專利名稱：：一種雙黃連液體制劑及其含量測定方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于中藥領域，具體涉及一種雙黃連液體制劑及其含量測定方法。
背景技術：
：雙黃連液體制劑為金銀花、連翹和黃茶經提取精制而得，主要含有黃芩苷、連翹苷、綠原酸、木犀草苷、漢黃芩素等?，F代藥理研究證明，雙黃連液體制劑具有抗菌、抗病毒、解熱等作用，可以清熱解毒，清宣風熱，適用于外感風熱引起的發(fā)熱、咳嗽、咽痛等病癥。臨床上被廣泛用于治療病毒及細菌感染的上呼吸道感染、肺炎、扁桃體炎、咽炎等。然而，隨著雙黃連液體制劑在臨床上的廣泛應用，其不良反應的報道也屢見不鮮。雙黃連液體制劑的不良反應主要表現在過敏性休克、皮膚潮紅、皮滲等。因此，需要研究解決雙黃連液體制劑在使用過程中引起的過敏問題，從而確定更加安全的雙黃連液體制劑的配方。另外，為了保證雙黃連液體制劑的質量，還需要提供更加高效的有效成分含量檢測方法。目前廣泛使用的方法是《中國藥典》2005年版一部記載的方法。該方法采用高效液相色譜法分別測定綠原酸、連翹苷和黃茶苷含量，且在每一種成分的測定中，使用不同的色譜條件。例如，在檢測黃茶苷時，使用的流動相是甲醇-水-冰醋酸(50:50:1);使用的檢測波長為274nm;并要求按黃芩苷峰計算，色譜柱的理論塔板數不低于1500。再如在檢測綠原酸時，使用的流動相是甲醇-水-冰醋酸(20:80:1);使用的檢測波長為324nm;并要求按綠原酸峰計算，色譜柱的理論塔板數不低于6000。另外，在檢測連翹苷時，使用的流動相是乙腈-水(25:75);使用的檢測波長為278nm;并要求按連翹苷峰計算，色譜柱的理論塔板數不低于6000。由此可見，現有技術中為了檢測綠原酸、連翹香和黃茶苷的含量，使用了3套不同的色譜條件，這顯然增加了檢測工作量，延長了檢測時間，增加了檢測成本。另外，現有技術中的檢測方法通常只檢測黃茶苷、連翹香和綠原酸的含量，而不檢測另外兩種有效成分木犀草苷和漢黃茶素的含量。
發(fā)明內容在雙黃連液體制劑所含的有效成分中，綠原酸既是抗病毒、抗菌的有效成分，也是可疑的致敏原性物質，進入機體后可能會導致過敏反應。另外，黃茶和連翹提取物中的皂苦成分在大劑量應用的情況下，也易引起過敏反應。為了盡量避免和減少雙黃連液體制劑引起的過敏反應，需要控制其中的綠原酸、黃茶苷和連翹苷的含量。因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種有效成分配比更加合理的雙黃連液體制劑。本發(fā)明的另一個目的是提供一種可以同時檢測雙黃連液體制劑中多種有效成分含量的方法。為了實現上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用了如下的技術方案一種雙黃連液體制劑，其中含有連翹苷0.1-1.0mg/ml、黃茶苷6.0-12.0mg/ml、綠原酸0.4-1.Omg/ml。根據本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方案，本發(fā)明的雙黃連液體制劑中含有連翹苷0.1-0.8mg/ml、黃茶苷6.0-10.0mg/ml、綠原酸0.4-1.0mg/ml。該實施方案提供的雙黃連液體制劑為一種注射液。根據本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方案，本發(fā)明的雙黃連液體制劑中含有連翹苷0.3-1.0mg/ml、黃蒼香8.0-12.0mg/ml、綠原酸0.6-1.0mg/ml。該實施方案提供的雙黃連液體制劑為一種口服液。根據本發(fā)明的又一種優(yōu)選實施方案，本發(fā)明的雙黃連液體制劑中還含有木犀草苷0.005-0.05mg/ml、漢黃茶素0.05-0.2mg/ml。