劑是這樣一種佐劑其在用抗原體外再刺激時刺激分離的T細(xì)胞群 產(chǎn)生高水平的Thl型細(xì)胞因子，并誘導(dǎo)與Thl型同種型相關(guān)的抗原特異性免疫球蛋白應(yīng)答?？杀慌渲埔陨a(chǎn)適用于本發(fā)明的佐劑的優(yōu)選Thl-型免疫刺激劑包括但不限于以 下佐劑。單磷酰脂A，特別是3-脫-0-?；瘑瘟柞Ｖ珹 (3D-MPL)，是用于本發(fā)明的優(yōu)選Thl 型免疫刺激劑。3D-MPL是由Ribi Immunochem，Montana制造的眾所周知的佐劑?；瘜W(xué)上， 常常以帶有4、5或6條?；湹?-脫-0-酰化單磷酰脂A的混合物提供。它可通過GB 2122204B中教導(dǎo)的方法純化并制備，該文獻(xiàn)還公開了二磷酰脂A及其3-0-脫?；凅w的制 備。已描述了其它純化的和合成的脂多糖(US 6，005，099和EP 0 729 473B l;Hilgers等， 1986，Int. Arch. Allergy. Immunol. ,79(4) :392_6 ；Hilgers 等，1987，Immunology, 60 (1) 141-6 JPEP 0 549 074B1)。優(yōu)選形式的3D-MPL為具有直徑小于0. 2 μ m的小粒度的顆粒 劑形式，其生產(chǎn)方法公開于EP 0 689 454。皂苷也是符合本發(fā)明的優(yōu)選Thl免疫刺激劑。皂苷是眾所周知的佐劑，講述于 Lacaille-Dubois,M禾口Wagner H. (1996. A review ofthebiological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine，第 2 卷，363-386 頁)。例如，Quil A(來自南美
14Quillaja Saponaria Molina 樹的樹皮)及其分離級分描述于 US 5，057，540 和“Saponins as vaccineadjuvants，，,Kensi 1, C. R. ,Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996,12 (1-2) 1-55;以及EP 0 362 279 Bi。溶血皂苷QS21和QS17 (HPLC純化的Quil A分離級分)已 被描述為有效的系統(tǒng)性佐劑，其生產(chǎn)方法公開于美國專利第5，057，540號和EP 0 362 279 Bi。在這些參考文獻(xiàn)中還描述了用作系統(tǒng)性疫苗的有效佐劑的QS7 (Quil A的非溶血性級 分)的用途。QS21 的用途進(jìn)一步描述于 Kensil 等(1991. J. Immunology 146 卷，431-437)。 QS21與聚山梨醇酯或環(huán)糊精的組合也為人所知(W099/10008)。包含Quil A的分離級分如 QS21和QS7的顆粒佐劑系統(tǒng)描述于WO 96/33739和WO 96/11711。一種這樣的系統(tǒng)被稱為 ISC0M，并可以包含一種或多種皂苷。另一種適宜的免疫刺激劑是含有未甲基化的CpG 二核苷酸(“CpG”)的免疫刺激性 寡核苷酸。CpG是存在于DNA中的胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸基序的縮寫。本領(lǐng)域已知CpG在 通過系統(tǒng)和粘膜途徑給予時是一種佐劑(W0 96/02555、EP 468520，Davis等，J. Immunol, 1998，160 (2) :870-876 ;McCluskie 和 Davis, J. Immunol. ,1998,161(9) :4463_6)。歷史上 觀察到BCG的DNA級分能夠發(fā)揮抗腫瘤作用。在進(jìn)一步的研究中，來自BCG基因序列的合 成寡核苷酸表現(xiàn)出能夠誘導(dǎo)免疫刺激作用(體內(nèi)和體外都如此)。這些研究的作者得出結(jié) 論包含中心CG基序的某些回文序列具備此活性。之后在Krieg，Nature 374，546頁，1995 的出版物中闡釋了 CG基序在免疫刺激中的核心作用。詳細(xì)的分析已表明，CG基序必須處 于一定的序列背景中，并且這些序列在細(xì)菌DNA中常見，但很少處于脊椎動物DNA中。免疫 刺激性序列常常是嘌呤、嘌呤、C、G、嘧啶、嘧啶；其中CG基序未被甲基化，但已知其它未甲 基化的CpG序列是免疫刺激性的，并且可用于本發(fā)明。在某些情況下存在6個核苷酸的回文序列組合。可在同一寡核苷酸中存在數(shù)個這 樣的基序，其或者為一種基序的重復(fù)或者為不同基序的組合。一種或多種這樣的含免疫刺 激性序列的寡核苷酸的存在可以激活多種免疫亞群，包括天然殺傷細(xì)胞(其產(chǎn)生干擾素Y 并具有溶細(xì)胞活性)和巨噬細(xì)胞(Wooldrige等，89卷(第8章)，1977)。其它含未甲基化 CpG但不具有這一共有序列的序列現(xiàn)在也已被證實(shí)具有免疫調(diào)節(jié)性。本發(fā)明人還推定，實(shí)際上這些含“CpG”的序列也對氧化敏感，加入本發(fā)明使用的含 硫醇的還原性基團(tuán)具有降低或消除這種不需要的氧化的進(jìn)一步的好處。在配制成疫苗時，CpG通常以游離溶液與游離抗原一起施用(W096/02555 ； McCluskie和Davis，出處同上)，或共價綴合至抗原(W098/16247)，或與諸如氫氧化鋁之 類的載體配制在一起((肝炎表面抗原)Davis等，出處同上；Brazolot-Millan等，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA,1998,95(26)，15553-8)。上述這些免疫刺激劑可以與載體一起配制，所述載體例如為脂質(zhì)體、水包油乳劑 和/或金屬鹽，包括鋁鹽(如氫氧化鋁)。例如，3D-MPL可與氫氧化鋁(EP O 689 454)或水 包油乳劑(W0 95/17210) 一起配制；QS21可有利地與含有膽固醇的脂質(zhì)體(W0 96/33739)、 水包油乳劑(W0 95/17210)或鋁佐劑(alum) (W0 98/15287) 一起配制；CpG可以與鋁佐劑 (Davis等，出處同上；Brazolot-Millan，出處同上)或其它陽離子載體一起配制。還優(yōu)選免疫刺激劑的組合，具體地說是單磷酰脂A和皂苷衍生物的組合(W0 94/00153 ；WO 95/17210 ；WO 96/33739 ；WO 98/56414 ；WO 99/12565 ；WO 99/11241)，更具體 地說是如WO 94/00153所公開的QS21和3D-MPL的組合?；蛘撸珻pG加皂苷(如QS21)的
15組合也構(gòu)成了一種用于本發(fā)明的有效佐劑?；蛘撸碥湛梢耘渲圃谥|(zhì)體或ISCOM中，并與 免疫刺激性寡核苷酸組合。增強(qiáng)的系統(tǒng)包括單磷酰脂A和皂苷衍生物的組合，特別是W094/00153中公開的 QS21和3D-MPL的組合，或WO 96/33739中公開的反應(yīng)原性較低的組合物，其中QS21在含膽 固醇的脂質(zhì)體(DQ)中被猝滅。該組合還可以含有免疫刺激性寡核苷酸。水包油乳液形式的、含QS21、3D_MPL和生育酚的特別有效的佐劑制劑描述于WO 95/17210，是用于本發(fā)明的另一合適制劑。用于本發(fā)明制劑的特別適合的佐劑組合如下i)3D_MPL+QS21，在脂質(zhì)體制劑中ii)3D_MPL+QS21，在水包油乳劑中iii)3D_MPL+QS21+CpG，在脂質(zhì)體制劑中，和iv)3D_MPL+QS21+CpG，在水包油乳劑中在本發(fā)明的又一方面，提供一種制備本文所述的疫苗制劑的方法，其中所述方法 包括將本發(fā)明的多肽與適宜的佐劑混合。藥物組合物的給予可采用一個或一個以上的單獨(dú)劑量形式，例如含有相同多肽的 組合物的重復(fù)給藥，或異質(zhì)性“初免_加強(qiáng)”接種方案。異質(zhì)性初免_加強(qiáng)方案在初免和加 強(qiáng)時使用不同形式的疫苗給予，其各自本身可包括兩次或更多次給予。初免組合物和加強(qiáng) 組合物將共有至少一種抗原，雖然無需相同形式的抗原，但它可以是不同形式的相同抗原。本發(fā)明的初免加強(qiáng)免疫可使用蛋白和基于DNA的制劑或病毒載體制劑的組合進(jìn) 行。這種策略被認(rèn)為有效誘導(dǎo)廣泛的免疫反應(yīng)。含佐劑的蛋白疫苗主要誘導(dǎo)抗體和T輔助 免疫反應(yīng)，而DNA作為質(zhì)?；蚧钶d體的遞送誘導(dǎo)強(qiáng)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)。因此， 蛋白和DNA或病毒載體接種的組合將提供廣泛的免疫反應(yīng)。這在HIV背景下特別有意義， 因?yàn)橹泻涂贵w、CD4+T細(xì)胞和/或CTL被認(rèn)為對抵抗HIV的免疫防御很重要。根據(jù)本發(fā)明，接種方案可包括順序(“初免_加強(qiáng)”)給予本發(fā)明的多肽抗原和編 碼所述多肽的DNA。所述DNA可以裸DNA如質(zhì)粒DNA或重組活載體(如痘病毒載體、腺病毒 載體)或任何其它適宜活載體的形式遞送。蛋白抗原可注射一次或若干次，接著是一次或 多次DNA或病毒載體給藥，或者可首先使用DNA或病毒載體進(jìn)行一次或多次給藥，接著進(jìn)行 一次或多次蛋白免疫。本發(fā)明的初免_加強(qiáng)免疫的具體例子包括用DNA、重組活載體(如修飾的痘病毒載 體，例如修飾的病毒Ankara(MVA)載體，或甲病毒載體，例如委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒載體或腺 病毒載體)初免，接著用蛋白(例如佐劑化蛋白)加強(qiáng)。初免組合物和加強(qiáng)組合物均可以超過一劑遞送。此外，可在初始的初免和加強(qiáng)給 藥之后，可交替地進(jìn)一步給藥，得到例如DNA質(zhì)粒或病毒載體初免/蛋白加強(qiáng)/進(jìn)一步的 DNA質(zhì)?；虿《据d體給藥/進(jìn)一步的蛋白給藥。替代的初免加強(qiáng)方案例如可以包括用一劑 或兩劑蛋白初免，隨后用DNA或病毒載體進(jìn)行一次或兩次加強(qiáng)。所述密碼子優(yōu)化是指多核苷酸序列被優(yōu)化，從而類似目標(biāo)表達(dá)系統(tǒng)(例如原核生 物系統(tǒng)，如大腸桿菌)中基因的密碼子選擇。具體而言，序列中的密碼子選擇被優(yōu)化，從而 類似高表達(dá)的大腸桿菌基因的密碼子選擇。為在本發(fā)明重組系統(tǒng)中表達(dá)而優(yōu)化密碼子的目的有兩重提高重組產(chǎn)物的表達(dá)水
16平并使表達(dá)產(chǎn)物更均勻(獲得更均勻的表達(dá)模式)。均勻性提高意味著無關(guān)的表達(dá)產(chǎn)物如 截短物更少。適于大腸桿菌表達(dá)的密碼子選擇還可消除推斷的“移碼”序列以及過早終止 和/或內(nèi)部起始位點(diǎn)。DNA代碼有4個字母(A、T、C和G)，且使用這些拼成三個字母的“密碼子”，其代表 生物基因中編碼的蛋白的氨基酸。沿著DNA分子的密碼子線性序列被翻譯成由那些基因編 碼的蛋白中的氨基酸線性序列。代碼是高度簡并的，61個密碼子編碼20種天然氨基酸，3 個密碼子代表“終止”信號。因此，大部分氨基酸由一個以上的密碼子編碼-事實(shí)上，數(shù)個 氨基酸由4個或更多不同的密碼子編碼。當(dāng)一個以上的密碼子可用于編碼已知氨基酸時，觀察到生物的密碼子選擇模式是 高度非隨機(jī)的。不同物種顯示它們密碼子選擇的不同偏好，而且，密碼子的利用在單一物種 的以高水平和低水平表達(dá)的基因之間可能顯著不同。這種偏好在病毒、植物、細(xì)菌和哺乳動 物細(xì)胞中是不同的，且某些物種較之其它物種顯示出遠(yuǎn)離隨機(jī)密碼子選擇的更強(qiáng)偏好。例 如，人和其它哺乳動物與某些細(xì)菌或病毒相比，偏好不太強(qiáng)。由于這些原因，存在顯著可能 性的是在大腸桿菌中表達(dá)的哺乳動物病毒的病毒基因，或在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的外源 或重組基因，對于有效表達(dá)具有不適當(dāng)?shù)拿艽a子分布。據(jù)信存在密碼子簇的異源DNA序列或 在將要表達(dá)的宿主中很少觀察到的密碼子冗余，預(yù)示著在該宿主中的異源表達(dá)水平較低。在本發(fā)明的多核苷酸中，密碼子選擇模式因此可由人免疫缺陷病毒的典型模式發(fā) 生改變，從而更接近代表靶生物(例如大腸桿菌)的密碼子偏好。用于密碼子優(yōu)化的可公開得到的程序有很多，例如，“CalcGene” (Hale and Thompson, Protein Expression and Purificationl2 :185—189 (1998)。本發(fā)明還擴(kuò)展至谷胱甘肽、一硫代甘油、半胱氨酸和N-乙酰半胱氨酸或其混合物 (具體地說是一硫代甘油、半胱氨酸或N-乙酰半胱氨酸)穩(wěn)定HIV疫苗組分的作用，所述 HIV疫苗組分例如包含免疫原性融合蛋白，所述免疫原性融合蛋白包含Nef或其免疫原性 片段或衍生物，和pl7Gag和/或p24Gag或其免疫原性片段或衍生物，其中當(dāng)pl7和p24Gag 均存在時，則在它們之間存在至少一種HIV抗原或免疫原性片段，所述融合蛋白具體地說 為F4。在替代的方面或其它的方面，本發(fā)明提供本文描述的蛋白，例如在惰性環(huán)境中的 F4蛋白，例如在其中已除去氧和/或蛋白避光保護(hù)的容器中。這似乎還能夠最小化或消除 蛋白的聚集和/或降解。所述蛋白例如可以在氮?dú)庀聝Υ婧?或在琥珀色小瓶中儲存。在本說明書的上下文中的包含是指包含性的，也就是說，所述實(shí)施方案包括相關(guān) 元素，但不排除其它元素。本發(fā)明還擴(kuò)展至由本文描述的元素組成或基本由其組成的單獨(dú)的實(shí)施方案，正如 包含所述元素的方面/實(shí)施方案，反之亦然。在本文件的背景部分中的描述是為了將本發(fā)明置于上下文中。不應(yīng)被視為承認(rèn)所 述信息是已知的或是通常的一般知識。 顯示以下實(shí)施例是為了闡述可用于制備本發(fā)明的顆粒的方法。 實(shí)施例 實(shí)施例1 :HIV-lp24-RT-Nef-pl7融合體F4和密碼子優(yōu)化的F4 (co)的構(gòu)建和表達(dá)
