專利名稱：來自乳桿菌屬細菌的免疫調節(jié)提取物及其制備及使用方法
來自乳桿菌屬細菌的免疫調節(jié)提取物及其制備及使用方法
技術領域：
本發(fā)明的實施方式包括來自乳桿菌屬細菌的提取物，其可在受試者中產生免疫 調節(jié)效應。本發(fā)明的實施方式可使用，例如，作為用于治療疾病的營養(yǎng)劑或藥物，例如與 抗-炎癥或促炎細胞因子的產生的不平衡相關的那些，例如感染，過敏，自身免疫病癥，及 發(fā)炎，或作為在受試者中提供健康益處的佐劑。本發(fā)明也特別包括制備及使用所述提取物 的方法。本發(fā)明也涉及特定乳桿菌屬細菌株。背景技術及發(fā)明概述免疫調節(jié)是指改變正?；虍惓Ｃ庖邞鸬膹V范圍的免疫干擾的綜合術語。微 生物產生及分泌可調節(jié)真核免疫應答的廣范圍的分子(Lavelle et al. , Curr Top Med Chem. 2004,4(5) ,499-508)。這些包括顛覆保護機理的因子，為輔助病原體定居及存留。已 鑒定病毒，細菌及寄生蟲-來源的可抑制炎癥應答的分子。除了可抑制免疫應答的微生物 因子之外，有力的免疫活化子也可為微生物源本身。這些包括細菌腸毒素，寄生蟲-來源的 排泄-分泌產物，及病毒核酸。被稱為Toll-樣受體(TLR)及由宿主生物表達的至少11種受體的家族被認為 在針對微生物的免疫學檢測及先天性應答中起關鍵作用。圖1提供TLR配體的列表(Gay and Gangloff，Ann. Rev. Biochem.，2007，76 :141-65)。TLR 識別由病毒，細菌及真菌產生 的也被稱為病原體-相關的分子模式(PAMP)的廣范圍的分子(Tse and Homer,Ann Rheum Dis. 2007Nov ；66 Suppl 3 :iii77_80)。TLR-關聯(lián)的免疫調節(jié)已應用于開發(fā)于廣泛的病理 (包括感染性，惡性，自身免疫及過敏性疾病)的新治療法。TLR激動劑及拮抗劑已作為用于預防及治療疾病的潛在治療劑而研究。在相對小 的臨床試驗中，已將TLR激動劑用作用于旨在防止感染，消滅過敏性超敏反應及清除惡性 細胞的疫苗的佐劑。TLR激動劑也已作為用于治療患感染性，過敏性及惡性疾病的患者的單 一治療及附加治療而研究。TLR拮抗劑的用途也已在臨床前研究及臨床試驗中作為用于自 身免疫疾病及膿毒癥的潛在治療劑研究。益生菌是當以足夠的量施用時可給受試者提供健康益處的活微生物(Mottet et al., Digestive and Liver Disease,2005, 37 :3_6 ；Ezendam et al. ,Nutr Rev,Jan. 2006, 64(1) :1-14 ；Gill and Prasad,Adv Exp Med Biol，2008，606 :423-54)。涉及通過益生微生 物的免疫應答刺激的生物機理及那些微生物的某些細胞成分已是研究的主題。例如，革蘭 氏陽性細菌具有包括大分子(例如脂磷壁酸(LTA))的特征性細胞壁。LTA可相關于免疫刺 激活性(例如，Bhakdi et al.，Infect. Immun.，1991,59 :4614-4620 ；Setoyama et al.，J Gen Microbiol,1985,131 (9) :2501-2503 ；Cleveland et al. ,Infect Immun,1996,64(6) 1906-1912)。也見(Deininger et al. ,Clin Vaccine Immunol, 2007,14(2) :1629-1633) 此外，益生細菌可含各種有免疫調節(jié)特征的TLR配體。來自各雙歧桿菌株的細胞壁碎片發(fā) 現(xiàn)在小鼠脾細胞中刺激干擾素-Y (IFN-Y)體外產生(T. Ambrouche, “ Contribution a I ‘ etude dupouvoir immunomodulateur des bifidobacteries Analyse in vitro et etude ex vivo des mecanismes moleculaires impliques, " Ph. D. Thesis,UniversiteLaval, Qu6bec，20(^)。由特定乳酸細菌的粒子細胞壁碎片制成的膠囊 (Del-Immune V , Pure Research Products, LLC, Colorado)也旨在刺激免疫系統(tǒng)。但是，以活或殺死的形式的攝入益生細菌，或攝入所述細菌的粒子細胞壁碎片不 可是在受試者中提供免疫調節(jié)效應的最有效的方式，但是。例如，活細胞提取物可包括 尺寸阻礙其被受試者有效吸收的大蛋白及脂肽，由此限制體內來自益生細菌的有利的分 子的局部濃度。體內病情也可毀壞活躍的細菌成分或別樣地修飾那些成分的化學結構， 致使它們失活。與口服施用活益生微生物(乳桿菌)相關的風險包括菌血癥及膿毒癥 (Lactobacillus Sepsis Associated With Probiotic Therapy, Pediatrics，Jan. 2005， 115(1) :178-181)。因此，有給有需要的受試者遞送益生細菌的有益效應的其他手段的需 求。本發(fā)明涉及乳桿菌提取物，一些實施方式可顯示強免疫調節(jié)活性。例如，本發(fā)明的 實施方式涉及可作為營養(yǎng)劑或作為藥物有用的來自細菌株的提取物，一些情況中，涉及治 療感染性疾病，過敏，呼吸系統(tǒng)病癥，及炎癥病理，或涉及發(fā)揮與治療流程相聯(lián)系的附加劑 的作用。本發(fā)明也涉及包括所述提取物的組合物，及例如使用不存在朊病毒疾病的風險的 培養(yǎng)基制備所述提取物的方法。本發(fā)明的方法包括，例如，在堿性條件下，或在堿性條件然 后是酸性條件下裂解細胞。在一些實施方式中，本發(fā)明的提取物是可溶性提取物，意為它們 不含顯著量的固體或顆粒物。在一些實施方式中，提取物含化學修飾的TLR配體。在一些 實施方式中，堿性處理可導致細胞物質(包括TLR配體，細胞壁成分，蛋白，脂磷壁酸，脂肽 及磷脂)的化學修飾。本發(fā)明的一些實施方式可包括從以下物種的一或多種獲得的提取物發(fā)酵乳 桿菌(Lactobacillus fermentum)，鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)，胚芽 乳桿菌(Lactobacillus ρIantarum),約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)，dr 乳桿菌(Lactobacillus helveticus)，干酷乳桿菌 defensis (Lactobacillus casei defensis)，干酪乳桿菌屬干酪種(Lactobacillus casei ssp. casei)，副干酪乳桿菌 (Lactobacillus paracasei)，保力口禾Ij亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)，畐Ij干酷乳 桿菌(Lactobacillus paracasei)，嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)，羅伊乳 桿菌(Lactobacillus reuteri)，唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)，乳酸乳桿菌 (Lactobacillus lactis)，及德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)。在一些實施方式中，提取物包括來自各以上細菌物種的至少一種株，而在其他實 施方式中，來自以上列表的一或多種特異性株可用一或多種不同株除去或取代。本發(fā)明的 一些實施方式包括從以下細菌株的一或多種獲得的提取物發(fā)酵乳桿菌1-3929，鼠李糖乳 桿菌71. 38，胚芽乳桿菌71. 39，約氏乳桿菌103782，及瑞士乳桿菌103146。將以上株根據(jù) 布達佩斯條約保藏。將發(fā)酵乳桿菌1-3929，鼠李糖乳桿菌71. 38，胚芽乳桿菌71. 39，約氏 乳桿菌103782，及瑞士乳桿菌103146各保藏在在法國、巴黎、25 Rue du Docteur Roux, F-75724，巴斯德研究所的國立微生物保藏中心。將發(fā)酵乳桿菌1-39 在2008年2月27 日保藏。其他株在包藏機構的收集物之中，及可通過聯(lián)系包藏機構得到。本發(fā)明也特別涉及株發(fā)酵乳桿菌1-39 ，從該株獲得的提取物，制備所述提取物 的方法，及其用途。該株通過使來自胚芽乳桿菌及發(fā)酵乳桿菌的株經歷染色體交換得到，由 此產生新乳桿菌株。從發(fā)酵乳桿菌1-39 獲得的提取物發(fā)現(xiàn)在與感染及免疫學病癥關聯(lián)的幾種不同體內及體外模型中活躍。在一些實施方式中，僅從一種特異性細菌株得到提取物?；蛘?，可使用多于一種 株。在其他實施方式中，可加入來自不同類型微生物(例如非-乳桿菌屬細菌物種)的一 或多種提取物。提取物可通過使細胞在培養(yǎng)基中生長到適宜濃度后在特異條件下裂解細菌細胞 來得到。在一些實施方式中，細菌在不存在朊病毒-相關的疾病的風險或可傳播的其他疾 病的風險的培養(yǎng)基中，通過攝取從基于動物的培養(yǎng)基獲得的產物來生長。例如，在一些實施 方式中，將基于植物的培養(yǎng)基(例如基于大豆的培養(yǎng)基)用于生長細胞。也可過濾裂解產物(即細胞裂解產物)以除去核酸及更大細胞碎片，例如不溶物 或顆粒物。在一些實施方式中，存在于提取物的核酸的量小于100 μ g/mL。因此，在一些實 施方式中，得到的提取物包括可溶分子成分，及不含顯著量的不溶物或顆粒物?？蓪⒛ぜ凹毎诜肿尤芙饣驊腋∮谔崛∥铮ㄖ鞍?，脂肽，肽聚糖，脂寡糖，脂 磷壁酸，及磷壁酸。裂解處理期間，細胞中(例如膜及細胞壁中)的分子可成為化學修飾的， 例如，通過堿性處理切割為更小的結構。盡管所述化學修飾，本發(fā)明的實施方式可相比全細 胞保留它們的生物活性，或所述實施方式可甚至相比全細胞展示增強的生物活性。例如，可將堿性處理用于裂解細胞，或可應用于已之前通過另一方法裂解的細胞。 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式的堿性處理期間，見于天然的蛋白及脂肽的L-氨基酸至少部 分外消旋化為D-氨基酸。D-氨基酸可有益于增加提取物的有效性的時間，因為它們在哺乳 動物腸中不有效消化。D-氨基酸也可在消化期間保護來自降解的更小的肽及蛋白。D-氨 基酸之例包括結合蛋白的D-氨基酸，及在較小程度上是賴氨酸丙氨酸(de Vrese et al. ,J Nutrition, 2000, 2026-2031)。由此，裂解期間化學修飾提取物中的抗原性分子，以含D-氨 基酸，可在患者體內保留更長時間，在一些實施方式中潛在地能使更強免疫刺激效應。在一些實施方式中，過濾處理也可影響得到的提取物的性質，因為過濾器孔徑，及 有時，過濾器表面的化學性質(即其極性)，可改變除去及保留的物質的類型。例如，本發(fā)明 的一些實施方式使用設計為保留目的分子、但移除其他分子成分(例如核酸或不溶物或顆 粒物)的過濾處理。過濾的提取物也可通過有機提取，有機相-水相提取，層析，超速離心，超濾，或其
組合進一步純化。

