專利名稱：重組失活病毒載體疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于預(yù)防和治療疾病，尤其禽類疾病的技術(shù)，更具體地，涉及含失活病毒載體和可藥用媒介物、佐劑或賦形劑的重組疫苗，所述載體具有插入的編碼蛋白的外源核苷酸序列，所述蛋白具有疾病的抗原活性。
背景技術(shù)：
眾所周知，抗病毒性病原體的疫苗都是從相應(yīng)病毒配制的，所述相應(yīng)病毒被分離出來，用于產(chǎn)生疫苗，通過多樣化的配制劑給動物或人施用。一方面，有些疫苗制品采用在野生環(huán)境顯示低致病性的完整活病毒制成，或者采用經(jīng)實(shí)驗(yàn)室減毒后致病性減弱的病毒制成，它們被給藥后，引起的抗原反應(yīng)足以提供抗高致病性的相同種病毒株的保護(hù)作用。例如，新城疫(ENC)就是由病毒引起的，傳染性很強(qiáng)，而且可能致死。該病感染家禽和野生禽類，引起高發(fā)病率和死亡率。ENC由副粘病毒科(Paramyxoviridae)禽副粘病毒屬(Avulavirus)的病毒引起。這些毒株根據(jù)其致病性和毒力強(qiáng)弱劃分為輕毒型 (lentog6nicas)，中等毒力型(mesogenicas)和強(qiáng)毒型(velog6nicas)，分別是低、中、高致病性(Office International des Epizooties (2008). Newcastle Disease. OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines forTerrestrial Animals. Office International des Epizooties. France, p.576-589)。ENC病毒有多種傳播來源。例如，經(jīng)由肝臟或死禽以及它們的產(chǎn)物或副產(chǎn)物 (subproductos)直接傳播，或者經(jīng)由諸如受感染的昆蟲或其它動物、包括人類等載體進(jìn)行間接傳播。引起高死亡率的強(qiáng)毒型ENC病毒(VVENC)的潛伏時間約為21天，顯示呼吸道癥狀和/或神經(jīng)癥狀，如呼吸困難(jadeo)，打噴嚏(estornudo)以及共濟(jì)失調(diào) (incoordinacion) ,MM^jt (alas erizadas) ,ΙΙ Ι δ (arrastre de las patas), ^5] 曲(cabeza, cuello torcidos)，抽搐(tics)，中心移位(desplazamientos en circulos)， 抑郁(cbpresi0n)，無欲(inapetencia)，以及徹底癱瘓(parcilisis completa)。此外，卵的生成被部分地或徹底地中斷，形成不成形的卵或有薄薄的粗糙卵殼，內(nèi)有含水清蛋白?？刂坪皖A(yù)防ENC的策略之一是應(yīng)用活病毒(virus activos)疫苗，通常由輕毒株制得?？笶NC的活疫苗誘導(dǎo)出呼吸道粘膜處的保護(hù)作用，并已產(chǎn)業(yè)化超過50年。這些活病毒疫苗主要是基于應(yīng)用來自Hitchner Bl和LaSota株的輕毒型病毒，后者是最常用的疫苗 (Op. Cit. , Office International desEpizooties(2008)Newcastle)。然而，因活病毒可被乳液中的一些成分滅活，乳化后的活疫苗的穩(wěn)定性是有限的。 故而，它們常常用在其它類型的配制劑中，或者，它們通過原位混合來遞送，這導(dǎo)致它們在大規(guī)模養(yǎng)禽場很難予以應(yīng)用?；畈《镜闹饕獑栴}在于，它們具有較高的遺傳變異能力，與其它活病毒重組，或者可能改變它們的致病特性，如流感病毒，因此它們并不總是能夠用作疫苗。流感是能感染哺乳動物和鳥類的呼吸道疾病。流感病毒株在特定人群中的出現(xiàn)可能導(dǎo)致個體(包括家禽、 人類、或其它哺乳動物)的嚴(yán)重后果。當(dāng)該病毒感染家養(yǎng)的母雞和哺乳動物時，它們快速發(fā)生變化以使得自己適應(yīng)這個新的群體，在該適應(yīng)性進(jìn)化過程中，可能在同一病毒內(nèi)引起重大的生物學(xué)改變，導(dǎo)致宿主和動物或人群的致命后果。具體地，禽流感(IA)是一種強(qiáng)傳染性病毒流行病，由正粘病毒科的甲型病毒引起。大多數(shù)IA病毒(VIA)都已從野生禽類中分離得到，尤其是水禽，它們起到攜帶并蓄積低致病性IA病毒(VIABP)的作用。當(dāng)這些病毒感染非天然宿主，如家禽，主要是鶉雞類(gallinaceaeM即，母雞，火雞，和鵪鶉等)時，它們在適應(yīng)過程中突變?yōu)楦咧虏⌒问?(VIAAP)。VAI可根據(jù)兩種病毒外膜蛋白進(jìn)行分類。第一種是血凝素，是最重要的蛋白，因?yàn)樗诒桓腥净虮唤臃N的禽體內(nèi)負(fù)責(zé)與中和抗體反應(yīng)，已報道了 16種不同的亞型或血清型。 第二種蛋白是神經(jīng)氨酸酶，已報道了 9種不同亞型。具體地，對于禽類來說，最重要的病毒是那些具有血凝素血清型H5和H7的病毒，當(dāng)它們突變?yōu)楦咧虏⌒詴r，能引起接近100%的
