專利名稱：對阿爾茨海默氏癥的新一代基因療法·免疫療法的開發(fā)的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種能用于阿爾茨海默氏癥的基因療法.免疫療法的導入了抗P -淀粉樣蛋白的抗體基因或其改良型的載體。
背景技術：
人類阿爾茨海默病(AD )的主要病理特征有老年斑和神經纖維改變，一旦它們進一步發(fā)展，則可觀察到神經細胞的減少和腦萎縮。眾所周知老年斑是由于從細胞膜上的受體淀粉樣前體蛋白(APP )切斷出的P -淀粉樣蛋白(AP )的積累所造成。此外，近年來，不僅是不溶性A(3,可溶性AI3聚集體的神經細胞毒性也被確認，引起了極大的關注(非專利文獻1 )。在日本得到批準的一種AD治療藥，只是一種膽;咸酯酶抑制劑的前體，該藥物彌補損失的神經傳輸，只抑制癥狀，但達不到根治。
因此，為了達到減少造成AD根本原因的A P為目的，設想把自身的A (3蛋白質依靠抗體除去的"A (3疫苗療法"(非專利文獻2 )。該疫苗療法是把合成的AP42肽與佐劑一起肌肉給藥。在2001年，這種疫苗的臨床試驗(II期)已經開始。結果證實了老年斑消失，確認具有一定的作用，但另一方面也確認了有6%的患者發(fā)生了腦膜腦炎的副作用，有1例患者死亡。由于這種副作用的出現，臨床試驗被停止。目前，疫苗的副作用被認為是兩個原因。其一認為給藥的AP抗體激活了小神經膠質細胞，也許這與腦膜腦炎相關聯。另一個認為由于疫苗中所含的佐劑中具有強的免疫激活作用，而引起T細胞等細胞性免疫，結果在一些患者中反應AP及APP反應性Thl型CD4+T細胞滲透到腦中，這一事實也許與腦膜炎相關(非專利文獻3)。因此，開發(fā)安全性高且能有效地減少AP的疫苗是所期望的。
Tamura等，用經合成的A P肽免疫的小鼠，制備產生針對A (3的各
3個表位的抗體的雜交瘤細胞(非專利文獻4)。 4巴雜交瘤細胞生產的抗體用胃蛋白酶切斷，除去與激活小神經膠質細胞相關的Fc區(qū)域，純化出
F(ab，)2。 4巴這個抗A(3F(ab，)2抗體隔一周給藥到A (3抗體過量表達的AD模型小鼠(Tg2576)的腹腔中，進行AD預防和治療效果的研究。使用該抗體后，根據小鼠大腦切片的免疫染色，證實老年斑消失。此外，用sandwich ELISA法，對可溶性 不溶性的腦內AP定量的結果確定腦內A(3由于抗體而減少。根據以上內容，通過Fc受體而不通過細胞吞噬，成功地清除了 AP。然而，通過被動免疫進行的療法，為了有持續(xù)的效果必須不斷地加入抗體，這是Tamura課題研究的一個難點。
此外，據報道，把帶有編碼抗A (3輕鏈抗體的腺相關病毒投入AD模型小鼠腦內，淀粉樣蛋白的沉積減少，而且即使在給藥一年后還觀察到抗A (3輕鏈抗體的表達(非專利文獻5 )。不過， 一般來說，輕鏈抗體和完整的抗體的比較，抗體能力要低。
Rakez Kayed et al，. Science (2003) 300 : 486-489[非專利文獻2]
Dale Schenk et al.， Nature (1999) 400 : 173-177[非專利文獻3]
James A. R. Nicoll et al.， Nature med (2003) 9 : 448-452[非專利文獻4]
Y. Tamura et al.， Neurobiology of Disease 20 (2005) 541-549[非專利文獻5]
K. Fukuchi et al.， Neurobiology of Disease 23 (2006) 502-51
發(fā)明內容
本發(fā)明目標是使比抗體給藥功效更持續(xù)、比單抗體更高的抗體強度的阿爾茨海默氏病的基因治療和免疫治療成為可能。
因此，要解決上述問題，本發(fā)明第一，著眼于可以期待長期基因表達的腺相關病毒(AAV)。由于AAV可以在細胞中可以穩(wěn)定地基因表達，因此即使單次給藥也可以預期具有長期的功效。此外，AAV已經對嚢腫性纖維化，血友病和其他的疾病進行臨床研究，作為安全性很高的基因治療的載體被廣泛使用。此外，由于不需要佐劑，可以期望病毒載體或
許能抑制Thl型CD4+T細胞活化。其次，注意AAV的血清類型。根據發(fā)明者的長年關于AAV載體研究的實際成果，清楚了不同血清型的腺相關病毒載體對細胞的親和性不同。本發(fā)明者決定使用在肌肉細胞表達效率最高的AAV1型載體。
本發(fā)明人從產生抗A |3抗體雜交瘤細胞提取mRNA并通過逆轉錄，獲得抗AP抗體cDNA (圖l)。為了抑制小神經膠質細胞的活性，從完整抗體基因除掉CH3區(qū)域，制備CH3缺陷型抗AP抗體基因。此外，為了確認在末端表達的抗體向腦內的移行性，在抗體基因C末端添加組氨酸標記(圖2)。將這些抗體基因克隆到轉運載體上，基因導入于培養(yǎng)細胞，抗AP抗體的表達及功能用Western blot法和ELISA法證實。將制作的抗AP抗體基因導入AAV基因組，制備帶有抗A(3抗體的AAV載體(圖1)。將AAV載體給小鼠的肌肉給藥，表達出的血液中抗A(3抗體能和AP肽結合，用ELISA法證實了這一點。本發(fā)明，通過這些i人識而完成。
本發(fā)明要點如下。
(1 )表達完整的抗P -淀粉樣蛋白抗體或片段的載體，該載體含有啟動子序列，抗P -淀粉樣蛋白抗體的免疫球蛋白重鏈或片段的編碼序列，以及編碼自我加工肽的序列以及編碼抗P -淀粉樣蛋白抗體的免疫球蛋白輕鏈的序列。
(2 )還含有polyA序列的(1 )記載的載體。
(3) 還含有ITR序列的(1)或(2)記載的載體。
(4) 在編碼自我加工肽的序列的5 '末端連接有加工蛋白酶酶切部分的(1) - ( 3 )任一項記載的載體。
(5) 加工蛋白酶為furin的(4)記載的載體。
(6) 自我加工肽為碼是2A的(1) - (5)任一項記載的載體。
(7 )編碼抗P -淀粉樣蛋白抗體的免疫球蛋白重鏈或其片段的序列以及編碼抗(3 -淀粉樣蛋白抗體的免疫球蛋白輕鏈的序列均含有分泌信號序
列的(1 ) - (6)任一項記載的載體。
(8 )抗P-淀粉樣蛋白抗體的免疫球蛋白重鏈的片段包含可變區(qū)域， 含有部分恒定區(qū)域或完全不含恒定區(qū)域的(1 )至(7 )任一項記載的載 體。
(9 )含有從抗P-淀粉樣蛋白抗體的免疫球蛋白重鏈去除CH3區(qū)域 的片段的編碼序列的表達CH3缺陷型抗體的(8)記載的載體。
(10 )載體為腺相關病毒載體的(1) - ( 9 )任一項記載的載體。
(11) 腺相關病毒為1型的(IO )記載的載體。
(12) 包含(1 ) - ( 1 1 )任一項記載的載體作為有效成分的阿爾茨 海默氏癥預防和/或治療藥物。
發(fā)明的效果
本發(fā)明開發(fā)了采用重組AAV載體的AD治療和/或預防性疫苗。該 疫苗對模型動物的有效性可以確定。此外，在體內高效價的抗體的持續(xù) 表達是可能的。


圖1表示實施例的實驗過程。
圖2表示實施例中制作出的由重組AAV表達的抗體結構。圖3由導入抗體基因的293T檢測出抗AP抗體。 發(fā)現純化出的IIA2的H《連單體位于約50KDa， L《連單體位于約 30KDa附近。細胞溶解液和細胞上清都發(fā)現H鏈、L鏈，如果去除CH3 的pWl HF2AL中，H鏈帶位于45KDa左右，比對照組的分子量要小。 因而，根據由去除了 CH3區(qū)域的基因也說明抗體的表達。在細胞溶解液 的上清中沒有發(fā)現，但在80KDa左右確認了條帶。這被預測是，H鏈 Furin2AL鏈按連接的狀態(tài)表達，向細胞外分泌過程中受到自身的加工、 形成二聚體后分泌到細胞。
圖4表示實施例中制作出的重組AAV的結構
圖5表示給重組AAV向Balb/C鼠的給藥以及小鼠的采血的計劃。
圖6從投入了 AAV HF2AL的Balb/c的血清中進行了 A (3特 異的IgGl抗體的檢測。依賴于病毒載體投入量，血中抗A(3抗體濃度 上升。在3.0x 10uvgAAVHF2AL感染組中、給藥4周后血中的抗A (3抗 體量漸漸地上升，最高值達到939n g/mL。之后，抗體濃度緩慢地降低， 不過即使給藥后24周還能維持在432 m g/mL 。此外，在3.0 x 101Qvg HF2AL 感染組中，8周后最高值只達到222jag/mL 、 24周變?yōu)?57p g/mL。在 3.0x 109vgHF2AL感染組中、24周后最高值只達到28ia g/mL。