17
1.未密碼子優(yōu)化的F4HIV-Igag p24(衣殼蛋白)和pl7 (基質(zhì)蛋白)、逆轉(zhuǎn)錄酶和Nef蛋白在嗜菌體T7 啟動子(PET表達(dá)系統(tǒng))的控制下，在大腸桿菌B834株(B834(DE3)是BL21(DE3)的甲硫氨 酸營養(yǎng)缺陷型親代)中表達(dá)。它們表達(dá)為含有4種蛋白的完整序列的單一融合蛋白。成熟的p24編碼序列來自 HIV-1BH10分子克隆，成熟的pl7序列和RT基因來自HXB2，且Nef基因來自BRU分離株。誘導(dǎo)后，重組細(xì)胞表達(dá)顯著水平的p24-RT-Nef-p 17融合蛋白，其占總蛋白的 10%。當(dāng)細(xì)胞在22°C下生長并誘導(dǎo)時，p24-RT-Nef-pl7融合蛋白主要限于細(xì)菌裂解物 的可溶性級分(甚至凍/融之后)。當(dāng)在30°C下生長時，約30%的重組蛋白與不溶性級分 關(guān)聯(lián)。融合蛋白p24-RT-Nef-pl7由1136個氨基酸組成，分子量約為129kDa。全長蛋白 在SDS凝膠上遷移至約130kDa。該蛋白基于其氨基酸序列具有7. 96的理論等電點(diǎn)(pi)， 這通過2D-凝膠電泳加以證實(shí)。重組質(zhì)粒的詳述名稱pRITl5436(或?qū)嶒?yàn)室名稱 pET28b/p24-RT_Nef-pl7)宿主載體pET28b復(fù)制子colEl選擇卡那霉素啟動子T7插入序列p24-RT-Nef-pl7融合基因重組蛋白的詳述p24-RT-Nef-pl7 融合蛋白1136 個氨基酸N-末端-p24 232個氨基酸-鉸鏈區(qū)2個氨基酸-RT 562個氨基酸-鉸鏈區(qū)2 個氨基酸-Nef 206個氨基酸-P17 132個氨基酸-C-末端核苷酸和氨基酸序列核苷酸序列atggttatcgtgcagaacatccaggggcaaatggtacatcaggccatatcacctagaactttaaatgcatgggtaaaagtagtagaagagaaggctttcagcccagaagtaatacccatgttttcagcattatcagaaggagccaccccacaagatttaaacaccatgctaaacacagtggggggacatcaagcagccatgcaaatgttaaaagagaccatcaatgaggaagctgcagaatgggatagagtacatccagtgcatgcagggcctattgcaccaggccagatgagagaaccaaggggaagtgacatagcaggaactactagtacccttcaggaacaaataggatggatgacaaataatccacctatcccagtaggagaaatttataaaagatggataatcctgggattaaataaaatagtaagaatgtatagccctaccagcattctggacataagacaaggaccaaaagaaccttttagagactatgtagaccggttctataaaactctaagagccgagcaagcttcacaggaggtaaaaaattggatgacagaaaccttgttggtccaaaatgcgaacccagattgtaagactattttaaaagcattgggaccagcggctacactagaagaaatgatgacagcatgtcagggagtaggaggacccggccataaggcaagagttttg jcatatgl' ggccccattagccctat
18tgagactgtgtcagtaaaattaaagccaggaatggatggcccaaaagttaaacaatggcc
attgacagaagaaaaaataaaagcattagtagaaatttgtacagagatggaaaaggaagg
gaaaatttcaaaaattgggcctgaaaatccatacaatactccagtatttgccataaagaa
aaaagacagtactaaatggagaaaattagtagatttcagagaacttaataagagaactca
agacttctgggaagttcaattaggaataccacatcccgcagggttaaaaaagaaaaaatc
agtaacagtactggatgtgggtgatgcatatttttcagttcccttagatgaagacttcag
gaaatatactgcatttaccatacctagtataaacaatgagacaccagggattagatatca
gtacaatgtgcttccacagggatggaaaggatcaccagcaatattccaaagtagcatgac
aaaaatcttagagccttttagaaaacaaaatccagacatagttatctatcaatacatgga
tgatttgtatgtaggatctgacttagaaatagggcagcatagaacaaaaatagaggagct
gagacaacatctgttgaggtggggacttaccacaccagacaaaaaacatcagaaagaacc
tccattccttaaaatgggttatgaactccatcctgataaatggacagtacagcctatagt
gctgccagaaaaagacagctggactgtcaatgacatacagaagttagtggggaaattgaa
ttgggcaagtcagatttacccagggattaaagtaaggcaattatgtaaactccttagagg
aaccaaagcactaacagaagtaataccactaacagaagaagcagagctagaactggcaga
aaacagagagattctaaaagaaccagtacatggagtgtattatgacccatcaaaagactt
aatagcagaaatacagaagcaggggcaaggccaatggacatatcaaatttatcaagagcc
atttaaaaatctgaaaacaggaaaatatgcaagaatgaggggtgcccacactaatgatgt
aaaacaattaacagaggcagtgcaaaaaataaccacagaaagcatagtaatatggggaaa
gactcctaaatttaaactgcccatacaaaaggaaacatgggaaacatggtggacagagta
ttggcaagccacctggattcctgagtgggagtttgttaatacccctcctttagtgaaatt
atggtaccagttagagaaagaacccatagtaggagcagaaaccttctatgtagatggggc
agctaacagggagactaaattaggaaaagcaggatatgttactaatagaggaagacaaaa
agttgtcaccctaactgacacaacaaatcagaagactgagttacaagcaatttatctagc
tttgcaggattcgggattagaagtaaacatagtaacagactcacaatatgcattaggaat
cattcaagcacaaccagatcaaagtgaatcagagttagtcaatcaaataatagagcagtt
aataaaaaaggaaaaggtctatctggcatgggtaccagcacacaaaggaattggaggaaa
tgaacaagtagataaattagtcagtgctggaatcaggaaagtgcta factatg| RRtRRca
aRtRRtcaaaaaRtaRtRtRRttRRatRRCctactRtaaRRRaaaRaatRaRacRaRctR
aRccaRcaRcaRatRRRRtRRRaRcaRcatctcRaRacctRRaaaaacatRRaRcaatca
CaaRtaRcaatacaRcaRctaccaatRctRcttRtRcctRRctaRaaRcacaaRaRRaRR
aRRaRRtRRRttttccaRtcacacctcaRRtacctttaaRaccaatRact
tacaaRRcaRctRtaRatcttaRccactttttaaaaRaaaaRRRRRRactRRaaRRRcta
attcactcccaacRaaRacaaRatatccttRatctRtRRatctaccacacacaaRRctac
ttccctRattRRcaRaactacacaccaRRRCcaRRRRtcaRatatccactRacctttRRa
tRRtRctacaaRctaRtaccaRttRaRccaRataaRRtaRaaRaRRccaataaaRRaRaR
aacaccaRcttRttacaccctRtRaRcctRcatRRaatRRatRaccctRaRaRaRaaRtR
tta^aRtRRaRRtttRacaRCCRCCtaRcatttcatcacRtRRCCCRaRaRCtRcatccR
gagtacttcaagaactgc jaggcctj atgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggaga
19
attagatcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaaaaaaaagcacagcaagcagcagctgacacaggacacagcaatcaggtcagccaaaattactaa [SEQ ID NO 1]p24序列以粗體表示Nef序列加下劃線方框通過基因構(gòu)建引入的核苷酸氨基酸序列MVIVQNIQGQMVHQAISPRTLNAWVKVVEEKAFSPEVIPMFSALSEGATP50QDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAGPIAPGQMREP100RGSDIAGTTSTLQEQIGWMTNNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTS150ILDIRQGPKEPFRDYVDRFYKTLRAEQASQEVKNWMTETLLVQNANPDCK200TILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPGHKARVL_ GPISPIETVSVKLKPG250MDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPVFAIKK300KDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAY350FSVPLDEDFRKYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMT400KILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYVGSDLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGLT450TPDKKHQKEPPFLKMGYELHPDKffTVQPIVLPEKDSffTVNDIQKLVGKLN500WASQIYPGIKVRQLCKLLRGTKALTEVIPLTEEAELELAENREILKEPVH550GVYYDPSKDLIAEIQKQGQGQWTYQIYQEPFKNLKTGKYARMRGAHTNDV600KQLTEAVQKITTESIVIWGKTPKFKLPIQKETWETffffTEYffQATffIPEffE650FVNTPPLVKLWYQLEKEPIVGAETFYVDGAANRETKLGKAGYVTNRGRQK700VVTLTDTTNQKTELQAIYLALQDSGLEVNIVTDSQYALGIIQAQPDQSES750ELYNQlIEQLIKKEKYYLAffYPAHKGIGGNEQYDKLYSAGIRKY_ MGGK800WSKSSVVGWPTVRERMRRAEPAADGVGAASRDLEKHGAITSSNTAATNAA850CAWLEAQEEEEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQ900RRQDILDLWIYHTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVEPDKVE950EANKGENTSLLHPVSLHGMDDPEREVLEWRFDSRLAFHHVARELHPEYFK1000NC ^PjMGARASYLSGGELDRffEKIRLRPGGKKKYKLKHIYffASRELERFAY1050NPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLYCVHQRIEIKD1100TKEALDKIEEEQNKSKKKAQQAAADTGHSNQVSQNY1136[SEQ ID NO 2]P24序列氨基酸1-232 (粗體)RT 序列氨基酸 235-795Nef 序列氨基酸 798-1002P17 序列氨基酸 1005-1136
20