死亡率。同樣地，禽類中的IA疾病有兩種臨床形式第一種是低致病性禽流感(IABP)，它引起輕微的疾病，有時表現(xiàn)出羽毛損壞，產(chǎn)卵量降低。但是，IA對于禽類的重要性占主導(dǎo)地位的，因?yàn)樵摬《揪哂休^高的突變能力，總是引起第二種臨床形式，變?yōu)楦咧虏⌒郧萘鞲?(IAAP)，引發(fā)接近100%的死亡率。具體地，IA臨床癥狀是多樣化的，受所涉病毒的亞型、致病性、免疫狀態(tài)以及被感染的禽物種的影響。VIAAP潛伏期為21天，有多種臨床癥狀結(jié)膜炎(conjuntivitis)， 以羽毛直立為特征的升溫，抑郁，虛脫(postratWn)和死亡。最常提及的損傷是肺充血 (congestion pulmonar),出血(hemorragias)禾口水月中(edemas)。一旦VIA進(jìn)入家禽飼養(yǎng)所，就可通過糞便和呼吸道飛沫向該環(huán)境排菌。病毒向其它禽類的傳播和擴(kuò)散主要是通過直接接觸受染禽類的分泌物，尤其是被污染的糞便，食物， 水，器材和衣物。該疾病的易感性和臨床表現(xiàn)非常多樣化。對于這類難以控制、而且當(dāng)用藥過程中失控可能導(dǎo)致活病毒疫苗對動物甚至人類健康產(chǎn)生危險的疾病而言，優(yōu)選應(yīng)用失活病毒的疫苗，通常是經(jīng)乳化的?，F(xiàn)有技術(shù)已開發(fā)了數(shù)種疫苗來預(yù)防多種病毒性疾病，如上述IA。對于這后一種疾病，已有經(jīng)乳化的含IA全病毒的疫苗，是從雞胚制得的。該病毒已被滅活，在水-油中乳化， 以便經(jīng)皮下或肌肉途徑施用給商用禽類(Officelnternational des Epizooties (2008). Avian influenza. OIE Manual of DiagnosticTest and Vaccines for Terrestrial Animals, Office International des EpizootiesFrance, p.465-481)。更具體地，用失活的IA病毒制得的疫苗在全身刺激出強(qiáng)免疫應(yīng)答，對控制全部兩種IA形式都有積極效果。該免疫接種被用于預(yù)防該疾病的臨床癥狀，以及可能地話，減少受染禽類向環(huán)境排毒。病毒排出的減少降低了病毒從接種后又被感染的禽類向未被感染過白勺胃胃白勺豐/H (Swayne, D, y Kapczynski, D (2008), Vaccines, Vaccination and Immunology for avianinfluenza viruses in poultry. In Avian Influenza. Ed by David Swayne. BlackwellPublishing, USA, p.407-451)。此外，經(jīng)過乳化的失活病毒疫苗穩(wěn)定性增加，能更好地管理疫苗，并延長疫苗的貨架期。因此，ENC疫苗已被配制為乳化的失活病毒。重要的考慮是，活病毒疫苗與失活病毒疫苗之間的一個主要區(qū)別是用藥后實(shí)現(xiàn)抗原反應(yīng)所需的病毒量。由于活病毒具有在細(xì)胞中復(fù)制自身的完整能力，疫苗中所需相關(guān)病毒的量低于引起抗原反應(yīng)的劑量，這避免了接種疫苗的個體產(chǎn)生不適，考慮到病毒能天然復(fù)制，一旦進(jìn)入機(jī)體，能達(dá)到實(shí)現(xiàn)所需抗原反應(yīng)的量。另一方面，失活病毒需要比活病毒更高的病毒濃度，通常至少高10-倍，才能達(dá)到相同的抗原活性，因?yàn)檫@種病毒經(jīng)過處理去掉了它的復(fù)制能力，致使施用疫苗時必需有足以引起免疫應(yīng)答的抗原總量，因?yàn)樵摍C(jī)體不能正常地復(fù)制該病毒，病毒量不會增加。另外，生物技術(shù)領(lǐng)域最重大的進(jìn)步之一是重組疫苗的應(yīng)用。在基因水平分離并剪接(或重組)生物的特定DNA片段，利用載體或DNA質(zhì)粒將所述片段轉(zhuǎn)移到另外的生物中， 產(chǎn)生抗原，從而誘導(dǎo)保護(hù)性抗體的生成，這樣的能力導(dǎo)致研發(fā)出新的疫苗。與傳統(tǒng)疫苗不同，重組技術(shù)給諸如IA等因?yàn)楦咄蛔兡芰Χ荒軕?yīng)用活病毒、以及完整失活病毒的應(yīng)用總是會因滅活操作不當(dāng)而引起風(fēng)險的這類疾病帶來非常重要的利好?；罨闹亟M疫苗插入了表達(dá)抗目標(biāo)疾病的抗原的必需核苷酸后，可以在具有低致病性的活病毒載體中安全地施用，以誘導(dǎo)呼吸道粘膜局部的免疫力，這在非重組的活病毒情形下是不可能實(shí)現(xiàn)的，因?yàn)橛邢嚓P(guān)風(fēng)險。重組疫苗的另一好處是，所用的病毒載體通常不對應(yīng)于保護(hù)作用要針對的疾病，這有利于它們用于獸醫(yī)診斷和預(yù)防技術(shù)領(lǐng)域以區(qū)分接種過的動物和被感染的動物， 艮口所謂 DIVA (Capua，I et al. , "Development of a DIVA (differentiating infected from vaccinated animals)strategy using a vaccinecontaining a heterologous neuraminidase for the control of avian influenza". Avian Pathology 32(1) pp. 47-55)。可是，目前用于控制IA的疫苗(在油中乳化，完整的失活病毒)和控制其它類似疾病的疫苗防止了由VIAAP引起的死亡，但不能避免VIA在禽類中感染和復(fù)制，因此，僅部分地實(shí)現(xiàn)了減少排毒和病毒傳播。因此，本領(lǐng)域已從低致病性疾病如新城疫中研發(fā)出了病毒載體，其中插入了編碼難于控制的疾病如禽流感的抗原性位點(diǎn)的基因，例如Ge，Deng，Tianet al. "Newcastle disease virus-based live attenuated vaccine completely protectschickens and mice",J.Vir. Vol. 81,No. l，p. 150-158”披露的活化重組疫苗。