圖1 由宿主生物表達的對于11種Toll-樣受體(TLR)的家族的配體。圖2 用于通過細菌裂解制備細菌提取物的切向流過濾(TFF)系統(tǒng)的模式圖。模 式圖顯示過濾器的2種不同構型全部過濾器同時工作的平行模式及過濾器以連續(xù)模式配 置的繞行模式。圖3 操作參數(shù)與通量之間的廣義相關性，指示用于切向流過濾處理(TFF)的壓力 控制及質量轉移控制的區(qū)。圖 4 在裂解產物 AFer300，CFer300,及 DFer300，及 ARahr300，CRahr300,及 DRahr300的不同稀釋液的存在下培養(yǎng)48小時的脾臟細胞的刺激。添加30 μ 1/孔的在細胞 培養(yǎng)基中1 1稀釋的Alamar藍 溶液后，細胞還溫育(a) 8. 5h (第一實驗)；(b) Mh (第二實驗)。顯示的是兩份培養(yǎng)物的在590nm處的平均發(fā)射值士標準偏差。圖5 在(a)第一測定，及(b)第二測定中，用發(fā)酵乳桿菌1-39 及鼠李糖乳桿菌 71. 38的提取物處理的小鼠中氧化氮(NO)產生的誘導。結果作為平均值士標準偏差以μ M 氧化氮(NO)表示。圖6 通過在最后抗原攻擊一天后全身體積描記術(Emka)，用增加濃度的吸入的 乙酰甲膽堿的本發(fā)明的提取物對氣道高應答性(AHR)的效應。顯示用磷酸緩沖鹽水(PBS) 處理的陰性對照動物(n = 4)，未處理的LACK-攻擊的動物(作為陽性對照組，η = 8)， 0Μ-1009Α-處理的LACK攻擊的小鼠(n = 8)，及0Μ-1009Β-處理的LACK攻擊的小鼠(n = 7)的結果(以平均增強的中止值+/_平均的標準誤差)。發(fā)明詳述定義提取物本文定義的提取物指通過裂解一或多種細菌株得到的物質。有時，從僅一 株得到提取物，而其他情況中，從幾種不同株的混合物得到提取物。有時，提取物是可溶性提取物，意為其不含顯著量的粒子及不溶物，例如粒子或固 體細胞壁碎片。與此相比，來自細胞壁，細胞器，及細胞膜的成分可包括在提取物中到它們 溶解或懸浮的程度。例如，提取物可經處理，以除去粒子及不溶物，例如經過濾，離心，或另 一分離技術?；瘜W裂解這是在堿性的，酸性，和/或滲透條件下裂解細菌細胞的方法。裂解產物如本文所用，此術語指從細胞裂解過程獲得的細菌提取物。過濾過濾處理，如本文所述，指使提取物或提取物的混合物通過一或多種過濾器 (例如微過濾器(即，微濾)和/或超過濾器(即，超濾))。所述過濾不可必然移除100% 的其要除去的成分，但可，在一些實施方式中，致使提取物基本上無那些成分。有時，過濾重 復幾次或幾個循環(huán)。初始ρΗ 術語指過程(例如細菌裂解或過濾)開始時所測的ρΗ。糖本文定義的糖包括單糖，二糖，以及更大糖，例如線性及分支的多糖。糖也包括 取代的或化學修飾的糖，例如脂多糖(LPQ及它們的化學修飾的變體。脂蛋白此術語指兼包括蛋白或肽鏈及脂質的大分子，例如，共價結合到脂質的蛋 白或肽。脂蛋白，如本文所用，也包括脂肽。肽聚糖此術語指包括糖及氨基酸的聚合物。脂磷壁酸(LTA)此術語指存在于革蘭氏陽性細菌株的表面-結合的粘接兩性分 子。磷壁酸此術語指經磷酸二酯鍵連接在一起的甘油磷酸酯或核糖醇磷酸酯的聚合 物。D-氨基酸此術語指以右-旋異構體的形式存在的氨基酸，相反于以生物合成方 式產生的L-氨基酸，其以左-旋異構體的形式存在。外消旋化此術語指L-氨基酸到D-氨基酸的至少部分化學修飾。避免基于朊病毒的疾病的風險的培養(yǎng)基指在提取物的制備的任何階段使用的不 包括物質(例如從動物(例如?；蜓?或可傳播基于朊病毒的疾病的任何其他動物獲取的 血清或肉提取物)的培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)基之例包括基于植物的或合成的培養(yǎng)基，及也使用馬血清的培養(yǎng)基或包括從不傳播朊病毒疾病的動物物種獲取的物質的培養(yǎng)基?；陔貌《?的疾病之例包括，例如，瘋牛病，羊瘙癢病，及克-雅二氏病。非-動物培養(yǎng)基是不包括源于動物的成分的培養(yǎng)基。實施例包括基于植物的(即 植物)培養(yǎng)基，例如大豆培養(yǎng)基，及合成的培養(yǎng)基。營養(yǎng)劑，如本文所用，指可在施用后在受試者中具有健康效應的任何組合物，其中 所述組合物是，例如，無需醫(yī)生的處方而受試者可用的。治療，作為本文中治療中使用的，兼指治療當前疾病或病癥，以及防止或保護以免 例如新疾病或病癥的發(fā)展。佐劑，本文所用的佐劑指本發(fā)明的實施方式，指連同醫(yī)學治療計劃提供給受試者 的本發(fā)明的實施方式。免疫調節(jié)，免疫調節(jié)，及如術語，如本文所用，指在受試者中以可具有健康益處的 方式修飾免疫應答的能力，例如產生抗-炎癥或免疫刺激效應?？?炎癥，及類似術語，如本文所用，指用于減少發(fā)炎的免疫調節(jié)效應。免疫刺激及類似術語，如本文所用，指免疫系統(tǒng)刺激。保護性免疫，如本文所用，指提供給受試者實施方式，以提供從隨后用感染劑或過 敏原攻擊的保護。結果，攻擊期間，在受試者中感染劑或過敏原的水平在濃度上足夠低，以 不顯著緩和受試者的健康。其中所述從攻擊的保護有效的時間長度可有限，例如數(shù)小時， 天，或周的時期。受試者，如本文所用，指任何動物受試者，包括哺乳動物受試者，例如人及家畜。家 畜，例如，可包括哺乳動物，例如狗，貓，馬，豬，牛，羊，山羊，或其他家畜，及也可包括非-哺 乳動物，例如鳥，例如雞，鴨，鵝，火雞及其他家禽。應知，本文中鑒定的及本發(fā)明中使用的特異性細菌株可包括從本文引用的原保藏 或其遺傳克隆獲得的株，包括已后期以不同保藏號名稱再保藏，但被認為與原保藏是遺傳 相同株的株。本文所用的全部數(shù)字是近似值，計入它們的測量，舍入，及有效數(shù)字中固有的誤差。提取物的制備本發(fā)明包括一或多種乳桿菌屬細菌株的提取物，其中所述提取物是可溶性提取 物，及其中所述提取物包括化學修飾的細菌分子。本發(fā)明的提取物可，例如，通過培養(yǎng)細胞，然后收獲得到的生物質，裂解及純化來 制備。對于各株，為獲得足夠的量的物質，發(fā)酵培養(yǎng)物可從工作種罐開始，然后接種到更大 發(fā)酵容器。使用的培養(yǎng)基對于各物種可相同。在一些實施方式中，避免基于朊病毒的疾病的 風險的培養(yǎng)基可用于生長待使用的全部株。發(fā)酵后，從一株或從一組株得到的生物質可通過熱處理，濃縮，及冷凍來滅活。因 此，使用以形成提取物的原材料，在一些實施方式中，可為未-裂解的全細胞。在其他實施方式中，用于制備提取物的原材料可為從已至少部分機械地，酶學地， 或化學地裂解的細胞獲得的生物質。再一實施方式中，原材料可為所述之前裂解的細胞的 級分，例如含細胞壁的級分。
在一些實施方式中，原材料用堿性培養(yǎng)基(例如來自強堿(例如氫氧化物，或其他 強礦物或有機堿)的培養(yǎng)基)處理。在此裂解或堿處理步驟中，裂解原材料中未-裂解的 細胞，而在一些實施方式中，細胞成分可經化學修飾。因此，在一些實施方式中，通過堿處理 得到經化學修飾的細菌分子，例如得到提取物的一或多種乳桿菌屬細菌株的強堿處理(即 未-裂解的細胞或成分，或來自細菌細胞的級分的堿處理，如剛解釋的)。在一些實施方式中，可使2 90g/L的生物質干重量濃度經歷堿處理，例如從約 2 約80g/L,或從約3 約40g/L,例如3，5，10，15，20，25，30，35，或40g/L,或甚至約5 50g/L或被以上所列濃度約束的其他范圍。在一些實施方式中，使約40 約80g/L經歷堿 處理，例如40，50，60，70，或80g/L或被以上所列濃度約束的范圍。生物質干重量在本文通過以g/Ι的樣品的物質的干重量定義。其可通過在小瓷皿 中于約105°C干燥樣品直到其達到恒定質量來測量。溫度可為從30 60°C，例如從30 55°C，30 50°C，30 45°C，30 40°C，或 30 35°C。在一些實施方式中，堿處理溫度可為從35 60°C，例如35 55°C，35 50°C， ；35 45°C，或；35 40°C，例如。在一些實施方式中，堿處理溫度可為31 °C，32°C，33°C， ；34°C，35 °C，36 °C，37 °C，38 °C，39 °C，或甚至40 V，或被以上所列溫度約束的范圍。堿處理時間可從2小時 幾天變化，例如1，2，3，4，5或甚至10天，或從3 120 小時，或從 3 48 小時，例如 3，5，8，15，14，16，18，20，22，24，洸，28，30，36，40，44，或 48 小 時，或從15 120小時，例如60 120小時，例如60，72，84，96，108，或120小時，或被以上 所列時間約束的范圍。應知，這些時間范圍包括其中任何分數(shù)的天，小時，或分鐘。在一些實施方式中，使用0. 001N- 1.0N的強堿濃度，例如，0. OOlN 0. 6N，或 0. ION 0. 8N，或 0. 6N 1. 0N，或從 0. 001,0. 002,0. 003，或 0. 1N，或 0. IN 0. 6N起始或結 束的范圍，或從0. 6，0. 7，0. 8，0. 9，1. 0，或1. ON起始或結束的范圍，或其他被以上所列濃度 約束的范圍。在一些實施方式中，使用堿濃度，以實現(xiàn)大于9. 0的初始pH，或大于9. 5的pH， 大于10. 0及小于13.5的pH，例如大于11. 5，大于12.0，大于12. 5，大于13. 0，或pH9. 0 PH13.5。又一實施方式中，可使用堿濃度，以實現(xiàn)大于10.0及小于13.0的初始pH，或pH 9.0 pH 13. 0，例如。在一些實施方式中，堿處理期間的pH可在提取可溶成分之后降低。例如，初始pH 可為堿性PH，例如pH 9.0 pH 13. 0，或pH 9. 5 pH 12.5。可使堿處理進行某些時期，例 如3 120小時，例如3 48小時，或以上所列的一定時間，于以上所列溫度。然后，在一 些實施方式中，PH可任選通過添加例如，鹽酸來致使成酸性，以獲得2. 0和4. 5之間的pH， 或2. 5和4. 5之間的pH，或2. 5和4. 0之間的pH，例如2. 5,3. 0,3. 5,4. 0，或被以上所列之 任何pH約束的范圍。在低pH的第二處理可于從30 60°C，35 55，或35 45°C，例如 35°C，36°C，37°C，38°C，39°C，40°C，41 °C，42°C，43°C，44 V，或甚至 45 V 的溫度進行。酸性處 理時間可從1小時到幾小時達72小時變化，例如1小時和M小時之間，或1小時和6小時 之間，或3小時和48小時之間，或3小時和M小時之間，或4和72小時之間，或甚至M小 時和72小時之間，或被以上所列時間約束的時間的任何范圍。在本發(fā)明的一些實施方式中，對包括，例如，來自發(fā)酵乳桿菌的物質，具有IOg/ L 40g/L之間的生物質干重量的細菌生物質進行堿性處理。在其他實施方式中，在包括乳 桿菌株的混合物及具有10g/L和40g/L之間的生物質干重量的細菌生物質進行堿性處理。在所述實施方式中，可以0. 025N和0. 25N之間的氫氧化物離子濃度，或以9. 5和12. 5之間 的pH，于35 45°C的溫度進行堿性處理3小時和48小時之間的時間。在一些實施方式 中，對包括來自一或多種乳桿菌株的物質的細菌生物質，以0. 025N和0. 20N之間，0. 025和 0. 15N 之間，0. 025 禾口 0. ION 之間，0. 05N 禾口 0. 25N 之間，0. 05N 禾口 0. 20N 之間，0. 05 禾口 0. 15N 之間，0. 05N 禾口 0. ION 之間，0. ION和 0. 25N 之間，0. ION和 0. 20N 之間，0. ION禾口 0. 15N之間， 0. 15N禾口 0. 25N之間，0. 15N禾口 0. 20N之間，或甚至0. 20N和0. 25N之間的氫氧化物離子濃 度進行堿性處理。所述實施方式可，例如，具有9. 5和12. 0之間，9. 5和11. 5之間，9. 5和
11.0 之間，9. 5 和 10. 5 之間，9. 5 和 10. 0 之間，10. 0 和 12. 5 之間，10. 0 和 12. 0 之間，10. 0 和11. 5之間，10. 0和11. 0之間，10. 0和10. 5之間，10. 5和12. 5之間，10. 5和12. 0之間， 10. 5 和 11. 5 之間，10. 5 和 11. 0 之間，11. 0 和 12. 5 之間，11. 0 和 12. 0 之間，11. 0 和 11. 5 之間，11. 5和12. 5之間，11. 5和12. 0之間的pH，或甚至12. 0和12. 5之間的pH。用于所 述實施方式的堿性處理時間可在3小時和36小時之間，3小時和M小時之間，3小時和18 小時之間，3小時和12小時之間，3小時和6小時之間，6小時和48小時之間，6小時和36 小時之間，6小時和M小時之間，6小時和18小時之間，6小時和12小時之間，6小時和8 小時之間，8小時和48小時之間，8小時和36小時之間，8小時和24小時之間，8小時和18 小時之間，8小時和12小時之間，12小時和48小時之間，12小時和36小時之間，12小時和 18小時之間，18小時和48小時之間，18小時和36小時之間，18小時和24小時之間，24小 時和48小時之間，M小時和36小時之間，或36小時和48小時之間。堿性處理可在約束在 以上范圍之任何時間期限進行，例如，3，6，8，12，18，24，36，或甚至48小時。所述條件可提 供用于中等堿性處理。 在其他實施方式中，可使來自一或多種乳桿菌株的10g/L和40g/L的生物質干重 量經歷0. 15N和0. 50N之間的氫氧化物離子濃度或11. 5和13. 5之間的pH，于35 45°C 的溫度15小時和120小時之間的時間。例如，在一些實施方式中，氫氧化物濃度可在0. 15N 和 0. 45N 之間，0. 15N 和 0. 40N 之間，0. 15N 和 0. 35N 之間，0. 15N 和 0. 30N 之間，0. 15N 和 0. 25N之間，0. 15N和 0. 20N之間，0. 20N和 0. 50N之間，0. 20N和 0. 40N之間，0. 20N和 0. 30N 之間，0. 25N 和 0. 50N 之間，0. 30N 和 0. 50N 之間，0. 30N 和 0. 40N 之間，或 0. 40N 和 0. 50 之 間。所述實施方式可，例如具有11. 5和13. 0之間，11. 5和12. 5之間，11. 5和12. 0之間，