方框通過基因構(gòu)建引入的氨基酸K(賴氨酸)代替色氨酸(W)。引入突變除去酶活性。重組蛋白的表達(dá)在pET質(zhì)粒中，靶基因(p24-RT-Nef-pl7)受到強(qiáng)嗜菌體T7啟動子的控制。該啟 動子不能由大腸桿菌RNA聚合酶識別，且依賴于宿主細(xì)胞中的T7RNA聚合酶源。B834(DE3) 宿主細(xì)胞含有在lacUV5控制之下的T7RNA聚合酶基因的染色體拷貝，且表達(dá)通過向細(xì)菌培 養(yǎng)物加入IPTG來誘導(dǎo)。使預(yù)培養(yǎng)物于37°C在搖瓶中生長至對數(shù)中期(A620:0. 6)，然后在4°C下過夜貯存 (以避免靜止期培養(yǎng)物)。使培養(yǎng)物在補(bǔ)加1 %葡萄糖和50 μ g/ml卡那霉素的LBT培養(yǎng)基 中生長。在生長培養(yǎng)基中加入葡萄糖的好處是減少基礎(chǔ)重組蛋白表達(dá)(避免cAMP介導(dǎo)的 lacUV5啟動子的去抑制)。使用于4°C過夜貯存的IOml培養(yǎng)物接種200ml含卡那霉素的LBT培養(yǎng)基(不含葡 萄糖)。培養(yǎng)物在30°C和22°C下生長，且當(dāng)0. D. 620達(dá)到0. 6時，加入IPTG(ImM終濃度)。 使培養(yǎng)物再培養(yǎng)3、5和18小時(過夜)。在3、5和18小時誘導(dǎo)之前和之后采集樣品。如下進(jìn)行提取物制備將細(xì)胞沉淀混懸于破碎緩沖液*(理論O.D.為10)中，并通過在弗氏破碎儀 (20. OOOpsi或1250bar)中流通4次而破碎。以20. OOOg離心粗提物(T) 30分鐘，以分離可 溶性級分(S)和不溶性(P)級分。*破碎緩沖液50mM Tris-HCL pH 8. 0，ImM EDTA, ImM DTT+蛋白酶抑制劑混合物 (Complete/Boerhinger)SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析與不溶性沉淀⑵、上清液⑶和粗提物⑴相應(yīng)的級分在10%還原SDS-PAGE上 電泳。p24-RT-Nef-pl7重組體通過考馬斯藍(lán)染色和蛋白質(zhì)印跡(WB)檢測?？捡R斯染色p24-RT-Nef-pl7蛋白顯現(xiàn)為一條帶在士 130kDa (使用理論分子量擬合)理論分子量128. 970道爾頓表觀分子量130kDa蛋白質(zhì)印跡分析試劑=-針對RT的單克隆抗體(p66/p51)購自 ABI (Advanced Biotechnologies)稀釋度1/5000-堿性磷酸酶綴合的抗小鼠抗體稀釋度1/7500表達(dá)水平_22°C誘導(dǎo)20小時后非常強(qiáng)的p24-RT-Nef-pl7特異性帶，占總蛋白的最多10% (參見圖1)重組蛋白“溶解度”“新鮮的”細(xì)胞提取物(T、S、P級分)于22°C /20小時生長/誘導(dǎo)下，在細(xì)胞提取 物的可溶性級分中回收到幾乎所有的p24-RT-Nef-pl7融合蛋白(圖1)。于30°C /20小時 生長/誘導(dǎo)下，約30%的p24-RT-Nef-pl7蛋白與不溶性級分關(guān)聯(lián)(圖1)
21“凍/融”(S2、P2級分)
于_20°C保存可溶性(Si)級分(22°C誘導(dǎo)20小時)。融化并以20. 000g/30分鐘 S2和P2(以1/10體積重懸浮)
含DTT的破碎緩沖液幾乎所有的p24-RT-Nef-pl7融合蛋白仍然可溶(僅 (見圖2)
不含DTT的破碎緩沖液85-90%的p24-RT-Nef-pl7仍然可溶(圖2) 圖
圖1-用于p24-RT-Nef-pl7(F4)的考馬斯染色和蛋白質(zhì)印跡(10% SDS-PAGE-還
圖2-通過考馬斯染色和蛋白質(zhì)印跡檢測的p24-RT-Nef-pl7溶解度測定(還原性 -10% SDS-PAGE)
除非指定了其它條件(例如溫度、破碎緩沖液組成)，否則以下實(shí)施例的細(xì)胞生長 ggcccgatatctccgat
agaaacagtttcggtcaagcttaaaccagggatggatggtccaaaggtcaagcagtggcc
gctaacggaagagaagattaaggcgctcgtagagatttgtactgaaatggagaaggaagg
caagataagcaagatcgggccagagaacccgtacaatacaccggtatttgcaataaagaa
aaaggattcaacaaaatggcgaaagcttgtagattttagggaactaaacaagcgaaccca
agacttttgggaagtccaactagggatcccacatccagccggtctaaagaagaagaaatc
ggtcacagtcctggatgtaggagacgcatattttagtgtaccgcttgatgaggacttccg
aaagtatactgcgtttactataccgagcataaacaatgaaacgccaggcattcgctatca
gtacaacgtgctcccgcagggctggaaggggtctccggcgatatttcagagctgtatgac
aaaaatacttgaaccattccgaaagcagaatccggatattgtaatttaccaatacatgga
cgatctctatgtgggctcggatctagaaattgggcagcatcgcactaagattgaggaact
22
gaggcaacatctgcttcgatggggcctcactactcccgacaagaagcaccagaaggagccgccgttcctaaagatgggctacgagcttcatccggacaagtggacagtacagccgatagtgctgcccgaaaaggattcttggaccgtaaatgatattcagaaactagtcggcaagcttaactgggcctctcagatttacccaggcattaaggtccgacagctttgcaagctactgaggggaactaaggctctaacagaggtcatcccattaacggaggaagcagagcttgagctggcagagaatcgcgaaattcttaaggagccggtgcacggggtatactacgacccctccaaggaccttatagccgagatccagaagcaggggcagggccaatggacgtaccagatatatcaagaaccgtttaagaatctgaagactgggaagtacgcgcgcatgcgaggggctcatactaatgatgtaaagcaacttacggaagcagtacaaaagattactactgagtctattgtgatatggggcaagaccccaaagttcaagctgcccatacagaaggaaacatgggaaacatggtggactgaatattggcaagctacctggattccagaatgggaatttgtcaacacgccgccacttgttaagctttggtaccagcttgaaaaggagccgatagtaggggcagagaccttctatgtcgatggcgc
cgcgaatcgcgaaacgaagctaggcaaggcgggatacgtgactaataggggccgccaaaaggtcgtaacccttacggataccaccaatcagaagactgaactacaagcgatttaccttgcacttcaggatagtggcctagaggtcaacatagtcacggactctcaatatgcgcttggcattattcaagcgcagccagatcaaagcgaaagcgagcttgtaaaccaaataatagaacagcttataaagaaagagaaggtatatctggcctgggtccccgctcacaagggaattggcggcaatgagcaagtggacaagctagtcagcgctgggattcgcaaggttctt lgcgatgl gggggtaagtggtctaagtctagcgtagtcggctggccgacagtccgcgagcgcatgcgacgcgccgaaccaRCCRcaRatRRCRtRRRRRcaRCRtctaRRRatctRRaRaaRcacRRRRctataaCttccaRtaacacRRcRRcRacRaacRccRCatRCRCatRRttaRaaRCCCaaRaaRaRRaaRaaRtaRRRtttccRRtaactccccaRRtRCCRttaaRRCCRatRacctataaRRcaRCRRtRRatctttctcacttccttaaRRaRaaaRRRRRRctRRaRRRcttaattcacaRccaRaRRCRacaRRatattcttRatctRtRRatttaccatacccaRRRRtactttccRRactRRcaRaattacaccccRRRRCcaRRCRtRCRctatcccctRactttcRRRtRRtRCtacaaactaRtcccaRtRRaacccRacaaRRtCRaaRaRRCtaataaRRRCRaRaacacttctcttcttcacccRRtaaRcctRcacRRRatRRatRacccaRaacRaRaRRttCtaRaatRRaRRttcRactctcRacttRcRttccatcacRtaRcaCRCRaRCtRCatCCagaatatttcaagaactgc Icqccca atgggcgccagggccagtgtacttagtggcggagaactagatcgatgggaaaagatacgcctacgcccggggggcaagaagaagtacaagcttaagcacattgtgtgggcctctcgcgaacttgagcgattcgcagtgaatccaggcctgcttgagacgagtgaaggctgtaggcaaattctggggcagctacagccgagcctacagactggcagcgaggagcttcgtagtctttataataccgtcgcgactctctactgcgttcatcaacgaattgaaataaaggatactaaagaggcccttgataaaattgaggaggaacagaataagtcgaaaaagaaggcccagcaggccgccgccgacaccgggcacagcaaccaggtgtcccaaaactactaa[SEQ ID NO 3]p24序列以粗體表示Nef序列加下劃線
23
方框通過基因構(gòu)建引入的核苷酸將針對未密碼子優(yōu)化的F4所用的程序用于密碼子優(yōu)化的序列。重組質(zhì)粒的詳述名稱=PRITl55I3(實(shí)驗(yàn)室名稱pET28b/p24-RT-Nef_pl7)宿主載體pET28b復(fù)制子colEl選擇卡那霉素啟動子T7插入序列p24-RT-Nef-pl7融合基因，密碼子優(yōu)化的密碼子優(yōu)化的F4基因在大腸桿菌BLR(DE3)細(xì)胞-即B834 (DE3)株的recA—衍生 物中表達(dá)。RecA突變防止λ嗜菌體的推斷產(chǎn)生。預(yù)培養(yǎng)物于37°C在搖瓶中生長至對數(shù)中期(A62Q:0.6)，然后4°C過夜貯存(以避免 靜止期培養(yǎng)物)。培養(yǎng)物在補(bǔ)加葡萄糖和50μ g/ml卡那霉素的LBT培養(yǎng)基中生長。將葡萄糖加 入到生長培養(yǎng)基中具有減少基礎(chǔ)重組蛋白表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)(避免cAMP介導(dǎo)的lacUV5啟動子的 去抑制)。使用4°C過夜貯存的IOml培養(yǎng)物接種200ml含卡那霉素的LBT培養(yǎng)基(不含葡萄 糖)。培養(yǎng)物在37°C下生長，且當(dāng)O.D.·達(dá)到0.6時，加入IPTG(lmM終濃度)。使培養(yǎng)物 于22°C再培養(yǎng)19小時(過夜)。在19小時誘導(dǎo)之前和誘導(dǎo)時采集樣品。提取物制備如下將細(xì)胞沉淀重懸浮于樣品緩沖液(理論O.D.為10)中，煮沸并直接加樣在 SDS-PAGE 上。SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析粗提物樣品在10 %還原SDS-PAGE上電泳。p24-RT-Nef-pl7重組蛋白通過考馬斯藍(lán)染色(圖2)和蛋白質(zhì)印跡檢測。考馬斯染色p24-RT-Nef-pl7蛋白顯現(xiàn)為一條帶在士 130kDa (使用理論分子量擬合)理論分子量128. 967道爾頓表觀分子量130kDa蛋白質(zhì)印跡分析試劑=_兔多克隆抗RT (兔PO3Ll6)稀釋度1/10.000-兔多克隆抗Nef-Tat (兔 388)稀釋度1/10.000-堿性磷酸酶綴合的抗_兔抗體稀釋度1/7500于22°C誘導(dǎo)19小時后，重組BLR(DE3)細(xì)胞以非常高的水平表達(dá)F4融合蛋白，占 總蛋白的10-15%。與來自天然基因的F4相比，來自于密碼子優(yōu)化基因的F4重組產(chǎn)物譜稍稍簡化。
2460kDa處的主F4-相關(guān)帶以及下面的次要帶沒有顯現(xiàn)(見圖3)。與表達(dá)F4的B834 (DE3) 重組株相比，產(chǎn)生F4co的BLR(DE3)株具有下列優(yōu)點(diǎn)F4全長蛋白的產(chǎn)量越高，重組產(chǎn)物的 條帶譜的復(fù)雜性越低。 圖3顯示了密碼子優(yōu)化的F4的考馬斯染色凝膠和蛋白質(zhì)印跡，其中
1/未誘導(dǎo)的