具體地，該文獻(xiàn)披露了用帶有禽流感亞型H5W基因的LaSota毒株進(jìn)行臨床試驗(yàn)的結(jié)果。才目胃令頁 白勺 — i ■ : Park, Man Seong et al. "Engineered viral vaccineconstructs with dual specificity :Avian Influenza and Newcastle disease". PNASVo 1. 103, No. 21, May 12，2006p. 8203-8208。該文獻(xiàn)涉及增加禽流感基因表達(dá)的技術(shù)，這種技術(shù)在后文稱“錨定”。雖然由于上述優(yōu)勢導(dǎo)致一些重組疫苗替代了活病毒疫苗，但重組疫苗尚未實(shí)現(xiàn)失活的全病毒疫苗的優(yōu)勢，而且重要的是，它們還未能針對插入的外源基因提供正確的免疫力，這主要是由于，諸如上述新城疫加流感這樣的重組疫苗，它們引起抗兩種疾病的抗原活性，但要求對插入載體中的外源抗原性位點(diǎn)有更多的接觸。結(jié)果是，人們繼續(xù)研發(fā)新技術(shù)， 如錨定技術(shù)，其利用遺傳修飾，在上述流感的情況下，在所述病毒載體中得到了更好的抗原表達(dá)。但這樣的技術(shù)尚未取得完全的成功。
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因此，來自活病毒的重組疫苗通常用比來自活病毒的非重組疫苗高出大約10倍的所用病毒載體濃度來配制，以便達(dá)到合適的目標(biāo)微生物抗原性位點(diǎn)暴露量。同樣地，重組疫苗尚未用于失活形式中，因?yàn)檫@可能意味著病毒載體的濃度要比正常病毒所需濃度高出100倍(比重組活病毒高出10倍)，這在產(chǎn)業(yè)方面會非常復(fù)雜。結(jié)果是，總體上，這些重組活病毒疫苗從未被作為乳液來用，因?yàn)槠浞€(wěn)定性有限，而且因?yàn)槿橐涸谶@方面沒有優(yōu)勢，這歸因于活病毒載體的活性特征。綜上可知，目前非常需要通過重組技術(shù)、以安全且有效的方式提供的、具有較高的穩(wěn)定性、合適的控制和效力結(jié)果的抗多樣化疾病的疫苗。發(fā)明簡述研發(fā)本發(fā)明過程中意外發(fā)現(xiàn)，當(dāng)疫苗包含重組失活的病毒載體，其中插入編碼目標(biāo)疾病之抗原性位點(diǎn)的外源核苷酸序列；且疫苗還包含可藥用的經(jīng)乳化的媒介物、佐劑或賦形劑時，用與基于相同病毒載體的重組活病毒疫苗所需滴度相似的病毒載體滴度，提供抗該目標(biāo)疾病的預(yù)期保護(hù)作用。在本發(fā)明一個實(shí)施方案中，所述外源核苷酸序列選自抗流感(influenza)，傳染性喉氣管炎(laringotraqueitis infecciosa)，7I專染f生支氣管炎(bronquitisinfecciosa), 法氏囊感染(infeccion de la bolsa de Fabricio，Gumboro)，月干炎(hepatitis)，病毒性鼻氣管炎(rinotraqueitis viral)，流行性感冒(corizainfecciosa)，豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae),巴斯德氏菌病(pasterelosis)，豬呼吸生殖綜合征 (Sindrome Reproductivo y RespiratorioPorcino, PRRS),環(huán)狀病毒(circovirus),博德特氏菌病(bordeteliosis)，副流感病毒(parainfluenza)的抗原位點(diǎn)序列，或，具有能插入相應(yīng)病毒載體中的大小的任何其它抗原。優(yōu)選地，采用選自禽流感(influenza aviar), 喉氣管炎，傳染性支氣管炎，法氏囊感染(Gumboro)，肝炎，PRRS，和環(huán)狀病毒的抗原。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述外源核苷酸序列由編碼禽流感病毒血凝素(HA) 的基因組成，其選自這種流感病毒的16種血凝素亞型或免疫原性變體，更優(yōu)選編碼所述蛋白的Hl，H2，H3，H5，H6，H7或H9亞型中的至少一種。在本發(fā)明一具體實(shí)施方案中，所述H5基因得自Mexican禽流感病毒亞型H5N2，或得自亞洲起源的亞型H5m，觀察到對這兩種亞型的非常好的保護(hù)作用，抵抗由VIAAP亞型 H5N2所致的死亡率。就本發(fā)明的病毒載體而言，在優(yōu)選實(shí)施方案中，新城疫病毒(Newcastledisease virus, rNDV)對應(yīng)于具有插入的外源核苷酸序列的病毒載體，所述病毒載體優(yōu)選選自以下疫苗株，如 LaSota，Ulster, QV4, Bi, CA 2002，Roakin, Komarov, Clone 30，或 VGGA 株，或來自新城疫遺傳組I至V的株。優(yōu)選地，所述重組病毒是LaSota株(rNDV/LS)。同樣地，在另一具體實(shí)施方案中，所述病毒載體是腺病毒，該腺病毒選自禽和豬的腺病毒，更優(yōu)選來自禽腺病毒9型(rFAdV/9)和豬腺病毒5型(rSAdV/5)。根據(jù)下文詳述的結(jié)果可知，借助本發(fā)明，能夠用位于病毒載體中的編碼目標(biāo)疾病之特異性抗原決定簇的外源核苷酸序列，在乳液或在其它可藥用佐劑中產(chǎn)生重組的失活病毒疫苗。