12.0 和 13. 5 之間，12. 0 和 13. 0 之間，12. 0 和 12. 5 之間，12. 5 和 13. 5 之間，12. 5 和 13. 0 之間，13. 0和13. 5之間的pH。堿性處理的時間期限可，例如在15小時和100小時之間，15 小時和90小時之間，15小時和75小時之間，15小時和60小時之間，15小時和48小時之 間，15小時和36小時之間，24小時和120小時之間，24小時和100小時之間，24小時和90 小時之間，24小時和75小時之間，24小時和60小時之間，24小時和48小時之間，36小時 和120小時之間，36小時和100小時之間，36小時和90小時之間，36小時和75小時之間， 36小時和60小時之間，36小時和48小時之間，48小時和120小時之間，48小時和100小 時之間，48小時和90小時之間，48小時和75小時之間，48小時和60小時之間，60小時和 120小時之間，60小時和100小時之間，60小時和90小時之間，60小時和75小時之間，75 小時和120小時之間，75小時和100小時之間，75小時和90小時之間，90小時和120小時 之間，或100和120小時之間。對于所述實施方式中堿性處理也考慮的時間期限包括15， 24，48，60，75、90，100，及120小時。所述條件可提供用于強堿性處理。
在其他實施方式中，10g/L和40g/L之間的起始生物質干重量可用0. 025N和 0. 25N之間的氫氧化物濃度或9. 5和12. 5之間的pH，于35 45°C的溫度處理3小時和48 小時之間的時間。然后可通過添加酸(例如鹽酸(HCl)，包括酸性處理)將pH調至2. 5和 4. 0之間。酸性處理可于35和45°C之間的溫度進行1小時和24小時之間的時間。例如， 在所述實施方式，包括一或多種乳桿菌株的細菌生物質的堿性處理可用0. 025N和0. 20N之 間，0. 025 和 0. 15N 之間，0. 025 和 0. ION 之間，0. 05N 和 0. 25N 之間，0. 05N 和 0. 20N 之間， 0. 05 禾口 0. 15N 之間，0. 05N 禾口 0. ION 之間，0. ION 禾口 0. 25N 之間，0. ION 和 0. 20N 之間，0. ION 和0. 15N之間，0. 15N和0. 25N之間，0. 15N和0. 20N之間，或甚至0. 20N和0. 25N之間的 氫氧化物濃度進行。堿性處理期間，所述實施方式可，例如，具有9.5和12.0之間，9.5和 11. 5之間，9. 5和11. 0之間，9. 5和10. 5之間，9. 5和10. 0之間，10. 0和12. 5之間，10. 0 和12. 0之間，10. 0和11. 5之間，10. 0和11. 0之間，10. 0和10. 5之間，10. 5和12. 5之間， 10. 5 和 12. 0 之間，10. 5 和 11. 5 之間，10. 5 和 11. 0 之間，11. 0 和 12. 5 之間，11. 0 和 12. 0 之間，11.0和11. 5之間，11. 5和12. 5之間，11. 5和12. 0之間的pH，或甚至12. 0和12.5 之間的PH。所述實施方式的堿性處理時間可在3小時和36小時之間，3小時和M小時之 間，3小時和18小時之間，3小時和12小時之間，3小時和6小時之間，6小時及〃 48小時 之間，6小時和36小時之間，6小時和24小時之間，6小時和18小時之間，6小時和12小 時之間，6小時和8小時之間，8小時和48小時之間，8小時和36小時之間，8小時和24小 時之間，8小時和18小時之間，8小時和12小時之間，12小時和48小時之間，12小時和36 小時之間，12小時和18小時之間，18小時和48小時之間，18小時和36小時之間，18小時 和24小時之間，24小時和48小時之間，24小時和36小時之間，或36小時和48小時之間。 堿性處理可進行以上約束的范圍之任何時間期限，例如，3，6，8，12，18，24，36，或甚至48小 時。然后可通過添加酸將PH調至2. 5和3. 5之間，2. 5和3. 0之間，3. 0和4. 0之間，3. 0和 3. 5之間，或3. 5和4. 0之間，用于堿性裂解之后的酸性處理。酸性處理可進行1小時和18 小時之間，1小時和12小時之間，1小時和6小時之間，1小時和3小時之間，3小時和M小 時之間，3小時和18小時之間，3小時和12小時之間，3小時和6小時之間，6小時和M小 時之間，6小時和18小時之間，6小時和12小時之間，12小時和M小時之間，12小時和18 小時之間，18小時和24小時之間的時間。酸性處理還考慮的時間包括1,3,6,12，18,24小 時。上述堿處理之后得到的裂解產物可接下來通過離心和/或過濾純化，例如，以除 去粒子及不溶性成分。例如，可將裂解產物以9000X重力離心，然后是在0.2 μ m過濾器上 的一或多輪過濾。有時，可使用在更大孔隙過濾器上的連續(xù)數(shù)輪的過濾，然后在0.2μπι過 濾器上過濾。也可采用超濾方法為輔助提取來自提取物的可溶物質，例如，再循環(huán)用于進一 步微過濾的超濾滲透物。在一些實施方式中，切向流過濾(TFF)方法可用于過濾裂解產物及用于提取來自 更大細胞碎片的可溶分子(圖2)。見，例如，S印arations Technology, Pharmaceutical and Biotechnology Applications,Wayne P. Olson,Editor,lnterpharm Press,Inc. ,Buffalo Grove, IL, U. S. A.，p. 126 to 135-ISBN :0-935184-72_4。在開始所述處理時，稀釋的細菌 裂解產物可保存在第一箱。在TFF中，例如，可將提取物暴露于微過濾器及超濾器。例如， 開始微過濾(MF)環(huán)，及將產物抽泵。將得到的MF滲余物再循環(huán)，同時將MF滲透物轉移到第二箱。達到適宜程度的濃度后，開始超濾(UF)環(huán)?？蓪F滲透再循環(huán)回第一箱，用于連 續(xù)的提取來自裂解產物的溶解的提取物，而將UF滲余物保存在第二箱。連續(xù)的提取期間， 可通過調節(jié)微過濾及超濾滲透物的流速來調整箱1和2中的體積?？捎肨FF或另一過濾方法進行幾種所述提取循環(huán)。在使用TFF的實施方式中，最 后循環(huán)末，可停止超濾環(huán)，及可單獨運行微過濾環(huán)，及將MF滲透物轉移到箱2。錯流及跨膜壓力的條件被定義為獨立的壓力及在，例如，被M. Cheryan膜理論 描述的質量轉移控制的區(qū)(Ultrafiltration and Microfiltration Handbook, 2nd Ed.， Ch. 4，199 。滲透物通量及提取產率被過濾條件影響(跨膜壓力(TMP)，錯流，溫度，等。)。 過濾器類型也可影響過濾表現(xiàn)，以及板系統(tǒng)類型(盒過濾器)?？墒褂貌煌瑯嬓?包括平行 模式及繞行模式)(見圖幻。開發(fā)特異條件用于對于各使用的模式類型及過濾器類型的組 合的優(yōu)化的表現(xiàn)。微過濾環(huán)可安裝1. 2 μ m 0. 1 μ m的過濾器，例如0. 65 0. 2 μ m，或0. 45 μ m的 過濾器。錯流可在有0. 3 2巴的TMP的100和3000L/小時Hi2(LHM)之間，例如300和 2500LHM之間，或2000LHM。超濾環(huán)可安裝IOKDa IOOOKDa的過濾器，例如IOKDa lOOKDa， 或IOKDa 30KDa，或30KDa IOOKDa的過濾器。錯流可在有0. 2 1. 5巴的TMP的30和 1000LHM之間，例如20和500LHM之間。5和20之間的膜滲濾體積可用于提取來自細菌細胞壁的可溶成分。在一些實施方 式中，使用8和15之間的體積。因此，例如，在一些實施方式中，可使用5和15之間個循環(huán) 的過濾，有時，8和15之間個循環(huán)。過濾后，提取物可進一步濃縮或離心，如果需要。例如，還可進行使用更小的孔隙 過濾器微過濾，例如0. 2μπι過濾器。過濾后，可將提取物冷凍干燥，在將其配制使用之前。在一些實施方式中，過濾之后，提取物可純化，以分離，消除或增加提取物中一或 多種修飾的成分的濃度。例如，可使用強離子層析步驟，以移除帶電的成分?？墒褂闷渌?化過程，例如凝膠過濾，層析，超速離心，提取及沉淀。細菌提取物的化學性質堿處理可導致對細胞成分的各種化學修飾。例如，在蛋白中(1)肽鍵可經歷部分 切割產生更小的多肽；(2)天然的L-氨基酸可至少部分外消旋化為D-氨基酸；及(3)天冬 酰胺及谷氨酰胺殘基可成為脫氨基的，導致蛋白等電點變化。分子(例如脂磷壁酸，脂肽， 及磷脂)可經歷酯鍵和/或酰胺鍵的堿-催化的水解，導致可具有新物理化學及免疫學性 質的修飾的兩性結構。其他可能的化學修飾之例包括細胞壁多糖的部分增溶及核糖核酸 (RNA)完全水解為個體核糖核苷酸，包括磷酸酯基團的重排。因此，那些化學修飾的一些或全部可在如本文所述的乳桿菌細胞的堿處理期間發(fā) 生。所述分子修飾可影響提取物的生物活性例如，本發(fā)明的細菌的堿處理可導致蛋白的部分水解以及脫氨基，脫酰胺，和/或 氨基酸從L到D的部分外消旋化。在一個根據(jù)本發(fā)明的提取物的分析研究中，峰代表D-天 冬氨酸，D-谷氨酸，D-絲氨酸，D-甲硫氨酸，D-組氨酸，D-丙氨酸，D-精氨酸，D-苯丙氨 酸，D-酪氨酸，D-亮氨酸，及D-賴氨酸，各觀察到。研究中那些物種的D-氨基酸的百分率 變動于3% 40%。因此，本發(fā)明的一些實施方式使下列的一或多種外消旋化絲氨酸，蘇氨酸，組氨酸，丙氨酸，精氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸，亮氨酸，及賴氨酸，例如全部以上氨基酸， 或多于一種、但少于全部以上氨基酸的任何選擇，例如，丙氨酸，苯丙氨酸及賴氨酸。在一些 實施方式中，至少10%的以上氨基酸的一或多種可成為從D到L外消旋化的。在其他實施 方式中，至少40%的以上氨基酸的一或多種可成為外消旋化的。由此，本發(fā)明的提取物可包括1和90%之間，例如1和80%之間，或1和60%之 間的D-氨基酸。在一些實施方式中，提取物包括10和45%之間的D-氨基酸，例如25和 35%之間的D-氨基酸。本發(fā)明的提取物可包括至少一種選自下列的D-氨基酸D-天冬氨 酸，D-天冬酰胺，D-谷氨酸，D-谷氨酰胺，D-絲氨酸，D-甲硫氨酸，D-組氨酸，D-丙氨酸， D-精氨酸，D-苯丙氨酸，D-酪氨酸，D-亮氨酸，D-賴氨酸，D-纈氨酸，及D-蘇氨酸。在一 些實施方式中，任何一種D-氨基酸的濃度包括1和50 %之間，例如10和40 %之間，或甚至 15和35%之間。本發(fā)明的一些提取物包括乳桿菌屬細菌細胞壁及膜成分，例如脂磷壁酸，磷壁酸， 肽聚糖，或它們的組合。在一些實施方式中，那些成分經化學修飾。一些提取物也包括細胞 壁和/或細胞膜成分，例如脂蛋白，其也可經化學修飾。在一些實施方式中，細胞壁成分或 細胞膜成分，例如脂蛋白，溶解或懸浮于提取物，從而不以粒子或不溶性形式存在。