專利名稱：?jiǎn)慰寺】贵w及其方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人源化IgGl同種型抗-⑶6抗體(Tlh)，其與存在于胸腺上皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、激活的τ細(xì)胞和各種其他細(xì)胞類型表面上的CD6的清道夫受體富含半胱氨酸 (SRCR)結(jié)構(gòu)域1 (Dl)結(jié)合。本發(fā)明進(jìn)一步涉及抑制T細(xì)胞增殖但不阻斷CD6和原初CD6配 體樣激活白細(xì)胞粘附分子(ALCAM)相互作用的方法。本發(fā)明還涉及使用與CD6的SRCR結(jié) 構(gòu)域1 (Dl)結(jié)合的抗-CD6抗體治療各種疾病適應(yīng)癥的方法。
背景技術(shù)：
⑶6是主要由人T細(xì)胞和B細(xì)胞亞群以及由一些B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病 和神經(jīng)元表達(dá)的重要細(xì)胞表面蛋白[Aruffo等，J.Exp. Med. 1991,174:949 ； Kamoun等， J. Immunol. 1981，127 987 ；Mayer 等，J. Neuroimmunol. 1990. 29 193]。CD6 是特征在于 具有至少一個(gè)與I型巨噬細(xì)胞的清道夫受體富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域(SRCR)同源的蛋白質(zhì) 大家族的成員[Matsumoto 等，J. Exp. Med. 1991，173 55 禾口 Resnick 等，Trends Biochem. Sci. 1994，19-5]。這個(gè)家族的其他成員包括 CD5[Jones 等，Nature. 1986,323 346]；親 環(huán)素C[Friedman等，1993，PNAS 90 :6815]；補(bǔ)體因子I，其結(jié)合激活的補(bǔ)體蛋白C3b 和 C4b [Go Idberger 等，J. Biol. Chem. 1987，262 10065]；由· τ·/· δ.T 細(xì)胞表達(dá)的牛 WC-l[Wijingaard 等，J. Immunol. 1992，149 3273]禾口 M130[Law 等，Eur J. Immunol. 1993， 23 :2320]，一種巨噬細(xì)胞激活標(biāo)記。使用抗-⑶6單克隆抗體(mAb)的阻斷研究表明⑶6通過(guò)調(diào)節(jié)T細(xì)胞與胸腺上皮 (TE)細(xì)胞的粘附相互作用在T細(xì)胞發(fā)育中起著重要作用[Patel等，J.Exp. Med. 1995 181 1563-1568]。其他研究已經(jīng)表明⑶6在T細(xì)胞激活中可以作為重要的輔助分子來(lái)起作用。 例如，某些抗-⑶6 mAb對(duì)于T細(xì)胞是直接致有絲分裂的[Gangemi等，J. Immunol. 1989，143 2439和Bott等，1993 Int. Immunol，7 :783]，而其他能夠和抗-CD3、抗-CD2或佛波醇12肉 豆蔻酸酯13醋酸酯(PMA) 一道共同刺激T細(xì)胞增殖[Gangemi等，J. Immunol. 1989，143 2439 ；Morimoto 等，J. Immunol. 1988，140 ；2165-2170 ；禾口 Osorio 等，Cell. Immunol. 1994， 154 23]。⑶6在T細(xì)胞激活中的作用的其他證據(jù)來(lái)自表明在T細(xì)胞激活后⑶6對(duì)Ser和 Thr 殘基變得超磷酸化[Swack等，Mol Immunol 1989 26 :1037_1049和 J. Biol. Chem. 1991， 266 7137 ；Cardenas 等，J. Immunol. 1990，145 1450-1455]和對(duì) Tyr 殘基變得磷酸化[Wee 等，J. Exp. Med. 1993，177 :219_223]的研究。這些和其他研究暗示CD6是體內(nèi)未成熟和成 熟T細(xì)胞功能的重要調(diào)節(jié)劑，影響T細(xì)胞激活和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。成熟⑶6蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域由三個(gè)SRCR結(jié)構(gòu)域(下文中稱為D1、D2和D3)組成。 D3對(duì)應(yīng)于膜近端SRCR結(jié)構(gòu)域，其后為短的33-氨基酸的莖區(qū)。這些胞外結(jié)構(gòu)域通過(guò)后面 為可變長(zhǎng)度的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的短跨膜結(jié)構(gòu)域錨定于細(xì)胞膜上[Aruffo等，J. Exp. Med. 1991， 174 949]。使用CD6-免疫球蛋白融合蛋白(含有與人IgG1恒定區(qū)融合的選定的CD6胞外 結(jié)構(gòu)域(CDe-Rgs)的研究，導(dǎo)致CD6配體的鑒定和克隆，該配體被稱為“激活的白細(xì)胞粘附 分子”(ALCAM) [Wee 等，Cell Immunol 1994,158 :353_364 ；Patel 等，J. Exp. Med. 1995. 181 1563-1568 ；Bowen 等，J. Exp. Med. 1995，181 :2213_2220]。ALCAM 與對(duì)應(yīng)于膜近端 SRCR 結(jié) 構(gòu)域的 CD6 的結(jié)構(gòu)域 3 結(jié)合[Whitney 等，J. Biol. Chem. 1995，270 18187-18190]。⑶6/ALCAM相互作用在T細(xì)胞調(diào)節(jié)中的作用的研究已經(jīng)表明該受體_配體對(duì)能夠 介導(dǎo)CD6表達(dá)細(xì)胞粘附到胸腺上皮細(xì)胞上[Bowen等，J. Exp. Med. 1995，181 2213]。這個(gè)和 其他證據(jù)表明CD6/ALCAM相互作用對(duì)于調(diào)節(jié)T細(xì)胞發(fā)育和激活是重要的。盡管⑶6的功能性表征仍然不完善，但抗-⑶6mAb已經(jīng)成功地應(yīng)用于臨床環(huán)境 下，用于清除骨髓的τ細(xì)胞和T細(xì)胞前體。接受抗-CD6-處理的異源骨髓的患者與高 水平移植聯(lián)合的移植物抗宿主疾病的發(fā)病率低的發(fā)現(xiàn)[Soiffer RJ, 1993, Bone Marrow Transplant. ； 12Suppl3. S7-10]導(dǎo)致CD6陰性的小的外周血T細(xì)胞亞群(5-6% )的發(fā)現(xiàn) (Rasmussen. J Immunol 1994. 152 :527_536)。CD6 陰性 T 細(xì)胞的亞群與正常的 CD6T 細(xì)胞 相比在MLR中呈現(xiàn)較低的同種異體反應(yīng)性。這些CD6-陰性T細(xì)胞的功能性表征還表明 了它們對(duì)異源刺激是無(wú)應(yīng)答的，但用植物凝集素(PHA)刺激時(shí)能夠增殖。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步 支持CD6在體內(nèi)調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能中起著重要作用的假設(shè)。還報(bào)道了 CD6是介導(dǎo)早期和晚 期T細(xì)胞-APC相互作用的免疫學(xué)突觸的一部分。(Gimferrer I. J Immunol 2004. 173 2262-2270)。
CD6分子是由蛋白酶敏感位點(diǎn)N糖基化的，并具有鏈內(nèi)二硫鍵。之前的報(bào)道表明 CD6以兩種分子形式存在，靜息T細(xì)胞中的105kDa的磷酸化形式和由腫瘤促進(jìn)劑佛波醇12 肉豆蔻酸酯13醋酸酯(PMA)激活蛋白激酶C后細(xì)胞中的130kDa的超磷酸化形式(Osorio M, Cellular Immunology, 1994154 :123_133)。US 6，372，215公開(kāi)了與⑶6 (h⑶6)的SRCR結(jié)構(gòu)域3 (D3)或人⑶6莖結(jié)構(gòu)域特異 性結(jié)合(CD6S)并抑制激活的白細(xì)胞粘附分子(ALCAM)與CD6結(jié)合的抗體和其他結(jié)合劑，在 此將其內(nèi)容引入作為參考。2006年12月26日提交的發(fā)明名稱為“用于診斷和治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的包含抗 ⑶6單克隆抗體的藥物組合物”的古巴專利申請(qǐng)⑶250/2006公開(kāi)了 Tlh與⑶6結(jié)合，但沒(méi) 有抑制CD6與ALCAM配體的結(jié)合，在此將其內(nèi)容引入作為參考。該發(fā)明的CD6抗體通過(guò)抑制由與結(jié)構(gòu)域結(jié)合引起的T細(xì)胞增殖來(lái)防止T細(xì)胞的激 活，該結(jié)構(gòu)域獨(dú)立于與CD6的已知配體(即ALCAM)相互作用的結(jié)構(gòu)域。早期的出版物和專利公開(kāi)了鼠抗CD6(I0R_T1)單克隆抗體的序列和為了將 I0R-T1人源化成Tlh(人源化I0R-T1)而進(jìn)行的氨基酸修飾。US 5712120及其同族 EP 0699755公開(kāi)了將鼠單克隆抗體人源化的特定方法以及I0R-T1和Tlh的序列。US 6572857及其同族EP0807125公開(kāi)了 I0R-T1和Tlh(人源化I0R-T1)的序列。出版物 [Roque-Navarro，L.等，Hybridoma and Hybridomics 2003.22:245-257]討論了將鼠單克 隆抗體人源化的特定方法以及I0R-T1和Tlh的序列。本發(fā)明的各個(gè)方面涉及Tlh重鏈和輕鏈的可變區(qū)的氨基酸序列。這確立了 Tlh核 苷酸和氨基酸序列，如通過(guò)用于制造Tlh的細(xì)胞系所表達(dá)的。本發(fā)明的單克隆抗體能夠與 CD6的結(jié)構(gòu)域I(Dl)結(jié)合并抑制T-細(xì)胞增殖，而不干擾ALCAM結(jié)合。本發(fā)明的單克隆抗體 在體外沒(méi)有誘導(dǎo)補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)、抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)和凋亡。發(fā)明目的本發(fā)明的主要目的是獲得能夠與CD6的結(jié)構(gòu)域1 (Dl)結(jié)合并抑制T細(xì)胞增殖而不干擾ALCAM結(jié)合的單克隆抗體。本發(fā)明的另一個(gè)主要目的是獲得使用該單克隆抗體來(lái)調(diào)節(jié)炎性病癥的方法。本發(fā)明的再另一個(gè)主要目的是獲得使用該單克隆抗體與免疫抑制劑相結(jié)合來(lái)調(diào) 節(jié)炎性病癥的方法。本發(fā)明的再另一個(gè)主要目的是獲得使用單克隆抗體與能夠引發(fā)抗炎免疫應(yīng)答的 抗原(如胰島素、GAD、MOG、MBP和HSP60)相結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)炎性病癥的方法。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明涉及能夠與CD6的結(jié)構(gòu)域I(Dl)結(jié)合并抑制T細(xì)胞增殖而不干擾 ALCAM結(jié)合的單克隆抗體；使用該單克隆抗體來(lái)調(diào)節(jié)炎性病癥的方法，該炎性病癥如牛皮 癬、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或患者體內(nèi)的自體免疫應(yīng)答，如與多發(fā)性硬化或移植排斥相關(guān)的不利 應(yīng)答，移植物抗宿主疾病，I"型糖尿病，牛皮癬，皮膚性T細(xì)胞淋巴瘤，甲狀腺炎和其他T細(xì) 胞介導(dǎo)的自體免疫疾病；使用該單克隆抗體與免疫抑制劑相結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)炎性病癥的方法， 該炎性病癥如牛皮癬、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或患者體內(nèi)的自體免疫應(yīng)答，如與多發(fā)性硬化或移 植排斥相關(guān)的不利應(yīng)答，移植物抗宿主疾病，I"型糖尿病，牛皮癬，皮膚性T細(xì)胞淋巴瘤，甲 狀腺炎和其他T細(xì)胞介導(dǎo)的自體免疫疾??；使用單克隆抗體與能夠引發(fā)抗炎免疫應(yīng)答的抗 原(如胰島素、GAD、M0G、MBP*HSP60)相結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)炎性病癥的方法，該炎性病癥如多發(fā) 性硬化或移植排斥，移植物抗宿主疾病，I"型糖尿病。附圖簡(jiǎn)述圖 1 圖Ia 源自質(zhì)粒和基因組DNA的Tlh的VH和Vk的核苷酸序列。圖lb =VH和Vk的氨基酸序列。圖Ic 之前出版物中公開(kāi)的Vk氨基酸序列與本專利中公開(kāi)的序列的比較，高亮顯 示序列差異。圖2 在單獨(dú)的Tlh和ALCAM或Tlh存在下，用⑶6_Fc處理的平板的ELISA閱讀。圖 3 當(dāng) MEM98 (與結(jié)構(gòu)域 1 結(jié)合的抗體(Castro AA M 等，J of Immunol, 178 (2007) 4351-4361))與Tlh競(jìng)爭(zhēng)時(shí)，存在所觀察到的劑量依賴性競(jìng)爭(zhēng)，表明兩者都與相 同的結(jié)構(gòu)域，即結(jié)構(gòu)域1結(jié)合。圖4 用Tlh抗體(5ug/ml)、hR3抗體(5ug/ml)和雷帕霉素(1. 2ug/ml)或沒(méi)用抗 體(作為對(duì)照)處理HUT 78細(xì)胞，并在CO2培養(yǎng)箱中在37°C下培養(yǎng)過(guò)夜。然后用膜聯(lián)蛋白 V標(biāo)記溶液處理細(xì)胞，接著進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。V FITC對(duì)數(shù)在水平軸上，PI/PE得克薩斯 紅在垂直軸上。圖5 =FITC通道的Sphero校準(zhǔn)圖。圖6 不同健康個(gè)體的T和B淋巴細(xì)胞上的⑶6受體密度。T細(xì)胞顯示出對(duì)⑶6陽(yáng) 性的⑶6受體比B細(xì)胞高10倍。圖7 使用B細(xì)胞單克隆抗體作為陽(yáng)性對(duì)照對(duì)Daudi細(xì)胞分析了 ADCC試驗(yàn)。用 CFSE標(biāo)記Daudi細(xì)胞并用或不用B細(xì)胞單克隆抗體(2. 5，5&10ug/ml)培養(yǎng)，hR3 (10ug/ml) 用作非特異性對(duì)照，PBMC用作效應(yīng)細(xì)胞，比例為1 25、1 50,1 100。將細(xì)胞培養(yǎng)6小 時(shí)。使用7AAD來(lái)檢測(cè)細(xì)胞毒性細(xì)胞。在CYAN ADP流式細(xì)胞計(jì)中分析細(xì)胞。圖8 在2D點(diǎn)圖中通過(guò)B細(xì)胞單克隆抗體的對(duì)Daudi細(xì)胞的ADCC試驗(yàn)。