一種雙黃連液體制劑的含量測定方法，該方法使用高效液相色譜作為檢測系統(tǒng)，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，理論塔板數按綠原酸峰計算，應不低于2000，以乙腈-0.2%磷酸溶液為流動相，其中乙腈為流動相A,0.2%磷酸溶液為流動相B，纟全測波長為270-290nm,其中包括柱平衡、上樣、洗脫等步驟，在洗脫步驟中，流動相A的體積百分比逐漸遞增，先用體積百分比為27%的A相和73%的B相作為流動相洗脫2-4個柱體積；然后用體積百分比為30%的A相和70%的B相作為流動相洗脫1-3個柱體積；4妄著用體積百分比為60%的A相和40%的B相作為流動相洗脫2-4個柱體積；再用體積百分比為90%的A相和10%的B相作為流動相洗脫3-5個柱體積。本發(fā)明提供的雙黃連液體制劑含有適量的綠原酸、黃芩苷和連翹苷，不僅具有理想的治療效果，而且還同時降低了過敏反應的發(fā)生。根據本發(fā)明的檢測方法，只需要使用一種流動相，就可以同時檢測黃荅苷、連翹普、綠原酸、木犀草苷和漢黃芩素等五種有效成分的含量。該方法不僅顯著提高了檢測效率，而且還有效地降低了檢測成本。具體實施方式實施例11)金銀花提取物的制備稱取金4艮花，加水溫浸2-3次，過濾，濃縮，醇沉，過濾，濾液回收乙醇至無乙醇味，加入膏重2-6倍量的純化水，輕輕攪拌，靜置，取上清液過濾，濾液濃縮后再次進行醇沉，靜置，取上清液過濾，濃縮，得金銀花提取物。采用高效液相色譜法檢測，測得提取物中含綠原酸15.22mg/g,木犀草苷0.38mg/g。2)連翹提取物的制備稱取連翹，加水煎煮3次，合并藥液，后續(xù)步驟同金銀花溫浸后步驟，得連翹提取物。采用高效液相色譜法檢測，測得提取物中含連翹苷4.05mg/g。3)黃茶提取物的制備取黃芩飲片，加水煎煮2次，每次2小時，過濾，合并濾液，調pH值，靜置，濾過，沉淀加水調pH值溶解，再加等量乙醇，攪拌，過濾，調pH值，濾過，沉淀用乙醇洗至中性，回收乙醇，離心，精制得黃茶提取物。采用高效液相色鐠法檢測，測得提取物中含黃芩苷72.16mg/g，含漢黃茶素1.07mg/g。實施例2用實施例1中得到的3種提取物配制如下配方注射液的配制(每支注射液的裝量為10ml)1)配方1:綠原酸0.4mg/ml，黃芩苷6.0mg/ml,連翹苷0.1mg/ml，漢黃茶素0.09mg/ml,木犀草苷0.01mg/ml。2)配方2:綠原酸1.0mg/ml,黃芩苷10.0mg/ml,連翹苷0.8mg/ml，漢黃茶素0.15mg/ml，木犀草苷0.024mg/ml。3)配方3:綠原酸1.5mg/ml，黃芩苷9.0mg/ml，連翹苷0.3mg/ml,漢黃芩素0.13mg/ml,木犀草苷0.04mg/ml。4)配方4:綠原酸2.0mg/ml，黃茶苷8.0mg/ml，連翹苷0.5mg/ml,漢黃茶素0.12mg/ml,木犀草苷0.05mg/ml?？诜旱呐渲?每支口服液的裝量為10ml)5)配方5:綠原酸0.6mg/ml,黃芩苷8.0mg/ml,連翹苷0.3mg/ml,漢黃芩素0.12mg/ml,木犀草苷0.015mg/ml。6)酉己方6:綠原酸1.0mg/ml，黃芩苷12.0mg/ml,連翹苷l.Omg/ml,漢黃芩素0.18mg/ml,木犀草苷0.024mg/ml。7)配方7:綠原酸1.5mg/ml,黃芩苷1l.Omg/ml,連翹苷0.5mg/ml,漢黃芩素0.16mg/ml，木犀草苷0.04mg/ml。8)配方8:綠原酸2.0mg/ml,黃芩苷9.0mg/ml,連翹苷0.8mg/ml,漢黃茶素0.13mg/ml,木犀草苷0.05mg/ml。實施例3雙黃連液體制劑對小鼠流感病毒感染的保護作用藥物本發(fā)明的雙黃連注射液(配方1,新雙黃連1):綠原酸0.4mg/ml,黃茶香6.0mg/ml，連翹苷O.lmg/ml,漢黃茶素0.09mg/ml,木犀草香0.01mg/ml。本發(fā)明的雙黃連口月l液(配方5,新雙黃連2):綠原酸0.6mg/ml,黃茶苷8.0mg/ml,連翹苷0.3mg/ml，漢黃芩素0.12mg/ml,木犀草苷0.015mg/ml。市售雙黃連注射液綠原酸1.3mg/ml,黃芩苷7.2mg/ml,連翹苷0.04mg/ml，漢黃蒼素0.02mg/ml,木犀草苷0.003mg/ml。。市售雙黃連口服液綠原酸l.lmg/ml,黃茶苷8.4mg/ml,連翹苷0.4mg/ml，漢黃茶素0.04mg/ml,木犀草苷0.002mg/ml。動物ICR封閉群小鼠，體重(20±2)g,雌雄各半病毒林甲型流行性感冒病毒鼠肺適應抹FMl方法1)病毒滴度測定將FM1接種于9-lld胚齡雞胚尿嚢腔，0.2ml/胚，35。