用本發(fā)明的疫苗(rNDV/LS_H5)所得的結(jié)果是意外的，因?yàn)閭鹘y(tǒng)上認(rèn)為，在病毒載體中重組疫苗的情形下，所述病毒載體在宿主細(xì)胞中的復(fù)制要求重組蛋白的足夠表達(dá)來刺激合適的免疫應(yīng)答，但是，在本發(fā)明中，所得結(jié)果顯示，目標(biāo)疾病的抗原性蛋白在載體病毒表面足量且正確地表達(dá)，并且它僅存在于失活形式中，這使得能產(chǎn)生抗所述目標(biāo)疾病的合適的抗原性和保護(hù)性反應(yīng)。具體地，在高致病性和難于控制的疾病如禽流感中，本發(fā)明重組疫苗的一個優(yōu)勢在于，不使用完整病毒，從而減少了疫苗病毒不當(dāng)失活引起爆發(fā)流行的風(fēng)險。而且，本發(fā)明的疫苗在禽類的呼吸道粘膜實(shí)現(xiàn)了局部免疫應(yīng)答，在全身也實(shí)現(xiàn)了免疫應(yīng)答，能通過特定的實(shí)驗(yàn)室測試區(qū)分禽類與完整病毒(用作疫苗的病毒或野生型病毒)接觸引起的免疫應(yīng)答，代表了流行病學(xué)領(lǐng)域的重要進(jìn)展。所述疫苗被配制成皮下用藥；但任何系統(tǒng)性途徑如肌肉或皮內(nèi)給藥也可以成功應(yīng)用。優(yōu)選給所述疫苗應(yīng)用液體媒介物，更優(yōu)選應(yīng)用油包水乳液，但也能成功應(yīng)用其它的免疫應(yīng)答佐劑或調(diào)節(jié)劑。用本發(fā)明的重組疫苗能減少野生型病毒向環(huán)境的排毒，從而大大減少病毒的傳播。


本發(fā)明各個新方面考慮的特征具體如權(quán)利要求所述。但是，本發(fā)明的疫苗，及其另外的目標(biāo)和優(yōu)勢，將從以下一些具體實(shí)施方式
的詳細(xì)描述、并結(jié)合附圖而很好地理解。在附圖中圖1顯示實(shí)施例6A的死亡率結(jié)果(M)和發(fā)病率指數(shù)(IM)，是用強(qiáng)毒型ENC病毒 (VVENC)進(jìn)行攻擊得到的。圖2顯示實(shí)施例6A的死亡率結(jié)果(M)和發(fā)病率指數(shù)(IM)，是用高致病性IA病毒 (VIAAP)亞型H5N2進(jìn)行攻擊得到的。圖3顯示實(shí)施例6B的死亡率結(jié)果(M)和發(fā)病率指數(shù)(IM)，是用VVENC進(jìn)行攻擊得到的。圖4顯示實(shí)施例6B的死亡率結(jié)果(M)和發(fā)病率指數(shù)(IM)，是用VIAAP亞型H5N2 進(jìn)行攻擊得到的。圖5顯示實(shí)施例6C的死亡率結(jié)果(M)和發(fā)病率指數(shù)(IM)，是用VVENC進(jìn)行攻擊得到的。圖6顯示實(shí)施例6C的死亡率結(jié)果(M)和發(fā)病率指數(shù)(IM)，是用VIAAP亞型H5N2 進(jìn)行攻擊得到的。圖7顯示實(shí)施例6D的死亡率結(jié)果(M)和發(fā)病率指數(shù)(IM)，是用VVENC進(jìn)行攻擊得到的。圖8顯示實(shí)施例6D的死亡率結(jié)果(M)和發(fā)病率指數(shù)(IM)，是用VIAAP亞型H5N2 進(jìn)行攻擊得到的。發(fā)明詳述研發(fā)本發(fā)明過程中意外發(fā)現(xiàn)，當(dāng)疫苗包含失活的病毒載體，其中插入編碼目標(biāo)疾病的核苷酸序列；且疫苗還包含可藥用媒介物、佐劑或賦形劑時，用與基于相同病毒載體的活病毒疫苗所需滴度相似的病毒載體滴度，提供抗該目標(biāo)疾病的預(yù)期保護(hù)作用。本發(fā)明的一個基本點(diǎn)是，所述病毒載體是失活的，失活是指，所述重組病毒起病毒載體的作用、并含有編碼目標(biāo)疾病的抗原性位點(diǎn)的核苷酸序列，它失去了復(fù)制特性。失活是通過本領(lǐng)域已知的物理或化學(xué)方法實(shí)現(xiàn)的，優(yōu)選用甲醛或beta-丙內(nèi)酯進(jìn)行化學(xué)滅活(Office International des Epizooties(2008). Newcastle Disease. OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for TerrestrialAnimals. Office International des Epizooties. France, p. 576-589)。相反，活病毒是指保持其復(fù)制能力。所述病毒載體，優(yōu)選選自腺病毒或巴拉米哥病毒(paramixovirus)的那些，已失活且插入了編碼目標(biāo)疾病的至少一種抗原性位點(diǎn)的外源核苷酸序列，優(yōu)選至少一種選自流感，傳染性喉氣管炎，傳染性支氣管炎，法氏囊感染(Gumboro)，肝炎，病毒性鼻氣管炎，流行性感冒，肺炎支原體，巴斯德氏菌病，豬呼吸生殖綜合征(PRRQ，環(huán)狀病毒，博德特氏菌病， 副流感病毒的抗原性位點(diǎn)，或任何其它具有能插入相應(yīng)病毒載體的大小的抗原。更優(yōu)選地， 可以采用選自禽流感，喉氣管炎，傳染性支氣管炎，法氏囊感染(Gumboro)，肝炎，PRRS，和環(huán)狀病毒的抗原。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述外源核苷酸序列由編碼禽流感病毒血凝素(HA) 的基因組成，其選自該流感病毒的16種血凝素亞型或免疫原性變體，更優(yōu)選編碼所述蛋白的Hl，H2, H3, H5, H6, H7或H9亞型中的至少一種。就本發(fā)明的病毒載體而言，在優(yōu)選實(shí)施方案中，新城疫病毒(rNDV)對應(yīng)于具有插入的外源核苷酸序列的病毒載體，所述病毒載體優(yōu)選選自以下疫苗株，如LaSota，Ulster, QV4, Bi, CA 2002，Roakin, Komarov, Clone 30，VGGA 株，或來自新城疫遺傳組 I 至 V 的株。 