專利名稱：抑肝散的生物測定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及抑肝散的測定方法，更詳細而言，涉及一種測定方法，該測定方法利用 對谷氨酸受體的作用，能定量地評價中藥制劑抑肝散的生理活性值(藥理活性值)。
背景技術：
中藥是將生藥混合而成的藥品，其活性成分并沒有完全確定。此外，由于并不限于 僅以單一的活性成分發(fā)揮效果，有時也共同起作用，因此為了保證其品質(zhì)，需要能夠?qū)χ兴?整體進行評價的測定方法(專利文獻1、專利文獻2)。在該測定方法中，有測定個別的成分后對它們進行綜合性評價的方法和采用生物 材料來評價生理活性的生物測定。而且在生物測定中，有生物體內(nèi)(體內(nèi)，in vivo)試驗 和試管內(nèi)(體外，in vitro)試驗，但生物體內(nèi)試驗的體系在試驗設施、試驗動物、處理能力 等方面存在各種限制，用于中藥的品質(zhì)評價時伴隨有困難。另一方面，在試管內(nèi)試驗的體系中，由于不需要特殊的設施，且短時間內(nèi)能獲得 穩(wěn)定的試驗結果，因此尋求利用該體系來建立生物測定法，實際上關于肌肉生長抑制素 (Myostatin)的生物測定法已有報道(專利文獻幻。但是，對于自身由包含多種有效成分 的生藥組合而成的中藥來說，還沒有發(fā)現(xiàn)通常適用的生物測定體系，因而期待建立該生物 測定體系。例如，中藥制劑抑肝散通常為具有以下組成的生藥混合物或其提取物，進而根據(jù) 需要含有賦形劑等藥用載體、其他制劑上可使用的成分，但關于該制劑，也還沒有發(fā)現(xiàn)合適 的生物測定體系，為了保證更佳的品質(zhì)，期望開發(fā)出其生物測定體系。[表 1]
日文名(英文名)配方曰本藥典蒼術JP Atractylodes Lancea Rhizome )4.0g曰本藥典茯苓JP Poria Sclerotium )4.0g曰本藥典川芎JP Cnidium Rhizome )3.0g曰本藥典當歸JP Japanese Angelica Root)3.0g曰本藥典柴胡JP Bupleurum Root)2.0g曰本藥典甘草JP Glycyrrhiza )1.5g曰本藥典鉤藤JP Uncaria Hook )3.0g專利文獻1 日本特表2000-512621專利文獻2 日本特表2001-521876
專利文獻3 日本特表2005-520486

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題因此，本發(fā)明的課題在于發(fā)現(xiàn)能夠保證抑肝散的更高品質(zhì)的、利用試管內(nèi)試驗的 生物測定體系。用于解決問題的方案本發(fā)明人等對抑肝散的作用進行了深入研究，結果認識到，抑肝散具有與谷氨酸 受體的結合活性，且該結合活性依賴于抑肝散的用量。此外，認識到抑肝散的構成生藥即柴 胡、川芎、當歸、甘草等也具有與谷氨酸受體的結合活性，且對于每種谷氨酸受體而言，引起 結合活性的生藥不相同。并且發(fā)現(xiàn)，應用該見解，能夠建立抑肝散、或柴胡、川芎、當歸、甘草 或者含有這些生藥的待測試樣的生物測定方法，從而完成了本發(fā)明。即本發(fā)明為一種抑肝散的生物測定方法，其特征在于，使標記配體和抑肝散競爭 性作用于表達谷氨酸受體的細胞或細胞膜，從而測定抑肝散的結合活性，并由該值評價抑 肝散的藥理活性值。此外本發(fā)明為一種至少含有柴胡、川芎、當歸或甘草的待測試樣的生物測定方法， 其特征在于，使標記配體和至少含有柴胡、川芎、當歸或甘草的待測試樣競爭性作用于表達 谷氨酸受體的細胞或細胞膜，從而測定待測試樣的受體結合活性，并由該值評價待測試樣 的藥理活性值。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明的生物測定方法，能夠不受試驗設施、試驗動物、處理能力等的限制， 通過試管內(nèi)試驗簡便且穩(wěn)定地求出抑肝散或含有作為抑肝散等的構成生藥的柴胡、川芎、 當歸、和甘草的待測試樣的生理活性值(藥理活性值)。