C孵育72h,連續(xù)傳代2次，收獲雞胚尿嚢液。用血凝實驗測定混合的尿嚢液中FM1的血凝效價?；旌夏驀耙翰《镜味葹?280Hp/ml。病毒液分裝，保存-80。C備用。2)病毒毒力(LD50)測定ICR小鼠60只，隨機分為6組，每組10只，雌雄各半。用Hank's液將FM1病毒液自原液濃度起做IO倍梯度稀釋，稀釋倍數分別為1、10、102、103、104，用乙醚對小鼠進行淺麻醉。每一稀釋度病毒滴鼻感染一組小鼠，0.03ml/只，正常對照組用生理鹽水滴鼻，0.03ml/只。小鼠感染病毒后連續(xù)飼養(yǎng)觀察7d，逐日記錄小鼠死亡數及活動情況。當正常對照組小鼠無異常，全部存活時，按Bliss法計算FM1對ICR小鼠的LD50及其95%可信區(qū)間。3)小鼠病毒性肺炎造模采用10xLD50的病毒量滴鼻感染ICR小鼠。4)死亡保護率和生命延長率測定ICR小鼠40只，隨機分為4組兩組給藥組(新雙黃連1組、市售雙黃連注射液組)、肺炎沖莫型組和正常對照組，每組10只，雌雄各半。除正常對照組外，其他組小鼠淺麻醉狀態(tài)下滴鼻感染10xLD50FMl，0.03ml/只。兩組給藥組分別注射新的雙黃連液體制劑、市售雙黃連液體制劑0.2ml/20g,肺炎才莫型組和正常對照組小鼠注射0.2ml/20g生理鹽水。1次/d,連續(xù)給藥7d。逐日觀察記錄各組小鼠發(fā)病死亡數，統(tǒng)計各組小鼠存活時間，計算小鼠生命延長率和小鼠死亡保護率。生命延長率(％)=(實驗組存活時間-模型組存活時間)/模型組存活時間><100%死亡保護率(％)=(才莫型組死亡率-實一驗組死亡率)/模型組死亡率><100%5)肺指數測定小鼠造模、分組同上。灌胃給予新雙黃連2、市售雙黃連口服液或生理鹽水。給藥7d期間，立即稱量死亡小鼠的體重和肺臟重量。給藥7d后，斷頸處死仍然存活的小鼠，稱量體重和肺臟重量。計算肺指數和肺炎抑制率。肺指數=肺臟重量/體重x100%抑制率(％)=(模型組肺指數-實驗組肺指數)/模型組肺指數xlOO%6)病毒感染小鼠肺部組織中流感病毒含量的測定將上述實驗小鼠的肺臟稱重，按每0.1g肺組織加lml的比例加入生理鹽水，在組織勻漿器中研磨制成勻漿液，1500rpm/10min離心，取上清液，用血凝實,驗測定流感病毒的滴度(血凝單位Hp/g)。結果1)雙黃連注射液對流感病毒性肺炎小鼠的保護作用流感病毒FM1給小鼠滴鼻后，連續(xù)觀察7d,FM1感染的肺炎小鼠死亡發(fā)生在感染后的第3-5天。模型組小鼠在第3、4、5天分別死亡4、4、2只，死亡率100%。兩組給藥組對流感病毒性肺炎小鼠的死亡保護率均為80%,新雙黃連1組的生命延長率為65.7%,市售雙黃連注射液組的生命延長率為66.2%,兩組間無顯著差異，但與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表明兩組給藥組均能降低流感病毒性FM1肺炎小鼠的死亡率，延長存活時間，兩組給藥組對流感病毒的保護作用相當。結果詳見表l。表1雙黃連注射液對流感病毒性肺炎小鼠的死亡保護作用<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2)雙黃連口服液對流感病毒性肺炎小鼠肺部流感病毒FM1滴度的影響模型組的肺指數是正常組的2.5倍，新雙黃連2組的肺指數是正常組的1.77倍，市售雙黃連口服液組的肺指lt是正常組的1.75倍，兩組給藥組與模型組比較P〈0.01;正常組小鼠的病毒滴度為0,模型組的病毒滴度為2011Hp/g,兩組給藥組的病毒滴度與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),但兩組間無顯著性差異。結果詳見表2。表2雙黃連口服液對流感病毒性肺炎小鼠肺部的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例4過每丈反應試-驗比較取實施例2中的配方1、2、5和6,按過每文反應檢查法進行試驗，結果小鼠無明顯反應，表明上述配方的雙黃連液體制劑不會致過敏反應。