優(yōu)選地，所述重組病毒是LaSota株(rNDV/LS)。同樣地，在另一具體實(shí)施方案中，所述病毒載體是腺病毒，該腺病毒選自禽和豬的腺病毒，更優(yōu)選來自禽腺病毒9型(rFAdV/9)和豬腺病毒5型(rSAdV/5)。就抗原性位點(diǎn)而言，當(dāng)流感是目標(biāo)疾病時，優(yōu)選對應(yīng)于禽流感血凝素(HA)蛋白的抗原性位點(diǎn)，優(yōu)選得自禽流感病毒的基因，且編碼現(xiàn)有16種亞型中的任一種，優(yōu)選H5，H7和 H9，優(yōu)選編碼亞型H5，其優(yōu)選得自Bive，435 *Viet(VT)株，如下述。在這方面可以指出， 編碼HA亞型H5的基因來源病毒株并非本發(fā)明的關(guān)鍵，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)表明，任何病毒株都能提供用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的遺傳物質(zhì)。就優(yōu)選的基因來源而言，值得一提的是，來自Bive株的H5基因?qū)?yīng)于1994年在墨西哥從嫩雞生物標(biāo)本分離出的VIABP-H5N2，墨西哥政府將其鑒定為(A/chi cken/ Mexico/232/CPA) ο 該病毒株已被"Secretaria de Agricultura, Ganaderia, Desarrollo Rural, Pesca y AlimentacWn (SAGARPA) ”批準(zhǔn)用于大規(guī)模生產(chǎn)乳化的失活疫苗，因此，用目標(biāo)基因?qū)υ摬《具M(jìn)行重組也確保了本發(fā)明重組疫苗的安全性。第二優(yōu)選的遺傳物質(zhì)是H5-435基因，它來自2005年在墨西哥從嫩雞生物標(biāo)本分離出的 VIABP-H5N2。本發(fā)明疫苗的病毒載體可以如下制得對目標(biāo)核苷酸序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從起始病原體的分離物鑒定出抗原性位點(diǎn)，將其插入所述病毒載體(優(yōu)選選自腺病毒或巴拉米哥病毒)，在該載體中擴(kuò)增。所述插入用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)，如限制酶和DNA連接酶等來實(shí)現(xiàn)。根據(jù)所述病毒載體，將所得感染性克隆引入用于制備該重組病毒的細(xì)胞系。根據(jù)病毒載體的特性，使所述病毒在任何合適的生長系統(tǒng)中復(fù)制，如SFP雞胚，或市售細(xì)胞系，或?yàn)榕囵B(yǎng)病毒而特別設(shè)計的系統(tǒng)。
實(shí)現(xiàn)抗原性反應(yīng)所需的病毒濃度優(yōu)選是102-10%150% /ml，這取決于所用的病毒載體，一旦達(dá)到該濃度，就將病毒滅活。優(yōu)選地，所述滅活通過本領(lǐng)域已知的物理或化學(xué)方法來進(jìn)行，優(yōu)選用甲醛或beta-丙內(nèi)酯進(jìn)行化學(xué)滅活。本發(fā)明疫苗的可藥用媒介物優(yōu)選含水的溶液或乳液。更優(yōu)選采用油包水乳液媒介物。疫苗的具體配制取決于所用的病毒載體、以及所插入的外源核苷酸序列。但在優(yōu)選實(shí)施方案中，當(dāng)病毒載體是新城疫病毒時，優(yōu)選劑量為Io4-IokiDIEPSo^ /ml。在以腺病毒作為病毒載體的實(shí)施方案中，優(yōu)選劑量為102-108DIEP50% /ml。就疫苗給藥而言，優(yōu)選在禽的脖子背面中部皮下給藥。本發(fā)明的疫苗對家禽施用， 如嫩雞，母雞，種雞，火雞，斗雞，珍珠雞，鷓鴣，鵪鶉，鴨，鵝，天鵝或鴕鳥。優(yōu)選地，所述疫苗皮下施用，但在一些物種中，可以對任何年齡的禽類進(jìn)行肌肉給藥。當(dāng)所述疫苗乳化在新城疫載體中對小雞給藥時，該疫苗優(yōu)選含有108-1(ΛΠΕΡ50% /0. 5ml/小雞，更優(yōu)選108 5DIEP50% /0. 5ml/小雞。對10日齡的小雞很可以容易地實(shí)施接種。本發(fā)明提供了非常重要的競爭性優(yōu)勢。本發(fā)明的重組失活疫苗使得有可能僅僅用病毒載體中的、插入了來自難以控制的致病生物的基因的重組疫苗就建立起接種計劃，這導(dǎo)致了將受感染的動物與僅接種疫苗的動物區(qū)分開來(DIVA)的方法，其可以有效用于疾病的控制和根除，該方法包括a)對至少一個接受了失活病毒載體的重組疫苗的動物，取至少一份樣品進(jìn)行第一種抗體檢測方法，其中所述病毒載體具有插入的編碼致病病原體之抗原的外源核苷酸序列，以檢測所述樣品中是否存在對應(yīng)于所述抗原的抗體；b)對已取樣進(jìn)行第一種抗體檢測的同一動物，取至少一份樣品進(jìn)行第二種抗體檢測方法，以檢測所述樣品中是否存在對應(yīng)于引起該疾病的病原體的抗體；c)根據(jù)第一和第二種抗原檢測方法的結(jié)果，確定所述動物是被感染了還是被接種了。例如，當(dāng)病原體難以控制，如VIA，主要是H5和H7，在家禽中引起高死亡率時，用本發(fā)明的重組失活疫苗可以實(shí)現(xiàn)非常優(yōu)秀的系統(tǒng)性保護(hù)作用，并具有較高的生物安全性，是與使用IA全病毒、但又未正確滅活的情形下引起重大風(fēng)險相比。這種風(fēng)險在大規(guī)模生產(chǎn)或病毒的過程中將增加。