圖1是表示抑肝散的各谷氨酸受體的結合活性的圖。其中，非選擇性結合是指對 離子通道型受體和代謝型受體這兩者的非選擇性結合。圖2是表示構成抑肝散的7種生藥的各谷氨酸受體結合活性的圖。
具體實施例方式本發(fā)明的抑肝散的生物測定方法通過使用表達谷氨酸受體的細胞或細胞膜來測 定該受體和抑肝散的結合活性，從而評價抑肝散的藥理活性值。具體而言，能夠利用以下方法使標記配體和抑肝散競爭性作用于表達谷氨酸受 體的細胞或細胞膜，由結合的標記配體量來測定抑肝散的結合活性。更具體而言，使標記配體和抑肝散競爭性地與在細胞或細胞膜中表達的谷氨酸受 體反應，由僅存在標記配體時的特異性結合量和競爭后的標記配體結合量之差來測定抑肝 散的結合活性值。本發(fā)明中使用的谷氨酸受體，可以根據(jù)藥理學的標準進行分類。S卩，已知谷氨酸介 由離子通道型受體和代謝型受體這兩種主要的受體來傳遞其作用。而且，離子通道型受體可以根據(jù)受體的藥理學和功能性質(zhì)進一步分類。上述離子通道型受體主要是N-甲基-D-天門冬氨酸(以下稱為“NMDA”)受體、 紅藻氨酸受體和α-氨基-3-羥基-5-甲基異噁唑-4-丙酸(以下稱為“ΑΜΡΑ”)受體。進 而，NMDA受體可分為具有谷氨酸結合部位、甘氨酸結合部位、苯環(huán)己哌啶結合部位、和多胺 結合部位的受體。另一方面，代謝型受體已知有8個不同的成員，它們被分為三組。S卩，mGluRl和 mGluR5 屬于組 I，mGluR2 和 mGluR3 屬于組 II，而 mGluR4、mGluR6、mGluR7 和 mGluR8 屬于 組 III。另外，本申請發(fā)明中的對谷氨酸受體的非選擇性結合是指，對離子通道型和代謝 型這兩者均具有結合性的結合。作為本發(fā)明方法中使用的表達谷氨酸受體的細胞膜，例如可列舉出根據(jù) Matthew A. Sills 等的論文(Matthew A. Sills, et al. , 1991, [3H]CGP39653 :a new N-methyl—D—asparate antagonist redioligand with low nanomolar affinity in rat brain, Eur. J. Pharmacol.，192，19-24)等所記載的方法從Wistar系大鼠等實驗動物的腦 組織中采集的腦膜部分。根據(jù)谷氨酸受體的種類，為得到腦膜部分而使用的腦組織的部位 不同，例如，在對谷氨酸受體的非選擇性結合試驗中可以從Wistar系大鼠的腦采集，在對 AMPA受體和NMDA受體的結合試驗中可以從Wistar系大鼠的大腦皮質(zhì)采集，在對紅藻氨酸 受體的結合試驗中可以從Wistar系大鼠的腦(除去小腦后的腦)采集。此外，作為本發(fā)明方法中使用的表達谷氨酸受體的細胞，可以列舉出通過基因操 作而導入了谷氨酸受體基因的細胞。例如，表達作為谷氨酸受體基因的mGluR5的細胞，可 以列舉出通過 Aramori I.等的方法(Aramori I. et al.