2/B834(DE3)/F4(天然基因) 3/BLR(DE3)/F4(天然基因) 4/BLR(DE3 )/F4(密碼子優(yōu)化的基因)實(shí)施例2 :P51RT (截短的、密碼子-優(yōu)化的RT)的構(gòu)建和表達(dá)氨基酸428-448之間的RT/p66區(qū)對大腸桿菌蛋白酶敏感。P51構(gòu)建體終止于Leu 427，導(dǎo)致RNA酶H結(jié)構(gòu)域的去除。在RT天然基因序列中鑒定的推斷大腸桿菌“移碼”序列也被去除(通過p51基因 的密碼子優(yōu)化)。p51合成基因的設(shè)計/構(gòu)建根據(jù)大腸桿菌密碼子選擇設(shè)計合成p51基因的序列。因此，它被密碼子優(yōu)化，使得 密碼子選擇類似大腸桿菌中高表達(dá)基因的密碼子選擇。合成基因如下構(gòu)建以一步PCR組 裝32個寡核苷酸。在第二個PCR中，使用末端引物擴(kuò)增全長組裝體，且即所得PCR產(chǎn)物克 隆到pGEM-T中間質(zhì)粒中。校正在基因合成過程中引入的點(diǎn)誤差后，將p51合成基因克隆到 pET29a表達(dá)質(zhì)粒中。該重組質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化B834(DE3)細(xì)胞。重組蛋白特征P5IRT核苷酸序列atg Iagtactl ggtccgatctctccgatagaaacagtttcggtcaagcttaaaccagggatg 60gatggtccaaaggtcaagcagtggccgctaacggaagagaagattaaggcgctcgtagag 120atttgtactgaaatggagaaggaaggcaagataagcaagatcgggccagagaacccgtac 180
aatacaccggtatttgcaataaagaagaaggattcaacaaaatggcgaaagcttgtagat 240tttagggaactaaacaagcgaacccaagacttttgggaagtccaactaggtatcccacat 300ccagccggtctaaagaagaagaaatcggtcacagtcctggatgtaggagacgcatatttt 360agtgtaccgcttgatgaggacttccgaaagtatactgcgtttactataccgagcataaac 420aatgaaacgccaggcattcgctatcagtacaacgtgctcccgcagggctggaaggggtct 480ccggcgatatttcagagctctatgacaaaaatacttgaaccattccgaaagcagaatccg 540gatattgtaatttaccaatacatggacgatctctatgtgggctcggatctagaaattggg 600cagcatcgcactaagattgaggaactgaggcaacatctgcttcgatggggcctcactact 660cccgacaagaagcaccagaaggagccgccgttcctaaagatgggctacgagcttcatccg 720gacaagtggacagtacagccgatagtgctgcccgaaaaggattcttggaccgtaaatgat 780
attcagaaactagtcggcaagcttaactgggcctctcagatttacccaggcattaaggtc 840cgacagctttgcaagctactgaggggaactaaggctctaacagaggtcatcccattaacg 900gaggaagcagagcttgagctggcagagaatcgcgaaattcttaaggagccggtgcacggg 960
25
gtatactacgacccctccaaggaccttatagccgagatccagaagcaggggcagggccaa 1020tggacgtaccagatatatcaagaaccgtttaagaatctgaagactgggaagtacgcgcgc 1080atgcgaggggctcatactaatgatgtaaagcaacttacggaagcagtacaaaagattact 1140actgagtctattgtgatatggggcaagaccccaaagttcaagctgcccatacagaaggaa 1200acatgggaaacatggtggactgaatattggcaagctacctggattccagaatgggaattt 1260gtcaacacgccgccgctggtaaaactg |aggcctgctagc| taa1302[SEQ ID NO 4]方框通過基因構(gòu)建引入的氨基酸1. 1氨基酸序列M |τ[ GPISPIETVSVKLKPGMDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPY 60NTPVFAIKKKDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDV⑶AYF 120SVPLDEDFRKYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMTKILEPFRKQNP 180DIVIYQYMDDLYVGSDLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGLTTPDKKHQKEPPFLKMGYELHP 240DKWTVQPIVLPEKDSWTVNDIQKLVGKLNWASQIYPGIKVRQLCKLLRGTKALTEVIPLT 300EEAELELAENREILKEPVHGVYYDPSKDLIAEIQKQGQGQWTYQIYQEPFKNLKTGKYAR 360MRGAHTNDVKQLTEAVQKITTESIVIWGKTPKFKLPIQKETWETffffTEYffQATffIPEffEF 420VNT PPLVKL433[SEQ ID NO:5]方框通過基因構(gòu)建引入的氨基酸K(賴氨酸)代替色氨酸(W)。引入突變以除去酶活性。長度、分子量、等電點(diǎn) (IP)433 個氨基酸，MW :50. 3kDa，IP :9. 081. 2B834(DE3)細(xì)胞中的 p51 表達(dá)與RT/p66生產(chǎn)株平行評價P51表達(dá)水平和重組蛋白溶解度。p51表達(dá)水平誘導(dǎo)條件:5小時內(nèi)于37°C進(jìn)行細(xì)胞生長/誘導(dǎo)(+ImM IPTG)。破碎緩沖液:50mMTris/HCl, pH 7. 5, ImM EDTA, +/-ImMDTT。蛋白質(zhì)印跡分析試劑_兔多克隆抗RT (兔P03L16)(稀釋度1/10，000)-堿性磷酸酶綴合的抗-兔抗體(稀釋度1/7500)使與粗提物(T)、不溶性沉淀⑵和上清液⑶相應(yīng)的細(xì)胞級分在10%還原 SDS-PAGE上電泳。正如考馬斯染色凝膠和蛋白質(zhì)印跡(圖4)所說明的，觀察到非常高的P51表達(dá) (占總蛋白的15-20% )，高于對P66所觀察到的。對于p51和p66蛋白(37°C誘導(dǎo)5小時后)，在細(xì)胞提取物的可溶性級分(Si)中 回收到80%重組產(chǎn)物(見圖4)。當(dāng)在30°C表達(dá)時，99%重組蛋白與可溶級分關(guān)聯(lián)(沒有給 出數(shù)據(jù))。p51蛋白質(zhì)印跡譜為多帶，但較之對P66所觀察到的復(fù)雜程度低。溶解度測定溶解度測定在還原(含DTT的破碎緩沖液)和非還原條件下制備的可溶性(S 1)
26級分的凍/融(5小時誘導(dǎo)，37°C )。在融化后，以20. 000g/30分鐘離心Sl樣品，產(chǎn)生S2和 P2(p2以1/10體積重懸浮)。在還原以及非還原條件下制備的可溶性級分(Si)于凍/融后，在可溶性(S2)級 分中仍然回收到99%的p51和p66。在沉淀(P2)中僅發(fā)現(xiàn)1%。這在圖5中示出。圖5顯示了 RT/p51和RT/p66溶解性測定，其中Sl是可溶性級分(于30°C誘導(dǎo)3 小時，保存于-20°C，在融化后，Sl樣品以20. 000g/30分鐘離心，產(chǎn)生S2和P2(p2以1/10 體積重懸浮)。實(shí)施例3 :Nef-pl7的構(gòu)建和表達(dá)構(gòu)建雙融合蛋白Nef-P 17重組質(zhì)粒構(gòu)建· pET29a/Nef-pl7 表達(dá)載體通過PCR從F4重組質(zhì)粒擴(kuò)增Nef-pl7融合基因。將PCR產(chǎn)物克隆到中間pGEM_T 克隆載體中，并隨后克隆到pET29a表達(dá)載體中。重組蛋白特征 長度、分子量、等電點(diǎn)(IP)Nef-p 17 (稱為 NP) 340 個氨基酸，MW 38. 5kDa, IP 7. 48 氨基酸序列和多核苷酸序列Nef-p 17核苷酸序列Atgggtggcaagtggtcaaaaagtagtgtggttggatggcctactgtaagggaaagaatg 60Agacgagctgagccagcagcagatggggtgggagcagcatctcgagacctggaaaaacat 120Ggagcaatcacaagtagcaatacagcagctaccaatgctgcttgtgcctggctagaagca 180Caagaggaggaggaggtgggttttccagtcacacctcaggtacctttaagaccaatgact 240Tacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggcta 300Attcactcccaacgaagacaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaaggctac 360Ttccctgattggcagaactacacaccagggccaggggtcagatatccactgacctttgga 420Tggtgctacaagctagtaccagttgagccagataaggtagaagaggccaataaaggagag 480Aacaccagcttgttacaccctgtgagcctgcatggaatggatgaccctgagagagaagtg 540Ttagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcccgagagctgcatccg 600
Gagtacttcaagaactgcaggcctatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaa 660Ttagatcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaa 720Catatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaa 780Acatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatca 840Gaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggata 900Gagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaag 960Aaaaaagcacagcaagcagcagctgacacaggacacagcaatcaggtcagccaaaattac 1020Taa1023[SEQ ID NO 6]Nef-p 17 (NP)
27
MGGKWSKSSVVGWPTVRERMRRAEPAADGVGAASRDLEKHGAITSSNTAATNAACAWLEA60
QEEEEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQGY120
FPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVEPDKVEEANKGENTSLLHPVSLHGMDDPEREV180
LEffRFDSRLAFHHVARELHPEYFKNC MGARASVLSGGELDRffEKI RLRPGGKKKYKLK 240
HIVWASRELERFAVNPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLYCVHQRI300
EIKDTKEALDKIEEEQNKSKKKAQQAAADTGHSNQVSQNY340
[SEQ ID NO 7]
方框通過遺傳構(gòu)建導(dǎo)入的氨基酸
Nef序列為粗體。
P17-Nef核苷酸序列
Atgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgatgggaaaaaattcgg60
Ttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggag120
Ctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaata180
Ctgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataat240
Acagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagct300
Ttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaaaaaagcacagcaagcagcagct360
Gacacaggacacagcaatcaggtcagccaaaattacctcgacaggcctatgggtggcaag420
Tggtcaaaaagtagtgtggttggatggcctactgtaagggaaagaatgagacgagctgag480
Ccagcagcagatggggtgggagcagcatctcgagacctggaaaaacatggagcaatcaca540
Agtagcaatacagcagctaccaatgctgcttgtgcctggctagaagcacaagaggaggag600
Gaggtgggttttccagtcacacctcaggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagct660
Gtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaa720
Cgaagacaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaaggctacttccctgattgg780
Cagaactacacaccagggccaggggtcagatatccactgacctttggatggtgctacaag840