圖7使用了抗A (3抗體的老人斑的;f企測 (結果)在使用13個月大的Tg2576的腦切片的免疫染色中，通過使 用了兔抗A (3 1-40多克隆抗體、兔抗A P 1-42多克隆抗體或IIA2的 免疫染色，在海馬 大腦皮質附近檢測出了老人斑。并且，使用了 AAV HF2AL感染HEK293的上清，通過免疫染色，在相同的部位檢出了老 人斑。從而，可認為通過AAV被表達出的抗體與雜交瘤衍生的抗體具有 同等的抗原特異性。
序列表
<序列號1〉
序列號1表示小鼠的免疫球蛋白重鏈的全長的DNA序列。 <序列號2 >
序列號2表示小鼠的免疫免疫球蛋白重鏈的全長的氨基酸序列。 <序列號3 〉
序列號3表示小鼠的免疫球蛋白重鏈的全長中除去CH3區(qū)域的DNA序列。<序列號4 〉
序列號4表示小鼠的免疫球蛋白重鏈的全長中除去CH3區(qū)域的氨基 酸序列。
<序列號5 〉
序列號5表示小鼠的免疫球蛋白輕鏈的全長的DNA序列。 <序列號6 〉
序列號6表示小鼠的免疫球蛋白輕鏈的全長的氨基酸序列。 <序列號7 〉
序列號7表示小鼠的免疫球蛋白重鏈的分泌信號的DNA序列。 <序列號8 〉
序列號8表示小鼠的免疫球蛋白重鏈的分泌信號的氨基酸序列。 <序列號9 〉
序列號9表示小鼠的免疫球蛋白輕鏈的分泌信號的DNA序列。 <序列號1 0 〉
序列號1O表示小鼠的免疫球蛋白輕鏈的分泌信號的氨基酸序列。 <序列號11>
序列號1 1表示編碼口^帝疫病毒來源的2A的DNA序列。 <序列號1 2 〉
序列號l 2表示口蹄疫病毒來源的2A的氨基酸序列。 <序列號1 3 >
序列號1 3表示Furin酶切部位的DNA序列。 表示Furin酶切部位的氨基酸序列。RAKR <序列號1 4 〉
序列號14表示人AI3的氨基酸序列。 <序列號1 5 ~ 3 6 〉
8序列號1 5 ~ 3 6表示在實施例中使用的引物的DNA序列。
具體實施例方式
下列對本發(fā)明實施方式進行詳細說明。
本發(fā)明提供了表達完整的抗(3 -淀粉樣蛋白抗體或片段的載體，該載 體含有啟動子序列，編碼抗(3 -淀粉樣蛋白抗體的免疫球蛋白重鏈或其片 段的序列，編碼自我加工肽的序列以及編碼(3 -淀粉樣蛋白抗體的免疫球 蛋白輕鏈的序列。
插入本發(fā)明載體的啟動子序列，只要能表達完整抗|3 -淀粉樣蛋白的 抗體或其片段，任何啟動子序列都是可以的，例如，可以是哺乳類用的 啟動子?？梢岳e許多應用的如CMV啟動子和CAG啟動子等。此外， 也可以是細胞特異性啟動子。
插入本發(fā)明的載體的抗P -淀粉樣蛋白抗體的免疫球蛋白重鏈或其片 段的編碼序列，可以是含有編碼抗P -淀粉樣蛋白抗體的免疫球蛋白重鏈 可變區(qū)中的抗體結合部位的區(qū)域的序列，可以例示編碼免疫球蛋白重鏈 的全長，Fab區(qū)域，由全長去除CH3區(qū)域的區(qū)域，輕《連抗體等的序列。 為了避免因小神經膠質細胞活性化而導致的腦膜腦炎，優(yōu)選除去編碼與 激活小神經膠質細胞相關的Fc區(qū)域(全部或部分)的免疫球蛋白重鏈的 片段的序列。編碼小鼠的抗P -淀粉樣蛋白抗體的免疫球蛋白重鏈的全長 的一個例子示于序列號l 。其氨基酸序列示于序列號2 。此外，乂人小鼠 的抗P -淀粉樣蛋白抗體的免疫球蛋白重鏈總長度中除去CH3區(qū)域(注 免疫球蛋白重鏈CH區(qū)域分為CH1—CH3這三個部分。CH3區(qū)域位于 重鏈的C-末端。)的片段的編碼序列的一個例子示于序列號3 。其氨基 酸序列示于序列號4 。通過在本發(fā)明的載體中插入抗l3-淀粉樣蛋白抗體 的免疫球蛋白重鏈的全長去除CH3區(qū)域的片段的編碼序列，可以使CH3 區(qū)域缺失型的抗(3 -淀粉樣蛋白抗體表達。
插入本發(fā)明載體的抗P -淀粉樣蛋白抗體的免疫球蛋白輕鏈的編碼序 列可以是編碼抗P -淀粉樣蛋白抗體的免疫球蛋輕鏈的全長的序列。編碼小鼠的P -淀粉樣蛋白抗體的免疫球蛋白輕鏈的全長的序列的一個例子 示于序列號5 。其氨基酸序列示于序列號6 。
優(yōu)選編碼抗(3 -淀粉樣蛋白抗體的免疫球蛋白重鏈或其片段的序列以
及編碼抗(3 -淀粉樣蛋白抗體的免疫球蛋白輕鏈的序列均含有分泌信號序 列。小鼠的抗(3 -淀粉樣蛋白抗體免疫球蛋白重鏈分泌信號序列的一個例 子示于序列號7 。其氨基酸序列示于序列號8 。此外，小鼠的抗(3-淀 粉樣蛋白抗體免疫球蛋白輕鏈的分泌信號序列的一個例子示于序列號9。 其氨基酸序列示于序列號10 。
編碼抗(3 -淀粉樣蛋白抗體的免疫球蛋白重鏈或其片段的序列以及編 碼輕鏈的序列可以按下列步驟制備。首先，制備產生抗(3-淀粉樣蛋白抗 體的雜交瘤細胞，從該雜交瘤細胞中提取總RNA。用商業(yè)試劑盒 (SMART RACE cDNA Amplification Kit末端基因擴增試劑盒 (Clontech.Mountain View.USA )制備含全長抗體基因的cDNA文庫，利 用與添加在mRNA3，的polyA互補的引物寡dT和與mRNA5，互補的引物 通過PCR進行抗體的基因片段擴增(RACE法)。這樣，可以獲得編碼免 疫球蛋白重鏈和輕鏈的全長的序列。此外，為了得到免疫球蛋白重鏈片 段的序列，利用所要的區(qū)域的5'末端互補的引物以及與3'末端互補的 引物，可以通過PCR進行抗體基因片段擴增。按這種方式得到的編碼免 疫球蛋白重鏈或其片段的序列以及編碼免疫球蛋白輕鏈的序列也含有常 規(guī)分泌序列。分泌的信號序列可用信號序列的預測軟件 (http:〃bp.nuap.nagoya-u.acjp/sosui /)來檢索。
抗P -淀粉樣蛋白抗體的免疫球蛋白重鏈或其片段可以是IgG、 IgM、 IgD 、 IgE或IgA中的任何一類，不過優(yōu)選IgG 。此外，通過本發(fā)明的 載體表達的抗體或其片段來自人類，小鼠，兔，羊和其他動物都是可以 的，而且還可以是來自于人和人以外動物的嵌合抗體，人源化抗體。嵌 合抗體和人源化抗體的制備方法是眾所公知的。
插入本發(fā)明載體的編碼自我加工肽的序列，只要可以表達完整抗(3 -淀粉樣蛋白抗體或其片段，可以是編碼任意自我加工肽的序列，例如， 可用編碼2A的序列例示。2A，通常為了兩種基因同時表達較多采用內核糖體進入位點(IRES)。然而，通過利用IRES的基因表達，位于IRES 下游的基因，比位于上游的基因的表達水平低。
因為IgG抗體在生物體內存在重鏈 輕鏈兩個完整的形式，使抗體 基因表達時，在細胞內鏈H和L鏈必須是等量表達。此外，通過在2A序 列前后配置H鏈和L鏈，可以使等量抗體基因同時表達(Jianmin Fang et al.， nature biotechnology (2005) 23 : 584-589 )。所謂2A，是來自口蹄疫 病毒(FMDV)的自我加工肽。已知的是在病毒中P1和P2蛋白質之 間存在，參與生產成熟酶P1和P2的產生。P1和P2同時作為l個ORF 表達后，在2A型的C-端側的發(fā)生自我加工。(詳細情況還不清楚)。 各種2A序列以及2A樣序列已知的，口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus)的2A序列示于圖11。其氨基酸序列示于序列號12。
與自我加工多肽的編碼序列相鄰，連接加工蛋白酶酶切部分比較好。 加工蛋白酶酶切部分優(yōu)選連^妄在自我加工多肽的編碼序列的5'端。加工 蛋白酶酶切部位只要可以表達完整的抗(3 -淀粉樣蛋白抗體或其片段，則 編碼任意加工蛋白酶酶切部位的都可以，例如，可以例舉furin酶切位點。 Furin是識別切斷堿基氨基酸的蛋白酶家族中的一員，局部存在于高爾基 體內。Furin酶切部位的DNA序列示于序列號13 。
本發(fā)明載體，再插入一個polyA序列是比較好的。依賴插入polyA 序列，能夠使轉錄的mRNA穩(wěn)定化。
本發(fā)明載體，按在啟動子等調控元件的控制下，可以使完整的抗(3-淀粉樣蛋白抗體或其片段進行表達的方式，在載體中插入抗(3 -淀粉樣蛋 白的抗體的基因。