，1992，Signal transduction and pharmacological characteristics of a metabotropic glutamate receptor,mGluRl,in transfected CHO cells, 8, 757-765)導入了人重組谷氨酸受體表達基因而制作的細胞，具 體而言，可列舉出表達mGluR5的CHO細胞、HEK-293細胞等。另外，為獲得表達mGluR5的 細胞膜，可列舉出將上述表達mGluR5的細胞通過勻漿等方法破壞、并通過高速離心分離等 方法分離細胞膜部分的方法。另外，可以利用作為市售品而可獲得的mGluR5表達細胞膜部 分。另外，作為針對谷氨酸受體的標記配體，可列舉出用放射性同位素、熒光、酶等標 記的配體，作為其例子可列舉出[3H]L-谷氨酸、[3H]AMPA、[3H]紅藻氨酸(Kainic acid)、 [3H]CGP-39653, [3H]MDL_105519、[3H]TCP, [3H]艾芬地爾(Ifenprodil)、[3H]使君子酸 (Quisqualic acid)，可根據(jù)各谷氨酸受體區(qū)分使用。作為本申請發(fā)明的生物測定方法的實施方式的一種，例如可列舉出以下方法，該 方法是從Wistar系大鼠采集表達了規(guī)定的谷氨酸受體的腦組織，然后，通過上述方法等獲 得腦膜部分，由放射配體等標記配體和抑肝散的競爭性反應求出結合活性。此時的反應體 系優(yōu)選為4 37°C左右，抑肝散的結合活性的測定，只要在向腦膜部分中添加標記配體和 抑肝散后20 120分鐘左右后進行即可。另外，抑肝散的結合活性能夠由僅存在標記配體 時的特異性結合量和競爭性反應后的配體結合量之差來測定。另外，作為本申請發(fā)明的其他的實施方式，可列舉出以下方法，該方法利用通過基 因操作導入了谷氨酸受體基因的細胞或該細胞的細胞膜，由放射配體等標記配體和抑肝散的競爭性反應求出結合活性。具體而言，可舉出以下方法，該方法使用表達mGluR5的CHO 細胞膜等，由PH]使君子酸和抑肝散的競爭性反應求出結合活性。此時的反應體系優(yōu)選為 25 37°C左右，抑肝散的結合活性的測定只要在向細胞膜等中添加標記配體和抑肝散后 30 120分鐘左右后進行即可。另外，抑肝散的結合活性能夠由僅存在標記配體時的特異 性結合量和競爭性反應后的配體結合量之差來測定。本申請發(fā)明的生物測定方法中，通常優(yōu)選同時對含有已知濃度的抑肝散的試樣進 行多個點、優(yōu)選為3個點以上的測定，由此來定量待測試樣中的抑肝散的藥理活性(結合活 性)值，但如果條件基本沒有改變，則也可以使用已經(jīng)由含有已知濃度的抑肝散的試樣制 作的標準曲線來測定。如上述那樣，能夠評價待測試樣中的抑肝散的藥理活性值，該作用機制被認為如 下。即，抑肝散與谷氨酸受體結合，但本發(fā)明中，該成分和標記的各配體發(fā)生競爭性反應，從 而相應于前述成分量，與谷氨酸受體結合的標記配體減少。通過測定該減少的標記配體量， 能夠評價抑肝散的結合活性。根據(jù)以上說明的本發(fā)明的生物測定法，通過對臨床上已確認作為抑肝散的藥理效 果的標準制劑和待測制劑在同一條件下評價藥理活性值，并比較標準制劑和待測制劑，從 而能夠?qū)χ苿┑钠焚|(zhì)同等性進行評價。進而，在以上說明的生物測定法中，對于除抑肝散以外的、柴胡、川芎、當歸、甘草 或含有它們的待測試樣(以下稱為“生藥試樣”)，也能與抑肝散同樣地評價品質(zhì)同等性。在此，作為除抑肝散以外的含有柴胡的待測試樣，可列舉出柴胡加龍骨牡蠣湯、柴 胡桂枝干姜湯、加味歸脾湯、抑肝散加陳皮半夏等中藥配方或含有柴胡的植物提取物制劑 等。