此外，本發(fā)明的提取物可包括，例如，10 lOOmg/mL的可溶干重量(SDW)的物質， 1 30mg/ml的蛋白(Prot.)，0· 5 4. Omg/ml的糖及少于100 μ g/mL的DNA0例如，一些 實施方式含約15 35mg/ml的可溶干重量，3 7mg/ml的蛋白，1. 0 3. Omg/ml的糖及 10 40μ g/ml的DNA。本發(fā)明的提取物可含，例如，30mg/ml的可溶干重量，9. 6mg/mL蛋 白，2. 4mg/ml的糖及33 μ g/ml的DNA，或另一實施例含32. 4mg/ml的可溶干重量，5. 8mg/mL 蛋白，2. 3mg/ml的糖及小于100 μ g/ml的DNA。以g/L或mg/mL的可溶干重量(SDW)通過 獲得5ml的由裂解或堿處理及將其在瓷皿中于105°C干燥至恒定質量所致的可溶級分來測 定。在一些實施方式中，提取物包括至少0. 3mg/ml的糖，例如0. 3和4. 5mg/ml之間的 糖。在一些實施方式中，至少一種糖選自單糖，二糖，及多糖。本發(fā)明的一些提取物包括至 少一種分支的多糖。在一些實施方式中，至少一種糖經化學修飾。本發(fā)明的細菌的裂解或堿處理可導致成分大分子的平均分子量降低至如下范圍， 例如，IkDa 300kDa和IOOkDa之間，或到IkDa 60kDa和IOkDa之間的范圍。在一些實 施方式中，提取物包括至少一種小于50kDa或小于30kDa，例如小于IOkDa的分子量的蛋白。細菌提取物的生物活性本發(fā)明的提取物可具有免疫調節(jié)活性。例如，一些提取物可刺激免疫系統(tǒng)。一些 提取物可具有抗-炎癥活性。提取物的特異性效應可依賴于制備條件及得到提取物的乳桿 菌的種或株，或所述種或株的混合物。因此，本發(fā)明的一些提取物可顯示有力的免疫刺激活 性，及可由此在治療感染中，或作為對于所述治療的附加劑有用，而其他實施方式可顯示更 弱的免疫刺激活性，但顯示抗-炎癥活性，由此在治療炎癥病癥，例如過敏，哮喘，自身免疫 疾病，結腸炎，及炎性腸病中，或作為對于所述治療的附加劑有用。由此，本發(fā)明的一些提取物可對于治療患有包括，但不限于，微生物感染，過敏性 疾病，及消化道病癥的病癥的患者有效。本發(fā)明的一些提取物也可提供給患者作為營養(yǎng)劑， 例如，作為治療各種包括，但不限于，微生物感染，過敏性疾病，及消化道病癥的病情的佐劑。提取物的生物活性范圍可通過幾種體外及體內測定來測定。例如， AlamarBlueTM-測定基于通過響應由細胞生長所致的化學還原的氧化-還原(氧化還原) 指示物的代謝活性的檢測合并熒光/比色生長指示物(實施例4)。體外細胞測定測試來自原代鼠巨噬細胞的氧化氮(NO)的產生，及可就提取物刺 激免疫系統(tǒng)的能力進行篩選，以殺侵襲細菌(圖5)。在一些實施方式中，提取物可在鼠巨 噬細胞中刺激NO產生，導致所測的NO濃度變動于3 μ m 60 μ M，例如5 μ m 40 μ Μ。在 一些實施方式中，NO濃度可為30 μ M以上。細菌物種類型也可影響這些結果。例如，來自 發(fā)酵乳桿菌的提取物可相比鼠李糖乳桿菌誘導更大氧化氮產生(見，例如以下實施例5)。 為就它們的體外免疫刺激或抗-炎癥潛力篩選本發(fā)明的實施方式，可在人外周血單核細胞 (PBMC)進行本發(fā)明的細菌提取物的測試。見!7Oligne等人(World J Gastroenterol, 2007, 13(2) :236-243)?？蓽y量IL12p70 (炎癥細胞因子)及ILlO (抗-炎癥細胞因子)的釋放， 及計算IL-10/IL-12比(實施例6)。本發(fā)明的一些實施方式相比活發(fā)酵乳細菌對照產生更 高IL10/IL12比，由此提示，當體內施用本發(fā)明的一些提取物時，可相比活親本微生物，顯 示相當?shù)?，或甚至更強?炎癥性質。因此，本發(fā)明包括能在人外周血單核細胞中達到可計 算的IL10/IL12比的提取物，其中所述比等于或大于由得到所述提取物的活乳桿菌株達到 的 IL10/IL12 比。本發(fā)明的提取物的免疫應答也可通過檢查它們的對Toll-樣受體(TLR)的效應來 測試，例如，提取物可在HEK293細胞中，在有或無TLR2激動劑Pam3Cys，或在有或無TLR4 激動劑LPS的情況下測試(實施例7)。HEK293細胞系能使使用ELISA分析(例如IL-8滴 定或監(jiān)控TLR-誘導的NF-κ B活化的基于報告子的系統(tǒng))有效監(jiān)控TLR活性。本發(fā)明的一 些實施方式可在HEK TLR 2/6細胞中發(fā)揮TLR2/6拮抗劑的作用。由此，一些實施方式可對 在受試者中抵抗感染有用，然而可開發(fā)其他實施方式用于使用抵抗發(fā)炎和/或自身免疫病 癥。本文公開的提取物也可就TLR及N0D2受體活性進行篩選(實施例8)。本發(fā)明的 一些實施方式體外活化TLR及或N0D2受體，表明它們可能經TLR和/或N0D2活化免疫系統(tǒng)?？刹捎檬砂咝纬杉毎?PFC)技術來評估B-淋巴細胞的非特異性刺激(實施例9)。 某些淋巴樣細胞釋放擴散及通過在補體的存在下形成裂解噬斑來導致相鄰紅細胞裂解的 溶血抗體。本發(fā)明的一些實施方式可通過B細胞增加免疫球蛋白的分泌，從而可潛在地預 防性地用于在患有復發(fā)的感染的受試者中激發(fā)免疫系統(tǒng)?？蓽y試本發(fā)明的提取物的抗-感染功效，例如在受試者的沙門氏菌感染，所述小 鼠的感染之后(實施例10)。本發(fā)明的一些實施方式可提供針對感染(例如細菌感染，即沙 門氏菌感染)的保護性免疫。例如，一些實施方式可降低小鼠中的通過注射鼠傷寒沙門氏 菌誘導的死亡率。NO體外活性與所測的體內活性的確定的組合，例如，在鼠過敏原-誘導的哮喘模 型中(實施例11)可提供本文公開的提取物的潛在臨床活性的更完全的觀察。在LACK(來 自寄生蟲碩大利什曼原蟲的蛋白)模型中，見于支氣管-肺泡灌洗液的嗜酸性粒細胞的數(shù) 相比哮喘對照(非-處理的)動物可降低1和10之間的倍數(shù)，例如降低1. 5倍 5倍。因此，在一些實施方式中，提取物降低嗜酸性粒細胞細胞數(shù)，嗜中性粒細胞細胞數(shù)，淋巴細胞 細胞數(shù)，或任何它們的組合，相對于哮喘非-處理的對照，在哮喘鼠受試者中至少1.5倍。本 發(fā)明的一些實施方式可在哮喘受試者中降低嗜酸性粒細胞增多癥，及伴隨地降低Th2細胞 因子水平(例如IL4，IL5，IL13)，其為哮喘的標記物。由此，所述實施方式，例如，可在患有 免疫學病癥(例如過敏性病癥，包括哮喘)的受試者中具有抗-炎癥活性。包含細菌提取物的組合物本發(fā)明的提取物可以許多不同方式配制用于最后施用?？芍苽淅?，口服片劑，膠 囊，丸劑，以及液體制劑或氣霧劑。也可制備用于輸注或注射的制劑。可例如，作為固體劑型或液體劑型配制本發(fā)明的實施方式。例示固體劑型可包括 含提取物的，例如，片劑，例如包被的片劑，可咀嚼的片劑，泡騰片劑，舌下片劑，顆粒劑，粉 末，或膠囊)。固體劑型也可含稀釋劑，填充劑，和/或其他賦形劑。可加入其他賦形劑成分，例 如防腐劑，著色劑，調味劑，及甜味劑。作為膠囊及片劑的替代品，可開發(fā)粉末或顆粒劑制劑。也可開發(fā)作為溶液或糖漿， 懸浮液及滴液的液體劑型用于口服途徑。本發(fā)明的提取物可包括在一或多種營養(yǎng)組合物中，例如營養(yǎng)和/或飲食補充劑及 食品添加劑，或一或多種藥物組合物。細菌提取物給受試者的施用可將包括至少一種本發(fā)明的提取物的劑施用于患有至少一種選自下列的病癥或 處于發(fā)展風險的受試者消化道病癥，呼吸道病癥，尿道病癥，及過敏性條件。例如，在一些 實施方式中，可將提取物施用于患有下列病癥或處于發(fā)展風險的受試者上或下肺部感染， 有急性下呼吸道感染的阻塞性肺部疾病，有急性惡化的阻塞性肺部疾病，鼻咽炎，鼻竇炎， 咽炎，扁桃體炎，喉炎，氣管炎，喉咽炎，流感，肺炎，支氣管肺炎，支氣管炎，鼻炎，鼻咽炎，咽 炎，鼻竇炎，扁桃體炎，喉炎，喉氣管炎，支氣管炎，過敏性鼻炎，過敏性哮喘，特應性皮炎，由 于阻塞性及回流性尿道疾病的尿道感染，尿道炎，腎小管-間質性腎炎，阻塞性腎盂腎炎， 包括慢性膀胱炎的膀胱炎，包括前列腺炎及慢性前列腺炎的雄性骨盆疼痛綜合征，前列腺 膀胱炎，雌性骨盆炎癥疾病，克羅恩病，和/或腸易激綜合征。在一些實施方式中，將提取物以營養(yǎng)組合物(例如營養(yǎng)補充劑和/或食品添加劑) 的形式施用于受試者。在其他實施方式中，將提取物以藥物組合物的形式施用于受試者。施 用可包括單個劑量或多個劑量施用。在一些實施方式中，提取物可以治療性有效劑量提供以治療患有一或多種以上病 情的受試者。在一些實施方式中，提取物可作為其他醫(yī)學治療的附加劑提供。
實施例實施例1細菌培養(yǎng)實施例1.1 發(fā)酵乳桿菌1-39 的培養(yǎng)初始培養(yǎng)條件通過將以下成分溶解于純化的水中來制備培養(yǎng)基氯化鈉3g/L ；磷酸氫二鈉 2g/L ；乙酸鈉:lg/L ；大豆胨50g/L ；葡萄糖:12g/L ；氯化鈣0. lg/L ；氯化鉀0. lg/L ；碳酸氫鈉0. 5g/L ；丙酮酸鹽0. lg/L ；谷氨酸鹽0. 2g/L ；金屬溶液(硫酸銅3mg/l ；鐵氯化 物:830mg/l ；硫酸鋅:860mg/l ；硫酸1. lmg/L) :0. 5mL/L。然后加入聚丙二醇(0. 02mL/L, 密度1. 005g/mL)。溶解后，不調節(jié)pH。將培養(yǎng)基滅菌后，用冷凍瓶的內容物(含1. 5ml的 冷凍的細菌)個別接種小錐形瓶及于37°C溫育8小時。然后將20ml等份的此培養(yǎng)物轉移 到含IOOOml的培養(yǎng)基的更大錐形瓶中，及再次以相同條件溫育。生長16小時后，將11錐 形瓶的內容物轉移到預發(fā)酵罐。預發(fā)酵罐中的培養(yǎng)條件通過將以下成分溶解于純化的水中來制備20L的培養(yǎng)基氯化鈉3g/L ；磷酸氫二 鈉2g/L;乙酸鈉lg/L;大豆胨50g/L;葡萄糖12g/L;氯化鈣0. lg/L ；氯化鉀0. lg/L； 碳酸氫鈉0. 5g/L ；丙酮酸鹽0. lg/L ；谷氨酸鹽0. 2g/L ；金屬溶液(硫酸銅:3mg/l ；鐵氯 化物:830mg/l ；硫酸鋅:860mg/l ；硫酸1. lmg/L) :0. 5mL/L。然后加入聚丙二醇(0. 02mL/ L)。溶解后，不調節(jié)pH。溫育溫度調節(jié)于37°C，以IOOrpm攪拌及無通氣。培養(yǎng)期間不調節(jié) pH。M小時后，將來自預發(fā)酵罐的71轉移到發(fā)酵罐(在預發(fā)酵罐培養(yǎng)M小時后700nm處 的光學密度(OD) = 1. 24) 0將預發(fā)酵罐的培養(yǎng)物在無菌條件下轉移到發(fā)酵罐。發(fā)酵罐中的培養(yǎng)條件通過將以下成分溶解于純化的水中來制備70L的培養(yǎng)基氯化鈉3g/L ；磷酸氫二 鈉2g/L;乙酸鈉lg/L;大豆胨50g/L;葡萄糖12g/L;氯化鈣0. lg/L ；氯化鉀0. lg/L； 碳酸氫鈉0. 5g/L ；丙酮酸鹽0. lg/L ；谷氨酸鹽0. 2g/L ；金屬溶液(硫酸銅:3mg/l ；鐵氯 化物:830mg/l ；硫酸鋅:860mg/l ；硫酸1. lmg/L) :0. 5mL/L。然后加入聚丙二醇(0. 02mL/ L)。溶解后，不調節(jié)pH。滅菌后，將8g/L葡萄糖加入培養(yǎng)物。溫育溫度調節(jié)于37°C，以IOOrpm攪拌及無通 氣。培養(yǎng)期間PH調節(jié)在5.7。16小時后，培養(yǎng)物(培養(yǎng)物的700nm處的OD 2.30)通過熱處 理于65°C滅活35分鐘及轉移到收獲箱。一旦滅活，將培養(yǎng)物轉移到超濾skid以分離來自 培養(yǎng)基的生物質，濃縮，及用純化的水中的NaCl (9g/L)洗滌。收獲的生物質等分(濃縮的 細菌懸浮液的質量2000g以31. Smg干重量生物質/g的濃縮的細菌懸浮液)然后于_15°C 冷凍。實施例1.2 瑞士乳桿菌103146的培養(yǎng)初始培養(yǎng)條件通過將以下成分溶解于純化的水中來制備培養(yǎng)基氯化鈉3g/L ；磷酸氫二鈉 2g/L ；乙酸鈉:lg/L ；大豆胨50g/L ；葡萄糖:12g/L ；氯化鈣0. lg/L ；氯化鉀0. lg/L ；碳酸 氫鈉0. 