載體是把作為目標的不同DNA轉運到宿主的核酸分子，質粒，粘粒， 噬菌體，嗟菌粒，病毒，YAC和BAC等媒體作為載體。載體用于文庫 的制作，克隆的實施，把插入的DNA產物在宿主細胞中表達。依據插 入的DNA大小和插入的目的，可以選擇適當的媒介。為了表達完整的抗 P-淀粉樣蛋白抗體或片段，優(yōu)選質粒(在宿主細胞表達用)和病毒(基 因療法用)。
作為表達用質粒載體，可以是具有哺乳動物用啟動子，多克隆位點，
ii多聚腺苷酸，ITR的載體，可以例舉pWl等。
在基因治療中使用載體時，優(yōu)選病毒載體。作為病毒載體有腺相關
病毒(AAV), 逆轉錄病毒載體，腺病毒載體，慢病毒載體，仙臺病毒
載體等。
AAV對囊泡性纖維癥，血友病等疾病正在進行臨床研究，作為安全 性高的基因治療載體被廣泛運用。此外，該病毒載體，因為不需要佐劑， 因此期望也許能抑制Thl型CD4+T細胞能的活化。AAV不被認為是病 源性的病毒，缺乏獨立的增殖能力，復制依賴于腺病毒和皰瘆病毒等的 輔助功能。已知，對于腺病毒的輔助功能而言，E1A , E1B, E2A, E4， VA基因是必需的。已知能感染人類的AAV有1到9型的血清型。2,3,5 和9型都來自于人類，2型有深入的研究，作為載體被充分利用。本發(fā) 明人清楚了不同血清型的AAV載體對細胞的親和力不同(Xin， K-Q. et al.， J.Virol. 80:11899-910, 2006 )。在下面的實施例中，使用在肌肉細胞中表 達最高的AAV1型載體。AAV基因組是具有約5kB的單鏈的DNA , 大約一半的病毒粒子具有(+ )鏈DNA的基因組，其余具有(-)DNA 鏈。5'端的大約一半是稱為"rep"的區(qū)域，編碼與病毒復制和轉錄相關的 Rep蛋白質。rep編石馬乂人p5啟動子開始轉錄和翻i奪的大Rep ( Rep78和 Rep68 ) 和乂人pl9啟動子的轉錄，翻i奪的小Rep ( Rep52和Rep40 ) 典的四個蛋白。3 '端約一半是被稱為"cap"區(qū)域，編碼結構蛋白質 VP1 ， VP2和VP3這三個衣殼蛋白。衣殼蛋白的mRNA由p40啟動子 的轉錄。AAV基因組的兩末端存在^皮稱為145核苷酸的ITR (逆向末 端重復)發(fā)夾結構，人們認為這個ITR區(qū)域在向宿主細胞染色體整合時 十分重要。
為了制作重組AAV載體，可以對通過磷酸鉤法轉化HEK293細胞 (經腺病毒的E1AE1B轉化的人類胚胎腎組織來源的細胞)進行轉染。例 如，制備l)保留在野生型AAV的兩端的ITR， 在其間插入目的異種 DNA (本發(fā)明中，啟動子序列，編碼抗(3-淀粉樣蛋白抗體的免疫球蛋 白重鏈或其片段的序列，加工蛋白酶酶切部位，編碼自我加工肽的序列 和編碼抗P-淀粉樣蛋白抗體和免疫球蛋白輕鏈的序列)的質粒(AAV質粒載體)，2 ) 具有編碼病毒復制和病毒粒子形成所必需的病毒蛋白
(Rep、 Cap)的序列的質粒(AAV輔助質粒)，3 )具有AAV的增殖所 必需的承擔腺病毒輔助作用的基因區(qū)域(E1A、 E1B、 E2A、 VA、 E4或 f6)中，HEK293細胞具有的E1A和E1B以外的區(qū)域的質粒(腺病 毒輔助質粒)，通過轉染將這三個質粒導入到HEK293細胞中，產生重 組AAV載體。這樣重組AAV的制作4吏用商業(yè)試劑盒(例如， STRATAGENE公司的AAV helper-free system ), 就可以完成。
本發(fā)明的載體，作為AD的預防和治療性疫苗有用。因此，本發(fā)明 還提供了含有把表達完整的抗(3 -淀粉樣蛋白抗體或其片段的載體作為活 性成分的阿爾茨海默病(AD)預防和/治療藥。
表達完整的抗(3-淀粉樣蛋白的抗體或其片段的載體，可以例如，溶 解于PBS等緩沖液，生理鹽水，無菌水等，根據需要通過過濾器等過濾 消毒后，通過注射對實-驗者給藥。此外，在溶液中可以加入添加劑(例 如，非活化劑，防腐劑，佐劑，乳化劑等)。然而，是表達完整的抗(3-淀粉樣蛋白抗體或其片段的載體是病毒載體的情況下，不需要添加輔劑。 表達完整的抗P-淀粉樣蛋白的抗體或其片段的載體可以靜脈，肌肉，腹 腔，皮下，皮內等方式給藥，也可以通過鼻，口給藥。
表達完整的抗(3 -淀粉樣蛋白抗體或其片段的載體的給藥量，給藥次 數和頻率，根據被驗者的癥狀，年齡，體重，給藥方式，給藥形態(tài)等的 不同而不同，例如重組AAV載體的情況是，通常每個成年人人均至少一 次10""Vg的給藥量，可以按所希望的效果持續(xù)的頻率給藥。
下面通過實施例詳細地說明本發(fā)明，本發(fā)明并不限于這些實施例。 [實施例1 ] 材料和方法 實驗過程用圖l表示。
(1 )產生抗A P抗體的雜交瘤細胞的制備
人A P 肽(DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGA IIGLMVGGVVIA)(序列號14)，使用自動化的1430A肽合成器(AppliedBiosystems,CA,USA) 合成。將肽用完整的Freund，佐劑乳化，通過每 只Balb/c小鼠皮下皮下給藥100ug進行免疫。給藥2周后，和不完整的 弗氏佐劑一起等量追加免疫AP肽。此外，給藥三個星期后單獨給藥 100ug肽。摘取小鼠脾細胞，按下列方法制備雜交瘤細胞。 C2)抗體基因的分離
為了得到對A (3抗體的H鏈 L鏈的基因，進行mRNA的分離。從 抗A (3抗體產生的雜交瘤IIA2中，使用TRIzol試劑(GIBCO BRL. N.Y. USA )提取總R NA。用BD SMART RACE cDNA擴增試劑盒 (Clontech.MountainView.USA)、分別RACEH鏈 L鏈的5， 3'末端，制 備cDNA。順序按使用手冊進行。使用作為編碼5，-RACE的反義的一部 分的GSPl的H鏈(5， CCC AAG CTT TTT ACC AGG AGA GTG GGA GA 3，)(序列號1 5 ) (RIKAKEN.Nagoya. Japan) 、 L鏈(5'ATA AGA ATG
號1 6 ) (RIKAKEN),作為編碼3，-RACE的有義的一部分的GSPl的 H鏈(5 CGG GGT ACC ATG GGC AGG CTT ACT TCT TC 3,)(序列號 1 7 ) (RIKAKEN) 、 L鏈(5, CCG GAA TTC ATG GAG ACA GAC ACA CTCCT3，)(序列號l 8 ) (RIKAKEN),得到H鏈.L4連的5， 3，片
段。下劃線部分是限制性內切酶識別序列。
1) H鏈
為了擴增H鏈的ORF，制備與含限制性酶位點的H鏈互補的引物 [有義(5， CGG GGT ACC ATG GGC AGG CTT ACT TCT TC 3，)(序列號 1 9 )反義(5'CCCAAGCTTTTTACCAGGAGAGTGGGAGA3，)](序 列號2 0 ) (RIKAKEN)。反義引物，除去H鏈3，末端的終止密碼，進 行設計。使用這些引物，以通過RACE法制作的H鏈片段作為模板，通 過聚合酶鏈反應(PCR)進行H鏈的擴增。
2) L鏈
為了擴增L鏈的ORF，制備與含有限制性酶位點的L鏈的5， -3， 末端互補的引物{有義(5， CCG GAA TTC ATG GAG ACA GAC ACA CTCCT3，)(序列號2 1 )反義(5，ATAAGAATGCGGCCGCAGTCGACGCTAACACTCATTCCTGTTGA3')}(序列號2 2 ) (RIKAKEN)， 通過RACE法制作出的L鏈片段作為模板，與1)同樣地擴增。
(3) Furin2A基因的制作
制作連接Furin和口蹄疫病毒的自我加工肽2A的DNA序列的寡 DNA(5， CGC GCC AAG CGC GCC CCC CGT GAA GCA GAC CCT GAA CTT CGA CCT GCT GAA GCT GGC CGG CGA CGT GGA GTC CAA CCCCGGCCCC3，)(序列號2 3)。制作與含限制性酶位點的F2A 互補的引物[有義(5， CTA GCT AGC CGC GCC AAG CGC GCC CCC GT 3，)(序列號2 4 )反義(5' CCG CTC GAG GGG GCC GGG GTT GGA CTCCA3，)(序列號2 5 ) ](RIKAKEN)。把寡DNA作為模板，使用 這些引物通過PCR進行F2A的擴增。制作與5， 、 3，末端互補的引物 {有義(5'CCCAAGCTTCGCGCCAAGCGCGCCCCCGT3，)(序列 號2 6 )反義(5, CCG GAA TTC GGG GCC GGG GTT GGA CTC CA3，) (序列號2 7)} (RIKAKEN), 和H鏈 L 4連同樣擴增Furin 2A。