而選擇配方3、4、7和8進行試驗，各組小鼠均有不同程度的過敏反應，表現為輕微抓鼻、顫抖、豎毛等，表明綠原酸含量在1.Omg/ml以上的雙黃連液體制劑有產生過敏現象的可能。按現行標準對新雙黃連液體制劑進行檢驗，各項均符合要求，另對其進行異常毒性、降壓物質、過敏反應、樹脂、重金屬、有害元素和指紋圖譜檢查，也符合相關要求。實施例51)儀器與試藥儀器高效液相色譜儀Agilent1200,色譜柱AgilentZORBAXEclipseXDB-C184.6x150mm5p。對照品黃茶苷(批號110715-200514),連翹普(批號110821-200610),綠原酸(批號:110753-200413),漢黃茶素(批號111514-200403),木犀草苷(批號111720-200503),上述對照品均購自中國藥品生物制品檢定所。沖羊品配方1、2、3試劑乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。2)色譜條件與洗脫程序色譜條件以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.2%磷酸溶液為流動相；4企測波長為278nm;流速為1.0ml/min;柱溫25。C;理論板數按綠原酸峰計算，應不低于2000。洗脫程序在洗脫步驟中，流動相A的體積百分比逐漸遞增，先用體積百分比為27%的A相和73%的B相作為流動相洗脫2-4個柱體積；然后用體積百分比為30%的A相和70%的B相作為流動相洗脫1-3個柱體積；接著用體積百分比為60%的A相和40%的B相作為流動相洗脫2-4個柱體積；再用體積百分比為90%的A相和10%的B相作為流動相洗脫3-5個柱體積。3)供試品溶液的制備精密吸耳又雙黃連液體制劑l.Oml,置于50ml容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，0.45pm微孔濾膜過濾，即得。4)對照品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的綠原酸、黃芩苷、連翹苷、漢黃芩素和木犀草苦對照品適量，置10ml容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度分別為20fig/ml、240|ig/ml、7pg/ml、1.6^g/ml和0.3|ng/ml的混合對照品溶液。5)線性關系考察分別精密吸取混合對照品溶液2|ul、5|il、10^1、15jxl、20|al，將其注入液相色譜儀，記錄色譜圖。分別以綠原酸、黃茶苷、連翹苷、漢黃芩素和木犀草苷進樣量(ng)為橫坐標，以峰面積為縱坐標，進行線性回歸，結果見表3。表3綠原酸、黃茶苷、連翹苷、漢黃茶素和木犀草苷的<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>6)精密度試驗精密吸取綠原酸、黃芩苷、連翹苷、漢黃芩素和木犀草苷混合對照品溶液注入液相色譜4義，重復進樣5次，每次20pl。綠原酸峰面積RSD=0.96%,黃蒼苷峰面積RSD=0.81%,連翹苷峰面積RSD=0.64%,漢黃茶素峰面積RSD=0.58Q/。，木犀草苷峰面積RSD=0.76%。結果表明，所選方法精密度良好。7)穩(wěn)定性試驗精密吸取同一供試品溶液，分別在O、2、4、6、8、10、12、24h進樣，測定樣品中綠原酸、黃茶苷、連翹苷、漢黃茶素和木犀草苷的峰面積，結果綠原酸峰面積RSD=1.55%,黃茶苷峰面積RSD=1.96%，連翹苷峰面積RSD=1.74%,漢黃茶素峰面積RSD=2.01%，木犀草香峰面積RSD=1.68%。表明樣品溶液在24h內穩(wěn)定。8)重復性試驗取同一樣品，按供試品溶液制備方法分別制備5份樣品溶液，按含量測定方法分別測定，記錄峰面積，結果綠原酸RSD=1.20%,黃茶苷RSD:1.340/0,連翹香RSD=1.06%,漢黃茶素RSD=1.28%,木犀草苷RSD-1.49。/。，表明方法重現性良好。9)專屬性試驗按處方比例及制備工藝，分別制備缺金銀花、黃茶、連翹的陰性對照樣品，按供試品溶液的制備方法制成陰性對照品溶液。