5g/L ；丙酮酸鹽0. lg/L ；谷氨酸鹽0. 2g/L ；金屬溶液(硫酸銅3mg/l ；鐵氯化 物:830mg/l ；硫酸鋅:860mg/l ；硫酸1. lmg/L) :0. 5mL/L。然后加入聚丙二醇(0. 02mL/L)。 溶解后，不調節(jié)pH。將培養(yǎng)基滅菌后，用冷凍瓶的內容物(含1. 5ml的冷凍的細菌)個別接 種小錐形瓶及于37°C溫育9小時。然后將20ml等份的此培養(yǎng)物轉移到含IOOOml的培養(yǎng)基 的更大錐形瓶中，及在相同條件下再次溫育。生長15小時后，將11錐形瓶的內容物轉移到 預發(fā)酵罐。預發(fā)酵罐中的培養(yǎng)條件通過將以下成分溶解于純化的水中來制備20L的培養(yǎng)基氯化鈉3g/L ；磷酸氫二 鈉2g/L;乙酸鈉lg/L;大豆胨50g/L;葡萄糖12g/L;氯化鈣0. lg/L ；氯化鉀0. lg/L ；碳酸氫鈉0. 5g/L ；丙酮酸鹽0. lg/L ；谷氨酸鹽0. 2g/L ；金屬溶液(硫酸銅:3mg/l ；鐵氯 化物:830mg/l ；硫酸鋅:860mg/l ；硫酸1. lmg/L) :0. 5mL/L。然后加入聚丙二醇(0. 02mL/ L)。溶解后，不調節(jié)pH。溫育溫度調節(jié)于37°C，以IOOrpm攪拌及無通氣。培養(yǎng)期間不調節(jié) PH。9小時后，將來自預發(fā)酵罐的71轉移到發(fā)酵罐。(預發(fā)酵罐培養(yǎng)9小時后700nm處的 OD 0. 14)。將預發(fā)酵罐的培養(yǎng)物在無菌條件下轉移到發(fā)酵罐。發(fā)酵罐中的培養(yǎng)條件通過將以下成分溶解于純化的水中來制備70L的培養(yǎng)基氯化鈉3g/L ；磷酸氫二 鈉2g/L;乙酸鈉lg/L;大豆胨50g/L;葡萄糖12g/L;氯化鈣0. lg/L ；氯化鉀0. lg/L； 碳酸氫鈉0. 5g/L ；丙酮酸鹽0. lg/L ；谷氨酸鹽0. 2g/L ；金屬溶液(硫酸銅:3mg/l ；鐵氯 化物:830mg/l ；硫酸鋅:860mg/l ；硫酸1. lmg/L) :0. 5mL/L。然后加入聚丙二醇(0. 02mL/ L)。溶解后，不調節(jié)pH。滅菌后，將8g/L葡萄糖加入培養(yǎng)物。溫育溫度調節(jié)在33°C，以IOOrpm攪拌及無通 氣。在培養(yǎng)開始時用CH3COOH將pH調至6. 7。24小時后將培養(yǎng)物(培養(yǎng)物的700nm處的 0D4. 17)通過熱處理于65°C滅活35分鐘及轉移到收獲箱。一旦滅活，將培養(yǎng)物轉移到超濾 skid以分離來自培養(yǎng)基的生物質，濃縮，及用純化的水中的NaCl (9g/L)洗滌(9g/L)。收獲 的生物質等分(濃縮的細菌懸浮液的質量440g以19. Img干重量生物質/g的濃縮的細菌 懸浮液)然后于_15°C冷凍。實施例1.3 胚芽乳桿菌71. 39的培養(yǎng)初始培養(yǎng)條件通過將以下成分溶解于純化的水中來制備培養(yǎng)基氯化鈉3g/L ；磷酸氫二鈉 2g/L ；乙酸鈉:lg/L ；大豆胨50g/L ；葡萄糖:12g/L ；氯化鈣0. lg/L ；氯化鉀0. lg/L ；碳酸 氫鈉0. 5g/L;丙酮酸鹽0. lg/L;谷氨酸鹽0. 2g/L;金屬溶液(硫酸銅3mg/l ；鐵氯化 物:830mg/l ；硫酸鋅:860mg/l ；硫酸1. lmg/L) :0. 5mL/L。然后加入聚丙二醇(0. 02mL/L)。 溶解后，不調節(jié)pH。將培養(yǎng)基滅菌后，用冷凍瓶的內容物(含1. 5ml的冷凍的細菌)個別接 種小錐形瓶及于35°C溫育9小時。然后將20ml等份的此培養(yǎng)物轉移到含IOOOml的培養(yǎng)基 的更大錐形瓶中，及在相同條件下再次溫育。生長15小時后，將11錐形瓶的內容物轉移到 預發(fā)酵罐。預發(fā)酵罐中的培養(yǎng)條件通過將以下成分溶解于純化的水中來制備20L的培養(yǎng)基氯化鈉3g/L ；磷酸氫二 鈉2g/L;乙酸鈉lg/L;大豆胨50g/L;葡萄糖12g/L;氯化鈣0. lg/L ；氯化鉀0. lg/L； 碳酸氫鈉0. 5g/L ；丙酮酸鹽0. lg/L ；谷氨酸鹽0. 2g/L ；金屬溶液(硫酸銅:3mg/l ；鐵氯 化物:830mg/l ；硫酸鋅:860mg/l ；硫酸1. lmg/L) :0. 5mL/L。然后加入聚丙二醇(0. 02mL/ L)。溶解后，不調節(jié)pH。溫育溫度調節(jié)于37°C，以IOOrpm攪拌及無通氣。培養(yǎng)期間不調節(jié) pH。9小時后，將來自預發(fā)酵罐的71轉移到發(fā)酵罐。(預發(fā)酵罐培養(yǎng)9小時后700nm處的 OD = 1. 62)。將預發(fā)酵罐的培養(yǎng)物在無菌條件下轉移到發(fā)酵罐。發(fā)酵罐中的培養(yǎng)條件通過將以下成分溶解于純化的水中來制備70L的培養(yǎng)基氯化鈉3g/L ；磷酸氫二 鈉2g/L;乙酸鈉lg/L;大豆胨50g/L;葡萄糖12g/L;氯化鈣0. lg/L ；氯化鉀0. lg/L ； 碳酸氫鈉0. 5g/L ；丙酮酸鹽0. lg/L ；谷氨酸鹽0. 2g/L ；金屬溶液(硫酸銅:3mg/l ；鐵氯化物:830mg/l ；硫酸鋅:860mg/l ；硫酸1. lmg/L) :0. 5mL/L。然后加入聚丙二醇(0. 02mL/ L)。溶解后，不調節(jié)pH。滅菌后，將8g/L葡萄糖加入培養(yǎng)物。溫育溫度調節(jié)在35°C，以IOOrpm攪拌及無通 氣。M小時后，培養(yǎng)物(培養(yǎng)物的700nm處的OD = 6. 36)通過熱處理于65°C滅活35分鐘 及轉移到收獲箱。一旦滅活，將培養(yǎng)物轉移到超濾skid以分離來自培養(yǎng)基的生物質，濃縮， 及用純化的水中的NaCl (9g/L)洗滌。收獲的生物質等分(濃縮的細菌懸浮液的質量600g 以60. 7mg干重量生物質/g的濃縮的細菌懸浮液)然后于_15°C冷凍。實施例1.4 鼠李糖乳桿菌71. 38的培養(yǎng)初始培養(yǎng)條件通過將以下成分溶解于純化的水中來制備培養(yǎng)基氯化鈉3g/L ；磷酸氫二鈉 2g/L ；乙酸鈉:lg/L ；大豆胨50g/L ；葡萄糖:12g/L ；氯化鈣0. lg/L ；氯化鉀0. lg/L ；碳酸 氫鈉0. 5g/L ；丙酮酸鹽0. lg/L ；谷氨酸鹽0. 2g/L ；金屬溶液(硫酸銅3mg/l ；鐵氯化 物:830mg/l ；硫酸鋅:860mg/l ；硫酸1. lmg/L) :0. 5mL/L。溶解后，不調節(jié)pH。將培養(yǎng)基滅 菌后，用冷凍瓶的內容物(含1. 5ml的冷凍的細菌)個別接種小錐形瓶及于35°C溫育9小 時。然后將20ml等份的此培養(yǎng)物轉移到含IOOOml的培養(yǎng)基的更大錐形瓶中，及在相同條 件下再次溫育。生長15小時后，將11錐形瓶的內容物轉移到預發(fā)酵罐。預發(fā)酵罐中的培養(yǎng)條件通過將以下成分溶解于純化的水中來制備20L的培養(yǎng)基氯化鈉3g/L ；磷酸氫二 鈉2g/L ；乙酸鈉:lg/L ；大豆胨50g/L ；葡萄糖:12g/L ；氯化鈣0. lg/L ；氯化鉀0. lg/L ； 碳酸氫鈉0. 5g/L ；丙酮酸鹽0. lg/L ；谷氨酸鹽0. 2g/L ；金屬溶液(硫酸銅:3mg/l ；鐵氯 化物:830mg/l ；硫酸鋅:860mg/l ；硫酸1. lmg/L) :0. 5mL/L。然后加入聚丙二醇(0. 02mL/ L)。溶解后，不調節(jié)pH。溫育溫度調節(jié)在35°C，以IOOrpm攪拌及無通氣。培養(yǎng)期間不調節(jié) pH。9小時后，將來自預發(fā)酵罐的71轉移到發(fā)酵罐。(預發(fā)酵罐培養(yǎng)9小時后700nm處的 OD 3. 75)。將預發(fā)酵罐的培養(yǎng)物在無菌條件下轉移到發(fā)酵罐。發(fā)酵罐中的培養(yǎng)條件通過將以下成分溶解于純化的水中來制備70L的培養(yǎng)基氯化鈉3g/L ；磷酸氫二 鈉2g/L;乙酸鈉lg/L;大豆胨50g/L;葡萄糖12g/L;氯化鈣0. lg/L ；氯化鉀0. lg/L； 碳酸氫鈉0. 5g/L ；丙酮酸鹽0. lg/L ；谷氨酸鹽0. 2g/L ；金屬溶液(硫酸銅:3mg/l ；鐵氯 化物:830mg/l ；硫酸鋅:860mg/l ；硫酸1. lmg/L) :0. 5mL/L。然后加入聚丙二醇(0. 02mL/ L)。溶解后，不調節(jié)pH。滅菌后，將8g/L葡萄糖加入培養(yǎng)物。溫育溫度調節(jié)在35°C，以IOOrpm攪拌及無通 氣。后14小時培養(yǎng)物(培養(yǎng)物的700nm處的0D5. 43)通過熱處理于65°C滅活35分鐘及轉 移到收獲箱。一旦滅活，將培養(yǎng)物轉移到超濾skid以分離來自培養(yǎng)基的生物質，濃縮，及用 純化的水中的NaCl (9g/L)洗滌。收獲的生物質等分(濃縮的細菌懸浮液的質量2798g以 51. 7mg干重量生物質/g的濃縮的細菌懸浮液)然后于_15°C冷凍。實施例1.5 約氏乳桿菌103782的培養(yǎng)初始培養(yǎng)條件通過將以下成分溶解于純化的水中來制備培養(yǎng)基氯化鈉3g/L ；磷酸氫二鈉 2g/L ；乙酸鈉:lg/L ；大豆胨50g/L ；葡萄糖:12g/L ；氯化鈣0. lg/L ；氯化鉀0. lg/L ；碳酸氫鈉0. 5g/L ；丙酮酸鹽0. lg/L ；谷氨酸鹽0. 2g/L ；金屬溶液(硫酸銅3mg/l ；鐵氯化 物:830mg/l ；硫酸鋅:860mg/l ；硫酸1. lmg/L) :0. 5mL/L。然后加入聚丙二醇(0. 02mL/L)。 溶解后，不調節(jié)pH。將培養(yǎng)基滅菌后，用冷凍瓶的內容物(含1. 5ml的冷凍的細菌)個別接 種小錐形瓶及于33°C溫育10小時。然后將20ml等份的此培養(yǎng)物轉移到含IOOOml的培養(yǎng) 基的更大錐形瓶中，及再次以相同條件溫育。生長14小時后，將11錐形瓶的內容物轉移到 預發(fā)酵罐。預發(fā)酵罐中的培養(yǎng)條件通過將以下成分溶解于純化的水中來制備20L的培養(yǎng)基氯化鈉3g/L ；磷酸氫二 鈉2g/L;乙酸鈉lg/L;大豆胨50g/L;葡萄糖12g/L;氯化鈣0. lg/L ；氯化鉀0. lg/L； 碳酸氫鈉0. 5g/L ；丙酮酸鹽0. lg/L ；谷氨酸鹽0. 2g/L ；金屬溶液(硫酸銅:3mg/l ；鐵氯 化物:830mg/l ；硫酸鋅:860mg/l ；硫酸1. lmg/L) :0. 5mL/L。然后加入聚丙二醇(0. 02mL/ L)。溶解后，不調節(jié)pH。溫育溫度調節(jié)在35°C，以IOOrpm攪拌及無通氣。將培養(yǎng)物的pH 用乙酸調至5.6。M小時后，將來自預發(fā)酵罐的71轉移到發(fā)酵罐。(預發(fā)酵罐培養(yǎng)對小時 后700nm處的OD :0. 47)。將預發(fā)酵罐的培養(yǎng)物在無菌條件下轉移到發(fā)酵罐。發(fā)酵罐中的培養(yǎng)條件通過將以下成分溶解于純化的水中來制備70L的培養(yǎng)基氯化鈉3g/L ；磷酸氫二 鈉2g/L;乙酸鈉lg/L;大豆胨50g/L;葡萄糖12g/L;氯化鈣0. lg/L ；氯化鉀0. lg/L； 碳酸氫鈉0. 5g/L ；丙酮酸鹽0. lg/L ；谷氨酸鹽0. 2g/L ；金屬溶液(硫酸銅:3mg/l ；鐵氯 化物:830mg/l ；硫酸鋅:860mg/l ；硫酸1. lmg/L) :0. 5rnL/L。然后加入聚丙二醇(0. 02mL/ L)。溶解后，不調節(jié)pH。滅菌后，將8g/L葡萄糖加入培養(yǎng)物。溫育溫度調節(jié)在35°C，以IOOrpm攪拌及無 通氣。M小時后將培養(yǎng)物(700nm處的0D，0. 174)通過于70°C熱處理30分鐘來滅活及轉 移到收獲箱。一旦滅活，將培養(yǎng)物轉移到超濾skid以分離來自培養(yǎng)基的生物質，濃縮，及用 純化的水中的NaCl (9g/L)洗滌。收獲的生物質等分(濃縮的細菌懸浮液的質量61. 5g以 20. 2mg干重量生物質/g的濃縮的細菌懸浮液)然后于_15°C冷凍。