(4) 質粒的制作
用HindIII和EcoRI進行限制性酶處理將(2)制作出的Furin 2ADNA 片段，同樣地導入于pBluescript II KS(-) phagemid的HindIII和EcoRI 位點。把這個質粒作為pBlue F2A。使用KpnI,HindIII限制性酶處理(2) 中制作出的H鏈片段，導入于位于pBlue F2A的F2A基因上游的 KpnI，HindIII位點。把這個質粒作為pBlue HF2A。并且，用EcoRI,NotI限 制性酶處理(2)制作出的L鏈片段，導入于pBlue HF2A的F2A基因下游 的EcoRI，NotI位點。并且、把這個質粒作為pBlueHF2AL。
(5) 堿基序列的確認
把(4)制作出的質粒，使用特異于pBluescript的HF2AL基因插入部 分的5，側T3區(qū)域的引物(5'AATTAACCCTCACTAAAGGG3，)(序 列號2 8 )、特異于H鏈350bp附近的序列的引物(5，TCG ACTTGG TAGGAGGTATG3，)(序列號2 9 )、特異于1100bp附近的序列的 引物(5，GGTGGAATGGTGTACACCTG3，)(序列號3 0 )， 確認H 鏈、F2A的堿基序列。而且，在L鏈端，使用與p Bluescript的HF2AL基因插入部分的3，側T7區(qū)域特異的引物(5' TAA TAC GAC TCA CTA TAGGG3，)(序列號3 1 )、與Ml3-20區(qū)域特異的引物(5， GTAAAA CGACGGCCA3，)序列3 2)、與L鏈340bp附近的配列特異的引物 (5'CAGCACAGTTGGGAGATTCC3，)(序列3 3 )、與400bp附 近的序列特異的的引物(5， CCG TTT GAT TTC CAG TTT GG 3，)(序列 3 4), 確定L鏈、F2A的堿基序列。用ABI PRISM 310 (ABI)測定 質粒DNA、確定H《連 L鏈的石威基序列。
(6) 抗體基因的亞克隆
為了確認抗體基因在培養(yǎng)細胞內的表達，用(4)制作出的pBlue HF2AL把抗體基因整合到表達載體pWl。制備與H鏈5，末端互補的 引物(H.有義(5， ATA AGA ATG CGG CCG CA G TCG ACA ATG GGC AGG CTT ACT TC3，)(序列號3 5 )。使用該引物和與L鏈3，末端 互補的引物進行，進行H鏈 Furin 2A L鏈一 系列的ORF DNA片段 的擴增。將這個DNA片段用Notl限制性酶處理、同樣的導入pWI的 Notl位點，制成pWl HF2AL。
(7) 抗體基因的改變
為了確認在末端表達出的抗體向腦的移行性、用組氨酸蛋白標記標 識抗體。制備在3，末端添加了組氨酸基因的L鏈互補的引物。使用這個 引物和與H鏈5，的末端互補的引物，進行H鏈'Furin. 2A L鏈 組氨酸蛋白 一 系列的ORF DNA片段的擴增。把這個DNA片段用Notl 限制性酶處理，同樣地導入pWI的NotI位點，形成pWl HF2ALHis。
在不引起由Fc受體介導的吞噬作用而讓腦內A (3的減少作為目的。 為了抑制小神經膠質細胞的活性，制作了從全長的抗體基因除去了 CH3 區(qū)域的CH3缺失型抗體的基因。制備與H鏈CH2區(qū)域的3'末端制作互 補的引物[反義(5， CCC AAG CTT GCC TTT GGT TTT GGA GAT GG 3，) (序列號3 6 ) ](RIKAKEN)，使用該引物和與H鏈5，末端互補的引 物，進行H鏈的ORF DNA片段的擴增。把這個DNA片段用Sail HindIII進行限制性酶處理，更換為pWIHFL的全長H鏈。把這個質粒 作為pWl HF2AL deleted CH3。而且，抗體的CH2 CH3區(qū)域的推測按一下方式進行。把H鏈的 DNA堿基序列轉換為氨基酸序列。使用在氨基酸序列數據庫的 Swiss-Prot上的同源性#全索BLAST(http:〃au.expasy.or g/tools/blast/)，才企索 與制作的H鏈氨基酸序列存在同源性的序列。因此，選擇出與制作的抗 體相同的小鼠IgGl的序列同源性高的序列(登錄號:P01868)。因為對數 據庫中的序列中由蛋白質的功能、區(qū)域結構等的高水平的說明，因此根 據P01868的信息預測制作出的抗體的CH2CH3區(qū)域等。
(8)Western blot
把用(6)(7)作成了的pWl HF2AL、 pWlHF2ALHis和作為陰性對照 的pWl用LipofectamineTM2000 (Invitr ogen )轉染293T纟田月包。24小時 后將細胞用PBS(-)洗凈1次后，將培養(yǎng)基換為無血清。然后，在48小時 時回收細胞，進行離心分離。以該上清作為細胞上清樣品，通過在細胞 團中添加NP-40溶胞緩沖液，于冰上靜置分鐘使細胞可溶。靜置后的樣 品再離心分離，這個上清作為細胞溶解液。在細胞上清 細胞溶解液中 分另'J力口入2x SDS,加熱10分鐘，作為western 樣品。把這個樣品使用 12% Bis-Tris聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，遷移到在Immobilon 膜。把 膜在阻斷緩沖液[5%脫脂乳、PBS(-)]中，4。C震蕩12小時，進行阻斷。 然后，將膜用PBST[PBS(-)、 0.1 % Tween 20]洗浄。為了檢測H鏈 L鏈， 使之分另ll與作為原發(fā)性抗體的 Anti mouse IgGl conjugated horseradish peroxidase (Southern Biotechnology Asociates， Alabama,USA) 、 HRP conjugatedantimousekappa light chainantibody (BETHYL laboratories.Montgmery.USA)反應，用PBST清洗4次。并且使之在膜上 與Immobilon Western chemiluminescent HRP Substrate (MILLIPORE, MA,USA)反應，在Hyperfilm (Amersham. Buckinghamshire.UK)下感。 結果示于圖3 。
pWl LacZ的制作
為了擴增LacZ的ORF ,制備包含限制性酶位點的與LacZ的5， 3 ，末端制作互補的引物{sense (5，ACG CGT CGA CAC TAT CCC GAA CTTACT3》反義(5'CGCGGATCCATGCGGCTGATGTTGAACTG
173，)} (RIKAKEN)，把pSV國P -Galatsidase control vector(promega, W isconsin USA)作為模板，通過PCR進行擴增。
將LacZ DNA片段用Sail和BamHI進行限制性酶處理，導入于 pWl的Sail和B amHI位點，制成pWl LacZ。
(9) 重組AAV載體的制作
使用Calcium phosphate transfection kit(invitrogent)，通過石岸酸4丐法將 用(6)(7)制作出的pWl HF2AL, pWl HF2AL His,去除CH3的pWl HF2AL， pWllacZ ，帶有病毒復制和粒子的形成所必需的病毒蛋白的基 因的AAV輔助質粒，帶有AAV的增殖所必需的腺病毒的基因E2A . VA.E4或6的腺病毒輔助質粒同時基因導入于HEK293。然后，將細 胞靜置72小時。將該細胞。在干冰和設定為37。C的孵化器中，反復冷 凍溶解，回收細胞內的重組病毒。再把這個病毒溶液用CsCl超離心法純 化病毒(AAVHF2AL 、刪除了 CH3的AAVHF2AL 、 AAVHF2ALHis 、 AAVLacZ)。制作出的重組AAV載體的結構示于圖4 。圖4從上起依次 表示AAVHF2AL、刪除了 CH3的AAV HF2AL、 AAV HF2AL His的結 構。