圖9 在2D點(diǎn)圖中用5 μ g/ml Tlh的對(duì)HUT78的ADCC試驗(yàn)。

圖10 :Tlh在ADCC試驗(yàn)中的作用。用CFSE標(biāo)記HUT78，并用或不用Tlh抗體培養(yǎng)， hR3用作非特異性對(duì)照，PBMC用作效應(yīng)細(xì)胞，比例為1 1、1 25、1 50。將目標(biāo)效應(yīng) 細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜。使用7AAD來(lái)檢測(cè)細(xì)胞毒性細(xì)胞。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)分析細(xì)胞。圖11 :Tlh在ADCC試驗(yàn)中的作用。用CFSE標(biāo)記HUT 78并用和不用Tlh抗體 (5&10ug/ml)培養(yǎng)，hR3(10ug/ml)用作非特異性對(duì)照，PBMC用作效應(yīng)細(xì)胞，比例為1 1、 1 25、1 50。將目標(biāo)效應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜。使用7AAD來(lái)檢測(cè)細(xì)胞毒性細(xì)胞。通過(guò)流式 細(xì)胞術(shù)來(lái)分析細(xì)胞。圖12 :a, b和c，d 各自表示分別為5 μ g/ml和10 μ g/ml的Tlh和hR3 (非特異性 抗體)的兩個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)。圖表示在不同目標(biāo)效應(yīng)比例下死細(xì)胞的百分比。圖13 使用Alamar藍(lán)的⑶C試驗(yàn)中B細(xì)胞單克隆抗體和Tlh之間的細(xì)胞毒性倍
數(shù)差異。圖14 =CFSE的直方圖，顯示了未刺激的和植物凝集素(PHA-M)刺激的細(xì)胞的熒光 強(qiáng)度。FITC對(duì)數(shù)在水平軸上，細(xì)胞數(shù)在垂直軸上。在峰上方的區(qū)域(R14)用于計(jì)數(shù)增殖事 件。圖15:作為條線圖的Tlh對(duì)淋巴細(xì)胞的劑量依賴性限制。該圖表示在不同濃度 (50ug/ml、25ug/ml、12. 5ug/ml、6. 25ug/ml)下 Tlh 對(duì) PHA 活化淋巴細(xì)胞的抑制％。使用相 同濃度的hR3(非特異性抗體)。圖16 作為獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的之前實(shí)驗(yàn)的重復(fù)。Tlh對(duì)淋巴細(xì)胞的劑量依賴性抑制。該 圖表示在不同濃度(50ug/ml、25ug/ml、12. 5ug/ml、6. 25ug/ml)下Tlh對(duì)PHA活化淋巴細(xì)胞 的抑制％。使用相同濃度的hR3 (非特異性抗體)。圖17 在基于ALAMAR藍(lán)試驗(yàn)的96孔平板中，10 μ g/ml濃度的可溶性Tlh的存在 明顯抑制了 PHA介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖。圖18 用于抗⑶3、抗⑶3+Tlh和抗CD3+ALCAM_Fc的栓系實(shí)驗(yàn)的平板設(shè)立。圖19 在栓系抗CD3、抗CD3+Tlh和抗CD3+ALCAM_Fc的存在下，sTlh禾口 shR3(10yg/ml)各自對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的作用之間的比較。如實(shí)驗(yàn)方案中所提及的，使用了 不同量的栓系抗⑶3和固定濃度的Tlh或ALCAM。圖20 在BLISS中之前數(shù)據(jù)的分析，其中較低的線是各自使用不同濃度的抗CD3 抗體和ALCAM-Fc或抗CD6抗體獲得的實(shí)驗(yàn)曲線。虛線是預(yù)測(cè)曲線，如果該組合是加性的。 上面的線是實(shí)驗(yàn)獲得的曲線，并且在兩種情況下，都在理論預(yù)測(cè)的曲線上方，表明該組合是 協(xié)同的。圖21 在不同的濃度下由IL2誘導(dǎo)的原初T細(xì)胞的增殖?？扇苄訲lh和可溶性hR3 沒(méi)有顯示任何作用。PHA作為陽(yáng)性對(duì)照加入。圖22 栓系⑶3和⑶3+ALCAM-Fc引起了淋巴細(xì)胞增殖，這受到可溶性Tlh的抑制。 IL2和可溶性Tlh —起顯示了在這兩種情況下該抑制的部分恢復(fù)。圖23 在抗⑶3和抗⑶3+ALCAM栓系孔中，與對(duì)照(可溶性hR3非特異性抗體) 相比較，可溶性Tlh降低了 IL10、INFy, IL6和TNFa表達(dá)。所加入的外源性IL2和可溶 性Tlh —起顯示了該抑制的部分恢復(fù)，表明可溶性Tlh的抑制受到IL2下調(diào)的介導(dǎo)。實(shí)驗(yàn) 顯示了來(lái)自兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)的平均值。
圖24 在可溶性Tlh (sTlh)的存在下，存在表達(dá)⑶4和⑶25的絕對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)的部分降低，在加入sTlh和外源性IL2時(shí)，其得到恢復(fù)。然而，在可能與絕對(duì)受體計(jì)數(shù)相關(guān)的平 均熒光強(qiáng)度中，在⑶4計(jì)數(shù)中存在明顯的MFI降低，而在⑶25計(jì)數(shù)中更為明顯?？梢酝ㄟ^(guò) 加入外源性IL2(1. 2ng/ml)分別將這兩種降低全部或部分恢復(fù)。在栓系抗⑶3以及栓系抗 CD3和ALCAM-Fc孔中都觀察到了這種現(xiàn)象。圖25 可溶性Tlh對(duì)增殖的抑制沒(méi)有受到增加的凋亡的介導(dǎo)。PI陽(yáng)性細(xì)胞是壞死 細(xì)胞，而膜聯(lián)蛋白V FITC陽(yáng)性細(xì)胞是凋亡細(xì)胞，兩者都是陽(yáng)性的是晚期凋亡細(xì)胞。從數(shù)據(jù) 清楚地看出與對(duì)照相比較，不同組合的每一個(gè)死亡參數(shù)不存在明顯的增加或減少。圖26 用Tlh抗體(10ug/ml)、hR3 (同種型對(duì)照)或不用抗體(作為對(duì)照)處理 PBMC，并在CO2培養(yǎng)箱中在37°C下培養(yǎng)5天。在培養(yǎng)前，用破傷風(fēng)類毒素刺激細(xì)胞。用Alamar 藍(lán)色染料測(cè)量增殖。在Tlh的存在下，觀察到?jīng)]有增殖的抑制。圖27 在此按照之前提及的(程序II)通過(guò)免疫熒光來(lái)顯示Raji細(xì)胞，是真實(shí)的 B細(xì)胞并且也表達(dá)MHC II抗原。圖28 在絲裂霉素處理過(guò)的Raji細(xì)胞存在下的PBMC增殖。陽(yáng)性對(duì)照表明PBMC 在PHA的存在下生長(zhǎng)。與沒(méi)有抗體或hR3對(duì)照相比較，sTlh抑制T細(xì)胞增殖(t檢驗(yàn)顯著 地)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)是獲自六個(gè)不同孔的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖29 異源樹(shù)突細(xì)胞混合的淋巴細(xì)胞反應(yīng)_平板設(shè)置。圖30 異源樹(shù)突細(xì)胞混合的淋巴細(xì)胞反應(yīng)。Tlh顯示PBMC增殖的劑量依賴性抑制。 陽(yáng)性對(duì)照吡美莫司(其是已知的IL2抑制劑)在所有測(cè)試的濃度下抑制。陰性對(duì)照hR3與 實(shí)驗(yàn)對(duì)照相似。Y軸是相對(duì)熒光單位(RFU)。圖31 異源樹(shù)突細(xì)胞混合的淋巴細(xì)胞反應(yīng)。細(xì)胞因子水平的評(píng)價(jià)。IL6和INFy 以劑量依賴性的方式受到Tlh以及吡美莫司(已知的IL2抑制劑)的抑制。所附序列表的簡(jiǎn)述SEQ ID NO 1 :VH序列的氨基酸序列SEQ ID NO 2 =VK序列的氨基酸序列SEQ ID NO 3 :VH序列的核苷酸(DNA)序列SEQ ID NO 4 =VK序列的核苷酸(DNA)序列發(fā)明詳述本發(fā)明涉及能夠與CD6的結(jié)構(gòu)域1 (Dl)結(jié)合并抑制T細(xì)胞增殖而不干擾ALCAM結(jié) 合的單克隆抗體。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，單克隆抗體包含與SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2 中所示氨基酸序列至少80%同源的氨基酸序列。在本發(fā)明的再另一個(gè)實(shí)施方案中，單克隆抗體包含與SEQ ID NO :3或SEQ ID NO: 4中所示核苷酸序列至少80%同源的氨基酸序列。在本發(fā)明的再另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體在體外不誘導(dǎo)補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)。在本發(fā)明的再另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體在體外不誘導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性 (ADCC)。在本發(fā)明的再另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體在體外不誘導(dǎo)凋亡。在本發(fā)明的再另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體抑制由栓系抗-CD3、栓系抗-CD3和抗-CD6的組合或栓系抗⑶3和ALCAM的組合誘導(dǎo)的原初PBMC的增殖。在本發(fā)明的再另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體特異性地抑制單向MLR，其中Raji細(xì)胞是 抗原呈遞細(xì)胞，并且PBMC增殖。在本發(fā)明的再 另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體特異性地抑制由PBMC介導(dǎo)的單向自體 MLR。在本發(fā)明的再另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)實(shí)質(zhì)性地降低促炎細(xì)胞因子，抗體引起原 初T細(xì)胞增殖的抑制。在本發(fā)明的再另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)⑶25和⑶4計(jì)數(shù)的減少，抗體引起原初T 細(xì)胞增殖的抑制。在本發(fā)明的再另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)介導(dǎo)IL2的抑制，抗體抑制了 T細(xì)胞增殖。在本發(fā)明的再另一個(gè)實(shí)施方案中，隨著外源性IL2的添加，抗體顯示出功能的增強(qiáng)。在本發(fā)明的再另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體涉及促炎細(xì)胞因子IL6和INFy的下調(diào)。在本發(fā)明的再另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體沒(méi)有抑制記憶-T-細(xì)胞群體。本發(fā)明涉及使用根據(jù)在前一個(gè)或多個(gè)權(quán)利要求的單克隆抗體來(lái)調(diào)節(jié)炎性病癥的 方法，該炎性病癥如牛皮癬、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或患者體內(nèi)的自體免疫應(yīng)答，如與多發(fā)性硬化 或移植排斥相關(guān)的不利應(yīng)答，移植物抗宿主疾病，I"型糖尿病，牛皮癬，皮膚性T細(xì)胞淋巴 瘤，甲狀腺炎和其他T細(xì)胞介導(dǎo)的自體免疫疾病。本發(fā)明涉及使用單克隆抗體與免疫抑制劑相結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)炎性病癥的方法，該炎性 病癥如牛皮癬、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或患者體內(nèi)的自體免疫應(yīng)答，如與多發(fā)性硬化或移植排斥 相關(guān)的不利應(yīng)答，移植物抗宿主疾病，I"型糖尿病，牛皮癬，皮膚性T細(xì)胞淋巴瘤，甲狀腺炎 和其他T細(xì)胞介導(dǎo)的自體免疫疾病。本發(fā)明涉及使用單克隆抗體與能夠引發(fā)抗炎免疫應(yīng)答的抗原(如胰島素，GAD, MOG, MBP和HSP60)相結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)炎性病征的方法，該炎性病癥如多發(fā)性硬化或移植排斥， 移植物抗宿主疾病，I"型糖尿病。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括將治療或藥物學(xué)上有效量的與人 ⑶6SRCR結(jié)構(gòu)域1 (Dl)特異性結(jié)合并且不抑制ALCAM結(jié)合h⑶6的抗-⑶6結(jié)合抗體施予患