Ctagtaccagttgagccagataaggtagaagaggccaataaaggagagaacaccagcttg900
Ttacaccctgtgagcctgcatggaatggatgaccctgagagagaagtgttagagtggagg960
Tttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcccgagagctgcatccggagtacttcaag1020
Aactgctaa1029
[SEQ ID NO 8]
實(shí)施例4 :p24-RT * -Nef-pl7(F4 * )的構(gòu)建和表達(dá)
F4*是F4 (p24-RT/p66-Nef-pl7)融合蛋白的突變形式，其中592位的甲硫氨酸被
賴氨酸取代。該甲硫氨酸是推斷的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄“起始”位點(diǎn)，這由對F4純化實(shí)驗(yàn)的Q瓊脂糖 洗脫樣品進(jìn)行的N-末端測序支持。實(shí)際上，Q洗脫樣品中存在的62kDa的主F4-相關(guān)小帶 在592位的甲硫氨酸處開始。甲硫氨酸被賴氨酸取代RMR — RSR。RiiR基序天然存在于分化枝A RT序列中。評價該突變對⑶4-⑶8表位的影響-一個HLA-A3CTL表位(A*3002)丟失，但另外9個HLA-A3表位存在于RT序列中。-在該區(qū)中沒有鑒定到輔助表位。重組蛋白特征
28交鏈區(qū)2個氨基酸|-|Nef: 206個氨基酸|-|P17: 132個氨基酸-C-末端參長度、分子量、等電點(diǎn)(IP)1136 個氨基酸，129kDa，IP 8. 07參核苷酸序列atggttatcgtgcagaacatccaggggcaaatggtacatcaggccatatcacctagaactttaaatgcatgggtaaaagtagtagaagagaaggctttcagcccagaagtaatacccatgttttcagcattatcagaaggagccaccccacaagatttaaacaccatgctaaacacagtggggggacatcaagcagccatgcaaatgttaaaagagaccatcaatgaggaagctgcagaatgggatagagtacatccagtgcatgcagggcctattgcaccaggccagatgagagaaccaaggggaagtgacatagcaggaactactagtacccttcaggaacaaataggatggatgacaaataatccacctatcccagtaggagaaatttataaaagatggataatcctgggattaaataaaatagtaagaatgtatagccctaccagcattctggacataagacaaggaccaaaagaaccttttagagactatgtagaccggttctataaaactctaagagccgagcaagcttcacaggaggtaaaaaattggatgacagaaaccttgttggtccaaaatgcgaacccagattgtaag
actattttaaaagcattgggaccagcggctacactagaagaaatgatgacagcatgtcagggagtaggaggacccggccataaggcaagagttttg (catatgt ggccccattagccctattgagactgtgtcagtaaaattaaagccaggaatggatggcccaaaagttaaacaatggccattgacagaagaaaaaataaaagcattagtagaaatttgtacagagatggaaaaggaagggaaaatttcaaaaattgggcctgaaaatccatacaatactccagtatttgccataaagaaaaaagacagtactaaatggagaaaattagtagatttcagagaacttaataagagaactcaagacttctgggaagttcaattaggaataccacatcccgcagggttaaaaaagaaaaaatcagtaacagtactggatgtgggtgatgcatatttttcagttcccttagatgaagacttcaggaaatatactgcatttaccatacctagtataaacaatgagacaccagggattagatatcagtacaatgtgcttccacagggatggaaaggatcaccagcaatattccaaagtagcatgacaaaaatcttagagccttttagaaaacaaaatccagacatagttatctatcaatacatggatgatttgtatgtaggatctgacttagaaatagggcagcatagaacaaaaatagaggagctgagacaacatctgttgaggtggggacttaccacaccagacaaaaaacatcagaaagaacctccattccttaaaatgggttatgaactccatcctgataaatggacagtacagcctatagtgctgccagaaaaagacagctggactgtcaatgacatacagaagttagtggggaaattgaattgggcaagtcagatttacccagggattaaagtaaggcaattatgtaaactccttagaggaaccaaagcactaacagaagtaataccactaacagaagaagcagagctagaactggcagaaaacagagagattctaaaagaaccagtacatggagtgtattatgacccatcaaaagacttaatagcagaaatacagaagcaggggcaaggccaatggacatatcaaatttatcaagagccatttaaaaatctgaaaacaggaaaatatgcacgtaaacgcggtgcccacactaatgatgtaaaacaattaacagaggcagtgcaaaaaataaccacagaaagcatagtaatatggggaaagactcctaaatttaaactgcccatacaaaaggaaacatgggaaacatggtggacagagta
-末
p24: 232個氨基酸琳交鏈區(qū)2個氨i^l-lRT: 562個氨基
29
ttggcaagccacctggattcctgagtgggagtttgttaatacccctcctttagtgaaattatggtaccagttagagaaagaacccatagtaggagcagaaaccttctatgtagatggggcagctaacagggagactaaattaggaaaagcaggatatgttactaatagaggaagacaaaaagttgtcaccctaactgacacaacaaatcagaagactgagttacaagcaatttatctagctttgcaggattcgggattagaagtaaacatagtaacagactcacaatatgcattaggaatcattcaagcacaaccagatcaaagtgaatcagagttagtcaatcaaataatagagcagttaataaaaaaggaaaaggtctatctggcatgggtaccagcacacaaaggaattggaggaaatgaacaagtagataaattagtcagtgctggaatcaggaaagtgcta |qctat<^ ggtggcaagtggtcaaaaagtagtgtggttggatggcctactgtaagggaaagaatgagacgagctgagccagcagcagatggggtgggagcagcatctcgagacctggaaaaacatggagcaatcacaagtagcaatacagcagctaccaatgctgcttgtgcctggctagaagcacaagaggaggaggaggtgggttttccagtcacacctcaggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaacgaagacaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaaggctacttccctgattggcagaactacacaccagggccaggggtcagatatccactgacctttggatggtgctacaagctagtaccagttgagccagataaggtagaagaggccaataaaggagagaacaccagcttgttacaccctgtgagcctgcatggaatggatgaccctgagagagaagtgttagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcccgagagctgcatccg
gagtacttcaagaactgc |aggcct| atgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaaaaaagcacagcaagcagcagctgacacaggacacagcaatcaggtcagccaaaattactaa[SEQ ID NO 9]p24序列為粗體Nef序列加下劃線方框通過基因構(gòu)建引入的核苷酸參氨基酸序列MVIVQNIQGQMVHQAISPRTLNAWVKVVEEKAFSPEVIPMFSALSEGATP 50QDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAGPIAPGQMREP 100RGSDIAGTTSTLQEQIGWMTNNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTS 150ILDIRQGPKEPFRDYVDRFYKTLRAEQASQEVKNWMTETLLVQNANPDCK 200TILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPGHKARVL@ GPI SPIETVSVKLKPG 250MDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPVFAIKK 300KDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAY 350FSVPLDEDFRKYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMT 400
30
KILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYVGSDLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGLT 450TPDKKHQKEPPFLKMGYELHPDKffTVQPIVLPEKDSffTVNDIQKLVGKLN 500WASQIYPGIKVRQLCKLLRGTKALTEVIPLTEEAELELAENREILKEPVH 550GVYYDPSKDLIAEIQKQGQGQWTYQIYQEPFKNLKTGKYARKRGAHTNDV 600KQLTEAVQKITTESIVIWGKTPKFKLPIQKETWETffffTEYffQATffIPEffE 650FVNTPPLVKLWYQLEKEPIVGAETFYVDGAANRETKLGKAGYVTNRGRQK 700VVTLTDTTNQKTELQAIYLALQDSGLEVNIVTDSQYALGIIQAQPDQSES 750ELYNQlIEQLIKKEKYYLAffYPAHKGIGGNEQYDKLYSAGIRKYpj MGGK 800WSKSSVVGWPTVRERMRRAEPAADGVGAASRDLEKHGAITSSNTAATNAA 850CAWLEAQEEEEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQ 900RRQDILDLWIYHTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVEPDKVE 950EANKGENTSLLHPVSLHGMDDPEREVLEWRFDSRLAFHHVARELHPEYFK 1000NC MGARASVLSGGELDRWEKIRLRPGGKKKYKLKHIVWASRELERFAV 1050NPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLYCVHQRIEIKD 1100TKEALDKIEEEQNKSKKKAQQAAADTGHSNQVSQNY1136[SEQ ID NO 10]P24序列氨基酸1-232 (粗體)RT 序列氨基酸 235-795Nef 序列氨基酸 798-1002P17 序列氨基酸 1005-1136方框通過基因構(gòu)建引入的氨基酸K(賴氨酸)代替甲硫氨酸(內(nèi)部“起始”密碼子)K(賴氨酸)K:代替色氨酸(W)。引入突變以除去酶活性。B834 (DE3)細(xì)胞中的F4 *表達(dá)與F4未突變構(gòu)建體平行，在18小時內(nèi)于22°C誘導(dǎo)F4*重組株。制備粗提物，并通 過考馬斯染色凝膠和蛋白質(zhì)印跡分析。如圖6所示，F(xiàn)4*高水平表達(dá)(10%總蛋白)，稍高于F4，且小62kDa帶消失。圖6顯示了還原條件(10% SDS-PAGE還原性凝膠；誘導(dǎo)19小時，22°C )下多種 F4蛋白的SDS-PAGE分析，其中1為F4，2為F4*，3為F4 (Q瓊脂糖洗脫樣品)，2. 5 μ g，而4 為F4 (Q瓊脂糖洗脫樣品)250ng。蛋白質(zhì)印跡分析試劑-合并3 種單克隆抗 p24 (JC13. 1，JC16. 1，IG8. 1. 1)(稀釋度 1/5000)-兔多克隆抗RT(兔P03L16)(稀釋度1/10000)-兔多克隆抗Nef-Tat (兔 388)(稀釋度1/10000)-堿性磷酸酶綴合的抗-兔抗體(稀釋度1/7500)-堿性磷酸酶綴合的抗-小鼠抗體(稀釋度1/7500)誘導(dǎo)條件3小時內(nèi)，37°C下細(xì)胞生長/30°C誘導(dǎo)(+ImM IPTG)。破碎緩沖液:F4:50mM Tris/HCl, pH 8. 0,50mM NaCl，ImMEDTA, +/-ImM DTT蛋白質(zhì)印跡分析