另外，作為除抑肝散以外的含有川芎的待測試樣，可列舉出七物降下湯、十全大補湯、酸 棗仁湯等中藥配方或含有川芎的植物提取物制劑等。另外，作為除抑肝散以外的含有當歸 的待測試樣，可列舉出當歸芍藥散、加味逍遙散、人參養(yǎng)榮湯等中藥配方或含有當歸的植物 提取物制劑等，再另外，作為除抑肝散以外的含有甘草的待測試樣，可列舉出芍藥甘草湯、 溫經(jīng)湯、四逆散等中藥配方或含有甘草的植物提取物制劑等。上述含有柴胡等的待測試樣的生物測定，基本上能與已對抑肝散所進行的說明同 樣地實施，由于各種生藥試樣對每種谷氨酸受體的反應性不同，因此優(yōu)選預先使用規(guī)定濃 度的生藥試樣進行試驗、并制作標準曲線。通過以上說明的本發(fā)明的生物測定法，對多個制劑批次進行藥理活性值的評價， 將由其平均值等導出的上下限的范圍進行標準化，通過判斷待測試樣的藥理活性值是否符 合該范圍，也能夠評價品質(zhì)同等性。實施例下面列舉出實施例和參考例，對本發(fā)明進行更詳細的說明，但本發(fā)明不受這些實 施例等的任何限定。參考例1待測藥物溶液的調(diào)制稱量20mg的待測藥物(TJ44或構成生藥提取物)，加入蒸餾水，調(diào)制成 20mg/125 μ L(在構成生藥提取物的情況下，為20mg/100 μ L)，進而用DMSO稀釋2倍，以得 到的溶液作為原液。用該溶液稀釋至各濃度。
實施例1根據(jù)下述⑴到⑶的方法求出各種濃度的抑肝散(TJ-M ；株式會社津村制)對 谷氨酸受體的結合活性(％ )。其結果示于圖1。(1)待測藥物對谷氨酸受體的非選擇性結合試驗向從Wistar系大鼠采集的腦組織中加入20mL/g的50mM Tris-HCl緩沖液，勻漿 后，重復進行3次離心分離(39，000\8、15分鐘、4°0，從而得到膜部分。向ImL的管中加 入200 μ L所得到的膜部分溶液(5-20mg/mL)、20 μ L的[3H] L-谷氨酸(最終濃度3. 75nM) 和各種濃度的待測藥物溶液2 μ L，在37°C下孵育30分鐘。作為對照組，加入DMSO溶液(最 終濃度0. 5% )，同樣地進行孵育。孵育結束后，用細胞收集器(BrandelMLR-48、Skatron micro-96、PerkinElmer) 過濾到玻璃纖維濾器(Whatman 1821-915 GF/B、Whatman)，用50mMTris-HCl緩沖液洗滌 3-6次后，用液體閃爍計數(shù)器(Wallac Counter, PerkinElmer)測定玻璃纖維濾器的[3H] L-谷氨酸的放射活性。非特異性結合由50 μ M的非標記L-谷氨酸存在下的[3H]L-谷氨酸 的放射活性測得。總結合由待測藥物非存在下的[3H]L-谷氨酸的放射活性測得。另外，待 測藥物的結合活性由以下的結合抑制率(％ )算出。結合抑制率(%) = [l-(c-a)/(b-a)] XlOOa 非特異結合的平均cpmb:總結合的平均cpmc 待測藥物存在下的cpm另外，本實驗的各種條件如下。細胞膜部分的來源=Wistar系大鼠的腦對照0.5%DMSO反應緩沖液含有CaCl22. 5mM 的 50mM Tris-HCl (ρΗ7· 4)反應時間及溫度30分鐘、37°C配體3.75nM 的[3H] L-谷氨酸(PerkinElmer)非特異性配體50 μ M的L-谷氨酸(Sigma)Kd :0. 293 μ MBmax :36pmol/mg 蛋白質(zhì)特異性結合90%(2)待測藥物對AMPA受體的結合試驗向從Wistar系大鼠采集的大腦皮質(zhì)的組織中添加20mL/g的50mM Tris-HCl (含 有200mM KSCN)緩沖溶液，勻漿后，重復進行3次離心分離(48，000 X g、15分鐘、4°C )，從而 得到膜部分。