本發(fā)明還能在流行病學(xué)水平區(qū)分接種的禽類與其它那些暴露于全病毒的禽類(DIVA系統(tǒng))，因?yàn)楫?dāng)僅僅插入禽流感病毒血凝素(HA)基因時，用于檢測抗該禽流感的被疫苗誘導(dǎo)的抗體的實(shí)驗(yàn)室測試是血凝抑制(HI)?，F(xiàn)有的免疫學(xué)測試，如ELISA以及其它測試如瓊脂凝膠擴(kuò)散等，在檢測本發(fā)明重組疫苗誘導(dǎo)的抗禽流感抗體時都是陰性，因?yàn)樗鼈儽辉O(shè)計為檢測由全病毒中其它抗原誘導(dǎo)的抗體。當(dāng)被本發(fā)明的重組疫苗接種過的禽類被野生病毒感染時，這些測試對于抗禽流感的抗體檢測是陽性的，從而可以區(qū)分出被感染的禽類。相應(yīng)地，本發(fā)明允許建立僅僅使用失活的和活的重組疫苗的聯(lián)合項目，前者將產(chǎn)生上述系統(tǒng)性免疫力，而重組活疫苗將補(bǔ)充粘膜水平的免疫力，最終產(chǎn)生的保護(hù)作用等于或接近于100%野生水平。在該項目中，也用到了上述DIVA系統(tǒng)。在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，乳化失活疫苗的重組載體是插入了流感基因的新城疫，用于VVENC和VIAAP兩種攻擊，可以同時施用具有相同載體和抗原的活疫苗，直接施用到呼吸道粘膜，通過經(jīng)眼途徑、噴霧、或在飲用水中來施用，使得局部應(yīng)答水平被大大刺激 (在呼吸道和消化道粘膜)，產(chǎn)生分泌型免疫球蛋白A(IgA)，從而顯著減少野生型病毒復(fù)制，因此顯著減少其排毒和傳播。另一方面，本發(fā)明的疫苗允許建立控制計劃，有可能通過區(qū)分被接種的禽類和被感染的禽類而實(shí)現(xiàn)根除，因?yàn)楫?dāng)施用本發(fā)明的重組失活疫苗時，有可能將被接種的禽類與被野生型病毒感染的禽類區(qū)分開來(DIVA系統(tǒng))，由于重組疫苗僅含VIA血凝素作為抗原， 允許應(yīng)用諸如ELISA這樣的診斷性測試，其檢測被其它病毒抗原誘導(dǎo)的抗體，而不僅僅是被血凝素誘導(dǎo)的抗體。本發(fā)明抗流感的重組疫苗用以下的具體實(shí)施例進(jìn)行更清楚的舉例說明，但這些實(shí)施例僅用于舉例的目的，不對本發(fā)明進(jìn)行限制。實(shí)施例實(shí)施例1產(chǎn)生新城疫-LaSota載體為了克隆新城疫病毒LaSota株基因組并因此制備病毒載體，先制得中間載體 “pNDV/LS”。用三唑法提取新城疫LaSota株的病毒總RNA。用此前純化的總RNA作為模板，從所述病毒基因組的純化RNA合成cDNA (互補(bǔ)DNA)。為了克隆新城疫基因組的所有基因(15，183堿基對(bp))，用PCR擴(kuò)增7種具有“重疊”末端和粘性限制性位點(diǎn)的片段。片段 1 (Fl)包含核苷酸(nt) 1-1755，F(xiàn)2 包含 nt 1-3321，F(xiàn)3 包含 nt 1755-6580，F(xiàn)4 包含 6， 151-10,210, F5 包含 nt 7，381-11，351，F(xiàn)6 包含 11，351-14，995，F(xiàn)7 包含 nt 14,701-15, 186。在克隆化載體pGEM-T中用標(biāo)準(zhǔn)連接技術(shù)裝配所述7種片段，以此重建新城疫LaSota 基因組，其經(jīng)過該克隆后僅具有單個限制性位點(diǎn)hell，位于P基因和M基因之間，起到將任何目標(biāo)基因克隆至該載體病毒區(qū)域的作用。實(shí)施例2從VIA亞型Η5Ν24!35株435克隆HA基因用三唑法提取病毒總RNA，以便克隆VIA 435株的HA基因。然后用該純化的總RNA 合成cDNA (互補(bǔ)DNA)，并通過PCR技術(shù)用特異性寡核苷酸擴(kuò)增IA病毒的HA基因。接著用標(biāo)準(zhǔn)克隆化技術(shù)將435的HA基因插入pGEM-T載體，得到質(zhì)粒p-GEMT_435。實(shí)施例3克隆帶有pNDV/LS載體的SacII位點(diǎn)的IA 435HA基因以制得質(zhì)粒pNDV/LS_435L 制得中間載體 pSacIIGE/GS 構(gòu)建中間載體pSacIIGE/GS，以便在HA 435基因的5，端引入新城疫的轉(zhuǎn)錄序列 GE/GS，方法是，以新城疫基因組為模板對GE/GS序列進(jìn)行PCR初始擴(kuò)增，然后將這些序列插入 pGEM-T。B.將HA基因亞克隆至p&icIIGE/GS載體中質(zhì)粒pGEMT_4;35用Hpal-Ndel消化后，克隆至pSacIIGE/GS中，得到質(zhì)粒 pSacIIGE/GS-HA435。C.將 GE/GS-HA435 亞克隆至 pNDV-LS 載體中兩種質(zhì)粒PSacIIGE/GS-HA435和pNDV/LS都用SacII消化，將消化產(chǎn)物純化，將 GE/GS-HA435區(qū)純化并插入pNDV/LS的SacII位點(diǎn)，得到感染性克隆pNDV/LS_435。