實施例2細菌裂解產物實施例2.1將一等份的來自實施例1. 1的含6g的細菌干重量的發(fā)酵乳桿菌1-39 生物質解 凍到室溫，然后用純化的水稀釋至達到12g/L的細菌生物質干重量。用0. 03M氫氧化鈉進 行堿化。裂解開始時所測的PH為10. 3。然后將裂解于40°C在連續(xù)攪拌下溫育6小時。溫 育后，PH是9. 9。實施例2.2將一等份的來自實施例1. 4的含20g的細菌干重量的鼠李糖乳桿菌71. 38生物質 解凍到室溫，然后用純化的水稀釋至達到40g/L的細菌生物質干重量。用0. 03M氫氧化鈉 進行堿化。裂解開始時所測的PH為10.3。然后將裂解于40°C在連續(xù)攪拌下溫育6小時。 溫育后，PH是9. 7。實施例2.3將一等份的來自實施例1. 1的含6g的細菌干重量的發(fā)酵乳桿菌1-39 生物質解 凍到室溫，然后用純化的水稀釋至達到12g/L的細菌生物質干重量。用0. 06M氫氧化鈉進行堿化。裂解開始時所測的PH為12. 3。然后將裂解于40°C在連續(xù)攪拌下溫育6小時。溫 育后，PH是11.8。實施例2.4將一等份的來自實施例1. 1的含6g的細菌干重量的發(fā)酵乳桿菌1-39 生物質解 凍到室溫，然后用0. 2NNaCl溶液稀釋至達到12g/L的細菌生物質干重量。NaCl溶液的終濃 度是0. 15N。裂解開始時所測的pH為6. 4。然后將裂解于40°C在連續(xù)攪拌下溫育6小時。 溫育后，PH是6. 3。實施例2.5采取實施例2. 1的等份的裂解產物以持續(xù)裂解處理。以pH3. 6用HCl 25%調整體 積及然后在靜態(tài)條件在水-浴中于40°C溫育1小時。實施例2.6采取實施例2. 4的等份的裂解產物以持續(xù)裂解處理。WpH 12. 4用NaOH ION調 整體積及然后在靜態(tài)條件在水-浴中于40°C溫育1小時。實施例2.7將一等份的來自實施例1. 3的含0. 4g的細菌干重量的胚芽乳桿菌71. 39生物質 解凍到室溫，然后用純化的水稀釋至達到7g/L的細菌生物質干重量。用0. 06M氫氧化鈉進 行堿化。裂解開始時所測的PH為12.6。然后將裂解在連續(xù)攪拌下于40°C溫育2小時。溫 育后，PH是12. 4。實施例2.8將一等份的來自實施例1. 5的含0. 3g的細菌干重量的約氏乳桿菌103782生物質 解凍到室溫，然后用純化的水稀釋至達到6g/L的細菌生物質干重量。用0. 06M氫氧化鈉進 行堿化。裂解開始時所測的PH為12.5。然后將裂解物在連續(xù)攪拌下于40°C溫育2小時。 溫育后，pH是12. 3。實施例2.9將一等份的來自實施例1. 2的含0. 4g的細菌干重量的瑞士乳桿菌103146生物質 于室溫解凍，然后用純化的水稀釋至達到8g/L的細菌生物質干重量。用0. 06M氫氧化鈉進 行堿化。裂解開始時所測的PH為12.8。然后將裂解物在連續(xù)攪拌下于40°C溫育2小時。 溫育后，pH是12. 2。實施例2.10將一等份的來自實施例1. 1的含6. Sg的細菌干重量的發(fā)酵乳桿菌1-39 生物質 于室溫解凍，然后用純化的水稀釋至達到7g/L的細菌生物質干重量。用0. 08M氫氧化鈉進 行堿化。裂解開始時所測的PH為12.2。然后將裂解物在連續(xù)攪拌下于40°C溫育7小時。 溫育后，PH是12. 0。將裂解物pH用HCl調至9. 8。裂解物包含溶解的干重量(SDW) :20. 5mg/g，蛋白(Prot) :4. 9mg/g。實施例2.11將一等份的來自實施例1. 1的含6. Sg的細菌干重量的發(fā)酵乳桿菌1-39 生物質 解凍到室溫，然后用純化的水稀釋至達到7g/L的細菌生物質干重量。用0. 15M氫氧化鈉進 行堿化。裂解開始時所測的PH為13.0。然后將裂解物在連續(xù)攪拌下于40°C溫育63小時。 溫育后，PH是12. 6。將裂解物pH用HCl調至9. 9。
裂解物包含SDff 23. 7mg/g, Prot :5. Omg/g。實施例2.12將一等份的來自實施例1. 1的含98g的細菌干重量的發(fā)酵乳桿菌1-39 生物質 解凍到室溫，然后用純化的水稀釋至達到10g/L的細菌生物質干重量。用0. 08M氫氧化鈉 進行堿化。裂解開始時所測的PH為12.0。然后將裂解物在連續(xù)攪拌下于40°C溫育M小 時。溫育后，PH是11. 1。將裂解物pH用NaOH調至11.5。裂解物包含SDW :23. 7mg/g。實施例2.13將一等份的來自實施例1. 1的含39g的細菌干重量的發(fā)酵乳桿菌1-39 生物質 解凍到室溫，然后用0. 2NNaCl溶液稀釋至達到7. 6g/L的細菌生物質干重量，以產生滲透裂 解產物。裂解開始時所測的PH為4. 4。然后將細菌滲透裂解物在連續(xù)攪拌下于40°C溫育 24小時。溫育后，pH是4. 2。然后將細菌裂解產物用添加NaOH至達到0. 06N來制成堿性。 堿性裂解開始時所測的PH是10. 6。將裂解物在連續(xù)攪拌下于40°C再-溫育2. 25小時。溫 育后，PH是10. 2。實施例3裂解產物的純化實施例3.1將實施例2. 5的裂解產物以3000 Xg離心20分鐘。然后用NaOHlON將上清調至 PH 6. 8及通過空隙度0. 45 μ m及0. 2 μ m的連續(xù)過濾器，及最后用0. 22 μ m的無菌過濾器過 濾。濃縮物包含 Prot 2. 8mg/mL ；DNA :17. 4 μ g/mL。D-氨基酸百分率14. 9% D-Ala, 14. 4% D-Pro, 14. 2% D-Asp。以mg的干重量/mL的NO產率活性干重量/mL的0. 003mg/mL(Cl) 0. 03mg/ mL (C2) 0. 3mg/mL(C3) :C1 3. 3yM,C2 33. 2yM,C3 :52. 5 μ Μ。以 g/L 或 mg/mL 的活性干 重量是以g/L或mg/mL的可溶干重量減去以g/L或mg/mL的氯化物含量。實施例3.2將實施例2. 6的裂解產物以3000Xg離心20分鐘。然后將上清用HCl調至pH 7及通過空隙度0. 45 μ m及0. 2 μ m的連續(xù)過濾器，及最后用0. 22 μ m的無菌過濾器過濾。 濃縮物包含 Prot 12. 3mg/mL ；DNA :27. 7 μ g/mL。D-氨基酸百分率:15. 9% D-Ala, 24. 4% D-Pro, 17. 4% D-Asp, 45. 1% D-Ser, 10. 1% D_Met。以mg的活性干重量/mL的NO產率活性干重量/mL的0. 003mg/mL(Cl) 0. 03mg/ mL (C2) 0. 3mg/mL (C3) :C1 :8. 0 μ M，C2 :56. 0 μ Μ, C3 :94. 3 μ Μ。實施例3.3首先將300ml的實施例2. 1的裂解產物以3000 Xg離心20分鐘。將上清用HCl調 至 PH 7.1。提取物在Sartoflow slice 200 Benchtop 錯流系統(tǒng)上以 330 :350ml/分 鐘的恒流通過聚醚砜(PES)的0.45 μ m膜(Sartorius Stedim Biotech GmbH)來濃縮。產 量是75%。最后將濃縮物通過PES膜0. 2 ym(Nalgene)無菌過濾。濃縮物包含SDW 30. 0mg/g ；Prot :9. 6mg/mL ；DNA :32. 8 μ g/mL。D-氨基酸百分率 14. 3 % D-Ala, 13. 9 % D-Pro, 14. 1 % D-Asp, 36. 9 % D-Ser0 以 mg 的活性干重量 /mL 的 NO 產率活性干重量/mL 的 0. 003mg/mL(Cl) 0. 03mg/mL (C2) 0. 3mg/mL (C3) :C1 :5. 1 μ Μ, C2 :30. 0 μ Μ, C3 :64. 0 μ M0
實施例3.4將300ml的實施例2. 2的裂解產物用HCl調至pH 7. 0。如實施例3. 3中所述以 350ml/分鐘的恒流過濾提取物。產量多于75 %。將濃縮物最后通過PES膜0. 2 μ m (Nalgene) 無菌過濾。濃縮物包含SDW 49. 2mg/g ；Prot :14. 2mg/mL ；DNA :34. 1 μ g/mL。D-氨基酸百分 率16. 0% D-Ala, 13. 3% D-Pro, 14. 2% D_Asp。以mg的活性干重量/mL的NO產率活性干重量/mL的0. 003mg/mL(Cl) 0. 03mg/ mL (C2) 0. 3mg/mL (C3) :C1 :0 μ Μ, C2 :4. 1 μ Μ，C3 :26. 3 μ Μ。實施例3.5首先將300ml的實施例2. 3的裂解產物以3000 Xg離心20分鐘。將上清用HCl調 至pH7. 1。如實施例3. 3中所述以330 350ml/分鐘的恒流過濾提取物。產量多于75%。 將濃縮物最后通過PES膜0. 2 ym(Nalgene)無菌過濾。濃縮物組成由SDff 34. 5mg/g ；Prot :8. 9mg/mL ；DNA :16. 8 μ g/mL。D-氨基酸百分 率16. 4% D-Ala, 24. 3% D-Pro, 17. 3% D_Asp。以mg的活性干重量/mL的NO產率活性干重量/mL的0. 003mg/mL(Cl) 0. 03mg/ mL (C2) 0. 3mg/mL (C3) :C1 :3. 0 μ M，C2 :36. 4 μ Μ, C3 :69. 5 μ Μ。實施例3.6將1000ml的實施例2. 13的裂解產物以9384Xg離心20分鐘。上清直接通過無 菌過濾器0. 22 μ m過濾。濃縮物包含SDff 32. 7mg/g ；Prot :6. 5mg/g ；糖2. 4mg/g。糖濃度根據(jù) Herbert 等 人的方法測定(Meth. Microbiol, 1971, 5B :266et seq.)。如實施例6中所述對人外周血單核細胞(PBMC)以不同濃度進行生物活性篩選。以 0. 5mg 的活性干重量 /mL 得到的結果為 TNF-α :83pg/mL ；IL-6 :898pg/mL ；IL-12 :140pg/ mL (在有l(wèi)Ong/ml IFN- y的情況下)；及IL-10 :221pg/mL (在有IFN- γ的情況下)。實施例3.7將pH調至10. 2后，將實施例2. 10的細菌裂解產物混合物轉移到微過濾(MF)箱。 微過濾(MF)單元使用0. 45 μ m切向流過濾(TFF)過濾器(Sartocon Slice Sartorius)。 將錯流調至^OL/h m2 (LHM)及跨膜壓力(TMP)至0. 4 0. 5巴。將滲透物轉移到超濾(UF) 箱。一旦微過濾箱中的裂解產物體積已達到初始體積之一半，UF單元開始。將UF過 濾器的滲透物用作MF箱中的洗滌緩沖液。MF及UF箱的體積維持在相同水平。10膜滲濾 體積后，UF停止，及將細菌裂解產物在MF箱中濃縮?；厥盏漠a量是83%。UF箱中回收的 提取物，用HCl將pH調至7. 3，然后通過0. 2 μ m無菌過濾器過濾。濃縮物包含SDW 17. 5mg/g ；Prot 4. 3mg/g。實施例3.8將實施例2. 7的裂解產物以9384Xg離心15分鐘。然后將上清用HCl調至pH 7. 3，及通過空隙度0. 45 μ m及0. 2 μ m的連續(xù)過濾器，及最后用0. 22 μ m的無菌過濾器過