向ImL的管中加入500 μ L所得到的膜部分溶液(5-20mg/mL)、20 μ L的『H] AMPA (最終濃度5ηΜ)和各種濃度的待測藥物溶液5. 25 μ L，在4°C下孵育90分鐘。作為對 照組，加入DMSO溶液(最終濃度0. 5% )，同樣地進行孵育。孵育完成后，用細胞收集器(BrandelMLR-48, Skatron micro-96, PerkinElmer) 過濾到玻璃纖維濾器(Whatman 1821-915 GF/B、Whatman)，用50mM Tris-HCl緩沖溶液洗 滌3-6次后，用液體閃爍計數(shù)器(Wallac Counter,PerkinElmer)測定玻璃纖維濾器的[3H] AMPA的放射活性。非特異性結合由1000 μ M的非標記L-谷氨酸存在下的[3H] AMPA的放射活性測得?？偨Y合由待測藥物非存在下的[3H]AMPA的放射活性測得。另外，待測藥物的結 合活性由前述算式的結合抑制率評價。另外，本實驗的各種條件如下。細胞膜部分的來源=Wistar系大鼠的大腦皮質(zhì)反應液含有KSCN200mM 的 50mM Tris-HCl (ρΗ7· 4)對照0.5%DMSO反應時間及溫度90分鐘、4°C配體5nM的[3H]AMPA(PerkinElmer)非特異性配體1000 μ M的L-谷氨酸(Sigma)Kd :0. 018 μ M(Kdl)、0· 99 μ M(Kd2)Bmax :0. 62pmol/mg 蛋白質(zhì)(Bmaxl)、17pmol/mg 蛋白質(zhì)(Bmax2)特異性結合90%(3)待測藥物對紅藻氨酸(Kainate)受體的結合試驗向從Wistar系大鼠采集的除去小腦的腦組織中加入20mL/g的50mM Tris-HCl緩 沖溶液，勻漿后，重復進行3次離心分離(48，000乂8、15分鐘、4°0，從而得到膜部分。向 ImL的管中添加500 μ L的膜部分溶液(5-20mg/mL)、20 μ L的[3H]紅藻氨酸(最終濃度 5ηΜ)和各種濃度的待測藥物溶液5. 25 μ L，在4°C下孵育60分鐘。作為對照組，加入DMSO 溶液(最終濃度0. 5% )，同樣地進行孵育。孵育完成后，用細胞收集器(BrandelMLR-48、Skatron micro-96、PerkinElmer) 過濾到玻璃纖維濾器(Whatman 1821-915 GF/B、Whatman)，用50mM Tris-HCl緩沖溶液洗 滌3-6次后，用液體閃爍計數(shù)器(Wallac Counter,PerkinElmer)測定玻璃纖維濾器的[3H] 紅藻氨酸的放射活性。非特異性結合由1000 μ M的非標記L-谷氨酸存在下的[3H]紅藻氨 酸的放射活性測得?？偨Y合由待測藥物非存在下的[3H]紅藻氨酸的放射活性測得。另外， 待測藥物的結合活性由前述算式的結合抑制率評價。另外，本實驗的各種條件如下。細胞膜部分的來源=Wistar系大鼠的腦組織(除去小腦)反應緩沖液50mMTris-HCl (ρΗ7· 4)對照0.5%DMSO反應時間及溫度60分鐘、4°C配體5nM的[3H]紅藻氨酸(PerkinElmer)非特異性配體1000 μ M的L-谷氨酸(Sigma)Kd :0. 012 μ MBmax :0. 35pmol/mg 蛋白質(zhì)特異性結合80%(4)待測藥物對NMDA受體的谷氨酸(Glutamate)結合部位的結合試驗向從Wistar系大鼠采集的大腦皮質(zhì)的組織中添加20mL/g的50mM Tris-HCl緩沖 溶液，勻漿后，離心分離(1，OOOXgUO分鐘、4°C )。