實(shí)施例4在細(xì)胞培養(yǎng)中制得重組病毒rNDV/LS_HA435Hep-2和A-549細(xì)胞最初用MAV-7病毒以感染復(fù)數(shù)(MOI)為1的水平進(jìn)行感染。 在37°C 5% CO2的環(huán)境中保溫1小時后，細(xì)胞用pNDVLS-435克隆的1微克(μ g)DNA、以及來自表達(dá)質(zhì)粒pNP，pP和pL (分別編碼病毒蛋白P，NP和L，它們是在上述兩種細(xì)胞中產(chǎn)生重組體所需要的)的0.2yg DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染12小時后，收獲這兩種細(xì)胞中產(chǎn)生的重組病毒，注射到10日齡SPF雞胚中，以擴(kuò)增所得病毒。48小時后，收獲尿囊液，在平板上用 Vero細(xì)胞進(jìn)行滴定，由此產(chǎn)生最終的重組病毒，用于制備疫苗。如上述制得具有來自Bive和Viet株的基因的重組病毒。實(shí)施例5用具有禽流感病毒H5插入子的新城疫LaSota重組病毒rNDV/LS_H5生產(chǎn)乳化失活疫苗的方法產(chǎn)?？乖瓘纳a(chǎn)育種開始，不含特異性病原體(SPF)的雞胚受精卵用預(yù)定的感染劑量接種。將胚在37°C保溫72小時，每日檢查死亡率。該階段之后，將活胚冷藏1天，優(yōu)選M小時，無菌收獲羊水(FAA)。離心使FAA澄清，用甲醛滅活，也可以用任何其它已知常用于制備這種疫苗的滅活劑。對FAA進(jìn)行測試，以確認(rèn)其被滅活，并確認(rèn)其純度、無菌性、DIEP滴度和HA滴度。制備乳液將疫苗制成油包水乳液。在油相中用礦物油和表面活性劑Span 80和Tween 80。 為制備水相，將FAA與保存液(硫柳汞)混合。為制備乳液，通過恒定攪拌將所述水相緩緩加入所述油相。用勻漿器或膠體磨碎機(jī)達(dá)到特定的粒徑。抗原含量配制疫苗，產(chǎn)生最小量108 5DIEP50% /0. 5ml,以便使用0. 5ml/禽的劑量。按照上述方法，制得6種重組疫三種有新城疫LaSota株載體(rNDV/LQ并具有 IA病毒的HA錨(稱為Rd)，另三種具有相同載體但無錨(稱為Re)；將Rd和Re基因組分別用三種不同的HA基因克隆，得到6種疫苗1. H5-Bive 基因得自 VIABP 亞型 H5N2 株(A/chicken/Mexico/232/CPA)，是 1994 年在墨西哥從嫩雞生物學(xué)標(biāo)本中分離的，對應(yīng)于由SAGARPA批準(zhǔn)用于生產(chǎn)乳化失活疫苗的
病毒株。2. H5-435基因得自VIAAP亞型H5N2的分離，是2005年在墨西哥從嫩雞生物學(xué)標(biāo)本中分離的。435株與Bive株在血凝抑制(HI)實(shí)驗(yàn)顯示不同的抗原特性，以及在核苷酸測序中的重要變化。3. H5-Vt基因從越南分離，對應(yīng)于IA病毒亞型H5W的H5基因。實(shí)施例5A按照實(shí)施例5所述方法制得乳化失活的重組實(shí)驗(yàn)性疫苗，其在(rNDV/LQ載體中具有錨(Rd)和H5-Bive基因，該疫苗被配成水/油藥物制劑，稱為EmiRd-Bive。實(shí)施例5B按照實(shí)施例5所述方法制得乳化失活的重組實(shí)驗(yàn)性疫苗，其在(rNDV/LQ載體中具有錨(Rd)和H5-435基因，該疫苗被配成水/油藥物制劑，稱為EmiRd-435。實(shí)施例5C按照實(shí)施例5所述方法制得乳化失活的重組實(shí)驗(yàn)性疫苗，其在(rNDV/LQ載體中具有錨和H5-Vt基因，該疫苗被配成水/油藥物制劑，稱為Emi Rd-Vt0實(shí)施例5D按照實(shí)施例5所述方法制得乳化失活的重組實(shí)驗(yàn)性疫苗，其在(rNDV/LQ載體中不具有錨(Rd)和H5-Bive基因，該疫苗被配成水/油藥物制劑，稱為Emi Re-Bive0實(shí)施例5E按照實(shí)施例5所述方法制得乳化失活的重組實(shí)驗(yàn)性疫苗，其在(rNDV/LQ載體中不具有錨(Rd)和H5-435基因，該疫苗被配成水/油藥物制劑，稱為EmiRe-435。實(shí)施例5F按照實(shí)施例5所述方法制得乳化失活的重組實(shí)驗(yàn)性疫苗，其在(rNDV/LS)載體中不具有錨和H5-Vt基因，該疫苗被配成水/油藥物制劑，稱為EmiRe-Vt。實(shí)施例6ENC-LaSota載體中重組疫苗的體內(nèi)效力評價，所述載體有和無針對IA病毒HA基因的錨為確定本發(fā)明乳化重組失活疫苗的效力，并證實(shí)這些效力可以用IA病毒不同抗原亞型和變體的不同克隆化血凝素基因?qū)崿F(xiàn)，測試了這些疫苗阻止IAAP病毒亞型H5N2和 VVENC在SPF禽中、以及在具有抗VIA和ENCV的母體免疫力的市售嫩雞中引起死亡的效力。在測量疫苗效力的不同攻擊實(shí)驗(yàn)中用到的病毒株如下1.禽流感(VIAAP-H5N2)高致病性病毒亞型 H5N2，A/chicken/ Queretaro/14588-19/95 株，滴度 108 CIDIEP50% /ml，等同于 100DLP50% /0. 3ml/ 小雞。2. VVENC 病毒Chimalhuacan 株含 108 CIDIEP50 % /ml,等同于 106_5DIEP50 % /0. 03ml/ 小雞。在INIFAP-CENID-Microbiologia的丙烯酸隔離單元(生物安全性水平為3)中， 對35日齡小雞(-DPV-接種后21天)進(jìn)行攻擊。為進(jìn)行所述攻擊，每個實(shí)驗(yàn)組進(jìn)一步分為兩個亞組，按事先確立的生物安全性程序，將每個亞組分配至相應(yīng)隔離單元。VIAAP-H5N2用PBS pH 7. 2進(jìn)行1 10稀釋，每只小雞在每只眼施用0. 06ml (2 滴)，并在每個鼻孔施用0. 09ml (3滴)，相當(dāng)于0. 3ml或100DLP50%。每只雞經(jīng)眼部給予VVENC病毒進(jìn)行攻擊，用的是0. 03ml病毒懸液，其含 108 5DIEP50% /ml，等同于 106 5DLP50% / 禽。為進(jìn)行攻擊后(PD)評估，所有組每日進(jìn)行檢查以記錄死亡率和發(fā)病率，包括臨床癥狀嚴(yán)重程度，對每個組的每一只雞在每個PD日(DPD)進(jìn)行監(jiān)控，按照表1的標(biāo)準(zhǔn)給它們分配一個數(shù)值表1-死亡率和發(fā)病率記錄值