(10) BALB/c鼠的給藥
對2個月的BALB/c雄性老鼠，給藥(9)的重組腺相關病毒(AAV)。 把AAV HF2AL分別以每只3.0 x 10uvg， 3.0 x 1010vg,3.0x I09vg進行肌 肉注射，各組5只(圖5 ) 。 AAV LacZ作為陰性對照按每只1.0 x 10 g,對5只給藥。肌肉內給藥，在背側皮下給藥在氯胺酮中(三共工 一乂k藥品.Tokyo.Japan)按終濃度達到0.4 %加入曱苯謹」秦溶液(乂《4工A 爿f、力A.Tokyo.Japan)形成的溶液，給藥在麻醉下進行。
(11) 酶-聯免疫吸附試,驗(ELISA)
給藥后，l周.2周'3周'4周，以后每4周用肝素處理処理后， 用毛細管(Drummond.Broomall.USA)采血。采集的血液在4。C靜置16小 時后，離心分離，回收上清，調制血清樣本。用這個血清進行"ELISA"。 在96孔微量滴定板(Nunc. N.Y. USA)上，用碳酸鹽緩沖液(0.1MNaHCO3) 溶解的A(3 1-13肽涂層，于4。C靜置16小時。然后，加入阻斷緩沖液(l
18%牛血清白蛋白(BSA) (SIGMA)、 0.05% Tween 20、 PBS(-)}，在37°C 下阻斷2小時。阻斷后，用PBST清洗3次，把血清用阻斷緩沖液稀釋， 添加到板上。把板在37。C下靜置2小時。靜置后，用PBST清洗3次， 再加入用阻斷緩沖液稀釋的結合了抗小鼠IgGl的辣根過氧化物酶 (SouthernBiotechnologyAsociates) , 37°C,靜置2小時。靜置后，用PBST 清洗3次，添加發(fā)色液[lTab/10mL o-phenylen dehydrochiolide (OPD) (Wako)， 0.1M 一寧檬酸、1 juL/mLH202]發(fā)色。R.T.、靜置30分鐘后，加 入 IN H2S04 停止發(fā)色。停止后，用 Benchmark Plus (BIO-RAD.California.USA)測定O.D.405nm。結果如圖6所示。 (12)腦樣品的準備
在麻醉下切出13個月大的Tg2576的腦。將摘出的腦浸入10%中性 緩沖的福爾馬林(Sigma，MO,USA),靜置48小時固定組織。
(13>[吏用Tg2576小鼠的腦切片的免疫組織化學
用xylene ethanol將Tg2576的石蠟切片脫去石蠟。添加100%曱酸 (Wako,Osaka，Japan),在烘箱中加熱，激活抗原。再用0.3%H2O2抑制內 因性過氧化物酶的活性，用 10%Normal Goat Searum(Vector La bomtories，CA，USA)防止抗體的非特異結合。作為1次抗體，使用兔抗A P 1-40多克隆抗體、兔抗A (3 1-42多克隆抗體或者IIA2, AAV HF2AL感 染HEK293的上清。力口入2次抗體envision + Dual Link System Peroxidase(Dako，,Denmark), 用 Dako Envision + "^式劑/HRP(DAB) (Dako，，Denmark)發(fā)色，通蘇木精進行核染色。結果如圖7所示。
工業(yè)上利用的可能性
本發(fā)明的載體，能作為阿爾茨海默氏癥的予防以及/或者治療疫苗 來利用。SEQUENCE LISTING 〈110〉 浙江海正藥業(yè)股份有限公司
〈120>對阿爾茨海默氏癥的新一代基因療法 免疫療法的開發(fā)
<130> FP1F090006ZX/CNZJHZ/MY
<150> JP2008-012393 <151> 2008—01—23
<160> 36
<170> Patentln version 3.1
<210> 1
〈211〉 1329
<212> 腿
<213> 小鼠(Mus musculus)
〈400> 1
aaagagtctg gccctgggat attgcagccc tcccagaccc tcagtctgac ttgttctttc 60
tctgggtttt cactgagcac ttctggtatg ggtgttggct ggattcgtca gccatcaggg 120
aagggtctag agtggctggc acacgtttgg tgggatgatc tcaagcgcta taacccagcc 180
ctgaagagcc gactgactat ctccaaggat acctccagca gtcagatatt tctcaggatc 240
gccagtgtgg acactgcaga tactgccaca tactactgtg ctcgacttgg taggaggtat 300
ggtaaccctc cctttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctcagccaaa 360
acgacacccc catctgtcta tccactggcc cctggatctg ctgcccaaac taactccatg 420
gtgaccctgg gatgcctggt casgggctat ttccctgagc cagtgacagt gacctggaac 480
tctggatccc tgtccagcgg tgtgcacacc ttcccagctg tcctgcagtc tgacctctac 540
actctgagca gctcagtgac tgtcccctcc agcacctggc ccagcgagac cgtcacctgc 600
aacgttgccc acccggccag cagcaccsag gtggacaaga aaattgtgcc cagggattgt 660ggttgtaagc cttgcatatg tacagtccca gaagtatcat ctgtcttcat cttcccccca 720
aagcccaagg atgtgctcac caittactctg actcctaagg tcacgtgtgt tgtggtagac 780
atcagca3gg atgatcccga ggtccagttc agctggtttg tagatgatgt ggaggtgcac 840
acagctcaga cgcaaccccg ggaggagcag ttcaacagca ctttccgctc agtcagtgaa 900
cttcccatca tgcaccagga ctggctcaat ggcaaggagt tcaaatgcag ggtcaacagt 960
gcagctttcc ctgcccccat cgagaaaacc atctccaaaa ccaaaggcag accgaaggct 1020
ccacaggtgt acaccattcc acctcccaag gagcagatgg ccaaggataa agtcagtctg 1080
acctgcatga taacagactt cttccctgaa gacattactg tggagtggca gtggaatggg 1140
cagccagcgg agaactacaa gaacactcag cccatcatgg acacagatgg ctcttacttc 1200
gtctacagca agctcaatgt gcagaagagc aactgggagg caggaaatac tttcscctgc 1260
tctgtgttac atgagggcct gcacaaccac catactgaga agagcctctc ccactctcct 1320 ggtaastga 1329
〈210〉 2 〈211〉 442 〈212〉 PRT
<213〉 小鼠(Mus musculus) 〈400〉 2
Lys Glu Ser Gly Pro Gly lie Leu Gin Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu
Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly Val 20 25 30
Gly Trp lie Arg Gin Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala His 35 40 45Val Trp Trp Asp Asp Leu Lys Arg Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser Arg 50 55 60
Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Ser Ser Gin lie Phe Leu Arg lie 65 70 75 80
Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Uu 85 90 95
Gly Arg Arg Tyr Gly Asn Pro Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro 115 120 125
Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gin Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly 130 135 140
Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn 145 150 155 160
Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin 165 170 175
Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr 180 185 190
Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser 195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys lie Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro 210 215 220
22Cys lie Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe lie Phe Pro Pro 225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr lie Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys 245 250 255
Val Val Val Asp lie Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gin Phe Ser Trp 260 265 270
Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gin Thr Gin Pro Arg Glu 275 280 285
Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro lie Met 290 295 300
His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser 305 310 315 320
Ala Ala Phe Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly 325 330 335
Arg Pro Lys Ala Pro Gin Val Tyr Thr lie Pro Pro Pro Lys Glu Gin 340 345 350
Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met lie Thr Asp Phe Phe 355 360 365
Pro Glu Asp lie Thr Val Glu Trp Gin Trp Asn Gly Gin Pro Ala Glu 370 375 380
Asn Tyr Lys Asn Thr Gin Pro lie Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe 385 390 395 400Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gin Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn
405 410
415
Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Uu His Asn His His Thr 420 425 430
Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 435 440
〈210〉 3 〈211〉 1008 〈212〉 DNA
<213〉小鼠(Mus musculus) 〈400〉 3
aaagagtctg gccctgggat attgcagccc tcccagaccc tcagtctgac ttgttctttc 60
tctgggtttt cactgagcac ttctggtatg ggtgttggct ggattcgtca gccatcaggg 120
aagggtctag agtggctggc acacgtttgg tgggatgatc tcaagcgcta taacccagcc 180
ctgaagagcc gactgactat ctccaaggat acctccagca gtcagatatt tctcaggatc 240
gccagtgtgg acactgcaga tactgccaca tactactgtg ctcgeicttgg taggaggtat 300
ggtaaccctc cctttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctcagccaaa 360
acgacacccc catctgtcta tccactggcc cctggatctg ctgcccaaac taactccatg 420
gtgaccctgg gatgcctggt caagggctat ttccctgagc cagtgacagt gacctggaac 480
tctggatccc tgtccagcgg tgtgcacacc ttcccagctg tcctgcagtc tgacctctac 540
actctgagca gctcagtgac tgtcccctcc agcacctggc ccagcgagac cgtcacctgc 600
aacgttgccc acccggccag cagcaccaag gtggacaaga aaattgtgcc cagggattgt 660
ggttgtaagc cttgcatatg tacagtccca gaagtatcat ctgtcttcat cttcccccca 720
aagcccaagg atgtgctcac cattactctg actcctaagg tcacgtgtgt tgtggtagac 780
24atcagcaagg atgatcccga ggtccagttc agctggtttg tagatgatgt ggaggtgcac 840
acagctcaga cgcaaccccg ggaggagcag ttcaacagca ctttccgctc agtcagtgaa 900
cttcccatca tgcaccagga ctggctcaat ggcaaggagt tcaaatgcag ggtcaacagt 960
gcagctttcc ctgcccccat cgagaaaacc atctccaaaa ccaaaggc 1008