濾ο有10倍稀釋的產物的外周血單核細胞(PBMC) :777pg/mLIL-10, 26pg/mL IL-12,13183pg/mL IL-6。實施例3.9將實施例2. 8的裂解產物以9384 Xg離心15分鐘。然后將上清用HCl調至pH 7. 4 及通過空隙度0. 45 μ m及0. 2 μ m的連續(xù)過濾器，及最后用0. 22 μ m的無菌過濾器過濾。有10 倍稀釋的產物的 PBMC :904pg/mL IL_10，0pg/mL IL-12，4995pg/mL IL-6。實施例3.10將實施例2. 9的裂解產物以9384 Xg離心15分鐘。然后將上清用HCl調至pH 7. 6 及通過空隙度0. 45 μ m及0. 2 μ m的連續(xù)過濾器，及最后用0. 22 μ m的無菌過濾器過濾。有10 倍稀釋的產物的 PBMC :476pg/mL IL_10，0pg/mL IL-12,4924pg/mL IL-6。實施例3.11將實施例2. 11的裂解產物轉移到MF箱后將pH調至10. 4。TFF安裝類似于實施 例3. 7。將錯流調至^OL/h m2及TMP至0. 4 0. 5巴。10膜滲濾體積后UF停止?；厥?的產量是86%。將最終產物用HCl調至pH 7. 3。得到的濃縮物包含SDW 24. 2mg/g ；Prot :4. 8mg/g。實施例3.12將實施例2. 12的裂解產物轉移到MF箱后將pH調至11. 5。TFF安裝類似于實施 例3. 7。將錯流調至^OUh m2及TMP至0. 4巴。10膜滲濾體積后UF停止。回收的產量是 74%。將最終產物用HCl調至pH7. 2。得到的濃縮物包含SDff 32. 4mg/g ；Prot :5. 8mg/g ；糖2. 3mg/g。如實施例6中所述對人外周血單核細胞(PBMC)以不同濃度進行生物活性篩選。以 0. 5mg 的活性干重量/mL 得到的結果是 TNF-α :37pg/mL ；IL-6 :1092pg/mL ；IL-12 :81pg/ mL (在有 lOng/ml IFN-y 的情況下)；及 IL-10 :160pg/mL (在有 10ng/ml IFN-γ 的情況 下)。通過 DC 蛋白測定測量蛋白濃度(BioRad，DC Protein assay, kit no. 500-0116)。進 行微平板測定流程。待分析的樣品(0. ImL)用1. 9mL的25mM磷酸鹽緩沖液pH 11稀釋。 每次用ang BSA/ml的牛血清白蛋白溶液(BSA，Pierce ref 23210)進行測定時制備蛋白標 準曲線。BSA溶液用25mM磷酸鹽緩沖液pH 11稀釋至獲得以下濃度0. 18，0. 24，0. 3，0. 36 和0.42mg BSA/ml。將樣品(20 μ 1)及BSA標準品(20 μ 1) —式四份加入干凈的干微孔板。 將來自DC蛋白測定試劑盒的試劑加入各孔。10分鐘后，將200 μ L的試劑B加入 各孔。微孔板在旋轉板搖床上混合5秒鐘。20分鐘后于室溫記錄750nm處的吸光度。使用 蛋白標準曲線上的線性回歸的斜率計算各樣品的蛋白濃度750nm處的0D = a* (蛋白濃度)+b mg樣品中的蛋白=[20X(750nm處的 0D-b)]/a通過獲得由裂解所致的5ml的可溶級分，及將其在瓷皿中于105°C干燥至恒定質 量來測定可溶干重量(SDW)。實施例4鼠脾臟細胞體外活化通過測量鼠脾臟細胞的活化(Alamar藍測定)來體外測定本發(fā)明的實施方式的免 疫刺激效應。材料及方法脾臟細胞的刺激
AlamarBlueTM-測定設計為定量測量人或動物細胞的生長。此測定基于通過響應 由細胞生長所致的化學還原的氧化-還原(氧化還原)指示物的代謝活性的檢測合并熒光 /比色生長指示物。與生長相關，氧化還原指示物導致從氧化的(非-熒光，藍)形式至還 原的(熒光，紅)形式的變化。小鼠Balb/c小鼠(雌性，6 8周齡)從Charles River實驗室，Sulzfeld，德國 接受，及通過子宮頸脫位處死。脾臟使用研缽勻漿；細胞懸浮液通過離心O80Xg，4°C，10 分鐘)洗滌，及重懸浮于含5%FCS，100U/ml青霉素及100μ g/ml鏈霉素的5ml RPMI 1640。 將100 μ 1脾臟細胞O X 106/ml)與50 μ 1的細菌提取物稀釋液在96孔平板(Falcon 3072) 中于37°C及5% (X)2在細胞培養(yǎng)基中溫育48h。添加用培養(yǎng)基1 1 稀釋的 30 μ 1 AlamarBlueTM 溶液后，用 Fluoroskan Ascent 讀取器(ThermoLabsystems，F(xiàn)rankfurt,德國)以M4nm激發(fā)及590nm發(fā)射波長處測量 AlamarBlueTM的化學還原。測試品測試以下提取物Afer300 如實施例3. 5中所述得到的來自發(fā)酵乳桿菌I-39^(12g/L)的提取物 (31.6mg的活性干重量/g)；Cfer300 如實施例3. 3中所述得到的來自發(fā)酵乳桿菌I-39^(12g/L)的提取物 (28. 4mg的活性干重量/g)；Dfer300 如實施例2. 4中所述得到的及使用與實施例3. 3相同條件純化的來自發(fā) 酵乳桿菌I-3^9(12g/L)的提取物5mg的活性干重量/g)。將此實施例用作非-堿性 裂解的對照。ARahr300 通過用NaOH 0. 03M于40°C堿性裂解6小時得到的來自鼠李糖乳桿菌 71. 38的提取物(40g/L) (49. 3mg的活性干重量/g)；CRahr300 如實施例3. 4中所述得到的來自鼠李糖乳桿菌71. 38的提取物(40g/ L) (46. 4mg的活性干重量/g)；DRahr300 來自通過在0. 15N NaCl溶液中于40°C滲透應激6小時裂解的鼠李糖 乳桿菌71. 38的提取物(40g/L) (46. 2mg的活性干重量/g)。將此實施例用作非_堿性裂解 的對照。陰性對照蒸餾水(蒸餾水)或磷酸緩沖鹽水(PBS)。結果測定脾細胞活化的體外研究通過Alamar藍測定在2個獨立實驗中測定用提取物處理后小鼠脾臟細胞的代謝 活性增加(見圖乜及牝)。脾臟細胞在提取物的存在下培養(yǎng)48h。添加Alamar藍⑧溶液后，測量發(fā)射值。如 圖^ b中所示，細菌提取物以約1 300稀釋液有效。使用t檢驗將全部組統(tǒng)計學地與 對照組比較。表1 通過Alamar藍測定在2個獨立實驗中細菌提取物的ρ-值(見圖如及仙)。批稀釋P-值測試1P-值測試2Afer300(稀釋 1 300)0. 000016(圖 4a)0. 00016(圖 4b)Cfer300(稀釋 1 300)0. 00021(圖 4a)0. 048(圖 4b)Dfer300(稀釋 1 300)0. 00033(圖 4a)0. 00016(圖 4b)ARahrfOO(稀釋 1 300)0. 0029(圖 4a)0. 0012(圖 4b)CRahrfOO(稀釋 1 300)0. 0031(圖 4a)0. 12(圖 4b)DRahrfOO(稀釋 1 300)0. 0025(圖 4a)0. 08(圖 4b)結論通過Alamar藍測定，通過測量鼠脾臟細胞的活化來體外測定細菌提取物的免疫 刺激效應。在本文，在2個獨立實驗中，我們比較了通過滲透裂解得到的提取物(DferfOO)， 其包括完整的，粒子細胞壁成分，有根據(jù)本發(fā)明的2種提取物(AFerfOO及CFerfOO)。從發(fā)酵 乳桿菌1-39 得到那些3種提取物。八卩6『300丄？6『300，及0 6『300提取物各以1 300的 稀釋液在刺激細胞的代謝中有效。我們觀察到DFer300滲透裂解對照與Af er300及CFer300 之間無差異。我們也比較了從第二株(鼠李糖乳桿菌71. 38)獲得的3種提取物(ARahr300， CRahr300，DRahr300)。在之前的設定中，ARahr300及CRahr300在本發(fā)明的范圍內，而DRahr 是滲透裂解對照。在本文，ARahrfOO提取物在2個獨立測定中以1 300的稀釋液有效， 然而CRahrfOO及DRahrfOO提取物在2個測定之一以相同稀釋顯示更弱的但顯著的刺激。 在比較全部6種提取物的結果中，其也呈現(xiàn)，發(fā)酵乳桿菌1-39 提取物在刺激脾臟細胞生 長中相比鼠李糖乳桿菌71. 38提取物更有效。實施例5通過骨髓-來源的巨噬細胞產生氧化氮通過測量由鼠骨髓-來源的巨噬細胞的氧化氮(NO)產生測試本發(fā)明的一系列實 施方式的免疫刺激潛力。材料及方法將6-周齡雄性C57/BL6小鼠(6周齡雄性，SPF質量，Charles Rivier，F(xiàn)R)通過 CO2吸入處死。將來自后軀附件的臀部，股骨，及脛骨除去。通過切割兩端部分后通過骨注 射Dulbecco改良的fegle培養(yǎng)基(DH)來從腔提取骨髓。洗滌后，將干細胞重懸浮00000 細胞/mL)于補充了 20%馬血清及30% 細胞上清的DH培養(yǎng)基。將細胞懸浮液在溫育 器中于37°C在8% CO2及濕度-飽和的氣氛下溫育8天。然后用冰-冷PBS使巨噬細胞離 壁，洗滌及重懸浮于補充了 5%胎牛血清(FCS)，氨基酸及抗生素(DHE培養(yǎng)基)的DH培養(yǎng) 基。將細胞密度調至700000細胞/mL。將提取物的水溶液直接在微孔板中，在DHE培養(yǎng)基 中連續(xù)稀釋。本發(fā)明的提取物以一式三份測試，及各微孔板包含培養(yǎng)基作為陰性對照。各 孔中的最終體積是100 μ L0將100 μ L的細胞懸浮液加入稀釋的提取物，及將細胞在溫育器 中，于37°C，在8% CO2及濕度-飽和的氣氛下溫育22小時。溫育期末，將100 μ L的上清轉 移到另一微孔板，及通過運行Griess反應來測定各上清中產生的亞硝酸鹽濃度。將100 μ L的2. 5%磷酸水溶液中的Griess試劑(5mg/ml的磺胺+0. 5mg/ml的N_(l_萘基)乙烯-二 胺鹽酸鹽)加入各孔。用分光光度計(SpectraMax加，分子裝置)相對690nm處的參照，在 562nm處讀取微孔板。亞硝酸鹽濃度正比于形成的氧化氮含量。基于亞硝酸鈉的標準曲線 (1 70 μ M NaNO2)測定亞硝酸鹽含量。結果作為平均值士標準偏差以μ M氧化氮(NO) 給出，及標繪為劑量應答曲線。測試品測試以下提取物第一測定0P0701B4_CFer300 如實施例3. 3中所述得到的來自發(fā)酵乳桿菌I_3^9(12g/L) 的提取物；0P0701B4_Dfer300 如實施例2. 4中所述得到的及使用與實施例3. 3相同條件純 化的來自發(fā)酵乳桿菌1-39 (12g/L)的提取物。將此實施例用作非-堿性裂解的對照。0P0701B4_CRahr300 如實施例3. 4中所述得到的來自鼠李糖乳桿菌71. 38的提取 物(40g/L)。0P0701B4_DRahr300 通過在0. 15N NaCl溶液中于40°C滲透應激6小時得到的來 自鼠李糖乳桿菌71. 38的提取物(40g/L)。將此實施例用作非-堿性裂解的對照。第二測定0P0701C_10G0. 5P4H 來自與 0. 037M NaOH 于 40°C溫育 4 小時的 10g/L 的生物質 干重量的發(fā)酵乳桿菌1-39 的提取物。0P0701C_10G1P4H 來自與0. 075M NaOH于40°C溫育4小時的10g/L的生物質干 重量的發(fā)酵乳桿菌1-39 的提取物。0P0701C_10G2P4H 來自與0. 150M NaOH于40°C溫育4小時的10g/L的生物質干 重量的發(fā)酵乳桿菌1-39 的提取物。0P0701C_10G1P21H 來自與 0. 075M NaOH 于 40°C溫育 21 小時的 10g/L 的生物質 干重量的發(fā)酵乳桿菌1-39 的提取物。0P0701C_10G0. 5P21H 來自與 0. 037M NaOH 于 40°C溫育 21 小時的 10g/L 的生物 質干重量的發(fā)酵乳桿菌1-39 的提取物。0P0701C_10G2P21H 來自與 0. 150M NaOH 于 40°C溫育 21 小時的 10g/L 的生物質 干重量的發(fā)酵乳桿菌1-39 的提取物。0P0701C_10G2P45H 來自與 0. 150M NaOH 于 40°C溫育 45 小時的 10g/L 的生物質 干重量的發(fā)酵乳桿菌1-39 的提取物。第一測定結果在第一測定中(圖fe)，根據(jù)本發(fā)明從堿性裂解獲得的提取物觀察到與從滲透裂 解獲得的提取物具有相同活性。我們也觀察到，免疫刺激活性與選定的株相關。從發(fā)酵乳桿菌1-39 獲得的提取 物相比從鼠李糖乳桿菌78. 31株獲得的提取物誘導更大NO2及NO3產率。第二測定結果在第二測定中(圖恥)，我們觀察到，提取物的體外活性關聯(lián)于裂解的初始條 件。顯示以下細菌提取物的對于相同株發(fā)酵乳桿菌1-39 ，及對于相同量IOg的生物質干重量 /L 的裂解物的活性:0P0701C_10G0. 5P4H, 0P0701C_10G1P4H, 0P0701C_10G2P4H, 0P0701C_10G1P21H, 0P0701C_10G0. 5P21H, 0P0701C_10G2P21H,及 0P0701C_10G2P45H。體外 活性依賴于NaOH的初始濃度及裂解的持續(xù)時間。結論這些實驗結果顯示，盡管通過堿性處理產生的化學修飾，實施方式的活性相比通 過滲透裂解得到的對照提取物或相比相應活細菌未降低(就此方面見以下實施例6)。