者ο在本發(fā)明的再另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物學(xué)上的有效劑量為0. l_25mg/kg/周。在本發(fā)明的再另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)與SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2中所示氨 基酸序列至少80%同源的氨基酸序列來(lái)表示單克隆抗體。在本發(fā)明的再另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)與SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4中所示氨 基酸序列至少80%同源的核苷酸序列來(lái)表示單克隆抗體?，F(xiàn)在將詳細(xì)地參考本發(fā)明目前優(yōu)選的實(shí)施方案，這些實(shí)施方案與以下實(shí)施例一 起，將用于解釋本發(fā)明的原理。列出以下實(shí)施例來(lái)幫助理解本發(fā)明，但目的不是并且不應(yīng)當(dāng)解釋為以任何方式來(lái) 限制本發(fā)明的范圍。該實(shí)施例不包括試驗(yàn)程序中所用常規(guī)方法的詳細(xì)描述。這樣的方法是 本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且在許多出版物中有描述，包括作為實(shí)施例來(lái)描述。除非在此另外限定，結(jié)合本發(fā)明所用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的意義。此外，除非上下文另外要求，單數(shù)項(xiàng)應(yīng)當(dāng)包括復(fù)數(shù)，并且復(fù)數(shù)項(xiàng)應(yīng)當(dāng) 包括單數(shù)。在描述和主張本發(fā)明中，將根據(jù)在此列出的定義來(lái)使用以下的術(shù)語(yǔ)?！翱?⑶6抗體”是與人⑶6 (h⑶6)的SRCR結(jié)構(gòu)域1 (Dl)特異性結(jié)合的抗體。在本 發(fā)明的優(yōu)選方面中，提供了與人CD6的SRCR結(jié)構(gòu)域1特異性結(jié)合并且不干擾激活淋巴細(xì)胞 粘附分子(ALCAM)結(jié)合CD6的抗體和其他免疫球蛋白，包括原初的和人工修飾的抗體和抗 體片段。本發(fā)明的Tlh單克隆抗體還包括含有如下重鏈和/或輕鏈的抗體，該重鏈和/或 輕鏈具有通過(guò)缺失、置換或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸源自構(gòu)成抗體的重鏈或輕鏈的氨基酸序 列的氨基酸序列?？梢酝ㄟ^(guò)部分地改變編碼氨基酸序列的核苷酸序列將上述部分氨基酸改 變(缺失、取代、插入或添加)給予本發(fā)明的抗體的氨基酸序列?？梢酝ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法使用已 知形式的定點(diǎn)突變來(lái)給予這種核苷酸序列的部分改變(Proc Natl Acad Sci U. S. A.，1984 Vol 81 5662)。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案表示了與CD6的清道夫受體富含半胱氨酸(SRCR)結(jié) 構(gòu)域I(Dl)特異性結(jié)合的單克隆抗體，其包含如下的重鏈和輕鏈可變區(qū)，該重鏈和輕鏈可 變區(qū)包含與SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 2中所示氨基酸序列至少80%同源的氨基酸序列。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案表示了與CD6的清道夫受體富含半胱氨酸(SRCR) 結(jié)構(gòu)域I(Dl)特異性結(jié)合的單克隆抗體，其包含如下的重鏈和輕鏈可變區(qū)，該重鏈和輕鏈 可變區(qū)包含SEQ ID NO 3中所示的核苷酸序列或其補(bǔ)體；和(b)包含SEQ ID NO 4中所示 核苷酸序列或其補(bǔ)體的核酸分子。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的與CD6的清道夫受體富含半胱氨酸(SRCR)結(jié)構(gòu)域 I(Dl)特異性結(jié)合的抗-⑶6抗體變體Tlh在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 1&2所示氨基酸殘基的位 置具有至少約65%氨基酸序列同一性或同源性，至少約70%氨基酸序列同一性或同源性， 至少約75%氨基酸序列同一性或同源性，至少約80%氨基酸序列同一性或同源性，至少約 80%氨基酸序列同一性或同源性，至少約85%氨基酸序列同一性或同源性，至少約90%氨 基酸序列同一性或同源性，至少約95%氨基酸序列同一性或同源性，至少約98%氨基酸序 列同一性或同源性或至少約99%氨基酸序列同一性或同源性。本發(fā)明的抗體在體外不誘導(dǎo)補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)。本發(fā)明的抗體在體外不誘導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)。本發(fā)明的抗體在體外不誘導(dǎo)凋亡。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明進(jìn)一步提供用于不同疾病(包括自體免疫失調(diào))的預(yù)防 齊U、治療劑或診斷劑，其含有本發(fā)明的主題抗體或其功能性片段作為活性成分?？贵w依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)指的是由巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、嗜中性細(xì)胞等的激活而 誘導(dǎo)的一種細(xì)胞毒性，通過(guò)抗體恒定區(qū)結(jié)合這些細(xì)胞表面上表達(dá)的Fc受體而得到識(shí)別。相 反，補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)指的是由補(bǔ)體系統(tǒng)的激活而誘導(dǎo)的一種細(xì)胞毒性，通過(guò)抗 體與抗原的結(jié)合而產(chǎn)生。已知這些活性的強(qiáng)度根據(jù)抗體亞類而不同。還已知這樣的差異 是由于抗體恒定區(qū)之間的結(jié)構(gòu)差異引起的(Charles A. Janeway等，Immunobiology，1997， Current Biology Ltd/Garland Publishing Inc.)。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，公開(kāi)了 Tlh的重鏈和輕鏈的可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列。這確定了 Tlh核苷酸和氨基酸序列如用于制造Tlh的細(xì)胞系所表達(dá)的。提供了篩選方法用于鑒定與h⑶6特異性結(jié)合的其他結(jié)合劑。這些方法需要接觸 與人⑶6SRCR結(jié)構(gòu)域1 (Dl)特異性結(jié)合并且不抑制ALCAM結(jié)合h⑶6的參照抗_h⑶6單克 隆抗體。
將不同濃度的ALCAM-Fc與固定濃度的Tlh在⑶6_Fc覆蓋的ELISA平板中一起培 養(yǎng)時(shí)，在所有ALCAM-Fc濃度下檢測(cè)到Tlh。該實(shí)驗(yàn)表明Tlh與來(lái)自ALCAM結(jié)合結(jié)構(gòu)域的不 同結(jié)構(gòu)域(D 3)結(jié)合。將MEM98(與結(jié)構(gòu)域 1 結(jié)合的抗體[Castro AA M 等，J of Immunol, 178(2007)4351-4361])與Tlh競(jìng)爭(zhēng)時(shí)，觀察到存在劑量依賴性競(jìng)爭(zhēng)，表明兩者都與相同的 結(jié)構(gòu)域，即結(jié)構(gòu)域1結(jié)合。在本發(fā)明的其他方面中，提供了用于調(diào)節(jié)炎性病癥的方法，該炎性病癥如多發(fā)性 硬化、移植排斥、移植物抗宿主疾病(GvHD)和1-型糖尿病。Tlh單克隆抗體能夠抑制原初 T細(xì)胞增殖，如在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)、PHA介導(dǎo)的PBMC增殖試驗(yàn)以及最終在栓系抗CD3抗體 和抗CD3抗體+ALCAM-Fc存在下的PBMC增殖中所觀察到的。其減少了促炎細(xì)胞因子并降 低了細(xì)胞上IL2受體(⑶25)和⑶4的表達(dá)。1型糖尿病是胰島素依賴性的并且認(rèn)為是由T細(xì)胞介導(dǎo)的自體免疫疾病。這表明 了 Tlh抗體具有通過(guò)干擾自體反應(yīng)性T細(xì)胞的增殖來(lái)防止胰島β細(xì)胞耗盡的功能。如果 這些細(xì)胞的團(tuán)塊是完整的，那么將導(dǎo)致對(duì)胰島素降低的依賴。因此，與Tlh抗體的作用特征 一致是可能的，其通過(guò)結(jié)合胰島素、谷氨酸脫羧酶(GAD)和熱休克蛋白60(HSP60)來(lái)促進(jìn)抗 炎應(yīng)答，因此在1型糖尿病中是有效的。通過(guò)延伸相同的邏輯，假定分子與胰高血糖素樣 肽-1 (GLPl)或其相關(guān)模擬物Exendin-4可以以附加乃至協(xié)同的方式來(lái)更有效地工作是合 理的。GLP-I和Exendin-4通過(guò)抑制這些細(xì)胞的凋亡和促進(jìn)這些細(xì)胞的再生增強(qiáng)了葡萄糖 介導(dǎo)的胰島素釋放、降低了胰高血糖素的水平和增加了 β細(xì)胞。Tlh結(jié)合髓磷脂堿性蛋白(MBP)或髓磷脂少突細(xì)胞糖蛋白(MOG)在多發(fā)性硬化中 是有效的。此外，Tlh結(jié)合起著抗炎和免疫抑制作用的其他小分子(如西羅莫司，他克莫司和 霉酚酸酯)在自體免疫失調(diào)、移植排斥和GvHD中可以具有特定的治療益處。這些方法包括將治療或藥物學(xué)上有效量的與人⑶6SRCR結(jié)構(gòu)域I(Dl)特異性結(jié)合 并且不抑制ALCAM結(jié)合h⑶6的抗-⑶6結(jié)合劑給藥于患者。用于這些方法中的優(yōu)選抗-⑶6 結(jié)合劑是單克隆抗體，包括人源化的和人單克隆抗體，以及修飾的免疫球蛋白，如抗體片段 和原初抗體的突變形式，這些抗體與對(duì)應(yīng)的原初抗體具有實(shí)質(zhì)性的氨基酸序列同一性，并 且基本上享有與其相同的結(jié)合特異性。在本發(fā)明的其他方面中，提供了診斷組合物和方法，用于在體外和體內(nèi)試驗(yàn)中檢 測(cè)⑶6、⑶6+細(xì)胞和/或⑶6-介導(dǎo)的活性，例如，與T細(xì)胞激活相關(guān)的⑶6活性。這些方法 同樣使用與人⑶6SRCR結(jié)構(gòu)域1 (Dl)特異性結(jié)合并且不抑制ALCAM結(jié)合h⑶6的抗-⑶6結(jié) 合劑。可以使用各種方法來(lái)篩選本發(fā)明主題抗體的各種功能性特征，這些方法包括但不 限于，用于體外試驗(yàn)、體內(nèi)和基于細(xì)胞的試驗(yàn)中的那些以及選擇技術(shù)?？梢酝瑫r(shí)或單獨(dú)篩選 多種特性。蛋白質(zhì)可以是純化或是未純化的，這取決于試驗(yàn)的需求。在一個(gè)實(shí)施方案中，篩選是針對(duì)抗-CD6抗體與已知的或被認(rèn)為結(jié)合抗-CD6抗體的蛋白質(zhì)分子的結(jié)合的定性或定量結(jié)合試驗(yàn)。這樣的試驗(yàn)通常涉及監(jiān)控細(xì)胞與抗-CD6抗體的應(yīng)答，例如，細(xì)胞存活、細(xì)胞死 亡、細(xì)胞的吞噬作用、細(xì)胞裂解、細(xì)胞形態(tài)的改變或轉(zhuǎn)錄激活，如原初基因或報(bào)告基因的細(xì) 胞表達(dá)。例如，這樣的試驗(yàn)可以測(cè)量抗-⑶6抗體引發(fā)ADCC或⑶C的能力。對(duì)于一些試驗(yàn)， 除了靶細(xì)胞以外，需要加入其他細(xì)胞或成分，例如，血清補(bǔ)體或效應(yīng)細(xì)胞，如外周血單核細(xì) 胞(PBMC)、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定最佳的劑量和劑量給藥方案，并且這將隨著特定 藥劑的藥物動(dòng)力學(xué)特征、給藥時(shí)間和方式、制劑強(qiáng)度和病癥發(fā)展情況(包括疾病癥狀的性 質(zhì)和程度)而改變。此外，與待治療的特定患者相關(guān)的因素，包括患者的性別、年齡、體重、 膳食、身體活動(dòng)和并發(fā)癥，將導(dǎo)致調(diào)節(jié)劑量和/或給藥方案的需要。藥物學(xué)上有效的劑量為 0. l-25mg/kg/周。可以在細(xì)胞、組織和整個(gè)生物體實(shí)驗(yàn)中表征本發(fā)明的抗-⑶6抗體的生物特性。如 本領(lǐng)域已知的，通常在動(dòng)物(包括但不限于小鼠、大鼠、兔子、狗、貓、豬和猴子)中測(cè)試藥 物，以測(cè)量藥物治療疾病或疾病模型的功效，或測(cè)量藥物的藥物動(dòng)力學(xué)、毒性和其他特性。本發(fā)明之前的描述說(shuō)明和描述了本發(fā)明。此外，公開(kāi)內(nèi)容顯示和描述了本發(fā)明的 代表性優(yōu)選實(shí)施方案，但如上所述，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明能夠在各種其他組合、改變和環(huán)境中使 用，并且能夠在在此所表達(dá)的本發(fā)明構(gòu)思的范圍內(nèi)進(jìn)行改變和改進(jìn)，與以上的教導(dǎo)和/或 相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識(shí)相稱。以下所述的實(shí)施方案進(jìn)一步用來(lái)解釋實(shí)施本發(fā)明的最佳已知 方式并且使得本領(lǐng)域的其他技術(shù)人員能夠以這樣的或其他實(shí)施方案利用本發(fā)明，并且根據(jù) 本發(fā)明的特定應(yīng)用或使用的需要進(jìn)行各種改變。因此，該描述不是打算用來(lái)將本發(fā)明限制 到在此所公開(kāi)的形式。此外，所附權(quán)利要求旨在解釋為包括備選的實(shí)施方案。1. Tlh的核苷酸(基因組和質(zhì)粒)和氨基酸序列使用基因組和質(zhì)粒DNA作為模板的多重PCR反應(yīng)用于測(cè)定Tlh的核苷酸序列。從 表達(dá)Tlh的NSO細(xì)胞制備基因組DNA。使用ESI-TOF和MALDI-T0F測(cè)定氨基酸序列。使用 不同酶(包括胰蛋白酶、Lys-C和Glu-C)的肽圖譜用于產(chǎn)生最終的氨基酸序列。圖1中公 開(kāi)的序列與US571220及其同族EP 0699755,US6572857及其同族EP0807125中已經(jīng)公開(kāi)的 Tlh序列略有不同。