<210> 4 <211> 336 <212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus) <400〉 4
Lys Glu Ser Gly Pro Gly lie Leu Gin Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu 15 10 15
Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly Val 20 25 30
Gly Trp lie Arg Gin Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala His 35 40 45
Val Trp Trp Asp Asp Leu Lys Arg Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser Arg 50 55 60
Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Ser Ser Gin lie Phe Leu Arg lie 65 70 75 80
Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu 85 90 95
Gly Arg Arg Tyr Gly Asn Pro Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110<formula>formula see original document page 26</formula>Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro lie Met 290 295 300
His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser 305 310 315 320
Ala Ala Phe Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly 325 330 335
〈210〉 5 〈211〉 654 〈212〉 DNA
<213〉小鼠(Mus musculus) 〈400〉 5
attgtgctga cacagtctcc tccttcctta
tC3tgC3ggg CC3gCC333g tgtC3gt3C3
cagaaaccag gacagccacc caaagtcctc gtccctgcca ggttcagtgg cagtgggtct
gtgg3gg3gg 3gg3t3CtgC 33C3tatt3C
ttcggtggag gcaccaaact ggaaatcaaa ttcccaccat ccagtgagca gttaacatct aacttctacc ccaaagacat caatgtcaag ggcgtcctga ac3gttgg3c tg3tc3ggac
3CCCtC3Cgt tg3CC33gg3 Cg3gt3tg33
cacaagacat caacttcacc cattgtcaag
〈210〉 6 〈211〉 217 〈212〉 PRT
27
gctgtttctc tggggcagag ggccaccgtc 60
tctaagtata gttatctgca ctggtaccaa 120
atcgagtatt catccaacct agaatctggg 180
gggacagact tcaccctcaa catccatcct 240
tgtcagcaca gttgggagat tccgtggacg 300
cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccatc 360
ggaggtgcct cagtcgtgtg cttcttgaac 420
tggaagattg atggcagtga acgacaaaat 480
8gc333g3C3 gc3cctac3g catg3gc3gc 540
cgacataaca gctatacctg tgaggccact 600
agcttcaaca ggaatgagtg ttag 654<213> 小鼠(Mus musculus) <400> 6
lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Pro Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gin 15 10 15
Arg Ala Thr Val Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Thr Ser Lys 20 25 30
Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys 35 40 45
Val Leu lie Glu Tyr Ser Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg 50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn lie His Pro 65 70 75 80
Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin His Ser Trp Glu 85 90 95
lie Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Ala 100 105 110
Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser lie Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gin Leu 115 120 125
Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140
Lys Asp lie Asn Val Lys Trp Lys lie Asp Gly Ser Glu Arg Gin Asn 145 150 155 160
28<formula>formula see original document page 29</formula><212> 腿
〈213>小鼠(Mus musculus) <400> 9
atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60 gac 63
〈210〉 10 〈211〉 21 <212> PRT
<213〉 小鼠(Mus musculus) <柳> 10
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 15 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp 20
〈210> 11 <211> 72 <212〉 腿
<213>口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus) <400> 11
gcgcccgtga agcagaccct gaacttcgac ctgctgaagc tggccggcga cgtggagtcc 60 aaccccggcc cc 72
<210> 12 〈211〉 24 <212〉 PRT
<213>口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus) 〈400〉 12
Ala Pro Val Lys Gin Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly 15 10 15Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20
<210> 13
<211> 12
<212> 腿