實施例6促炎和抗炎活性的體外篩選為就它們的體外免疫刺激或抗-炎癥潛力篩選本發(fā)明的實施方式，對一系列細菌 提取物在人PBMC上進行測試。測量了 IL12p70(炎癥細胞因子)及ILlO(抗-炎癥細胞因 子)兩者的釋放，及報道了 IL-10/IL-12比，如R)ligne等人所述(World J Gastroenterol 2007January 14 ；13(2) :236-243)。目的旨在比較在經不同提取/純化方法得到的一系列6種提取物上的IL_12p70 及IL-10的產生。對于各提取物得到的IL-10/IL-12p70比可與提取物的抗炎潛力相關。使 用活細菌作為對照，相對其比較提取物的活性OX 107CfU/ml的發(fā)酵乳桿菌1-39 )。材料及方法將6種細菌提取物的分級的量在lOng/ml的IFN- γ的存在下稀釋于細胞培養(yǎng)基， 細胞因子已知增強IL-12p70的產生，以lmg/ml的初始劑量(所測的最高最終劑量)起始。 測試從健康供體血分離的PBMC作為lOOng/ml lmg/ml的活性干重量提取物的系列稀釋液。裂解產物或活細菌株的至少3小時之前將IFN-Y加入培養(yǎng)基中。報道來自2個 獨立實驗的數(shù)據(jù)。人PBMC的制備從外周血分離PBMC。簡言之，F(xiàn)icoll 梯度離心(Pharmacia，Uppsala, Sweden) 后，收集單核細胞，在 RPMI 1640 培養(yǎng)基(Live technologies, Paisley, Scotland)中洗 滌，及在補充了慶大霉素(150yg/mL)，L-谷氨酰胺QmMoL/L)，及10 %胎牛血清(FCS) (Gibco-BRL)的 RPMI 1640 中調至 2 X IO6 細胞 /mL。細胞因子的誘導將PBMC(2X IO6細胞/mL)接種于M孔組織培養(yǎng)板(Corning，NY)。如上所述刺 激細胞。在有5% CO2的空氣氣氛中于37°C刺激M小時后，收集培養(yǎng)上清，通過離心澄清 及保存于_20°C，直到細胞因子分析。使用對IL-10及IL-12p70的pharmingen抗體對(BD Biosciences, San Jose, Ca，美國)，根據(jù)生產商的建議通過ELISA測量細胞因子。測試品0P0701C_10G2P45H(A)來自于 40°C與 0. 15M NaOH 共存 45 小時的 IOg 的生物質 干重量/L的裂解物的發(fā)酵乳桿菌1-39 裂解物的提取物。0P0701C_10G1P4H(B)來自于 40°C與 0. 075M NaOH 共存 4 小時的 IOg 的生物質干 重量/L的裂解物的發(fā)酵乳桿菌1-39 裂解物的提取物。0P0701C_5G4P21H(C)來自于 40°C與 0. 300M NaOH 共存 21 小時的 5g 的生物質干 重量/L的裂解物的發(fā)酵乳桿菌1-39 裂解物的提取物。0P0701C_40G0. 5P4H(D)來自于 40°C與 0. 037M NaOH 共存 6 小時的 40g 的生物質干重量/L的裂解物的發(fā)酵乳桿菌1-39 裂解物的提取物。0P0701B4_CFerl50 (E)如實施例3. 1中所述得到的來自發(fā)酵乳桿菌1_3擬9 (12g/ L)的提取物0P0701B4_BFer300(F)來自于 40°C與 0. 075M NaOH 共存 6 小時的 6g 的生物質干 重量/L的裂解物的發(fā)酵乳桿菌1-39 裂解物的提取物。發(fā)酵乳桿菌1-39 ，于_80°C以2X107cfu/ml在20%甘油中冷凍的活細菌。結果此測試的目的旨在比較本發(fā)明的實施方式與活乳桿菌株的體外免疫刺激或 抗-炎癥潛力。為分析不同提取物及活細菌，比較從PBMC釋放的各細胞因子IL-10及IL-12 的量，以及IL10/IL12比。如果IL-10或IL-12濃度中的任一個，或兩個值，接近于非-刺激的水平(即， 10pg/ml以下)，比不被認為可計算，及標記為N. C.(非-計算的值)。從PBMC獲得的以pg/ml表示的結果顯示于表2和3。在IFNy的存在下，將比較本發(fā)明的6種細菌提取物(提取物A 提取物F)與活 形式的發(fā)酵乳桿菌Ox IO7細菌/ml，作為活樣品1及活樣品2所測兩次)的對人PBMC的 效果(以Pg/ml的ILlO及IL12p70應答)。僅對100 μ g/ml及l(fā)mg/ml的提取物劑量報道 比例 IL10/IL12。表2 人PBMC中細菌提取物的體外促炎(免疫刺激)或抗-炎癥(免疫調節(jié))潛 力。
ABCDEFILlO (+IFNy)lmg/ml14610899953961549100 μ g/ml323211211066IL12(+IFNy )lmg/ml8781947748100 μ g/ml111015916211IL10/IL12(+IFNy )lmg/mlN. C.14.03N. C.10. 1712. 4911.40100 μ g/mlN. C.2. 11N. C.2. 050. 650. 52N. C.非可計算的值在IFN γ的存在下，比較本發(fā)明的6種提取物(提取物A 提取物F)與活形式的 發(fā)酵乳桿菌OXlO7細菌/ml，作為活樣品1及活樣品2所測兩次)對人PBMC的效果(IL10及IL12p70應答，以pg/ml)。僅對100 μ g/ml及l(fā)mg/ml的提取物劑量報道比例IL10/IL12。表3 在人PBMC中活發(fā)酵乳桿菌株1-39 的體外促炎(免疫刺激)或抗-炎癥
(免疫調節(jié))潛力。
權利要求
1.一或多種乳桿菌屬細菌株的提取物，其中所述提取物是可溶性提取物，及其中所述 提取物包括化學修飾的細菌分子。
2.權利要求1的提取物，其中所述化學修飾的細菌分子產生自將一或多種乳桿菌屬細 菌株暴露于堿性培養(yǎng)基。
3.權利要求1或2的提取物，其中所述提取物在受試者中具有免疫調節(jié)活性。
4.權利要求3的提取物，其中所述提取物在受試者中具有免疫刺激活性。
5.權利要求3的提取物，其中所述提取物在受試者中具有抗-炎癥活性。
6.權利要求1 5中任一項的提取物，其中所述一或多種乳桿菌株包括下列的一或多 禾中發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum),鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus), 1$^ LIf lif (Lactobacillus plantarum),lif (Lactobacillus johnsonii), Jfnf i L If lif (Lactobacillus helveticus), zF If lif defensis(Lactobacillus casei defensis)，干酪乳桿菌屬干酪種(Lactobacillus casei ssp. casei)，副干酪乳桿菌 (Lactobacillus paracasei),保力口禾丨J亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus),畐汗酪乳 tf lif (Lactobacillus paracasei), BfStILff lif (Lactobacillus acidophilus),桿菌(Lactobacillus reuteri)，唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)，乳酸乳桿菌 (Lactobacillus lactis),, ^! ^lif (Lactobacillus delbrueckii)。
7.權利要求1 6中任一項的提取物，其中所述一或多種乳桿菌屬細菌株包括下列 的一或多種發(fā)酵乳桿菌1-3929，鼠李糖乳桿菌71. 38，胚芽乳桿菌71. 39，約氏乳桿菌 103782，及瑞士乳桿菌103146。
8.權利要求1 7中任一項的提取物，其中所述提取物中下列的一或多種被外消旋化 至少10% 天冬氨酸，谷氨酸，絲氨酸，組氨酸，丙氨酸，精氨酸，酪氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨 酸，及賴氨酸。
9.權利要求1 8中任一項的提取物，其中所述提取物在人外周血單核細胞中能達到 可計算的IL10/IL12比，所述比等于或大于由得到所述提取物的活乳桿菌株達到的ILlO/ IL12 比。
10.權利要求1的提取物，其中所述提取物在哮喘鼠受試者中，相對于哮喘非-處理的 對照，降低嗜酸性粒細胞細胞數(shù)，嗜中性粒細胞細胞數(shù)，淋巴細胞細胞數(shù)，或任何它們的組 合至少1.5倍。
11.制備權利要求1的提取物的方法，包括(a)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)一或多種乳桿菌屬細菌株；(b)將各乳桿菌屬細菌株暴露于堿性培養(yǎng)基；及(c)處理步驟(b)的產物以除去不溶性物及顆粒物。
12.權利要求11的方法，其中步驟(c)通過切向流過濾進行。
13.權利要求11或12的方法，其中將各乳桿菌屬細菌株暴露于大于9.0的pH對于化 學修飾細菌分子而言是足夠的。
14.權利要求11，12或13的方法，還包括在部分(b)之后及部分(c)之前以小于4.5 WpH處理各株。
15.權利要求11 14中任一項的方法，其中所述化學修飾包括將提取物中下列的一或 多種外消旋化至少10% 天冬氨酸，谷氨酸，絲氨酸，組氨酸，丙氨酸，精氨酸，酪氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，及賴氨酸。
16.營養(yǎng)組合物，其包括權利要求1 10中任一項的提取物、或根據(jù)權利要求11 15 中任一項制備的提取物。
17.藥物組合物，其包括權利要求1 10中任一項的提取物、或根據(jù)權利要求11 15 中任一項制備的提取物。
18.降低與選自呼吸系統(tǒng)病癥，過敏性病情，尿道病癥，及消化病癥的至少一種病情相 關的至少一種癥狀的方法，包括給受試者施用治療有效量的權利要求1 15中任一項的提 取物、或權利要求的16或17的組合物。
19.權利要求18的方法，其中所述呼吸系統(tǒng)病癥選自上和下肺部感染，鼻咽炎，鼻竇 炎，咽炎，扁桃體炎，喉炎，氣管炎，喉咽炎，流感，肺炎，支氣管肺炎，及有急性惡化的阻塞性 肺部疾病。
20.權利要求18的方法，其中所述過敏性病情選自過敏性鼻炎，過敏性哮喘，及特應 性皮炎。
21.權利要求18的方法，其中尿道病癥選自尿道炎，腎小管-間質性腎炎，阻塞性腎 盂腎炎，包括慢性膀胱炎的膀胱炎，包括前列腺炎及慢性前列腺炎的雄性骨盆疼痛綜合征， 前列腺膀胱炎，及雌性骨盆炎癥疾病。
22.權利要求18的方法，其中所述消化病癥選自克羅恩病及腸易激綜合征。
23.權利要求18的方法，其中所述受試者是人或家畜。
24.權利要求1 15中任一項的提取物或權利要求16或17的組合物作為用于降低與 選自呼吸系統(tǒng)病癥，過敏性病情，尿道病癥，及消化病癥的至少一種病情相關的至少一種癥 狀的藥物的用途。
25.權利要求1 15中任一項的提取物或權利要求16或17的組合物作為免疫調節(jié)劑 的用途。
26.分離的微生物株，發(fā)酵乳桿菌1_3擬9。
27.提取物，其從權利要求25的株獲得。
28.權利要求沈的提取物，其中所述提取物是可溶性提取物。
全文摘要
本發(fā)明包括來自乳桿菌屬細菌的提取物，其可在受試者中產生免疫調節(jié)效應。本發(fā)明的實施方式可使用，例如，作為用于治療疾病的營養(yǎng)劑或藥物或作為醫(yī)學治療中的佐劑，例如與抗-炎或促炎細胞因子的產生的不平衡相關的那些。本發(fā)明的提取物可有用的病情包括感染，過敏，自身免疫病癥，及發(fā)炎，或作為在受試者中提供健康益處的佐劑。本發(fā)明也特別包括制備及使用所述提取物的方法。本發(fā)明也涉及特定乳桿菌屬細菌株。
文檔編號A61K35/74GK102143756SQ200880130960
公開日2011年8月3日 申請日期2008年9月4日 優(yōu)先權日2008年9月4日
發(fā)明者C·夏瓦洛利, J·A·鮑爾, J-P·L·維格魯, L·L·G·沙爾維, M·薩爾瓦尼 申請人:Om藥物公司