已經(jīng)確定了本專利中公開(kāi)的序列對(duì)其目標(biāo)CD6具有完全的功能活性，如 以下提及的各種實(shí)施例中所述的。2. Tlh與CD6受體的結(jié)構(gòu)域1 (Dl)結(jié)合ELISA實(shí)驗(yàn)清楚地顯示了不同濃度的ALCAM的存在沒(méi)有阻止Tlh結(jié)合⑶6_Fc。 ALCAM與Tlh之間不存在競(jìng)爭(zhēng)表明對(duì)于兩者的結(jié)合結(jié)構(gòu)域是不同的。將MEM98(與結(jié)構(gòu)域 I(Dl)結(jié)合的抗體[Castro AA M 等，J of Immunol, 178(2007)4351-4361])與Tlh競(jìng)爭(zhēng)時(shí)，觀察到存在劑量依賴性競(jìng)爭(zhēng)，表明兩者都與相同的 結(jié)構(gòu)域，即結(jié)構(gòu)域1結(jié)合。3. Tlh沒(méi)有誘導(dǎo)HUT 78細(xì)胞凋亡凋亡的特點(diǎn)之一是磷脂酰絲氨酸(PS)從質(zhì)膜內(nèi)部遷移至外部[JBiol Chem 1990. 265 =4923-4928]。通過(guò)使用用于區(qū)分凋亡和壞死細(xì)胞的膜聯(lián)蛋白-V-熒光素和碘化 丙啶(PI)來(lái)進(jìn)行凋亡細(xì)胞膜外部小葉上的磷脂酰絲氨酸的分析。膜聯(lián)蛋白V是Ca2+依賴 性磷脂結(jié)合蛋白，對(duì)磷脂酰絲氨酸具有高親和性[J Immunol Methods 1995.184:39-51]。盡管PI結(jié)合不同的壞死細(xì)胞，膜聯(lián)蛋白-V-熒光素結(jié)合凋亡的細(xì)胞。這種方法幫助區(qū)分凋 亡的和壞死的細(xì)胞群體。早期凋亡群僅是膜聯(lián)蛋白V陽(yáng)性的，而后期凋亡是膜聯(lián)蛋白V和 PI陽(yáng)性的。在該實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到Tlh在HUT78細(xì)胞中具有有限的凋亡潛能，HUT78細(xì)胞是 表達(dá)⑶6的T淋巴瘤細(xì)胞系。用Tlh處理HUT78細(xì)胞，顯示出40%的凋亡，這差不多等于膜 聯(lián)蛋白V FITC通道中的未處理對(duì)照。未處理和非特異性同種型對(duì)照，hR3(與EGFR結(jié)合的 單克隆抗體)處理的細(xì)胞各自顯示出35. 3%和36. 5%的凋亡，而陽(yáng)性對(duì)照雷帕霉素顯示出 54. 3%的凋亡。該數(shù)據(jù)表明Tlh沒(méi)有在HUT78細(xì)胞系中介導(dǎo)凋亡。4.⑶6陽(yáng)性的T和B細(xì)胞，在⑶6受體的表達(dá)中顯示出差異胸腺細(xì)胞、成熟的T細(xì)胞、 稱為B-I亞型的B細(xì)胞亞群和一些大腦細(xì)胞表達(dá)⑶6[J Exp Med 1991. 174 :949-952 ;J Immunol 1997.158:1149-1156]。該實(shí)驗(yàn)的目的是定量各 自在T和B細(xì)胞中的受體密度和⑶6表達(dá)。該實(shí)驗(yàn)表明與B細(xì)胞相比，T細(xì)胞上的⑶6受體密度高10倍。該方法沒(méi)有主張定 量絕對(duì)受體密度，因?yàn)闆](méi)有使用抗體的飽和量。然而，T和B細(xì)胞中表達(dá)模式的倍數(shù)差異是 明確可區(qū)分的。5. Tlh誘導(dǎo)溫和的ADCC (抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性)抗體結(jié)合目標(biāo)或受感染細(xì)胞時(shí)，抗體的Fc部分結(jié)合存在于細(xì)胞(特別時(shí)原初殺傷 (NK)細(xì)胞)表面上的Fc受體。然后，這引起這些細(xì)胞的激活。這些激活的細(xì)胞釋放細(xì)胞因 子和細(xì)胞毒素顆粒，并通過(guò)引發(fā)凋亡來(lái)促進(jìn)細(xì)胞死亡。將這稱為抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì) 胞毒性(ADCC)。在本發(fā)明中，用細(xì)胞追蹤染料CFSE (羧基熒光素二醋酸酯琥珀酰亞胺酯)標(biāo)記靶 細(xì)胞群體(HUT 78/Daudi)?；跓晒馑氐娜玖螩FSE具有使其特別適用于活細(xì)胞標(biāo)記的生 化特性[J Immunol Methods 2000.243:147-154]。CFSE由含有兩個(gè)醋酸酯部分的熒光素 分子和琥珀酰亞胺酯官能團(tuán)組成。以這種形式，它是膜滲透性的，并且沒(méi)有熒光。擴(kuò)散至胞 內(nèi)環(huán)境中后，內(nèi)源性酯酶除去醋酸酯基團(tuán)，產(chǎn)生高度熒光的分子，并且對(duì)細(xì)胞膜是非滲透性 的[J Immunol Methods 2000. 243 147-154]。在抗體Tlh的存在或不存在下，培養(yǎng)靶細(xì)胞， HUT78細(xì)胞。以不同比例(目標(biāo)效應(yīng)1 1、1 25、1 50,1 100)加入效應(yīng)細(xì)胞(通 過(guò)Ficoll paque方法收集的PBMC)，并在37°C下培養(yǎng)最佳的時(shí)間。使用7AAD來(lái)測(cè)量細(xì)胞 死亡。7氨基放線菌素D(7AAD)進(jìn)入死細(xì)胞中，并結(jié)合DNA。集合CFSE標(biāo)記的細(xì)胞，用來(lái)評(píng) 價(jià)靶細(xì)胞的抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。Daudi細(xì)胞用來(lái)證明該試驗(yàn)是否合格，使用公知的具有有 效ADCC活性的B細(xì)胞單克隆抗體。B細(xì)胞單克隆抗體在6小時(shí)內(nèi)顯示出超過(guò)50%的細(xì)胞 毒性。在相似的條件下，四個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)表明Tlh在HUT78細(xì)胞中誘導(dǎo)了溫和的ADCC，在效應(yīng) 細(xì)胞存在下過(guò)夜培養(yǎng)。6. Tlh沒(méi)有介導(dǎo)補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(⑶C)使用基于Alamar藍(lán)(刃青天)的試驗(yàn)來(lái)測(cè)量抗體促進(jìn)細(xì)胞殺滅的能方。通過(guò)抗 體與細(xì)胞表面抗原的結(jié)合來(lái)誘導(dǎo)這，由此固定和激活導(dǎo)致靶細(xì)胞裂解的補(bǔ)體。刃青天是氧 化還原-活性染料，其得到還原時(shí)，顏色從藍(lán)色變成粉色。最近的數(shù)據(jù)表明刃青天進(jìn)入細(xì)胞 的細(xì)胞質(zhì)中，它在其中還原成熒光素產(chǎn)品，然后再次分泌返回至培養(yǎng)基中[Eur J Biochem 2000. 267 5421-5426]。
來(lái)自這些試驗(yàn)的結(jié)果決定性地證明了抗體在表達(dá)⑶6的細(xì)胞系中(即HUT78)沒(méi) 有誘導(dǎo)CDC。7. Tlh抑制PHA介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖植物血球凝集素(PHA-M)用于刺激淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞分裂。PHA，來(lái)自紅 蕓豆(Phaseolus vulgaris)的凝集素提取物，含有有效的、細(xì)胞凝聚和促有絲分裂的活 性[Proc Natl Acad Sci USA 1982.79:1611-1615]。PHA 含有五個(gè)異凝集素家族(L4E0、 L3E1, L2E2, L1E^ L0E4)，各自通過(guò)非共價(jià)力把四聚物結(jié)合在一起。亞基是兩個(gè)不同類型的，稱 為淋巴細(xì)胞反應(yīng)性(L)和紅血球反應(yīng)性(E)。L對(duì)淋巴細(xì)胞表面受體具有高親和性，但對(duì) 紅細(xì)胞的那些親和性很低，并且負(fù)責(zé)異凝集素的促有絲分裂特性。E負(fù)責(zé)紅血球凝集特性。 PHA-P是蛋白質(zhì)形式，而PHA-M是這些異凝集素的粘蛋白形式[J Biol Chem 1977. 252 9018-9023]。 用細(xì)胞追蹤染料CFSE (羧基熒光素二醋酸酯琥珀酰亞胺酯)標(biāo)記PBMC。然后用或 不用不同濃度的抗體來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。通過(guò)植物血球凝集素(PHA)來(lái)刺激細(xì)胞，以在37°C下增 殖三天。隨著細(xì)胞增殖，CFSE相等地分布至子細(xì)胞中，每次連續(xù)傳代將具有一半的細(xì)胞熒 光強(qiáng)度[J Immunol Methods 1994. 171 :131_137]。認(rèn)為增殖抑制的百分比是抗體的作用。 通過(guò)以下公式來(lái)估算增殖抑制的% [ {PHA- (Tlh+PHA)} /PHA] * 100，其中，PHA是由PHA誘發(fā) 的增殖，Tlh+PHA是在Tlh和PHA存在下誘導(dǎo)的增殖。這些數(shù)據(jù)表明Tlh以劑量依賴性方式介導(dǎo)了 PHA刺激的淋巴細(xì)胞的增殖抑制。由 于正常個(gè)體之間的固有差異，抑制百分比在個(gè)體間可能是不同的。然而，總體而言，使用Tlh 觀察到PHA刺激的淋巴細(xì)胞的劑量依賴性抑制，但使用非特異性IgGl同種型抗體hR3未觀察到。8.即使在基于96孔平板的Alamar藍(lán)試驗(yàn)中Tlh也能抑制PHA介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增
殖將之前的實(shí)驗(yàn)改變成基于高通量平板的試驗(yàn)，其中在用或不用Tlh或非特異性 IgGl同種型抗體hR3的96孔培養(yǎng)皿中培養(yǎng)新鮮收集的PBMC。隨后，加入PHA來(lái)刺激淋巴 細(xì)胞增殖三天。通過(guò)使用Alamar藍(lán)來(lái)測(cè)量增殖。通過(guò)T檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性測(cè)試。該試驗(yàn)重申了如下事實(shí)在可溶性Tlh的存在下，PHA介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖得到了 明顯抑制，但在非特異性IgGl同種型抗體hR3存在下沒(méi)有得到抑制。這與之前的試驗(yàn)一起 表明了 Tlh在抑制原初T細(xì)胞增殖中的作用。9. Tlh降低由栓系抗⑶3、抗⑶3+Tlh和抗⑶3+ALCAM Fc誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖已知通過(guò)T細(xì)胞受體(TCR)和共刺激受體的刺激引發(fā)了 T細(xì)胞分化從靜息(靜 止)狀態(tài)轉(zhuǎn)換成激活狀態(tài)，激活狀態(tài)的特征在于快速生長(zhǎng)和增殖并且獲得效應(yīng)物功能 [Immunity 2007. 27 173-178]。人⑶6受體是在未成熟胸腺細(xì)胞、成熟T和稱為Bla亞群 的B淋巴細(xì)胞亞群、慢性B細(xì)胞淋巴細(xì)胞性白血病和大腦的各種區(qū)域上表達(dá)的105-130kDa 的1型糖蛋白[J Immunol 2006. 177 1152-1159]。CD6是基于家族特征性的三個(gè)100至 IlOaa長(zhǎng)的富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域的胞外區(qū)域的存在的蛋白質(zhì)受體的清道夫受體富含半胱氨 酸(SRCR)超家族的B組成員[J Exp Med 1991. 174 =949-952]?？色@得的證據(jù)表明CD6是 涉及淋巴細(xì)胞激活和分化過(guò)程的輔助分子[J Immunol 2006.177:1152-1159]。在胸腺細(xì) 胞和靜止的成熟T細(xì)胞上，CD6與TCR/CD3復(fù)合物[J Immunol 2004. 173 =2262-2270]和CD5(SRCR超家族的一個(gè)親密成員)[J Biol Chem 2003. 278 =8564-8571]部分相關(guān)。此外，CD6在成熟免疫突觸(IS)的中心部分累積，它在那與TCR/CD3和CD5共同定位。還已經(jīng)表明 ⑶6在早期T細(xì)胞-APC接觸中影響IS成熟，以及T細(xì)胞增殖性應(yīng)答[J Immunol 2006. 177 1152-1159, Eur J Immunol 2004.34:930-940]。非常確定的是導(dǎo)致細(xì)胞增殖的最佳T細(xì)胞激活需要至少兩個(gè)刺激信號(hào)。一個(gè)涉 及TCR-CD3復(fù)合物，其識(shí)別與抗原呈遞細(xì)胞(APC)上的I類或II類主要組織相容性復(fù)合體 (MHC)分子結(jié)合的肽片段，第二個(gè)信號(hào)不是抗原特異性的，已經(jīng)稱為共刺激或輔助信號(hào)，因 為盡管是必需的，但其沒(méi)有通過(guò)自身引起T細(xì)胞增殖[Immunology 1998.93:358-365]。已 經(jīng)鑒定了幾個(gè)潛在的共刺激信號(hào)受體及其配體，并且這些包括⑶4與II類MHC、⑶8與I類 MHC、CD2與淋巴細(xì)胞功能相關(guān)的抗原-3、CD5與CD72、CD28與B7-1/B7-2以及CD6與CD6 配體(D166或ALCAM)之間的相互作用[Immunology 1998. 93 :358_365 ；Curr OPin Immunol 1995. 7 389-395]。之前存在關(guān)于用或不用抗共刺激分子抗體的栓系抗CD3抗體導(dǎo)致淋巴細(xì)胞增殖 作用的文獻(xiàn)。在CD3刺激時(shí)，單獨(dú)或通過(guò)與CD2或CD4的共同交聯(lián)，CD6在兩個(gè)最C-端的 酪氨酸殘基(Y629和Y662)上暫時(shí)變成磷酸化的[J Exp Med 1993. 177 =219-223] 0因此， 已經(jīng)表明CD6-介導(dǎo)的對(duì)T細(xì)胞增殖的作用涉及酪氨酸激酶活性，這依賴于PKC激活[Cell Immunol 1995. 166 :44_52]。盡管CD6的信號(hào)途徑與CD28 (另一種共刺激分子)的相比沒(méi) 有得到很好的表征，但這兩種細(xì)胞表面抗原的作用之間存在一些相似性。例如，通過(guò)TCR 復(fù)合體與信號(hào)協(xié)同作用的兩個(gè)受體任一的連接促進(jìn)T-細(xì)胞增殖[J Immunol 1989. 