分別取混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照品溶液，按含量測定方法進行測定，結果陰性對照品溶液在供試品溶液和混合對照品溶液中綠原酸、黃茶苷、連翹苷、漢黃茶素和木犀草苷保留時間相應位置上均無吸收峰出現，表明陰性對照品無千擾。10)準確度試驗精密量取同一樣品0.4ml各6份，分別置于50ml容量瓶中，每瓶均加入綠原酸、黃茶苷、連翹苷、漢黃芩素和木犀草苷對照品適量，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，0.45pm微孔濾膜過濾。按含量測定方法進行測定，結果綠原酸平均回收率為98.5%,RSD為1.04%;黃茶苷平均回收率為99.43%,RSD為1.36%;連翹苷平均回收率為99.67%，RSD為1.03。/。；漢黃茶素平均回收率為98.02%，RSD為1.81。/。；木犀草苷平均回收率為99.28%,RSD為1.160/。。11)含量測定取3批樣品，按供試品溶液制備方法分別進行處理得供試品溶液。分別4青密吸取混合對照品溶液與供試品溶、液各10^1,注入液相色譜儀，按上述色傳條件和洗脫程序進行檢測，用外標法計算樣品中綠原酸、黃芩苷、連翹苷、漢黃茶素和木犀草苷的含量，結果見表4。表4配方l、2、3中各有效成分的含量測定結果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>權利要求1.一種雙黃連液體制劑，其中含有連翹苷0.1-1.0mg/ml、黃芩苷6.0-12.0mg/ml、綠原酸0.4-1.0mg/ml。2.如權利要求1所述的雙黃連液體制劑，其中含有連翹苷0.1-0.8mg/ml、黃茶普6.0-10.0mg/ml。3.如權利要求1所述的雙黃連液體制劑，其中含有連翹苷0.3-1.0mg/ml、黃茶苷8.0-12.0mg/ml、綠原酸0.6-1.Omg/ml。4.如權利要求1至3任一權利要求所述的雙黃連液體制劑，其中還含有木犀草苷0.005-0.05mg/ml、漢黃芩素0.05-0.2mg/ml。5.如權利要求2所述的雙黃連液體制劑，該制劑為一種注射液。6.如權利要求3所述的雙黃連液體制劑，該制劑為一種口服液。7.—種雙黃連液體制劑的含量測定方法，4吏用高效液相色譜作為檢測系統(tǒng)，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，理論塔板數按綠原酸峰計算，應不低于2000,以乙腈-0.2%磷酸溶液為流動相，其中乙腈為流動相A,0.2。/Q磷酸溶液為流動相B，檢測波長為270-290nm，其中包括柱平衡、上樣、洗脫等步驟，在洗脫步驟中，流動相A的體積百分比逐漸遞增，先用體積百分比為27%的A相和73%的B相作為流動相洗脫2-4個柱體積；然后用體積百分比為30%的A相和70%的B相作為流動相洗脫1-3個柱體積；接著用體積百分比為60%的A相和40%的B相作為流動相洗脫2-4個柱體積；再用體積百分比為90%的A相和10%的B相作為流動相洗脫3-5個柱體積。8.如權利要求7所述的含量測定方法，其中檢測對象為連翹苷、黃茶苷和綠原酸的含量。9.如權利要求7所述的含量測定方法，其中檢測對象為連翹苷、黃茶苷、綠原酸、木犀草苷和漢黃茶素的含量。全文摘要本發(fā)明主要涉及一種雙黃連液體制劑及其含量測定方法。雙黃連液體制劑主要含有黃芩苷、連翹苷、綠原酸等，其不良反應主要表現在過敏性休克、皮膚潮紅、皮疹等。本發(fā)明提供了一種雙黃連液體制劑，其中含有適量的綠原酸、黃芩苷和連翹苷等有效成分，不僅具有理想的治療效果，同時還降低了過敏反應的發(fā)生。本發(fā)明還提供了一種雙黃連液體制劑有效成分的檢測方法。使用本發(fā)明的檢測方法，只需要使用一種流動相，就可以同時檢測黃芩苷、連翹苷、綠原酸、木犀草苷和漢黃芩素等五種有效成分的含量。該方法不僅顯著提高了檢測效率，而且還有效地降低了檢測成本。文檔編號A61K36/185GK101474260SQ200910000860公開日2009年7月8日申請日期2009年1月19日優(yōu)先權日2009年1月19日發(fā)明者周廣紅,周雪峰,岳大彪,方同華,王春生,項彥華申請人:黑龍江省珍寶島制藥有限公司