收集其上清液，離心分離(20, 000Xg, 20分鐘、4°C)從而得到顆粒。將該顆粒用緩沖液再懸浮，離心分離(8，000Xg、20分鐘、4°C)。收集上清液，離心分離(48，000乂8、20分鐘、4°0，從而得到顆粒。將該顆粒用緩沖 液再懸浮，進行3次(20分鐘、10分鐘、10分鐘)離心分離(48，000Xg、4°C )，從而得到膜 部分。向ImL的管中加入500 μ L的膜部分溶液(5_20mg/mL)、20 μ L的[3H]CGP-39653 (最 終濃度2nM)和各種濃度的待測藥物溶液5.25 μ L，在4°C下孵育20分鐘。作為對照組，加 入DMSO溶液(最終濃度0. 5% )，同樣地進行孵育。孵育完成后，用細胞收集器(BrandelMLR-48、Skatron micro-96、PerkinElmer) 過濾到玻璃纖維濾器(Whatman 1821-915 GF/B、Whatman)，用50mM Tris-HCl緩沖溶液 洗滌3-6次后，用液體閃爍計數(shù)器(Wallac Counter、PerkinElmer)測定玻璃纖維濾器的 [3H]CGP-39653的放射活性。非特異性結合由1000 μ M的非標記L-谷氨酸存在下的[3H] CGP-39653的放射活性來測得?？偨Y合由待測藥物非存在下的[3H]CGP-39653的放射活性 來測得。另外，待測藥物的結合活性由前述算式的結合抑制率評價。另外，本實驗的各種條件如下。細胞膜部分的來源=Wistar系大鼠的大腦皮質(zhì)反應緩沖液50mMTris-HCl (ρΗ7· 4)對照0.5%DMSO反應時間及溫度20分鐘、4°C配體2nM的[3H] CGP-39653 (PerkinElmer)非特異性配體1000 μ M的L-谷氨酸(Sigma)Kd :0. 019 μ MBmax :2. 3pmol/mg 蛋白質(zhì)特異性結合70%(5)待測藥物對NMDA受體的甘氨酸(Glycine)結合部位的結合試驗向從Wistar系大鼠采集的大腦皮質(zhì)的組織中，添加20mL/g的50mM HEPE S緩沖 溶液，勻漿后，離心分離(1，OOOXgUO分鐘、4°C)。收集其上清液，離心分離(20, 000Xg, 20分鐘、4°C )，從而得到顆粒。將該顆粒用緩沖溶液再懸浮，離心分離(8，000Xg、20分鐘、 4°C)。收集上清液，離心分離(48，000乂8、20分鐘、4°0，從而得到顆粒。將該顆粒用緩沖 溶液再懸浮，進行3次(20分鐘、10分鐘、10分鐘)離心分離(48，000Xg、4°C)，從而得到膜 部分。向ImL的管中加入500 μ L的膜部分溶液(5_20mg/mL)、20 μ L的[3H]MDL-105519 (最 終濃度0. 33nM)和各種濃度的待測藥物溶液5. 25μ L，在4°C下孵育30分鐘。作為對照組， 加入DMSO溶液(最終濃度0. 5% )，同樣地進行孵育。孵育完成后，用細胞收集器(BrandelMLR-48, Skatron micro-96, PerkinElmer) 過濾到玻璃纖維濾器(Whatman 1821-915 GF/B、whatman)，用50mM HEPES緩沖液洗滌 3-6次后，用液體閃爍計數(shù)器(Wallac Counter, PerkinElmer)測定玻璃纖維濾器的[3H] MDL-105519的放射活性。非特異性結合由10 μ M的非標記MDL-105519存在下的[3H] MDL-105519的放射活性來測得。總結合由待測藥物非存在下的pH]MDL_105519的放射活 性來測得。另外，待測藥物的結合活性由前述算式的結合抑制率評價。另外，本實驗的各種條件如下。細胞膜部分的來源=Wistar系大鼠的大腦皮質(zhì)反應緩沖液50mMHEPES(pH7. 7)