31
試劑-兔多克隆抗RT (兔P03L16)(稀釋度1/10，000)-兔多克隆抗Nef-Tat (兔 388)(稀釋度1/10000)-堿性磷酸酶綴合的抗-兔抗體(稀釋度1/7500)實(shí)施例5 :F4 (p51)和F4(p51) *的構(gòu)建和表達(dá)RT/p51用于F4融合構(gòu)建體(代替RT/p66)。F4(p51) = p24-p51-Nef_pl7F4(p51) * = p24_p51 * -Nef-pl7_突變的F4 (p51)推斷的內(nèi)部甲硫氨酸起始位 點(diǎn)(存在于RT部分中)被賴氨酸取代，從而進(jìn)一步簡化了抗原譜。重組質(zhì)粒的構(gòu)建F4(p51)通過PCR從pET29a/p51表達(dá)質(zhì)粒擴(kuò)增編碼p51的序列。將限制位點(diǎn)摻入 到PCR引物中(NdeI和StuI位于編碼序列的5'末端，AvrII位于編碼序列的3'末端)。 將PCR產(chǎn)物克隆到pGem-T中間質(zhì)粒中并測序。pGem-T/p51中間質(zhì)粒被NdeI和AvrII限制， 且P51片段連接到由NdeI和NheI限制的pET28b/p24-RT/p66-Nef-pl7表達(dá)質(zhì)粒中(導(dǎo)致 RT/p66序列的切除)。連接在T4DNA連接酶存在下于適宜的濃度通過組合消化反應(yīng)進(jìn)行。 連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化DH5 α大腸桿菌細(xì)胞。通過DNA測序證實(shí)p51插入到正確的翻譯讀框中 (代替f4融合蛋白中的RT/p66)。所得融合構(gòu)建體p24-RT/p51-Nef-pl7稱作F4(p51)。F4(p51)女推斷的內(nèi)部甲硫氨酸起始位點(diǎn)(存在于RT/p51中)的突變用 “GeneTailor定點(diǎn)誘變系統(tǒng)”(Invitrogen)實(shí)現(xiàn)，產(chǎn)生F4 (p51) *構(gòu)建體。F4(p51)和F4 (p51) *表達(dá)質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化B834 (DE3)細(xì)胞。重組蛋白特征N-末端|p24: 232個氨基酸傳交鏈區(qū)4個氨基酸I-P1/51*: 426個 氨基酸交鏈區(qū)3個氨fl]-|Nef: 206個氨基酸交鏈區(qū)2個氨|
基酸丨-|pl7: 132個氨基酸丨-C-末端 長度、分子量、等電點(diǎn)(IP)1005 個氨基酸，114. 5kDa，IP :8. 47 核苷酸序列(F4(p51) * )Atggttatcgtgcagaacatccaggggcaaatggtacatcaggccatatcacctagaact60Ttaaatgcatgggtaaaagtagtagaagagaaggctttcagcccagaagtaatacccatg120Ttttcagcattatcagaaggagccaccccacaagatttaaacaccatgctaaacacagtg180Gggggacatcaagcagccatgcaaatgttaaaagagaccatcaatgaggaagctgcagaa240Tgggatagagtacatccagtgcatgcagggcctattgcaccaggccagatgagagaacca300Aggggaagtgacatagcaggaactactagtacccttcaggaacaaataggatggatgaca360Aataatccacctatcccagtaggagaaatttataaaagatggataatcctgggattaaat420Aaaatagtaagaatgtatagccctaccagcattctggacataagacaaggaccaaaagaa480Ccttttagagactatgtagaccggttctataaaactctaagagccgagcaagcttcacag540Gaggtaaaaaattggatgacagaaaccttgttggtccaaaatgcgaacccagattgtaag600Actattttaaaagcattgggaccagcggctacactagaagaaatgatgacagcatgtcag660Ggagtaggaggacccggccataaggcaagagttttg jCATATGaggcctl GGTCOGATCTCT720
32
CCGATAGAAACAGTTTCGGTCAAGCTTAAACCAGGGATGGATGGTCCAAAGGTCAAGCAG780
TGGCCGCTAACGGAAGAGAAGATTAAGGCGCTCGTAGAGATTTGTACTGAAATGGAGAAG840
GAAGGCAAGATAAGCAAGATCGGGCCAGAGAACCCGTACAATACACCGGTATTTGCAATA900
AAGAAGAAGGATTCAACAAAATGGCGAAAGCTTGTAGATTTTAGGGAACTAAACAAGCGA960
ACCCAAGACTTTTGGGAAGTCCAACTAGGTATCCCACATCCAGCCGGTCTAAAGAAGAAG1020
AAATCGGTCACAGTCCTGGATGTAGGAGACGCATATTTTAGTGTACCGCTTGATGAGGAC1080
TTCCGAAAGTATACTGCGTTTACTATACCGAGCATAAACAATGAAACGCCAGGCATTCGC1140
TATCAGTACAACGTGCTCCCGCAGGGCTGGAAGGGGTCTCCGGCGATATTTCAGAGCTCT1200
ATGACAAAAATACTTGAACCATTCCGAAAGCAGAATCCGGATATTGTAATTTACCAATAC1260
ATGGACGATCTCTATGTGGGCTCGGATCTAGAAATTGGGCAGCATCGCACTAAGATTGAG1320
GAACTGAGGCAACATCTGCTTCGATGGGGCCTCACTACTCCCGACAAGAAGCACCAGAAG1380
GAGCCGCCGTTCCTAAAGATGGGCTACGAGCTTCATCCGGACAAGTGGACAGTACAGCCG1440
ATAGTGCTGCCCGAAAAGGATTCTTGGACCGTAAATGATATTCAGAAACTAGTCGGCAAG1500
CTTAACTGGGCCTCTCAGATTTACCCAGGCATTAAGGTCCGACAGCTTTGCAAGCTACTG1560
AGGGGAACTAAGGCTCTAACAGAGGTCATCCCATTAACGGAGGAAGCAGAGCTTGAGCTG1620
GCAGAGAATCGCGAAATTCTTAAGGAGCCGGTGCACAGGGTATACTACGACCCCTCCAAG1680
GACCTTATAGCCGAGATCCAGAAGCAGGGGCAGGGCCAATGGACGTACCAGATATATCAA1740
GAACCGTTTAAGAATCTGAAGACTGGGAAGTACGCGCGCAAACGAGGGGCTCATACTAAT1800
GATGTAAAGCAACTTACGGAAGCAGTACAAAAGATTACTACTGAGTCTATTGTGATATGG1860
GGCAAGACCCCAAAGTTCAAGCTGCCCATACAGAAGGAAACATGGGAAACATGGTGGACT1920
GAATATTGGCAAGCTACCTGGATTCCAGAATGGGAATTTGTCAACACGCCGCCGCTGGTA1980
AAACTG {gccctaGCTl ATGggtggcaagtggtcaaaaagtagtgtggttggatggcctact2040
Gtaagggaaagaatgagacgagctgagccagcagcagatggggtgggagcagcatctcga 2100
Gacctggaaaaacatggagcaatcacaagtagcaatacagcagctaccaatgctgcttgt2160
Gcctggctagaagcacaagaggaggaggaggtgggttttccagtcacacctcaggtacct2220
Ttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaagggg 2280
Ggactggaagggctaattcactcccaacgaagacaagatatccttgatctgtggatctac2340
Cacacacaaggctacttccctgattggcagaactacacaccagggccaggggtcagatat2400
Ccactgacctttggatggtgctacaagctagtaccagttgagccagataaggtagaagag 2460
Gccaataaaggagagaacaccagcttgttacaccctgtgagcctgcatggaatggatgac2520
Cctgagagagaagtgttagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcc2580
Cgagagctgcatccggagtacttcaagaactgc lAGGCCTlATGGGTGCGAGAGCGTCAGTA 2640
TTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAA2700
AAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAAT2760
CCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCC2820
CTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGT2880
GTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAG2940
CAAAACAAAAGTAAGAAAAAAGCACAGCAAGCAGCAGCTGACACAGGACACAGCAATCAG3000
GTCAGCCAAAATTACtaa3018
33
在10%還原SDS-PAGE上分析與粗提物⑴、不溶性沉淀⑵和上清液⑶相對應(yīng) 的細(xì)胞級分。F4(p51)以高水平(10%總蛋白)表達(dá)，類似于F4。在細(xì)胞提取物的可溶性級分 (S)中回收到幾乎所有的F4(p51)。用抗-Nef-tat試劑檢測后，F(xiàn)4(p51)WB譜顯示被簡化 (+/-60kDa以下的截短產(chǎn)物減少)。B834(DE3)細(xì)胞中的 F4(p51) * 表達(dá)與F4(p51)未突變構(gòu)建體F4和F4*平行，于22°C誘導(dǎo)F4 (p51) *重組株18小時。 制備粗細(xì)胞提取物并通過考馬斯染色凝膠和蛋白質(zhì)印跡分析。觀察到F4(p51)和F4(p51)* 融合蛋白的高表達(dá)，占總蛋白的至少10%。WB譜低于+/-60kDa的截短產(chǎn)物減少。此外， 就F4(p51)*構(gòu)建體而言，47kDa帶(由于內(nèi)部起始位點(diǎn))已消失。實(shí)施例6 :F4、F4 (p51) *和F4 *的純化_純化方法I將含4種HIV抗原p24-RT-Nef-pl7的融合蛋白F4按照純化方法I從大腸桿菌細(xì) 胞勻漿純化，該方法包括下列主要步驟■ F4的硫酸銨沉淀■ SO3Fractogel陽離子-交換色譜(正電模式)■辛基瓊脂糖疏水作用色譜(正電模式)■ Q瓊脂糖FF陰離子_交換色譜(正電模式)■在SDS存在下的Superdex 200凝膠過濾色譜■透析和濃縮此外，用同一純化方法I純化F4(p51)*融合蛋白(RT被攜帶另外的突變 Met592Lys的密碼子優(yōu)化的p51取代)和F4*蛋白(攜帶另外的Met592Lys突變的F4)。蛋白定量■使用Lowry測定法測定總蛋白。檢測蛋白濃度之前，針對PBS，0. 1% SDS過夜透 析所有樣品，以除去干擾物質(zhì)(尿素，DTT)。BSA(Pierce)用作標(biāo)準(zhǔn)品。SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡■在還原或非還原SDS-PAGE樣品緩沖液(+/-β -巰基乙醇)中制備樣品，并于 95 °C加熱5分鐘?！鲇?00V在4-20% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上使用Imm厚的預(yù)制Novex Tris-甘氨 酸凝膠或Criterion凝膠(Bio-Rad)分離蛋白75分鐘?！鍪褂每捡R斯藍(lán)R250目測觀察蛋白。■對于蛋白質(zhì)印跡(WB)，于4°C以100V在1.5小時內(nèi)或以30V過夜將蛋白從 SDS-凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(Bio-Rad)上。■使用針對不同抗原的單克隆抗體抗-p24、抗-Nef-Tat、抗-RT檢測F4(有時， 抗-p24和抗Nef-Tat的混合物用于檢測最大數(shù)目的蛋白帶)?！鰤A性-磷酸酶綴合的抗_小鼠或抗_兔抗體與第一抗體結(jié)合，并使用BCIP和 NBT作為底物目測蛋白帶?？?大腸桿菌蛋白質(zhì)印跡■通過SDS-PAGE分離5 μ g蛋白(Lowry)，并轉(zhuǎn)移到上述硝酸纖維素膜上?！鍪褂枚嗫寺】筥大腸桿菌抗體檢測殘余的宿主細(xì)胞蛋白。使用如上的堿性_磷