143 2439-2447]。它們還能夠在組織血纖維蛋白溶酶原激活子(TPA)的存在下引發(fā)T-細(xì)胞增 殖，導(dǎo)致 IL-2受體(IL-2R)和 IL-2mRNA 的上調(diào)[Cell Immunol 1995. 166 :44_52，Proc Natl Acad Sci USA 1989.86:1333-1337]。還顯示了栓系抗CD6和抗CD28抗體引起了與抗CD3 抗體刺激無(wú)關(guān)的靜止淋巴細(xì)胞的增殖[Immunology 1998.93 =358-365] 在本發(fā)明中，我們顯示了 Tlh抗體抑制由栓系抗⑶3、抗⑶3+Tlh和抗⑶3+ALCAM Fc介導(dǎo)的T細(xì)胞增殖。事實(shí)上，我們觀察到抗⑶3+Tlh和抗⑶3+ALCAM的結(jié)合實(shí)際上是超 過(guò)單獨(dú)的CD3的協(xié)同作用，如在數(shù)據(jù)的Bliss分析中所觀察到的。我們進(jìn)一步顯示了外源 IL2(1.25ng/ml)的加入導(dǎo)致可溶性Tlh介導(dǎo)的T細(xì)胞增殖抑制部分恢復(fù)。通過(guò)細(xì)胞因子 分析，我們顯示了 Tlh主要抑制IFNy、ILlO和TNF，并且IL2的外源添加誘導(dǎo)了這些促炎 細(xì)胞因子的部分恢復(fù)。增殖淋巴細(xì)胞中CD25和CD4的受體密度的估算表明可溶性Tlh導(dǎo) 致新兩種標(biāo)記的下調(diào)，而外源IL2部分地恢復(fù)了這些標(biāo)記表達(dá)。將該數(shù)據(jù)聯(lián)系在一起，表明 了 Tlh通過(guò)抑制促炎細(xì)胞因子(如IFNy)和IL2受體表達(dá)的降低來(lái)抑制T細(xì)胞增殖。因 為外源IL2的加入顯示了部分“功能獲得”，我們的結(jié)果看來(lái)表明了 Tlh可以抑制由栓系抗 ⑶3、抗⑶3+栓系Tlh和抗⑶3+栓系A(chǔ)LCAM Fc介導(dǎo)的IL2合成。9a.原初PBMC (外周血單核細(xì)胞)中IL2的滴定IL2是T細(xì)胞激活必需和充分的細(xì)胞因子。它通過(guò)上調(diào)的IL2受體發(fā)出信號(hào)。它 在T細(xì)胞發(fā)育、T細(xì)胞免疫記憶和T調(diào)控細(xì)胞的發(fā)育中具有關(guān)鍵作用[J Immunol 1995. 155 1151-1164]。從該實(shí)驗(yàn)看，在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中使用了 1. 25ng/ml的IL2最佳濃度。9b. Tlh導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子、⑶4和⑶25受體表達(dá)的降低，而不誘導(dǎo)凋亡，但在外源 IL2的存在下部分地除去了這種抑制
流式細(xì)胞術(shù)是可以基于大小和顏色可以區(qū)分不同顆粒的分析工具。BDtmCBA使用 一系列具有離散熒光強(qiáng)度的顆粒來(lái)同時(shí)檢測(cè)多種可溶性分析物。將BDAtmCBA結(jié)合流式細(xì)胞 術(shù)來(lái)形成強(qiáng)有力的復(fù)合試驗(yàn)。使用BDA CBA人Thl/Th2細(xì)胞因子II來(lái)定量測(cè)量單個(gè)樣品 中的白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素_4、白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-10、TNF和干擾素γ水平 [J Immunol Methods 2001.254:109-118]。用IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF和IFN-γ蛋白特異性的捕獲抗體覆蓋具有不同熒 光強(qiáng)度的六個(gè)珠粒制劑。將六個(gè)珠粒制劑混合在一起，形成BD CBA，將其分解在DAKO Cyan ADP條帶流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器的FL3通道中。將細(xì)胞因子捕獲珠粒與PE-綴合的檢測(cè)抗體混合 在一起，然后用重組標(biāo)準(zhǔn)品或測(cè)試樣品培養(yǎng)，以形成夾層復(fù)合物。使用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器獲得 樣品數(shù)據(jù)后，以圖表形式產(chǎn)生樣品結(jié)果。從這些試驗(yàn)可以清楚 Tlh導(dǎo)致原初T細(xì)胞增殖的抑制，并且通過(guò)促炎細(xì)胞因子的 實(shí)質(zhì)性降低以及CD25和CD4數(shù)量的減少介導(dǎo)了這。外源IL2的添加能夠恢復(fù)抑制以及提高 促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，并且還提高了⑶4和⑶25的絕對(duì)受體數(shù)量。這些結(jié)果表明了由Tlh 引起的T細(xì)胞增殖抑制是通過(guò)抑制IL2和引起“功能獲得”的外源IL2的添加介導(dǎo)的。我 們還觀察到通過(guò)誘導(dǎo)凋亡沒(méi)有介導(dǎo)T細(xì)胞增殖的降低。10. Tlh沒(méi)有抑制記憶T細(xì)胞增殖識(shí)別抗原呈遞細(xì)胞上的外源抗原后，T細(xì)胞增殖并且引起免疫應(yīng)答。這些T細(xì)胞 中的一些轉(zhuǎn)化成記憶T細(xì)胞，其在系統(tǒng)中循環(huán)，并且用相同的抗原再次激發(fā)時(shí)，這些細(xì)胞增 殖并引起免疫應(yīng)答。大部分人對(duì)破傷風(fēng)類毒素進(jìn)行了免疫，并且用相同的抗原激發(fā)來(lái)自這 些人的T細(xì)胞時(shí)，群體中的記憶T細(xì)胞增殖。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明破傷風(fēng)類毒素以劑量依賴性 的方式刺激了 τ細(xì)胞的增殖，但是STlh沒(méi)有顯示出這些細(xì)胞增殖的任何抑制。這強(qiáng)烈地表 明了 Tlh沒(méi)有抑制記憶T細(xì)胞增殖。這對(duì)于Tlh療法是有利的，因?yàn)檠h(huán)記憶T細(xì)胞增殖 沒(méi)有受到影響，并且進(jìn)行Tlh療法的患者不會(huì)變得易受感染。11. Tlh在PBMC和Raji細(xì)胞介導(dǎo)的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中抑制T細(xì)胞增殖將來(lái)自遺傳上全異個(gè)體的淋巴樣細(xì)胞的混合物在體外培養(yǎng)時(shí)，它們經(jīng)歷了特 征性的應(yīng)答，將其稱為混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR) [Proc Natl Acad Sci USA 1973. 70 2707-2710]。通過(guò)早期增殖階段接著效應(yīng)淋巴細(xì)胞的出現(xiàn)來(lái)代表這種反應(yīng)，效應(yīng)淋巴細(xì)胞 對(duì)帶有用于刺激最初反應(yīng)的抗原的靶細(xì)胞呈現(xiàn)出特異性細(xì)胞毒性。同種異體T淋巴細(xì)胞的兩個(gè)群在MLR中都增殖，除非通過(guò)用絲裂霉素C或致死的 X-照射使得一個(gè)群成為無(wú)反應(yīng)的。在稱為單向MLR的后一種系統(tǒng)中，無(wú)反應(yīng)的群提供了刺 激細(xì)胞，該刺激細(xì)胞表達(dá)刺激細(xì)胞的同種異體抗原。在單向MLR受體中，Th細(xì)胞識(shí)別刺激 細(xì)胞上的同種異體II類MHC分子，并應(yīng)答這些差異而增殖。從含有抗CD4加補(bǔ)體的應(yīng)答群 種除去⑶4+TH細(xì)胞消除了 MLR，并且阻止了 CTL的產(chǎn)生。輔助細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞)也已經(jīng) 顯示出對(duì)MLR是重要的?，F(xiàn)在認(rèn)識(shí)到巨噬細(xì)胞的作用是激活I(lǐng)I類-MHC限制的Th細(xì)胞，在 MLR中測(cè)量了其的增殖。在本發(fā)明中，使用用絲裂霉素處理過(guò)的Raji細(xì)胞來(lái)進(jìn)行單向MLR，因此它們是抗 原呈遞細(xì)胞，同時(shí)在PBMC上測(cè)量增殖。之前的文獻(xiàn)表明Raji細(xì)胞表達(dá)ALCAM[J Immunol 2004. 173 2262-2270]。從該實(shí)驗(yàn)可以推斷出Tlh特異性地抑制單向MLR，其中Raji細(xì)胞是抗原呈遞細(xì)胞，而PBMC增殖。12. Tlh在由PBMC和成熟樹(shù)突細(xì)胞介導(dǎo)的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中抑制T細(xì)胞增殖 在同種異體(抗原呈遞細(xì)胞取自一個(gè)個(gè)體，PBMC取自另一個(gè)個(gè)體)混合淋巴細(xì)胞 反應(yīng)中，其中成熟樹(shù)突細(xì)胞(抗原呈遞細(xì)胞)引起原初PBMC的增殖，Tlh以劑量依賴性的方 式抑制這種增殖。數(shù)據(jù)表明作用方式涉及至少兩種主要的促炎細(xì)胞因子(即，IL6和IFN γ ) 的下調(diào)。材料和方法細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)物將HUT 78(來(lái)自ATCC的T細(xì)胞淋巴瘤人細(xì)胞系)用作靶細(xì)胞。在補(bǔ)充的Iscove's DMEM中培養(yǎng)細(xì)胞，該培養(yǎng)基含有2mg/ml NaHCO3>20mM H印es、2mM L-谷氨酰胺和20% FBS (Invitrogen)。Daudi細(xì)胞(B細(xì)胞淋巴瘤，ATCC)，將細(xì)胞在RPMI 1640中培養(yǎng)；該培養(yǎng)基含有 2mg/ml NaHCO3>20mM H印es、2mM L-谷氨酰胺和 10% FBS (Invitrogen)。WIL2S細(xì)胞(B細(xì)胞淋巴瘤)將細(xì)胞在DMEM中培養(yǎng)；該培養(yǎng)基含有2mg/ml NaHCO3>20mM H印es、2mM L-谷氨酰胺和 10% FBS (Invitrogen)。將PBMC(外周血單核細(xì)胞)用作效應(yīng)細(xì)胞通過(guò)Ficoll-Paque(Amersham目錄 號(hào)17-14403-03)介導(dǎo)的密度離心來(lái)分離PBMC。白細(xì)胞層獲自健康捐獻(xiàn)者，并且通常是新 鮮收集的。將細(xì)胞在RPMI 1640 (Invitrogen)中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基含有2mg/ml NaHC03、20mM H印es、2mM L-谷氨酰胺和 5% FBS(Invitrogen)。抗體在體外使用以下的抗_CD6MAb =B細(xì)胞單克隆抗體(Genentech)、hR3抗體(CIM， Havana,古巴)。IXPBS (Invitrogen 目錄號(hào)10010)。覆蓋緩沖液(NaHC03_8. 4g、Na2C03_3. 56g，在 1000ml 水中，pH9. 5)。PBS/ 吐溫(1000ml PBS 中 0. 5ml 吐溫-20, SIGMA)阻斷溶液(PBS中 BSA)RPMI 1640 (目錄號(hào)11875Invitrogen)Iscove' s DMEM(Invitrogen 目錄號(hào)12200_036)Alamar 藍(lán)(Invitrogen DAL-1100)Biotek 平板閱讀器(Synergy HT)集合的人血清在 EDTA vacutainers (BD vacutainers 目錄號(hào)368457)中收集的來(lái)自健康個(gè)體 的外周血補(bǔ)充1% FBS (胎牛血清)的 Iscove，s DMEM 培養(yǎng)基(Invitrogen)凋亡試劑盒-目錄號(hào)1988549 (Roche)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器Dako Cyan ADPFicoll-Paque (Amersham 目錄號(hào)17-14403-03)，RPMI 1640 目錄號(hào) 11875 (Invitrogen)FBS.(胎牛血清)Gibco 目錄號(hào)10082-147