<213> 人工序列(Artificial) <220>
<223> furin cleavage site
<400> 13
cgcgccaagc gc 12
<210> 14 <211> 42 〈212〉 PRT
〈213〉 智人(Homo sapiens) 〈400〉 14
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys 15 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie 20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val lie Ala 35 40
<210> 15
<211> 29
<212> 腿
<213> 人工序列(Artificial) <220>
<223〉 primer<400> 15
cccaagcttt ttaccaggag agtgggaga 29
<210〉 16
<211〉 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<223> primer <400〉 16
ataagaatgc ggccgcagtc gacgctaaca ctcattcctg ttga 44
<210> 17
<211〉 29
<212> 腿
<213〉 人工序列(Artificial)
<220>
<223〉 primer
<400> 17
cggggtacca tgggcaggct tacttcttc 29
<210> 18
<211> 29
<212> 腿
<213〉 人工序列(Artificial) <220>
<223〉 primer
<400〉 18
ccgg3attca tgg3g3C3ga cacactcct 29
<210> 19 <211〉 29 <212> DNA<213> 人工序列(Artificial) 〈220>
<223> primer
〈400〉 19
cggggtacca tgggcaggct tacttcttc 29
<210> 20
<211> 29
〈212〉 DNA
〈213〉 人工序列(Artificial) <220>
<223〉 primer
<400> 20
cccaagcttt ttaccaggag agtgggaga 29
<210> 21
〈211〉 29
〈212〉 DNA
<213> 人工序列(Artificial) 〈220>
<223> primer
<400〉 21
ccggaattca tggagacaga cacactcct 29
<210> 22
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial) 〈220〉
<223> primer
<400〉 22
ataagaatgc ggccgcagtc gacgctaaca ctcattcctg ttga 44<210> 23 <211〉 85 〈212〉 DNA
<213〉 人工序列(Artificial) <220〉
<223> primer <400> 23
cgcgccaagc gcgccccccg tgaagcagac cctgaacttc gacctgctga agctggccgg 60 cgacgtggag tccaaccccg gcccc
〈210> 24
<211> 29
<212> 腿
<213〉 人工序列(Artificial) <220〉
<223〉 primer
<400> 24
ctagctagcc gcgccaagcg cgcccccgt
<210> 25
<211> 29
<212> DNA
<213〉 人工序列(Artificial) <220〉
<223> primer
<400> 25
ccgctcgagg gggccggggt tggactcca
<210> 26
<211〉 29
<212> 腿
<213> 人工序列(Artificial)
85
29
29
34<220>
<223〉 primer 〈400〉 26
cccaagcttc gcgccaagcg cgcccccgt 29
<210〉 27
<211> 29
〈212〉 DNA
<213> 人工序列(Artificial) <220>
<223> primer
<400> 27
ccggaattcg gggccggggt tggactcca 29
〈210〉 28
<211> 20
〈212〉 腿
<213〉 人工序列(Artificial) <220>
<223> primer
<400〉 28
aattaaccct cactaaaggg 2(
<210> 29
<211> 20
<212〉 DNA
<213> 人工序列(Artificial) <220〉
<223〉 primer
<400> 29
tcgacttggt aggaggtatg 》
<210> 30<211〉 20
<212〉 DNA
<213> 人工序列(Artificial) <220〉
<223> primer
<400〉 30
ggtgg33tgg tgt3C3CCtg 20
<210〉 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial) <220>
<223> primer <柳〉31
taatacgact cactataggg 20
<210> 32
<211> 15
<212〉 DNA
<213> 人工序列(Artificial) 〈220>
<223〉 primer
〈400> 32
gt333acgac ggccs 15
<210> 33
<211〉 20
<212〉 腿
<213> 人工序列(Artificial) <220〉
<223> primer
<400> 33<formula>formula see original document page 37</formula>
權利要求
1、表達完全型抗β-類淀粉體抗體或其片段的載體，該載體含有啟動子序列、編碼抗β-類淀粉體抗體的免疫球蛋白重鏈或其片段的序列、編碼自我加工肽的序列和編碼抗β-類淀粉體抗體的免疫球蛋白輕鏈的序列。
2、 4又利要求1所述的載體，其含有polyA序列。
3、 權利要求1或2所述的載體，其含有ITR序列。
4、 權利要求1 3任一項所述的載體，加工蛋白酶酶切部位與編碼 自我加工肽的序列的5'末端側相連接。
5、 權利要求4所述的載體，所述加工蛋白酶是Furin。
6、 權利要求1 ~ 5任一項所述的載體，所述自我加工肽是2A。
7、 權利要求1 ~ 6任一項所述的載體，編碼抗P -類淀粉體抗體的免 疫球蛋白重鏈或其片段的序列和編碼抗P -類淀粉體抗體的免疫球蛋白輕 鏈的序列均含有分泌信號序列。
8、 權利要求1 7任一項所述的載體，抗P-類淀粉體抗體的免疫球 蛋白重鏈的片段含有可變區(qū)域，含有恒定區(qū)域的一部分或完全不含恒定 區(qū)域。
9、 權利要求8所述的載體，該載體表達CH3缺陷型抗體，其含有 編碼從抗(3-類淀粉體抗體的免疫球蛋白重鏈中除去CH3區(qū)域的片段的 序列。
10、 權利要求1 9任一項所述的載體，所述載體是腺相關病毒載體。
11、 權利要求10所述的載體，所述腺相關病毒載體為1型。
12、 阿耳茨海默氏病的預防和/或治療藥，其含有權利要求1~11 任一項所述的載體作為有效成分。
全文摘要
比抗體投入有持續(xù)的效果，比單鏈抗體有更高抗體能力，使阿爾茨海默氏病的基因治療·免疫治療成為可能。表達完整型抗β-淀粉樣蛋白抗體或片段的載體，該載體含有啟動子序列，抗β-淀粉樣蛋白抗體的免疫球蛋白重鏈或其片段的編碼序列，編碼自我加工肽的序列以及編碼抗β-淀粉樣蛋白抗體的免疫球蛋白輕鏈的序列。包含以上載體作為有效成分的阿爾茨海默氏癥的預防以及治療的藥物。
文檔編號A61K48/00GK101491683SQ20091000113
公開日2009年7月29日 申請日期2009年1月23日 優(yōu)先權日2008年1月23日
發(fā)明者奧田研爾, 島田勝, 浜島健治, 高橋透 申請人:浙江海正藥業(yè)股份有限公司