35酸酶反應(yīng)目測蛋白帶。純化方法I方法I包括硫酸銨沉淀和4個色譜步驟■在存在 IOmM DTTUmM PMSFUmM EDTA 的 50mM Tris 緩沖液pH 8. 0 中以 0D50(約 360ml)勻漿大腸桿菌細(xì)胞。以IOOObar進(jìn)行2次Rannie流通?！鲆?4400 Xg離心20分鐘除去細(xì)胞碎片和不溶性物質(zhì)?！鰧⒘蛩徜@(AS)從3. 8M原液加入到澄清過的上清液中，至1. 2M終濃度。使蛋白 于室溫(RT)沉淀約2小時，然后通過離心(lOmin，14400Xg)沉淀。將沉淀重混懸于8M尿 素、IOmMDTT的IOmM磷酸鹽緩沖液pH 7. O中?！鲈诖嬖?M尿素和IOmM DTTWpH 7. O磷酸鹽緩沖液中，在SO3Fractogel柱 (Merck)上捕獲抗原。洗滌柱子，從而洗脫下未結(jié)合的蛋白，接續(xù)用170mM NaCl的預(yù)洗脫步 驟，以除去結(jié)合的宿主細(xì)胞蛋白(HCP)。然后用460mM NaCl、8M尿素、IOmM DTT的磷酸鹽緩 沖液pH 7.0洗脫？4。■使用pH 7的IOmM磷酸鹽緩沖液2倍稀釋SO3洗脫液，并在存在4M 尿素、ImM DTT、230mM NaCl的pH 7. O磷酸鹽緩沖液中，上樣到辛基瓊脂糖柱 (AmershamBiosciences)。洗滌步驟(平衡緩沖液)之后，用pH 8. O的8M尿素、ImM DTT的 25mM Tris緩沖液洗脫結(jié)合的F4。■稀釋辛基洗脫液，并調(diào)節(jié)至pH 9. 0，然后在pH 9. O的8M尿素(25mM Tris)存在 下，F(xiàn)4 與 Q 瓊脂糖柱(AmershamBioscience)結(jié)合。洗掉(8M 尿素、25mM Tris, pH 9. 0)未 結(jié)合的蛋白，并通過預(yù)洗脫步驟(90mM NaCl，溶于8M尿素、25mM Tris中，pH 9.0)除去HCP 和F4-降解產(chǎn)物。使用200mM NaCl、8M尿素的Tris緩沖液pH 9. O將F4從柱子上解吸?！鰧? % SDS加入Q洗脫液的等分試樣，并針對含0. 1 % SDS和ImM DTT的PBS緩 沖液透析，從而在將樣品注射到凝膠過濾柱(制備級Superdex 200，連續(xù)的兩個16 X 60cm 柱)上之前除去尿素。過程中的SDS-PAGE分析之后合并相關(guān)級分。■在室溫下，在透析膜(12_14kDa截留分子量)中，針對1升0. 5M精氨酸、IOmM Tris、5mM谷胱甘肽，pH 8. 5過夜透析樣品兩次。連續(xù)純化步驟以下面的流程圖表示。純化流程圖360ml 勻漿 0D50 (Rannie)50mM Tris pH 8. O,ImM PMSF,IOmM DTT,2mM EDTAImm14400 X g 離心 20 分鐘I硫酸銨沉淀1. 2M AS，2h，RT，14400 Xg 離心，IOminI將沉淀重混懸于8M尿素、IOmM PO4, IOmM DTT, pH 7. O中I(+) SO3Fractogel EMD 650 (M)色譜
36
pH 7. 0，8M 尿素，IOmM DTT, 170mM NaCl 預(yù)洗脫，460mM NaCl 洗脫I2 X 稀釋至 pH 7. 0，4M 尿素，5mM DTT，230mM NaClI(+)辛基瓊脂糖色譜pH 7. 0，4M 尿素，230mM NaCl，8M 尿素，20mM Tris pH 8. 0 洗脫I約2 X 稀釋，調(diào)節(jié)至 pH 9. 0 (NaOH)I(+)Q瓊脂糖FF色譜Tris pH 9. 0，8M 尿素，90mM NaCl 預(yù)洗脫，200mM NaCl 洗脫I加入SDSI透析—TBS,0. 1 % SDS, pH 8. 5ISuperdex 200 凝膠過濾色譜 16 X 120cm2. TBS,0. 1% SDS, pH 8. 5IIPA SDS-PAGEI合并/濃縮/透析—配制相容的緩沖液IPA-過程中分析如果沒有特別說明，所有緩沖液均含有ImM DTT0實(shí)施例7 :F4和F4co (密碼子優(yōu)化的)的純化-純化方法11純化方法II還開發(fā)了與方法I相比更簡化的純化程序_方法II。方法II僅由2個色譜步驟 和用于緩沖液交換的最終透析/滲濾組成。特別地，引入CM hyperZ色譜柱(BioS印ra)替 代方法I的澄清步驟、硫酸銨沉淀和SO3色譜(參見實(shí)施例6)。方法II用于純化F4和完 全密碼子優(yōu)化的F4( “F4co”)。對于F4co而言，進(jìn)行了兩種不同形式的方法II，其中一種 包括羧酰胺化，另一種不包括。羧酰胺化步驟的目的是防止蛋白的氧化聚集。該羧酰胺化 在第一次色譜步驟(CM hyperZ)之后進(jìn)行?！鲈诖嬖贗OmM DTT的pH 8. 050mM Tris緩沖液中，以0D90對大腸桿菌細(xì)胞(表 達(dá)F4或F4co)進(jìn)行勻漿。1000巴下進(jìn)行2次Rarmie流通?！鲈谟糜贑M hyperZ樹脂(BioS印ra)之前，將8M尿素加入到勻漿中，所述樹脂使 用8M尿素的磷酸鹽緩沖液pH 7平衡?？乖东@以分批模式進(jìn)行。然后將樹脂填裝到柱中， 使用平衡緩沖液洗掉未結(jié)合的蛋白，通過用120mM NaCl的預(yù)洗脫步驟除去結(jié)合的宿主細(xì)胞
37蛋白(HCP)。然后用360mM NaCl，8M尿素，IOmM DTT的磷酸鹽緩沖液pH 7. 0洗脫F4co?！鰹榱丝刂迫诤系鞍椎难趸奂現(xiàn)4co的半胱氨酸基團(tuán)可以用碘乙酰胺羧酰胺 化。因此，任選地，將50mM碘乙酰胺加入到CM hyperZ洗脫液中，并于室溫在黑暗中進(jìn)行30 分鐘的羧酰胺化。■然后充分稀釋(約5-8倍)CM hyperZ洗脫液，并調(diào)節(jié)至pH9. 0。然后在8M尿素 存在下于PH 9. 0的Tris緩沖液中，F(xiàn)4co或F4C0Ca (密碼子優(yōu)化的羧酰胺化)與Q瓊脂糖 柱(AmershamBioscience)結(jié)合。使用平衡緩沖液洗掉未結(jié)合的蛋白，并用含90mM NaCl (僅 含未羧酰胺化的蛋白)的相同緩沖液的預(yù)洗脫步驟除去結(jié)合的HCP。用含200mM NaCl,8M 尿素的PH 9. 0的Tris緩沖液使F4co從柱子上解吸?！鲇谑覝卦谕肝瞿?12_14kDa，截留分子量)中，針對1升0. 5M精氨酸、IOmM Tris 緩沖液、IOmM谷胱甘肽(僅加入到未羧酰胺化的蛋白中)，pH 8.5過夜透析樣品兩次?；?者，緩沖液交換通過使用具有30kDa或50kDa截留分子量的切向流膜，針對10個樣品體積 的相同緩沖液滲濾而完成。■最后，通過0. 22 μ m膜除菌過濾透析產(chǎn)品。連續(xù)純化步驟在下面的流程圖中表示。純化流稈圖勻漿 0D90 (Rannie)50mM Tris pH 8. 0, IOmM DTTI加入8M尿素，調(diào)節(jié)至pH 7. 0I(+) CM hyperZ 色譜pH 7. 0，8M 尿素，IOmM DTT, 120mM NaCl 預(yù)洗脫，360mM NaCl洗脫I任選的羧酰胺化加入50mM碘乙酰胺，30分鐘，RTI稀釋并調(diào)節(jié)至pH 9. 0，8M尿素I(+)Q瓊脂糖FF色譜Tris pH 9. 0，8M尿素，預(yù)洗脫，使用NaCl*洗脫I透析/滲濾—磷酸鹽緩沖液，0.5M精氨酸，pH 8. 5 (IOmM谷胱甘肽)I除菌過濾如果F4co沒有被羧酰胺化，則所有緩沖液均含DTT，并在純化的原液中包含谷胱 甘肽。一旦蛋白被羧酰胺化，則省略還原劑。*NaCl-就F4co而言，是200mM NaCl，對于 F4C0Ca，洗脫是通過NaCl梯度進(jìn)行的。對于F4C0Ca，該步驟可通過用60mM NaCl預(yù)洗脫并
38使用IOOmM NaCl洗脫以進(jìn)一步優(yōu)化；而對于F4co，該步驟可通過用IOOmM NaCl洗脫進(jìn)一 步優(yōu)化(無需預(yù)洗脫步驟)。結(jié)果F4co的純化圖7顯示了在F4co純化和羧酰胺化的F4co ( "F4coca")純化過程中收集的含F(xiàn)4 級分的SDS凝膠。在8M尿素存在下，CM hyperZ樹脂完全捕獲粗勻漿中的F4co (第1道)，并用360mM NaCl實(shí)現(xiàn)定量洗脫。第2道中所示的CMhyperZ洗脫液富含大量F4co。將樣品適當(dāng)稀釋并 調(diào)節(jié)至PH 9后，F(xiàn)4co或F4C0Ca與Q瓊脂糖柱結(jié)合。然后如第3道所示，用200mM NaCl特 異性洗脫F4co或F4C0Ca。該色譜不僅除去剩余的宿主細(xì)胞蛋白，而且還除去DNA和內(nèi)毒 素。為了使純化物質(zhì)進(jìn)入制劑相容性緩沖液中，針對IOmM Tris緩沖液、0.5M精氨酸、IOmM 谷胱甘肽，PH 8. 5，在具有12-14kDa截留分子量的透析膜中透析Q瓊脂糖洗脫液。對于羧 酰胺化蛋白省略谷胱甘肽。F4co和F4coca的純化均產(chǎn)生約500mg純化物質(zhì)/L培養(yǎng)物0D130。其與之前用未 密碼子優(yōu)化的F4所觀察到的處于相似的范圍內(nèi)。如上所述，已經(jīng)開發(fā)了兩種不同的純化方法(I和II)來純化不同的F4構(gòu)建體。圖 8比較所得的不同的純化原液。F4呈現(xiàn)出幾種強(qiáng)的低分子量(LMW)帶，密碼子優(yōu)化的F4co僅可見到較弱的帶。方 法I和方法II產(chǎn)生非常相似的F4CO譜。抗大腸桿菌蛋白質(zhì)印跡分析證實(shí)了純化蛋白的純 度，表明所有制劑中的宿主細(xì)胞蛋白污染低于1%。實(shí)施例8測試兩種可以避免氧化的抗氧化劑機(jī)制螯合劑在某些制劑中，螯合劑能夠螯合制劑中存在的可催化氧化反應(yīng)的離子。對于含本 發(fā)明所用的蛋白的制劑可以測試這一項(xiàng)。含-SH的化合物這些抗氧化劑的-SH官能團(tuán)可以在蛋白與F4co的-SH官能團(tuán)反應(yīng)后穩(wěn)定蛋白，或 者可以被氧化，以代替蛋白的-SH官能團(tuán)。測試了 4種螯合劑，即檸檬酸三鈉鹽、蘋果酸鈉鹽、葡萄糖、L-甲硫氨酸，并測試 了 4種抗氧化劑，即谷胱甘肽、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸和一硫代甘油。選定試劑的效力根據(jù)其避免F4co的分子間和/或分子內(nèi)氧化的能力來評價。將對 測試的抗氧化劑獲得的結(jié)果與用亞硫酸鈉(還原劑)+EDTA(螯合劑)獲得的結(jié)果相比較， 在后一種情況下，僅避免了分子內(nèi)氧化。圖9顯示了通過非還原條件的SDS PAGE在非還原條件下分析的螯合劑檸檬酸、 L-甲硫氨酸、蘋果酸和葡萄糖的篩選，其中1檸檬酸三鈉鹽 0. 5%重量/體積2檸檬酸三鈉鹽 1.0%重量/體積3檸檬酸三鈉鹽1. 5%重量/體積4檸檬酸三鈉鹽2. 0%重量/體積5L-甲硫氨酸0. 001 %重量/體積
39
6L-甲硫氨酸0. 01 %重量/體積7L-甲硫氨酸0. 1 %重量/體積8L-甲硫氨酸0. 5 %重量/體積9蘋果酸鈉鹽0. 001 %重量/體積10蘋果酸鈉鹽0. 01 %重量/體積11蘋果酸鈉鹽0. 1 %重量/體積12蘋果酸鈉鹽0.5%重量/體積13葡萄糖0. 001%重量/體積14葡萄糖0.01%重量/體積15葡萄糖0. 1 %重量/體積16葡萄糖1. 0%重量/體積抗氧化劑的篩選以2個步驟實(shí)施。首先，以8種試劑對30 μ g劑量的最終原液進(jìn) 行預(yù)篩選。然后，根據(jù)結(jié)果，有效的抗氧化劑經(jīng)受了對最終原液和90μ g劑量的成品(Final Container)的蹄選。a.對30 μ g劑量的預(yù)篩詵(最終原液)對30 μ g劑量的預(yù)篩選測試以非還原條件的SDS-PAGE對4°C儲存1天的最終原液 進(jìn)行分析。b.對90 μ g劑量的篩詵以90 μ g制劑進(jìn)一步分析所篩選的潛在抗氧化劑，以分析經(jīng)由不同的配制步驟的 效力，所述配制步驟包括最終原液的儲存、分裝、凍干和復(fù)溶?？乖芙舛?目測觀察以比色皿在自然光前觀察制劑(500μ 1)。制劑被描述為‘澄清的’(透明溶液)或 ‘渾濁的’。-離心(14300g，15分鐘)，之后是還原條件的SDS-PAGE對于半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸或一硫代甘油或谷胱甘肽，未觀察到對F4co溶解 度的負(fù)面作用。抗原氧化非還原條件的SDS-PAGE將配制的蛋白與純化原液、陰性對照(用EDTA和亞硫酸鈉配制的F4co)和陽性對 照(未加入亞硫酸鈉和EDTA配制的F4co)比較。穩(wěn)定性測試和加速穩(wěn)定性測試最終原液于4°C儲存后Tl (第1天)、T8 (第8天)和T15 (第15天)非還原條件的SDS-PAGE。復(fù)溶的成品在凍干后(TO)或37°C *儲存7天后或在AOT**下以水復(fù)溶餅塊后非還原條件的 SDS PAGE。于25°C以脂質(zhì)體佐劑復(fù)溶后24小時非還原條件的SDS PAGE。于25°C儲存4小時后以脂質(zhì)體佐劑復(fù)溶的成品的還原條件SDS-PAGE。
40
*7 天，37°C使凍干餅塊經(jīng)受37°C的溫度7天，以便加速穩(wěn)定性。之后，以注射用水復(fù)溶餅塊， 以便通過非還原條件的SDS-PAGE分析。#加諫氧化測試(AOT)使凍干餅塊經(jīng)受765w/m2光照15小時，以迫使產(chǎn)品曝光。之后，以注射用水復(fù)溶 餅塊，以便通過非還原條件的SDS-PAGE分析。a)配制流程圖按照以下流程圖制備多種制劑，但亞硫酸鈉已被相關(guān)的抗氧化劑替代。H2O+蔗糖30% (商品 IM959)+NaH2PO4. 2H20/K2HP04IOOmM pH 6. 8 (商品 121518& 進(jìn)行中(ongoing))+NaH2PO4. 2H20 IOmM/ 精氨酸 0. 8M pH 6. 8 (商品 121518&127636)+吐溫80. 3%重量/體積(商品129042)+EDTA 二鈉 IOmM pH 6. 8，IOX 稀釋時(商品 416234)