抗CD6-PE、抗CD6-FITC、抗D19-PECy5、抗CD3-FITC和抗CD4-AlexaAbD Serotec, UKSPHERO Rainbow 校準(zhǔn)顆粒(目錄號(hào)RCP-30_5A)CFSE (Sigma 目錄號(hào)21888), 7AAD (Invitrogen 目錄號(hào):V 35124)RPMI 1640 (Invitrogen)，其含有 2mg/ml NaHCO3>20mM H印es、2mM L-谷氨酰胺和5% FBS(Invitrogen)。96 孔 Fluotrac 600 平板-目錄號(hào) 655O77 (Greiner Bio)作為說(shuō)明而非限制，提供了以下實(shí)施例。實(shí)施例Ia通過(guò)ELISA，Tlh和ALCAM不與相同的結(jié)構(gòu)域結(jié)合在覆蓋緩沖液中稀釋rhCD6FC/嵌合體(R&D systems) (100 μ g/ml)，并將100 μ 1 加入到96孔Nunc-Maxisorp平板的每個(gè)孔中。然后將平板在4°C下培養(yǎng)過(guò)夜。用PBS吐 溫20將平板洗滌三次。隨后，加200 μ 1阻斷溶液(1XPBS中2 % BSA+0. 1 %吐溫20)并 在37°C下培養(yǎng)1小時(shí)。培養(yǎng)后，再次用PBS吐溫將平板洗滌三次，接著加入不同濃度的 Tlh單克隆抗體(0. 2mg/ml)和rhALCAMFc(R&D systems)。然后將這在37°C下培養(yǎng)一小 時(shí)。隨后用PBS吐溫將平板洗滌3次。向孔中，加入200μ1稀釋于阻斷緩沖液中的抗人 IgG(Fab)2ALPd 20000)，并在37°C下培養(yǎng)一小時(shí)。用PBS吐溫將平板洗滌三次，將200 μ 1 對(duì)硝基苯基磷酸鹽(PNPP)底物加入到每個(gè)孔中，并在37°C下培養(yǎng)，直至顏色產(chǎn)生約15分 鐘。使用BIOTEK Micro平板讀數(shù)器在405nm下進(jìn)行閱讀。實(shí)驗(yàn)表明不同濃度的ALCAM的 存在沒(méi)有阻止Tlh與⑶6受體結(jié)合。ALCAM與Tlh之間的競(jìng)爭(zhēng)的不存在表明對(duì)于兩者的結(jié) 合結(jié)構(gòu)域是不同的(圖2)。實(shí)施例IbTlh與CD6的結(jié)構(gòu)域1 (Dl)結(jié)合當(dāng) MEM98(與結(jié)構(gòu)域 1 結(jié)合的抗體)(Castro AA M 等，J of Immunol, 178(2007)4351-4361)與Tlh競(jìng)爭(zhēng)時(shí)，觀察到劑量依賴性競(jìng)爭(zhēng)，表明兩者都與相同的結(jié)構(gòu) 域，即結(jié)構(gòu)域1結(jié)合(圖3)。實(shí)施例2Tlh在HUT78細(xì)胞中不誘導(dǎo)凋亡收集細(xì)胞，并將1.5ml的3. 3X IO5細(xì)胞/ml (終細(xì)胞5X IO5細(xì)胞)接種于每個(gè) 35mm培養(yǎng)皿中。將所需含量的抗體加入各個(gè)培養(yǎng)皿中，以制得(5 μ g/ml)的終濃度。在對(duì) 照培養(yǎng)皿中，沒(méi)有加入抗體。作為陽(yáng)性對(duì)照，用1.2μ g/ml濃度的雷帕霉素培養(yǎng)細(xì)胞。將 細(xì)胞在5% CO2培養(yǎng)箱中在37°C下培養(yǎng)過(guò)夜。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至FACS試管BD Falcon目 錄號(hào)352054，并且在室溫下(RT)在1200RPM下離心5分鐘。丟棄上清液，并重懸浮于2ml 的PBS中，在RT下在1200RPM下離心5分鐘。丟棄上清液，加入100 μ 1膜聯(lián)蛋白-V-熒光 素標(biāo)記溶液，并在RT下培養(yǎng)10-15分鐘。用2ml PBS將細(xì)胞洗滌并在1200RPM下離心5分 鐘。然后丟棄上清液。將細(xì)胞重懸浮于0.5ml PBS中，并通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器獲取(集合 了 3000個(gè)細(xì)胞)，使用488nm激發(fā)。對(duì)于膜聯(lián)蛋白V，在FITC通道中閱讀樣品，對(duì)于PI，在 PE Texas紅通道中閱讀。運(yùn)行雷帕霉素處理臂中的膜聯(lián)蛋白V單獨(dú)和PI單獨(dú)的樣品，使得 能夠補(bǔ)償。
用Tlh處理的HUT 78細(xì)胞顯示出40%的凋亡，其幾乎等于膜聯(lián)蛋白V FITC通道 中未處理的對(duì)照。未處理的和非特異性抗體(hR3抗體)處理的細(xì)胞各自顯示出35. 3%和 36. 5%的凋亡，而陽(yáng)性細(xì)胞雷帕霉素顯示出54. 3%的凋亡。該數(shù)據(jù)表明Tlh在HUT 78細(xì)胞 中沒(méi)有介導(dǎo)凋亡(圖4)。實(shí)施例3來(lái)自正常個(gè)體的T和B淋 巴細(xì)胞上的⑶6受體的表達(dá)差異通過(guò)Ficol I-Paque (Amersham目錄號(hào)17_14403_03)介導(dǎo)的密度離心來(lái)分離 PBMC。白細(xì)胞層獲自健康捐獻(xiàn)者并且通常是新鮮收集的。然后將PBMC在PBS中洗滌。然 后將PBMC以1. 5xl06細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度重懸浮于5ml的IXPBS中，并將IOOul加入到每 個(gè)falcon試管中。將10 μ L綴合抗體(1 10稀釋度)加入到各自的試管中并渦旋，然后 在4°C下培養(yǎng)30分鐘。培養(yǎng)后，將2ml的IXPBS加入到每個(gè)試管中，然后在RT下在1200RPM 下離心5分鐘。丟棄上清液，將細(xì)胞重懸浮于0.5mL IXPBS中，以在流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器中獲取 細(xì)胞。為了 FSC和SSC中所需的群(3000個(gè)細(xì)胞)，將細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)集合。和以上的試 管一起，在相同的電壓設(shè)定下，還獲取了 SPHER0 (目錄號(hào)RCP-30-5A) Rainbow校準(zhǔn)顆粒。 記錄了每個(gè)峰的熒光平均通道數(shù)(即，相對(duì)亮度)。使用以下公式將平均通道數(shù)轉(zhuǎn)化成相對(duì) 通道數(shù)i.相對(duì)通道# = (R/4) log (平均通道#χ10)ii.其中R =分辨率(即，256)在Excel表上使用對(duì)每個(gè)峰指定的MEF值與相對(duì)通道數(shù)進(jìn)行作圖，以獲得如圖5 中所示的校準(zhǔn)圖。獲得T和B細(xì)胞上的CD6抗體的RCN，將其在Sphero校準(zhǔn)圖上作圖，以定 量各種淋巴細(xì)胞亞群的單個(gè)細(xì)胞上的CD6受體密度。源自該圖的用于計(jì)算淋巴細(xì)胞上的受體數(shù)目的公式為a. FITC 通道:y = 134. 95e 0.0366χb. PE 通道:y = 23. 6e 03736x與B細(xì)胞相比，T細(xì)胞上的⑶6受體密度高10倍。發(fā)現(xiàn)T和B細(xì)胞表達(dá)模式的差 異是可區(qū)分的(圖6)。實(shí)施例4Tlh導(dǎo)致溫和的ADCC (抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性)收集靶細(xì)胞系(HUT 78/Daudi)，并在PBS中洗滌兩次。將細(xì)胞(2xl05)重懸浮于 Iml 0.25 μ M濃度的CFSE中(每種細(xì)胞類型需要CFSE的滴定，以挑選不會(huì)泄漏至PE Cy5通 道中的CFSE濃度)。將細(xì)胞在37°C下精確地培養(yǎng)10分鐘。加入2ml RPMI,5% FBS,以停止 反應(yīng)。用2ml RPMI 5% FBS將細(xì)胞洗滌兩次，以除去CFSE。然后將靶細(xì)胞群體以IxlO5細(xì) 胞/ml的細(xì)胞密度重懸浮于RPMI培養(yǎng)基中，然后將IOOul (IO4個(gè)細(xì)胞)加入到每個(gè)falcon 試管中。將50ul抗體(5Ug/ml，10Ug/ml)加入各自的試管中，并在RT下培養(yǎng)30分鐘。然 后以1 1、1 25、1 50和1 100的T/E比例將PBMC(效應(yīng)細(xì)胞)加入到各自的試管 中。用培養(yǎng)基使每個(gè)試管中的最終體積為250ul。將每個(gè)試管在1200rpm下離心2分鐘， 以促進(jìn)細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用，并在37°C下培養(yǎng)，使得產(chǎn)生ADCC。用B細(xì)胞單克隆抗體 將Daudi細(xì)胞培養(yǎng)6小時(shí)，作為陽(yáng)性對(duì)照與樣品一起運(yùn)行。然后用IXPBS洗滌細(xì)胞。加入 100ul7AAD (6. 25ug/ml)，并在4°C下培養(yǎng)15分鐘。用IXPBS洗滌細(xì)胞，在4°C下在1200RPM下離心5分鐘。丟棄上清液，并將細(xì)胞懸浮于500ul的IXPBS中。在約200事件/秒下獲 取細(xì)胞，并在流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器的FITC和PE Cy5通道中觀察。CFSE陽(yáng)性細(xì)胞在對(duì)數(shù)級(jí)別的 第二和第三十進(jìn)位之間發(fā)出熒光，沒(méi)有濺入PE Cy5通道中。在該群體中總共集合了 3000 個(gè)FITC陽(yáng)性細(xì)胞，評(píng)價(jià)了顯示出7AAD細(xì)胞(PE Cy5陽(yáng)性)的百分比(圖7和圖8)。除了 非特異性抗體對(duì)照外，該試驗(yàn)中還包括單獨(dú)的效應(yīng)/靶細(xì)胞，比例為1 1、1 25、1 50 和1 100。凋亡的％采用FITC/PEcy5點(diǎn)圖分散中右上象限的細(xì)胞％ (圖9)。實(shí)施例5Tlh 對(duì) HUT78 產(chǎn)生的 ADCC 基于實(shí)施例4，以相同的試驗(yàn)程序進(jìn)行ADCC試驗(yàn)，以檢測(cè)Tlh對(duì)HUT 78的作用。 將細(xì)胞培養(yǎng)4小時(shí)至過(guò)夜。使用過(guò)夜培養(yǎng)獲得最佳的和一致的結(jié)果。來(lái)自四個(gè)不同的單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的體外結(jié)果表明在效應(yīng)細(xì)胞存在下過(guò)夜培養(yǎng)，Tlh在 HUT78細(xì)胞中誘導(dǎo)了溫和的ADCC (圖10、11和12)。實(shí)施例6Tlh不介導(dǎo)補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(⑶C)將來(lái)自全血的集合人血清(最小三)收集于無(wú)菌試管中，并使血液在室溫下凝固 至少4小時(shí)，在900g下離心20分鐘。收集血清，等分并儲(chǔ)存在_80°C下。將靶細(xì)胞(Wil-2S/ HUT-78)在稀釋緩沖液中洗滌，并重懸浮至2xl05細(xì)胞/mL。將抗體以4x最終所需的濃度稀 釋于稀釋緩沖液中。以4x所需的終濃度來(lái)稀釋補(bǔ)體(即，對(duì)于1 10的終濃度，1 2.5 稀釋)。將50 μ L稀釋的抗體、稀釋的補(bǔ)體和50 μ L細(xì)胞懸浮液(10，000細(xì)胞/孔)加入到 96-孔平底平板的每個(gè)孔中。包括以下的對(duì)照孔靶細(xì)胞+Ab單獨(dú)(自發(fā)的細(xì)胞死亡)、靶 細(xì)胞+血清單獨(dú)(背景裂解)和靶細(xì)胞+10% SDS(用于最大細(xì)胞死亡)。陽(yáng)性對(duì)照是用不 同濃度的B細(xì)胞單克隆抗體處理的Wil-2S細(xì)胞。將96-孔平板在37°C下培養(yǎng)2小時(shí)。將 50uL/孔的Alamar藍(lán)加入到每個(gè)孔中，并將平板在37°C下培養(yǎng)過(guò)夜。在分光光度計(jì)Biotek Synergy HT上測(cè)量熒光，使用530nm激發(fā)，590nm發(fā)射和靈敏度=35。結(jié)果表明與Rituxan 相比，Tlh沒(méi)有誘導(dǎo)CDC(圖13)。實(shí)施例7Tlh抑制PHA介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)物在同意后，按照標(biāo)準(zhǔn)放血程序從正常個(gè)體采取全血。通過(guò)FicolI-Paque (Amersham 目錄號(hào)17-14403-03)介導(dǎo)的密度離心來(lái)分離PBMC。白細(xì)胞層獲自健康捐獻(xiàn)者，并且通常 是新鮮收集的。將細(xì)胞在RPMI 1640 (Invitrogen)中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基含有2mg/ml NaHCO3, 20mM Hepes,2mM L-谷氨酰胺和 10% FBS (Invitrogen)。通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器使用CFSE的淋巴細(xì)胞增殖抑制收集PBMC并在PBS中洗滌。將細(xì)胞(7. 5xl06)重懸浮于Iml 2 μ M CFSE濃度的 PBS中。將細(xì)胞在37°C下精確培養(yǎng)10分鐘。加入IOml的RPMI，10% FBS來(lái)停止反應(yīng)。用 IOml PBS將細(xì)胞洗滌兩次。然后將細(xì)胞制劑以1. 5xl06細(xì)胞/ml的密度重懸浮于5ml的 PBS中，并將200ul加入到每個(gè)BD FACS試管中。加入200ul所需的并且是不同濃度的(各 自為50ug/ml、25ug/ml、12. 5ug/ml和6. 25ug/ml)非特異性抗體并在37°C下培養(yǎng)30分鐘。 將2ml PBS加入到每個(gè)試管中，在RT下在1200RPM下離心5分鐘，以洗掉未結(jié)合的抗體。將Iml RPMI, 10% FBS加入到每個(gè)試管的沉淀中。將Iml RPMI 10% FBS中的20 μ g/ml FHA 加入到各自的試管中，以刺激增殖。試管中的總體積是2ml，并且PHA的終濃度為IOyg/ ml。將試管渦旋，并在CO2培養(yǎng)箱中，在37°C下培養(yǎng)3天。用PBS洗滌細(xì)胞，并在4°C下，在 1200RPM下離心5分鐘。丟棄上清液，并重懸浮于500 μ 1 IXPBS中。在約200事件/秒下 總共獲得20000事件，并在FITC通道中觀察。% 抑制={[ΡΗΑ- (Tlh+PHA) ] /PHA} *100(其中 PHA = PHA-細(xì)胞單獨(dú)，PHA+Tlh = (PHA+Tlh)-細(xì)胞單獨(dú)，PHA+hR3 = (PHA+hR3)_細(xì)胞單獨(dú))細(xì)胞單獨(dú)是CFSE+ 細(xì)胞。這些數(shù)據(jù)表明Tlh抗體以劑量依賴性方式介導(dǎo)淋巴細(xì)胞刺激的PHA增殖的抑制。 由于正常個(gè)體間內(nèi)在的差異，個(gè)體間的抑制百分比可能是不同的。然而，總體而言，使用Tlh 觀察到PHA刺激的淋巴細(xì)胞的劑量依賴性抑制，但使用非特異性抗體hR3沒(méi)有(圖14、圖 15和圖16)。實(shí)施例8即使在基于96孔平板的Alamar藍(lán)試驗(yàn)中Tlh也能抑制PHA介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖PBMC是新鮮收集的，并且以4xl05細(xì)胞/ml的濃度重懸浮于RPMI5% FBS中。將 50 μ 1細(xì)胞加入到每個(gè)孔中。將100 μ 1 2Χ濃度(20 μ g/ml)的抗體(Tlh或hR3)加入到 各自的孔中。將100 μ 1單獨(dú)的培養(yǎng)基加入到非抗體孔中。然后將平板在37°C下培養(yǎng)半小 時(shí)。將50 μ 1 4Χ濃度(20 μ g/ml)的PHA加入到各自的孔中，以刺激淋巴細(xì)胞的增殖。在 剩余的孔中，加入50 μ 1培養(yǎng)基，使得所有孔中的終體積為200 μ 1/孔。將平板在CO2培養(yǎng) 箱中，在37°C下培養(yǎng)三天。將65μ1 Alamar藍(lán)加入每個(gè)孔中，并在CO2培養(yǎng)箱中，在37°C 下培養(yǎng)過(guò)夜。在分光光度計(jì)Biotek Synergy HT上測(cè)量熒光，使用530nm激發(fā)，590nm發(fā)射 和靈敏度=35。該試驗(yàn)重申了以下的事實(shí)在可溶性Tlh的存在下，PHA介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖得到 明顯的抑制，但在非特異性抗體hR 3的存在下，沒(méi)有得到明顯抑制。這與之前的實(shí)驗(yàn)一起 表明了 Tlh在抑制原初T細(xì)胞增殖中的作用。該實(shí)驗(yàn)還顯示了與之前基于流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器 的實(shí)驗(yàn)相比(圖17)，PHA介導(dǎo)的T細(xì)胞增殖的抑制可以轉(zhuǎn)化成方便的基于平板的試驗(yàn)形式。實(shí)施例9Tlh降低了由栓系抗⑶3、抗⑶3+栓系Tlh和抗⑶3+栓系A(chǔ)LCAM Fc誘導(dǎo)的淋巴 細(xì)胞增殖將50 μ 1覆蓋緩沖液加入到96孔平板中，將50ul 2x濃度(lug/ml)的抗CD3抗 體加入到A行中，如圖18中所示。從第一個(gè)A行中取出50 μ 1抗體稀釋液，使用12個(gè)通道 電子移液管從平板往下連續(xù)稀釋直至E行。將50 μ 1覆蓋緩沖液加入A-E行的1-4列，將 50 μ 1 2Χ (2 μ g/ml)濃度的抗體(Tlh (5-8)或ALCAM Fc (9-12))加入到各自的孔中，使得 孔的終濃度具有恒定的1 μ g/ml抗體和不同濃度的抗⑶3抗體(A-E行具有1、0. 5,0. 25、 0. 625 μ g/ml)(圖18)。將100 μ 1 1 μ g/ml的Tlh或hR3或ALCAM作為對(duì)照加入到各自的 孔中(如模板中所示的)。對(duì)于培養(yǎng)基對(duì)照、sTlh和shR3，在三個(gè)平板中進(jìn)行以上的設(shè)定。 為了抗體結(jié)合平板，將平板在4 °C下培養(yǎng)過(guò)夜。