權(quán)利要求
1.重組疫苗，包含病毒載體和可藥用媒介物、佐劑或賦形劑，其特征在于，所述病毒載體是失活的，且具有插入的編碼目標(biāo)疾病之抗原的外源核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1的重組疫苗，進(jìn)一步地特征在于，所述外源核苷酸序列編碼選自下組的抗原流感，傳染性喉氣管炎，傳染性支氣管炎，法氏囊感染(Gumboro)，肝炎，病毒性鼻氣管炎，流行性感冒，豬肺炎支原體，巴斯德氏菌病，豬呼吸生殖綜合征(PRRS)，環(huán)狀病毒，博德特氏菌病或副流感病毒。
3.權(quán)利要求2的重組疫苗，進(jìn)一步地特征在于，所述外源核苷酸序列由編碼禽流感病毒血凝素(HA)的基因組成。
4.權(quán)利要求3的重組疫苗，進(jìn)一步地特征在于，所述編碼血凝素(HA)的基因選自禽流感病毒血凝素(HA)亞型Hl，H2，H3，H5，H6，H7或H9中的至少一種。
5.權(quán)利要求4的重組疫苗，進(jìn)一步地特征在于，所述編碼血凝素(HA)的基因是H5亞型。
6.權(quán)利要求1的重組疫苗，進(jìn)一步地特征在于，所述病毒載體選自腺病毒或巴拉米哥病毒。
7.權(quán)利要求6的重組疫苗，進(jìn)一步地特征在于，所述病毒載體選自巴拉米哥病毒。
8.權(quán)利要求7的重組疫苗，進(jìn)一步地特征在于，所述巴拉米哥病毒是新城疫病毒。
9.權(quán)利要求8的重組疫苗，進(jìn)一步地特征在于，所述新城疫病毒選自LaSota，Ulster, QV4，B1，CA 2002, Roakin, Komarov, Clone 30，或 VGGA 毒株，或來自新城疫遺傳組 I 至 V 的毒株。
10.權(quán)利要求6的重組疫苗，進(jìn)一步地特征在于，所述病毒載體選自腺病毒。
11.權(quán)利要求10的重組疫苗，進(jìn)一步地特征在于，所述腺病毒選自禽或豬的腺病毒。
12.權(quán)利要求11的重組疫苗，進(jìn)一步地特征在于，所述腺病毒是禽腺病毒9型。
13.權(quán)利要求11的重組疫苗，進(jìn)一步地特征在于，所述腺病毒是豬腺病毒5型。
14.權(quán)利要求1的重組疫苗，進(jìn)一步地特征在于，所述疫苗的可藥用媒介物優(yōu)選含水溶液或乳液。
15.權(quán)利要求14的重組疫苗，進(jìn)一步地特征在于，用水-油乳液作為媒介物。
16.權(quán)利要求1的重組疫苗，進(jìn)一步地特征在于，所述病毒載體的所需滴度類似于重組活病毒疫苗的所需滴度。
17.權(quán)利要求16的重組疫苗，進(jìn)一步地特征在于，實(shí)現(xiàn)抗原反應(yīng)所需的病毒濃度是 102-101CIDI50% /ml。
18.權(quán)利要求7的重組疫苗，進(jìn)一步地特征在于，實(shí)現(xiàn)抗原反應(yīng)所需的病毒濃度是 104-101CIDIEP50% /ml。
19.權(quán)利要求18的重組疫苗，進(jìn)一步地特征在于，當(dāng)所述疫苗被制備為對雞用藥時，所述病毒濃度為 108-109DIEP50% /0. 5ml/ 雞。
20.權(quán)利要求19的重組疫苗，進(jìn)一步地特征在于，所述疫苗具有1085DIEP50% /0. 5ml/雞。
21.權(quán)利要求10的重組疫苗，進(jìn)一步地特征在于，實(shí)現(xiàn)抗原反應(yīng)所需的病毒濃度是 102-108DIEP50% /ml。
22.權(quán)利要求1的重組疫苗，進(jìn)一步地特征在于，實(shí)現(xiàn)抗原反應(yīng)所需的病毒濃度是，所述疫苗被制備為皮下用藥或肌肉用藥的疫苗。
23.免疫接種以抵抗動物疾病的方法，其特征在于，包括對動物施用重組疫苗，所述疫苗包含失活的病毒載體，其中插入了編碼所述疾病的抗原的外源核苷酸序列。
24.權(quán)利要求23的免疫接種以抵抗動物疾病的方法，進(jìn)一步地特征在于，還對所述動物施用另一種重組疫苗，所述疫苗包含與所述失活的病毒載體相同但已活化的病毒載體， 其具有插入的編碼所述疾病之抗原的外源核苷酸序列。
25.可用于控制和根除疾病的鑒定被感染的動物和被接種的動物的方法，包含a)對至少一個接受了失活病毒載體的重組疫苗的動物，取至少一份樣品進(jìn)行第一種抗體檢測方法，其中所述病毒載體具有插入的編碼致病病原體之抗原的外源核苷酸序列，以檢測所述樣品中是否存在對應(yīng)于所述抗原的抗體；b)對已取樣進(jìn)行第一種抗體檢測的同一動物，取至少一份樣品進(jìn)行第二種抗體檢測方法，以檢測所述樣品中是否存在對應(yīng)于引起該疾病的病原體的抗體；c)根據(jù)第一和第二種抗體檢測方法的結(jié)果，確定所述動物是被感染了還是被接種了。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種疫苗，其包含失活的病毒載體和可藥用媒介物、佐劑或賦形劑，該載體中插入了編碼目標(biāo)疾病的外源核苷酸序列，所述疫苗通過用與基于相同病毒載體的活病毒疫苗所需滴度相似的病毒載體滴度來提供抗所述目標(biāo)疾病的預(yù)期保護(hù)作用。主要地，本發(fā)明描述了巴拉米哥病毒或腺病毒的病毒載體。
文檔編號A61K39/145GK102281896SQ200880132687
公開日2011年12月14日 申請日期2008年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月19日
發(fā)明者B.洛扎諾-杜伯納德, D.薩法蒂-米茲拉西, E.索托-普里安特, J.A.蘇亞雷斯-馬丁內(nèi)茲, M.J.蓋伊-古蒂雷茲 申請人:阿維-梅克斯實(shí)驗(yàn)室公司