于室溫磁力攪拌5分鐘(135 rpm)+抗氧化劑
于室溫磁力攪拌5分鐘(135 rpm)+F4co (Tris IOmM/ 精氨酸 0. 4M/Na2S0310mM/EDTA ImM ；pH 8. 5)
于室溫磁力攪拌5分鐘(135 rpm)檢查和/或調(diào)節(jié)至pH 7. 5+/-0. 1于+4 °C不攪拌儲存分裝+凍干MS含-SH化合物的篩選分析包含-SH官能團(tuán)的制劑谷胱甘肽、一硫代甘油、半胱氨酸和N-乙酰半胱氨酸。 對30 μ g劑量的預(yù)篩選(最終原液)
41[1003]含-SH的化合物在最終原液步驟于4°C 1天后表現(xiàn)出有前景的結(jié)果在所測試的 最高濃度(0.625% )既沒有觀察到分子內(nèi)氧化，也沒有觀察到分子間氧化。 對90 μ g劑量的篩選最終原液穩(wěn)定件包含谷胱甘肽或一硫代甘油的90 μ g劑量制劑的非還原條件SDSPAGE示于圖10， 采用半胱氨酸或N-乙酰半胱氨酸的該SDS PAGE示于圖11。圖10顯示了非還原條件的SDS-PAGE 含谷胱甘肽和一硫代甘油的制劑于4°C T15 天的最終原液穩(wěn)定性。圖10的SDS-PAGE說明IPB2CTRL+3CTRL-4GSH 0.00625%5GSH 0. 0625%6GSH 0. 625%7MTG 0.00625%8MTG 0. 0625%9MTG 0. 625%10在其緩沖液中的PB圖11顯示了非還原條件的SDS-PAGE 含半胱氨酸和乙酰半胱氨酸的制劑于 40C T15天的最終原液穩(wěn)定性。圖11的SDS-PAGE說明IPB2CTRL+3CTRL-4Cyst 0. 00625%5Cyst 0. 0625%6Cyst 0. 625%7Acyst 0. 00625%8Acyst 0. 0625%9Acyst 0. 625%10在其緩沖液中的PB證實(shí)了谷胱甘肽、一硫代甘油、半胱氨酸和N-乙酰半胱氨酸在最終原液于4°C儲 存15天過程中的效力。就最終原液于4°C的穩(wěn)定性而言，谷胱甘肽0. 625%、一硫代甘油0. 625%、半胱氨 酸0. 625%和乙酰半胱氨酸0. 625%與亞硫酸鈉至少等效?？傊?，含0. 5%重量/體積濃度的半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸或一硫代甘油的F4 制劑于4°C儲存1、8或15天時沒有顯示出任何分子間氧化或分子內(nèi)氧化的跡象。含0. 5%重量/體積的谷胱甘肽的F4制劑于4°C儲存1、8或15天時沒有顯示出 分子間氧化或分子內(nèi)氧化的跡象。使用0. 13%重量/體積的亞硫酸鈉的相應(yīng)制劑于4°C儲存1、8或15天時顯示出
42一些分子間氧化。所測試的4種螯合劑的制劑于4°C儲存24小時時全部顯示出分子間氧化和分子內(nèi)氧化。成品穩(wěn)定件和加諫穩(wěn)定件于TO (時間0)在注射用水復(fù)溶后通過非還原條件SDS PAGE分析餅塊，并與經(jīng)受 加速穩(wěn)定性(7天37°C和/或AOT [加速氧化測試)的餅塊比較。當(dāng)以0. 5%重量/體積使用N-乙酰半胱氨酸或一硫代甘油時，于37°C儲存7天的 餅塊沒有顯示出分子間氧化或分子內(nèi)氧化的跡象。當(dāng)以0. 5%重量/體積使用半胱氨酸或 谷胱甘肽或以0. 13%重量/體積使用亞硫酸鈉時，觀察到一些分子間氧化。圖12顯示了含谷胱甘肽和一硫代甘油的復(fù)溶凍干抗原(餅塊)的非還原條件的 SDS-PAGE，其中ICTRL+2CTRL-3GSH 0. 625%4MTG 0.00625%5MTG 0. 0625%6MTG 0. 625%對餅塊進(jìn)行加速測試含-SH官能團(tuán)的4種化合物即便在所述餅塊接受加速穩(wěn)定性(7天37°C，Α0Τ，或 二者的組合)之后，也至少與亞硫酸鈉等效。一硫代甘油、半胱氨酸和N-乙酰半胱氨酸的 最高測試濃度(0. 5% )比IOmM亞硫酸鈉更有效避免F4co氧化。由這些數(shù)據(jù)結(jié)果可以得出關(guān)于效力的結(jié)論· 0. 5%谷胱甘肽提供與IOmM亞硫酸鈉等效的穩(wěn)定性。 而0.5%—硫代甘油、0.5%半胱氨酸、0.5%乙酰半胱氨酸提供優(yōu)于IOmM亞硫
酸鈉的穩(wěn)定性。F4co 溶解度在以ASOlB復(fù)溶餅塊4小時后，研究選定的賦形劑對F4co溶解度的影響。圖13 顯示了針對半胱氨酸和N-乙酰半胱氨酸獲得的結(jié)果，其中ICTRL+2CTRL-3Cyst 0. 625%4Acyst 0. 00625%5Acyst 0. 0625%6Acyst 0. 625%圖14 還原條件的SDS-PAGE 以含MPL和QS21的脂質(zhì)體佐劑復(fù)溶含半胱氨酸和乙 酰半胱氨酸的餅塊，于25°C 4小時后(離心之前和之后)，其中ICTRL+2CTRL-3Cyst 0. 5%
43[1062]4Acyst 0. 5%且其中NC 未離心的SN上清液P 沉淀總之，含0. 5%重量/體積濃度的半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸或一硫代甘油的F4 制劑在與含MPL和QS21的脂質(zhì)體佐劑一起于25°C儲存24小時時沒有顯示出任何分子間氧 化或分子內(nèi)氧化的跡象。含0. 5%重量/體積的谷胱甘肽的F4制劑在與含MPL和QS21的 脂質(zhì)體佐劑一起于25°C儲存24小時時顯示出一些分子間氧化。使用0. 13%重量/體積的 亞硫酸鈉的相應(yīng)制劑在等同條件下儲存時顯示出一些分子間氧化。具有較低量的抗氧化劑的制劑顯示出不同程度的氧化。
4權(quán)利要求
一種用于HIV疫苗或液體原液的組分，所述組分包含a)免疫原性融合蛋白，所述融合蛋白包含Nef或其免疫原性片段或衍生物，以及p17Gag和/或p24Gag或其免疫原性片段或衍生物，其中當(dāng)p17和p24Gag均存在時，在它們之間存在至少一種HIV抗原或免疫原性片段，和b)穩(wěn)定劑，所述穩(wěn)定劑為含硫醇官能團(tuán)的抗氧化劑，例如選自谷胱甘肽、一硫代甘油、半胱氨酸、N 乙酰半胱氨酸或其混合物。
2.權(quán)利要求1的組分或液體原液，其中所述穩(wěn)定劑為谷胱甘肽。
3.權(quán)利要求1的組分或液體原液，其中所述穩(wěn)定劑為一硫代甘油。
4.權(quán)利要求1的組分或液體原液，其中所述穩(wěn)定劑為半胱氨酸。
5.權(quán)利要求1的組分，其中所述穩(wěn)定劑為N-乙酰半胱氨酸。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的組分或液體原液，其中所述穩(wěn)定劑的濃度使得最終制劑中 的濃度為約0. 5%重量/體積。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的組分或原液，所述組分或原液進(jìn)一步包含蔗糖、葡萄糖、甘 露醇或果糖。
8.權(quán)利要求7的組分或原液，其中所述蔗糖、葡萄糖、甘露醇或果糖的濃度使得最終制 劑的濃度為1-10% (重量)。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的組分或原液，所述組分或原液進(jìn)一步包含精氨酸。
10.權(quán)利要求9的組分或液體原液，其中所述精氨酸的濃度為200-400mM。
11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的組分或液體原液，所述組分或液體原液進(jìn)一步包含螯合劑。
12.權(quán)利要求11的組分或液體原液，其中所述螯合劑選自檸檬酸三鈉鹽、蘋果酸鈉鹽、 葡萄糖、L-甲硫氨酸或EDTA 二鈉。
13.權(quán)利要求12的組分或液體原液，其中所述螯合劑為EDTA。
14.權(quán)利要求12或權(quán)利要求13的組分或原液，其中所述螯合劑的濃度為每劑 0. 5mM-2mM0
15.權(quán)利要求14的組分或液體原液，其中所述螯合劑的濃度使得最終制劑的濃度為 lmM-1. 25mM。
16.權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的組分或原液，所述組分或原液進(jìn)一步包含非離子表面活 性劑。
17.權(quán)利要求16的組分或原液，其中所述非離子表面活性劑為吐溫80。
18.權(quán)利要求16或權(quán)利要求17的組分或原液，其中所述非離子表面活性劑的濃度使得 最終制劑的濃度為0. 005%重量/體積至約0. 05%重量/體積。
19.權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的組分或原液，所述組分或原液進(jìn)一步包含緩沖劑。
20.權(quán)利要求19的組分或原液，其中所述緩沖劑為磷酸鹽(PO4)緩沖劑，例如磷酸鈉。
21.權(quán)利要求19或權(quán)利要求20的組分或原液，其中所述緩沖劑的濃度使得最終制劑的 濃度為lmM-50mM。
22.權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)的組分或原液，所述組分或原液進(jìn)一步包含防腐劑。
23.權(quán)利要求22的組分或原液，其中所述防腐劑為硫柳汞。
24.用于HIV疫苗的原液或組分，所述原液或組分包含2a)免疫原性融合蛋白，所述免疫原性融合蛋白包含Nef或其免疫原性片段或衍生物， 以及pl7Gag和/或p24Gag或其免疫原性片段或衍生物，其中當(dāng)pl7和p24Gag均存在時， 在它們之間存在至少一種HIV抗原或免疫原性片段，b)穩(wěn)定劑，所述穩(wěn)定劑為包含硫醇官能團(tuán)的抗氧化劑，所述穩(wěn)定劑例如選自谷胱甘肽、 一硫代甘油、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸或其混合物，c)重量/體積或以下的非離子表面活性劑，d)200mM-450mM 精氨酸，e)0.5mM-2. OmM 螯合劑，f)lmM-50mM 緩沖劑。
25.一種凍干組分或液體原液，其如權(quán)利要求1-24中的任一項(xiàng)所定義。
26.—種藥物組合物或疫苗，所述藥物組合物或疫苗包含如權(quán)利要求1-24中的任一項(xiàng) 所定義的組分。
27.權(quán)利要求26的藥物組合物或包含權(quán)利要求25的凍干抗原的疫苗，所述藥物組合物 或疫苗進(jìn)一步包含佐劑。
28.權(quán)利要求27的藥物組合物或疫苗，其中所述佐劑包含TLR4激動劑。
29.權(quán)利要求28的藥物組合物或疫苗，其中所述TRL4激動劑為MPL。
30.權(quán)利要求27-29中任一項(xiàng)的藥物組合物或疫苗，其中所述佐劑進(jìn)一步包含皂苷。
31.權(quán)利要求30的藥物組合物或疫苗，其中所述皂苷為QS21。
32.權(quán)利要求27-31中任一項(xiàng)的藥物組合物或疫苗，其中所述佐劑以脂質(zhì)體制劑提供。
33.權(quán)利要求1-24中的任一項(xiàng)所定義的組分或原液或權(quán)利要求26-31中的任一項(xiàng)所定 義的藥物組合物或疫苗，它們用于治療和/或預(yù)防HIV或AIDS。
34.權(quán)利要求1-24中的任一項(xiàng)所定義的組分或最終原液或權(quán)利要求26-31中的任一項(xiàng) 所定義的藥物組合物在制備用于治療或預(yù)防HIV或AIDS的藥物中的用途。
35.一種用于治療或預(yù)防HIV或AIDS的治療方法，所述方法包括給予治療有效量的如 在權(quán)利要求26-32中的任一項(xiàng)所定義的藥物組合物或疫苗。
36.具有至少一個硫醇官能團(tuán)的抗氧化劑用于穩(wěn)定免疫原性融合蛋白的制劑的用途， 所述免疫原性融合蛋白包含Nef或其免疫原性片段或衍生物，以及pl7Gag和/或p24Gag 或其免疫原性片段或衍生物，其中當(dāng)P17和p24Gag均存在時，則在它們之間存在至少一種 HIV抗原或免疫原性片段。
37.權(quán)利要求36的用途，其中所述抗氧化劑選自一硫代甘油、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨 酸和谷胱甘肽。
38.權(quán)利要求36或37的用途，其中所述蛋白為F4。
39.一種藥盒，所述藥盒包括權(quán)利要求25中所定義的凍干組分和單獨(dú)的裝有佐劑的容器ο
40.一種復(fù)溶如權(quán)利要求25所定義的凍干組分的方法，所述方法包括將液體佐劑加入 所述組分中的步驟。
全文摘要
一種HIV疫苗的組分，其包含a)免疫原性融合蛋白，其包含Nef或其免疫原性片段或衍生物，和p17Gag和/或p24Gag或其免疫原性片段或衍生物，其中當(dāng)p17和p24Gag這二者均存在時，在它們之間存在至少一種HIV抗原或免疫原性片段，和b)穩(wěn)定劑，其選自一硫代甘油、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸或其混合物。本發(fā)明還擴(kuò)展至包含所述組分的HIV疫苗以及治療/預(yù)防HIV的用途。
文檔編號A61K39/12GK101951950SQ200880127446
公開日2011年1月19日 申請日期2008年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月21日
發(fā)明者D·I·勒穆瓦納, S·V·A·蓬薩爾 申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司