阻斷平板使平板達(dá)到室溫，并使用vaccusafe(IBS Integra BioScience)吸出覆蓋緩沖液，通過(guò)將200 μ 1的阻斷溶液加入每個(gè)孔中來(lái)阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)。將平板在37°C下培養(yǎng) 1小時(shí)，并用PBS/吐溫洗滌兩次。用RPMI培養(yǎng)基進(jìn)行第三次洗滌。小心地除去剩余體積的
培養(yǎng)基。添加細(xì)胞懸浮液將100 μ 1 PBMC (30, 000個(gè)細(xì)胞)加入每個(gè)孔中。將100 μ 1 2Χ濃度的所需抗體 (Tlh或hR3)加入到各自的平板中。將100 μ 1培養(yǎng)基加入到培養(yǎng)基平板中。將96孔平板 在5% CO2培養(yǎng)箱中，在37°C下培養(yǎng)72小時(shí)。將65μ1 Alamar藍(lán)溶液加入到每個(gè)孔中，并 在5% CO2培養(yǎng)箱中，在37°C下培養(yǎng)過(guò)夜。使用96孔熒光計(jì)(Synergy HT，使用Gen 5軟 件)閱讀熒光，使用530nm激發(fā)和590nm發(fā)射(靈敏度=35)(圖19)。對(duì)于Bliss分析，栓系抗-⑶3+Tlh和抗⑶3+ALCAM的組合是超過(guò)單獨(dú)的栓系 抗-CD3協(xié)同作用的(圖20)。實(shí)施例9a原初PBMC中IL2的滴定將100 μ 1培養(yǎng)基加入到所有孔中。將100 μ 1 2χ濃度的IL2 (20ng/ml)加入到第 一行A2至AlO。從第一行取100 μ 1向下進(jìn)行連續(xù)稀釋，直至H行。將50 μ 1 PBMC懸浮液 (6χ105細(xì)胞/ml)加入到所有孔中。在各自孔中加入50ul培養(yǎng)基或抗體(Tlh或hR3 10 μ g/ ml)或PHA 10μ g/ml，使得終體積為200μ 1。將平板在5% CO2培養(yǎng)箱中，在37°C下培養(yǎng)5 天。將65μ1 Alamar藍(lán)溶液加入到每個(gè)孔中，并在5% CO2培養(yǎng)箱中，在37°C下培養(yǎng)過(guò)夜。 使用96孔熒光計(jì)(Synergy HT,使用Gen 5軟件)閱讀熒光，使用530nm激發(fā)和590nm發(fā)射 (靈敏度=35)?；谠搶?shí)驗(yàn)，確定選擇1.25ng/ml的IL2用于隨后的實(shí)驗(yàn)中(圖21)。實(shí)施例9bTlh導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的減少，并且在外源IL2的存在下部分地除去了這種抑制細(xì)胞因子分析人Thl/Th2細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品的制備用0. 2ml試驗(yàn)稀釋液重建1小瓶冷凍干燥的人Thl/Th2細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品，以制備 IOx大量標(biāo)準(zhǔn)品，并在進(jìn)行稀釋之前使其平衡至少15分鐘。將12X75mm試管(BD Falcon 目錄號(hào)352008)做上標(biāo)記，并以以下次序排列1 2、1 4、1 8、1 16、1 32、1 64、 1 128 和 1 256。將900 μ 1試驗(yàn)稀釋液吸移至頂部的標(biāo)準(zhǔn)試管中。將300 μ 1試驗(yàn)稀釋液吸移至剩 余的每個(gè)試管中。通過(guò)從頂部標(biāo)準(zhǔn)品中轉(zhuǎn)移300μ1至1 2稀釋試管中并徹底混合來(lái)進(jìn) 行連續(xù)稀釋。通過(guò)從1 2試管中轉(zhuǎn)移300μ1至1 4試管中進(jìn)行進(jìn)一步的連續(xù)稀釋，以 此類推至1 256試管，并徹底混合。制備一個(gè)含有試驗(yàn)稀釋液的試管，用作Opg/ml負(fù)對(duì) 照?；旌系娜薚hl/Th2細(xì)胞因子珠粒的制備將捕獲珠粒單獨(dú)裝瓶，就在將其與PE檢測(cè)試劑、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品混合之前，需要合 并珠粒試劑(A1-A6)。確定實(shí)驗(yàn)需要的試管的數(shù)量(包括標(biāo)準(zhǔn)品和對(duì)照)。在混合前將每 個(gè)捕獲珠粒懸浮液渦旋幾秒鐘。對(duì)于每個(gè)待分子的試管，將每個(gè)捕獲珠粒的10 μ 1等份加入到標(biāo)記為“混合捕獲珠?！钡膯蝹€(gè)試管中(例如，10 μ 1 IL-2捕獲珠粒Χ18試管=180 μ 1 所需的IL-2捕獲珠粒)。樣品的制備 使用合適體積的試驗(yàn)稀釋液通過(guò)所需的稀釋倍數(shù)(即，1 2、1 10或1 100)
來(lái)稀釋測(cè)試樣品。將樣品轉(zhuǎn)移至含有混合的捕獲珠粒和PE檢測(cè)試劑的適當(dāng)試管之前，將樣 品稀釋液徹底混合。培養(yǎng)物上清液試驗(yàn)程序?qū)?0 μ 1混合的捕獲珠粒(使用混合的人Thl/Th2細(xì)胞因子捕獲珠粒制備中所述 的程序制備)加入到合適的試管中。在加入試管之前，將混合的捕獲珠粒渦旋。將50μ 1人 Thl/Th2-II PE檢測(cè)試劑加入試管中。將50 μ 1人Thl/Th2細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液加入到 對(duì)照試管中。將50 μ 1的每種測(cè)試樣品加入到測(cè)試試管中。將試管在RT下培養(yǎng)3小時(shí)，并 防止其直接暴露于光。將Iml洗滌緩沖液加入到每個(gè)試管中，并在200xg離心5分鐘。從 每個(gè)試管小心吸取上清液，并丟棄。將300 μ 1洗滌緩沖液加入到每個(gè)試管中，以重懸浮珠 粒沉淀。在流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器上分析樣品(圖22和圖23)?？扇苄訲lh抑制增殖T細(xì)胞上的⑶4和⑶25受體表達(dá)按照栓系試驗(yàn)程序中所述的設(shè)定試驗(yàn)，S卩，圖18中提及的平板的覆蓋和PBMC的培 養(yǎng)。然后從96孔平板中取出細(xì)胞，放入BD falcon試管中。將2ml的IXPBS加入到每個(gè)試 管中，并在1200RPM下離心5分鐘。丟棄上清液，將IOOul IXPBS加入細(xì)胞沉淀中。每個(gè)試 管中取100 μ 1細(xì)胞，并加入10 μ 1 Flourchrome、綴合的抗CD4 Alexa或抗CD25PE，并在 4°C下培養(yǎng)30分鐘。培養(yǎng)后，將2ml IXPBS加入每個(gè)試管中，然后在RT下在1200RPM下離 心5分鐘。丟棄上清液。將細(xì)胞重懸浮于0.5mL IXPBS中，然后在流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器中獲取 細(xì)胞。為了 FSC和SSC中所需的群(3000個(gè)細(xì)胞)，將細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)集合。估算了兩者 的細(xì)胞百分比和平均熒光強(qiáng)度。將該實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次，并且顯示了一個(gè)代表圖。結(jié)果在獨(dú)立 的實(shí)驗(yàn)中是可重復(fù)的(圖24)。上述試驗(yàn)中的凋亡沒(méi)有增加在試驗(yàn)中，按照試驗(yàn)程序?qū)嵤├?中所述設(shè)定，從96孔平板中取出細(xì)胞，放入BD falcon試管中，并做上標(biāo)記，用于凋亡試驗(yàn)。每個(gè)試管中加入2ml 1XPBS，并在1200RPM下 離心5分鐘。丟棄上清液，將IOOul IXPBS加入到細(xì)胞沉淀中。加入IOOul PI/膜聯(lián)蛋白 V標(biāo)記溶液并在4°C下培養(yǎng)30分鐘。培養(yǎng)后，將2ml IXPBS加入到每個(gè)試管中，然后在室溫 下在1200RPM下離心5分鐘。丟棄上清液。將細(xì)胞重懸浮于0. 5mL IXPBS中，并在流式細(xì) 胞計(jì)數(shù)器中獲取細(xì)胞。為了 FSC和SSC中所需的群(3000個(gè)細(xì)胞)，將細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)集 合(圖25)。從這些實(shí)驗(yàn)，清楚了 Tlh導(dǎo)致原初T細(xì)胞增殖的抑制并且由促炎細(xì)胞因子的實(shí)質(zhì) 性增加以及CD25和CD4數(shù)量減少來(lái)介導(dǎo)。外源IL2的加入能夠恢復(fù)抑制以及提高促炎細(xì) 胞因子的表達(dá)，以及提高CD4和CD25的絕對(duì)受體數(shù)。這些結(jié)果表明由Tlh引起的T細(xì)胞增 殖的抑制是通過(guò)IL2的抑制來(lái)介導(dǎo)的，并且外源IL2的加入導(dǎo)致“功能的獲得”。我們還觀 察到T細(xì)胞增殖的降低不是由凋亡的誘導(dǎo)來(lái)介導(dǎo)的。實(shí)施例10在破傷風(fēng)類毒素介導(dǎo)的T細(xì)胞增殖試驗(yàn)中Tlh不抑制記憶T細(xì)胞
通過(guò)FicolI-Paque (Amersham 目錄號(hào)17-14403-03)(密度梯度離心)分離 PBMC。 白細(xì)胞層獲自健康的捐獻(xiàn)者并且通常是新鮮收集的。然后將PBMC在PBS (Invitrogen)中洗 滌。然后將PBMC以0. 3xl06細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度重懸浮于2ml的補(bǔ)充5% FBS的RPMI培養(yǎng) 基中。然后將細(xì)胞在無(wú)菌BD FACS 5ml試管中培養(yǎng)30分鐘，用或不用TlhlOug/ml和hR3， 其用作非特異性對(duì)照。培養(yǎng)后，將細(xì)胞渦旋并將100 μ 1細(xì)胞懸浮液加入到各自的孔中。將 IOOul 破傷風(fēng)類毒素(Cat#582231，CALBI0CHEM) (10ug/ml)工作溶液(含有 5 % FBS 的 RPMI 培養(yǎng)基)加入到各自的孔中，以刺激記憶T細(xì)胞增殖。將平板在CO2培養(yǎng)箱中在37°C下培養(yǎng) 五天。將65μ1 Alamar藍(lán)加入到每個(gè)孔中，并在在CO2培養(yǎng)箱中在37°C下培養(yǎng)過(guò)夜。在分 光光度計(jì)Biotek Synergy HT上測(cè)量熒光，使用530nm激發(fā)，590nm發(fā)射和靈敏度=35 (圖 26)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果 顯示破傷風(fēng)類毒素以劑量依賴性方式刺激了 T細(xì)胞的增殖，但sTlh沒(méi)有 顯示出這些細(xì)胞增殖的任何抑制。這強(qiáng)烈地表明了 Tlh沒(méi)有抑制記憶T細(xì)胞增殖。這對(duì)于 Tlh療法是有利的，因?yàn)檠h(huán)記憶T細(xì)胞增殖沒(méi)有受到影響，并且Tlh治療中的患者將不會(huì) 易受感染。實(shí)施例11Tlh在PBMC和Raji細(xì)胞介導(dǎo)的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中抑制T細(xì)胞增殖收集Raji/PBMC細(xì)胞，并懸浮于IXPBS中。將8xl05細(xì)胞/ml Raji細(xì)胞/PBMC重 懸浮于Iml絲裂霉素(25ug/ml)中。將細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中在37°C下培養(yǎng)30分鐘。培養(yǎng) 后，將2ml的含有5% FBS的RPMI加入每個(gè)試管中，并在RT下在1200RPM下離心5分鐘以 除去絲裂霉素。丟棄上清液，并再加入2ml的含有5% FBS的RPMI并離心。丟棄上清液，并 將細(xì)胞重懸浮于RPMI培養(yǎng)基中。將50ul PBMC (4xl05細(xì)胞/ml)加入96孔圓底平板的各自的孔中。將100 μ 1抗體 稀釋液Tlh或hR3 (10ug/ml)加入各自的孔中，并在CO2培養(yǎng)箱中在37°C下培養(yǎng)30分鐘。將 50ul絲裂霉素處理過(guò)的Raji細(xì)胞(4xl05細(xì)胞/ml)加入到各自的孔中。連同該試驗(yàn)一起， 包括的對(duì)照是單獨(dú)的絲裂霉素處理過(guò)的Raji細(xì)胞、單獨(dú)的PBMC、絲裂霉素處理過(guò)的Raji細(xì) 胞+PHA、PBMC+PHA、絲裂霉素處理過(guò)的Raji和PBMC。