對照0.5%DMSO反應時間及溫度30分鐘、4°C配體0.33nM 的[3H]MDL-105519 (PerkinElmer)非特異性配體10μΜMDL-105519 (Sigma)Kd :6nMBmax :3. 7pmol/mg 蛋白質(zhì)特異性結合85%(6)待測藥物對代謝型谷氨酸受體mGluR5的結合試驗向ImL的管中加入30yg蛋白質(zhì)/IOOyL的CHO-Kl細胞膜溶液、20μ L的[3H] 使君子酸(Quisqulic acid)(最終濃度0. 03 μ Μ)和各種濃度的待測藥物溶液1. 1 μ L，在 25°C下孵育2個小時。作為對照組，加入DMSO溶液(最終濃度0.5%)，同樣地進行孵育。孵育完成后，用細胞收集器(Micro 96 FilterMate, PerkinElmer)過濾到玻璃纖 維濾器(Whatman 1821-915 GF/B、Whatman)，用20mM HEPES緩沖溶液洗滌6次后，用液體 閃爍計數(shù)器(Wallac Counter)測定玻璃纖維濾器的[3H]使君子酸的放射活性。非特異性 結合由1000 μ M的非標記L-谷氨酸存在下的[3H]使君子酸的放射活性來測得。總結合由 待測藥物非存在下的[3H]使君子酸的放射活性來測得。另外，待測藥物的結合活性由前述 算式的結合抑制率評價。另外，本實驗的各種條件如下。細胞膜的來源CH0-K1細胞(表達人重組mGluR5) (PerkinElmer)反應緩沖液含有MgCl2 2mM、CaCl2 2mM 的 20mM HEPES (pH7. 4)對照0.5%DMSO反應時間及溫度2小時、25°C配體0·03 μ M 的使君子酸(PerkinElmer)非特異性配體1000 μ M的L-谷氨酸(Sigma)Kd :0. 026 μ MBmax :0. 68pmol/mg 蛋白質(zhì)特異性結合85%(結果)如圖1所示，關于25到800 μ g/mL濃度的抑肝散(TJ44 ；株式會社津村制)對 谷氨酸受體的結合活性(％)，NMDA顯示出最高的結合活性，接著依次是紅藻氨酸、AMPA、 mGluR5。另外，NMDA受體中，可見與谷氨酸結合部位和甘氨酸結合部位的結合活性。進而， 可認為各谷氨酸受體中的結合活性存在用量依賴性。實施例2以實施例1的方法求出抑肝散(TJ-M ；株式會社津村制)的各構成生藥的7種提 取物(50 μ g/mL)的結合活性(％ )。該結果示于圖2。另夕卜，圖中也一并記載了 200 μ g/mL 抑肝散的結合活性(％)。由圖2的結果可認為，對于AMPA受體，柴胡、川芎、和當歸有較高活性，對于紅藻氨 酸受體，柴胡、川芎、當歸、和甘草有較高活性。另外認為，對于NMDA受體的谷氨酸結合部 位，柴胡、川芎、當歸和甘草有較高活性，對于NMDA受體的甘氨酸結合部位，柴胡、川芎和甘草有較高活性。此外認為，對于mGluR5，柴胡和川芎有較高活性。由上述實施例1和實施例2的結果可知，抑肝散的用量與結合活性之間存在較高 的相關關系，另外，抑肝散的構成生藥中，柴胡、川芎、當歸或甘草與對各谷氨酸受體的結合 活性之間存在較高的相關關系。由該結果可以了解到，以實施例1的方法能夠測定抑肝散 的藥理活性值，以及各種谷氨酸受體的結合活性是由抑肝散中的柴胡、川芎、當歸或甘草產(chǎn) 生的。產(chǎn)業(yè)上的可利用件根據(jù)本發(fā)明，通過試管內(nèi)試驗，能夠不受試驗設施、試驗動物、處理能力等的限制， 簡便且穩(wěn)定地求出抑肝散的藥理活性值。因此，與以往的對所含的一定成分進行分析的方法相比，能夠以更高程度保證抑 肝散的品質(zhì)。