將平板在CO2培養(yǎng)箱中在37°C下培養(yǎng) 5天。將65μ1 Alamar藍(lán)加入到每個(gè)孔中，并在CO2培養(yǎng)箱中在37°C下培養(yǎng)過(guò)夜。在分光 光度計(jì)Biotek Synergy HT上測(cè)量熒光，使用530nm激發(fā)，590nm發(fā)射和靈敏度=35?？傊^察到Tlh可以特異性地抑制單向MLR，其中Raji細(xì)胞是抗原呈遞細(xì)胞，并 且PBMC增殖(圖27和圖28)。實(shí)施例12 混合的淋巴細(xì)胞反應(yīng)(樹(shù)突細(xì)胞和外周血淋巴細(xì)胞(PBL))MLR 試驗(yàn)按照DC PBL = 1 2比例進(jìn)行MLR試驗(yàn)。用三個(gè)濃度的Tlh設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)?zāi)０澹?美莫司用作陽(yáng)性對(duì)照，hR3為陰性對(duì)照。顯示了模板(圖29)。根據(jù)橫跨平板進(jìn)行連續(xù)稀釋。按照平板的設(shè)計(jì)加入PBL和DC。將絲裂霉素C處理過(guò)的PBL加入平板中相應(yīng)的孔 中。在所有孔中，終體積為200ul。重復(fù)兩次進(jìn)行MLR。一個(gè)平板用于增殖試驗(yàn)，而另一個(gè)用于細(xì)胞因子試驗(yàn)。最終，將兩個(gè)平板簡(jiǎn)短離心，并在CO2培養(yǎng)箱中保存6天。增殖試驗(yàn)培養(yǎng)后，在顯微鏡下檢測(cè)平板的污染，并將20ul的Alamar藍(lán)(10%總體積/孔)加入到每個(gè)孔中。在靈敏度35下，在4小時(shí)時(shí)開(kāi)始的不同時(shí)間范圍下進(jìn)行讀數(shù)，直至過(guò)夜 (圖 30)。細(xì)胞因子試驗(yàn)從每個(gè)孔中收集上清液，并且對(duì)于每個(gè)組，將上清液合并。在流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器中使 用BD CBA Thl/Th2試劑盒II分析細(xì)胞因子(圖31)。在同種異體(抗原呈遞細(xì)胞取自一個(gè)個(gè)體，而PBMC取自另一個(gè)個(gè)體)混合淋巴細(xì) 胞反應(yīng)中，其中成熟樹(shù)突細(xì)胞(抗原呈遞細(xì)胞)導(dǎo)致原初PBMC的增殖，Tlh以劑量依賴性 方式抑制這種增殖。數(shù)據(jù)顯示了作用模式涉及至少兩種主要的促炎細(xì)胞因子(即IL6和 IFNy)的下調(diào)。實(shí)施例13I型糖尿病動(dòng)物模型已知NOD (非肥胖糖尿病)雌性小鼠產(chǎn)生自發(fā)性的自體免疫T細(xì)胞介導(dǎo)的糖尿病， 如通過(guò)隨著時(shí)間增加的葡萄糖所測(cè)量的。這種胰島素依賴性糖尿病(IDDM)模型是用于研 究藥物的治療和預(yù)防效果的極好模型。將該小鼠用于研究CD6替代抗體(以Tlh結(jié)合人 CD6相似方式結(jié)合鼠CD6的大鼠單克隆抗體)的治療和預(yù)防益處。在中間實(shí)驗(yàn)中，來(lái)自Harlan的動(dòng)物在8-10周中已經(jīng)顯示出產(chǎn)生了疾病。這些小 鼠在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)的年齡為6-7周。2. 46-19. 68mg/kg/周的劑量范圍明顯降低了葡萄糖水 平，并且事實(shí)上在最高劑量下，將葡萄糖水平降至正常。在治療情況下，十只小鼠中的相似實(shí)驗(yàn)以劑量依賴性方式延遲了疾病的發(fā)作。在 最高劑量下延遲可以長(zhǎng)達(dá)三周。實(shí)施例14 膠原蛋白誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎模型膠原蛋白誘發(fā)關(guān)節(jié)炎(CIA)的小鼠模型對(duì)研究動(dòng)物模型中的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎特 別有利。該模型在歷史上還用于研究抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎分子(包括抗體)的作用。在該研究中使用C57BL/6雄性小鼠。簡(jiǎn)而言之，將來(lái)自Sigma的雞膠原蛋白(CII) 溶解于IOmM醋酸中，并使用0. 2 μ m濾器進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾。在該研究中使用50 μ 1注射體積。 將CII以4mg/ml溶解，用于100 μ 1體積。所有程序在2_8°C下進(jìn)行。將熱滅活的結(jié)核分枝桿菌與不完全弗氏佐劑(IFA)混合用研缽和杵棒精細(xì)研磨。 然后通過(guò)將兩者混合將CII乳化到此溶液中。所有程序在2-8°C下進(jìn)行。在尾巴的基部給予第一次劑量?jī)芍芎?，注射加?qiáng)劑量。然后監(jiān)控關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)生。在產(chǎn)生疾病的十只小鼠中，使用特異性地檢測(cè)與Tlh相似結(jié)構(gòu)域中的小鼠CD6的 替代抗⑶6抗體。與未處理的對(duì)照相比，2. 46-19. 68mg/kg/周的劑量范圍以劑量依賴性方 式明顯地降低了這些小鼠中的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。這些實(shí)驗(yàn)確定了如下的事實(shí)Tlh的替代 抗體可以控制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。實(shí)施例15 自體免疫腦脊髓炎(EAE)
實(shí)驗(yàn)性自體免疫腦脊髓炎(EAE)是腦炎的動(dòng)物模型。其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的 炎性脫髓鞘疾病，并且作為人CNS脫髓鞘疾病(包括多發(fā)性硬化的疾病)的模型進(jìn)行研究。已知注射大鼠髓鞘堿性蛋白時(shí)，C57BL/6小鼠易受這種疾病的影響，并且使用了加 強(qiáng)實(shí)驗(yàn)方案，其中在第0天和17天用200μ gCFA中的大鼠MBP使小鼠免疫，接著注射標(biāo)準(zhǔn) 的百日咳毒素。該實(shí)驗(yàn)方案導(dǎo)致單相的中等疾病過(guò)程，在第20天時(shí)開(kāi)始，具有發(fā)炎和軸突 損傷的組織學(xué)標(biāo)記，但沒(méi)有明顯的脫髓鞘。將處理臂中的10只小鼠暴露于不同濃度的Tlh替代抗體下，其結(jié)合小鼠CD6的相 似結(jié)構(gòu)域，與Tlh結(jié)合人⑶6—樣。劑量范圍為2. 46-19. 68mg/kg/周。與安慰劑制劑相比， 處理明顯地以劑量依賴性方式控制了疾病，尤其是在最高劑量下。實(shí)施例16
同種異體移植將來(lái)自品系A(chǔ)自交小鼠的皮膚移植至小鼠B時(shí)，可能以特定的方式排斥皮膚移植， 在第3天至第7天之間皮膚首先變得血管化。然后用淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜中性白細(xì)胞和 其他炎癥細(xì)胞滲透血管化的皮膚。在7-10天內(nèi)移植的組織存在減少的血管化，并且在10 天后出現(xiàn)可見(jiàn)的壞死。對(duì)二十只小鼠(BALBc-WT)嘗試該實(shí)驗(yàn)，這些小鼠接受來(lái)自C57BL6/WT小鼠的皮膚 移植。使用標(biāo)準(zhǔn)外科手術(shù)程序，切下皮膚并移植至不同的BALBc小鼠中。將處理臂中的十 只小鼠暴露于不同濃度的Tlh替代抗體，其與小鼠CD6的相似結(jié)構(gòu)域結(jié)合，與Thl與人CD6 結(jié)合一樣。劑量范圍為2.46-19.68mg/kg/周。在BALBc小鼠接受移植之前的一周，給予第 一次注射，并在此后持續(xù)6周?？磥?lái)這些數(shù)據(jù)表明了與未處理的動(dòng)物相比，在接受藥物的小鼠中更常見(jiàn)能耐受皮 膚移植。在所有未處理的動(dòng)物中，在三周內(nèi)移植變得壞死。對(duì)移植的耐受也是劑量依賴性 的，接受最高劑量的動(dòng)物更能承受移植。
權(quán)利要求
一種單克隆抗體，其能夠與CD6的結(jié)構(gòu)域1(D1)結(jié)合并抑制T細(xì)胞增殖而不干擾ALCAM結(jié)合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的單克隆抗體，其包含與SEQID NO :1或SEQ ID NO :2所示的氨基 酸序列為至少80%同源的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的單克隆抗體，其包含與SEQID NO :3或SEQ ID NO :4所示的核苷 酸序列為至少80%同源的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求1的單克隆抗體，其中抗體在體外沒(méi)有誘導(dǎo)補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)。
5.權(quán)利要求1的單克隆抗體，其中抗體在體外沒(méi)有誘導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)。
6.權(quán)利要求1的單克隆抗體，其中抗體在體外沒(méi)有誘導(dǎo)凋亡。
7.權(quán)利要求1的單克隆抗體，其中抗體抑制由栓系抗-CD3；栓系抗-CD3和抗-CD6的 組合或栓系抗⑶3和ALCAM的組合誘導(dǎo)的原初PBMC的增殖。
8.權(quán)利要求1的單克隆抗體，其中抗體特異性地抑制單向MLR，其中Raji細(xì)胞是抗原 呈遞細(xì)胞，并且PBMC增殖。
9.權(quán)利要求1的單克隆抗體，其中抗體特異性地抑制由PBMC介導(dǎo)的單向自身MLR。
10.權(quán)利要求1的單克隆抗體，其中抗體通過(guò)實(shí)質(zhì)性地降低促炎細(xì)胞因子引起原初T細(xì) 胞增殖的抑制。
11.權(quán)利要求1的單克隆抗體，其中抗體通過(guò)⑶25和⑶4計(jì)數(shù)的下降引起原初T細(xì)胞 增殖的抑制。
12.權(quán)利要求1的單克隆抗體，其中抗體通過(guò)介導(dǎo)IL2的抑制而抑制T細(xì)胞增殖。
13.權(quán)利要求1的單克隆抗體，其中隨著外源IL2的添加，抗體顯示出功能的獲得。
14.權(quán)利要求1的單克隆抗體，其中抗體參與促炎細(xì)胞因子IL6和INFY的下調(diào)。
15.根據(jù)在前任一項(xiàng)權(quán)利要求的單克隆抗體，其中抗體沒(méi)有抑制記憶T細(xì)胞群體。
16.使用根據(jù)在前權(quán)利要求一項(xiàng)或多項(xiàng)的單克隆抗體來(lái)調(diào)節(jié)炎性病癥的方法，所述炎 性病癥如牛皮癬、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或患者體內(nèi)的自體免疫應(yīng)答，如與多發(fā)性硬化或移植排 斥相關(guān)的不利應(yīng)答，移植物抗宿主疾病，I"型糖尿病，牛皮癬，皮膚性T細(xì)胞淋巴瘤，甲狀腺 炎和其他T細(xì)胞介導(dǎo)的自體免疫疾病。
17.使用單克隆抗體與免疫抑制劑相結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)炎性病癥的方法，所述炎性病癥如牛 皮癬、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或患者體內(nèi)的自體免疫應(yīng)答，如與多發(fā)性硬化或移植排斥相關(guān)的不 利應(yīng)答，移植物抗宿主疾病，1-型糖尿病，牛皮癬，皮膚性T細(xì)胞淋巴瘤，甲狀腺炎和其他T 細(xì)胞介導(dǎo)的自體免疫疾病。
18.使用單克隆抗體與能夠引發(fā)抗炎免疫應(yīng)答的抗原如胰島素，GAD，M0G，MBP和HSP60 相結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)炎性病癥的方法，所述炎性病癥如多發(fā)性硬化或移植排斥，移植物抗宿主疾 病，1型糖尿病。
19.根據(jù)權(quán)利要求16、17或18的方法，包括將治療或藥物學(xué)上有效量的抗CD6結(jié)合抗 體給藥于患者，該抗體特異性地與人⑶6SRCR結(jié)構(gòu)域1 (Dl)結(jié)合而不抑制ALCAM與h⑶6結(jié)口 O
20.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中藥物學(xué)上有效的劑量為0.l-25mg/kg/周。
21.根據(jù)權(quán)利要求16、17、18或19的調(diào)節(jié)炎性病癥或自體免疫反應(yīng)的方法，其中通過(guò) 與SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2中所示的氨基酸序列為至少80%同源的氨基酸序列來(lái)表示單克隆抗體。
22.根據(jù)權(quán)利要求16、17、18或19的調(diào)節(jié)炎性病癥或自體免疫反應(yīng)的方法，其中通過(guò) 與SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4中所示的氨基酸序列為至少80%同源的核苷酸序列來(lái)表 示單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及人源化IgG1同種型抗-CD6抗體(T1h)，其與存在于胸腺上皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、激活的T細(xì)胞和多種其他細(xì)胞類型的表面上的CD6的清道夫受體富含半胱氨酸(SRCR)結(jié)構(gòu)域1(D1)結(jié)合。
文檔編號(hào)A61P37/06GK101970493SQ200880127743
公開(kāi)日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2008年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月14日
發(fā)明者H·巴拉蘇布拉馬尼安, J·E·M·卡斯米洛, J·L·瓦拉達(dá)勒斯, K·N·薩斯特里, L·阿迪卡瑞, M·查特伊, P·納伊爾, R·P·羅德里戈茲, R·梅拉克德, S·D·拉庫(kù)瑪 申請(qǐng)人:百康有限公司;分子免疫中心