權利要求
1.一種抑肝散的生物測定方法，其特征在于，使標記配體和抑肝散競爭性作用于表達 谷氨酸受體的細胞或細胞膜，從而測定抑肝散的受體結合活性，由該值評價抑肝散的藥理 活性值。
2.根據(jù)權利要求1所述的抑肝散的生物測定方法，其使用對谷氨酸受體中的離子通道 型和代謝型這兩者均具有結合性的非選擇性標記配體。
3.根據(jù)權利要求1所述的抑肝散的生物測定方法，其使用與谷氨酸受體中的離子通道 型受體特異性結合的標記配體。
4.根據(jù)權利要求3所述的抑肝散的生物測定方法，其使用與離子通道型受體中的N-甲 基-D-天門冬氨酸受體、紅藻氨酸受體以及α -氨基-3-羥基-5-甲基異噁唑-4-丙酸受 體特異性結合的標記配體。
5.根據(jù)權利要求4所述的抑肝散的生物測定方法，其使用與N-甲基-D-天門冬氨酸受 體的谷氨酸結合部位或甘氨酸結合部位特異性結合的標記配體。
6.根據(jù)權利要求1所述的抑肝散的生物測定方法，其使用與谷氨酸受體中的代謝型受 體特異性結合的標記配體。
7.根據(jù)權利要求6所述的抑肝散的生物測定方法，其使用與代謝型受體中的mGluR5特 異性結合的標記配體。
8.—種至少含有柴胡、川芎、當歸或甘草的待測試樣的生物測定方法，其特征在于，使 標記配體和至少含有柴胡、川芎、當歸或甘草的待測試樣競爭性作用于表達谷氨酸受體的 細胞或細胞膜，從而測定待測試樣的受體結合活性，由該值評價待測試樣的藥理活性值。
9.根據(jù)權利要求8所述的至少含有柴胡、川芎、當歸或甘草的待測試樣的生物測定方 法，其使用對谷氨酸受體中的離子通道型和代謝型這兩者均具有結合性的非選擇性標記配 體。
10.根據(jù)權利要求8所述的至少含有柴胡、川芎、當歸或甘草的待測試樣的生物測定方 法，其使用與谷氨酸受體中的離子通道型受體特異性結合的標記配體。
11.根據(jù)權利要求10所述的至少含有柴胡、川芎、當歸或甘草的待測試樣的生物測 定方法，其使用與離子通道型受體中的N-甲基-D-天門冬氨酸受體、紅藻氨酸受體以及 α -氨基-3-羥基-5-甲基異噁唑-4-丙酸受體特異性結合的標記配體。
12.根據(jù)權利要求11所述的至少含有柴胡、川芎、當歸或甘草的待測試樣的生物測定 方法，其使用與N-甲基-D-天門冬氨酸受體的谷氨酸結合部位或甘氨酸結合部位特異性結 合的標記配體。
13.根據(jù)權利要求8所述的至少含有柴胡、川芎、當歸或甘草的待測試樣的生物測定方 法，其使用與谷氨酸受體中的代謝型受體特異性結合的標記配體。
14.根據(jù)權利要求13所述的至少含有柴胡、川芎、當歸或甘草的待測試樣的生物測定 方法，其使用與代謝型受體中的mGluR5特異性結合的標記配體。
全文摘要
為了發(fā)現(xiàn)一種能夠保證抑肝散的更高品質(zhì)的、利用試管內(nèi)試驗的生物測定體系，提供了一種抑肝散的生物測定方法，其特征在于，使標記配體和抑肝散競爭性作用于表達谷氨酸受體的細胞或細胞膜，從而測定抑肝散的結合活性，并由該值評價抑肝散的藥理活性值。
文檔編號A61K36/48GK102066930SQ200880130008
公開日2011年5月18日 申請日期2008年6月27日 優(yōu)先權日2008年6月27日
發(fā)明者五十嵐康, 寺脅潔, 川上善治 申請人:株式會社津村