專利名稱：：免疫調(diào)節(jié)組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明系關(guān)于醫(yī)藥、食品、營養(yǎng)及免疫的領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明系關(guān)于一種免疫調(diào)節(jié)的組合物，其可提升個體對抗病原的免疫反應(yīng)及降低發(fā)炎反應(yīng)。
背景技術(shù)：
：免疫系統(tǒng)為身體用來保護(hù)自己防御外來的微生物、毒素、本身的癌細(xì)胞或是來自他人的血液或組織等可能有害物質(zhì)的一個防御系統(tǒng)。免疫系統(tǒng)可分為先天及后天免疫系統(tǒng)。先天免疫系統(tǒng)(又稱非特異性免疫系統(tǒng))系作為第一道防御機制，可提供立即的保護(hù)，相關(guān)成員包括天然殺手細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性白血球、嗜酸性白血球等。后天免疫系統(tǒng)(又稱特異性免疫系統(tǒng))，則是作為第二道防御機制，需要時間產(chǎn)生針對特定抗原之免疫反應(yīng)，相關(guān)成員包括T細(xì)胞與B細(xì)胞。后天免疫系統(tǒng)可產(chǎn)生輔助T細(xì)胞第1型(Thl)免疫反應(yīng)及輔助T細(xì)胞第2型(Th2)免疫反應(yīng)。Thl免疫反應(yīng)主要是指細(xì)胞調(diào)節(jié)的免疫反應(yīng)，其涉及白細(xì)胞介素-2(IL-2)及干擾素-Y(IFN-Y)之分泌及細(xì)胞毒殺T淋巴細(xì)胞(CTLs)之活化，可對抗病毒感染及癌細(xì)胞。Th2免疫反應(yīng)主要是指體液免疫反應(yīng)，其涉及白細(xì)胞介素-4(IL-4)及白細(xì)胞介素-5(IL-5)之分泌及B細(xì)胞之活化(產(chǎn)生抗體)，可對抗游離的細(xì)菌或寄生蟲。一般認(rèn)為，過度的IL-4及IL-5之分泌與過敏及發(fā)炎反應(yīng)有關(guān)。此外，免疫力的提供可通過主動免疫或被動免疫而達(dá)成。主動免疫是指身體接受外來物質(zhì)(例如，病菌)剌激后，身體的免疫系統(tǒng)活化，主動產(chǎn)生對抗該外來物質(zhì)的免疫力。相對地，被動免疫是指將對抗特定病原的免疫分子(通常是抗體)導(dǎo)入身體中，身體并未主動產(chǎn)生該等免疫分子。一般而言，主動免疫需較長時間產(chǎn)生免疫力，但效果持久，而被動免疫可較快提供免疫力，但效果不持久。已有先前技術(shù)提出一種作為免疫剌激劑的組合物，其包括數(shù)種中草藥，可提高IL-1的分泌，但不會使IL-4上升(US6，464，982)。此外，已知雌性禽類經(jīng)特定病原的致免疫作用后，其產(chǎn)下的蛋的蛋黃部分具有對抗該特定病原的特異性抗體，從該蛋黃部分可分離出所需的特異性抗體，以被動免疫方式對抗該病原引起的疾病。相關(guān)技術(shù)已發(fā)展多年，可用于，例如，舒緩沙門氏菌(如Yokoyama等人，1998)、輪狀病毒(如Bartz等人，1980及Kuroki等人，1994)等所引起的腹瀉及縮短其腹瀉期間。Shin等人(2002)揭示，以幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori)免疫母雞，進(jìn)而從該母雞產(chǎn)下的雞蛋的蛋黃部分，分離出對抗幽門螺旋桿菌的抗體，該抗體可用于治療幽門螺旋桿菌的感染。Marquardt等人(US7，355，092)揭示一種提供大腸桿菌纖毛抗原的基因疫苗，并說明該基因疫苗投予母雞后，可收集產(chǎn)下的雞蛋及進(jìn)一步從該雞蛋分離出對抗纖毛抗原的抗體，俾于人體或動物提供被動免疫以對抗腹瀉疾病。然而，目前尚無文獻(xiàn)揭示一雌性禽類經(jīng)抗原剌激后產(chǎn)下的禽蛋具有調(diào)節(jié)個體的免疫功能的功效。
發(fā)明內(nèi)容本案首次揭露一來自經(jīng)幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori)致免疫的雌性禽類產(chǎn)下的蛋的蛋黃產(chǎn)物具有調(diào)節(jié)個體的免疫功能的功效。因此，在一方面，本發(fā)明提供一種免疫調(diào)節(jié)組合物，其包括一蛋黃產(chǎn)物，該蛋黃產(chǎn)物系來自一經(jīng)幽門螺旋桿菌、其片段或組合致免疫的雌性禽類所產(chǎn)下的蛋，其中該雌性禽類較佳為雞、鴨及鵝，更佳為雞。典型地，該蛋黃產(chǎn)物為冷凍干燥的粉末。在一具體實例中，本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)組合物為膠囊形式，較佳地，前述蛋黃產(chǎn)物為冷凍干燥的粉末，并入該膠囊中。在另一具體實例中，本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)組合物為錠劑、丸劑、懸浮液或顆粒形式。典型地，本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)組合物系經(jīng)口服投予一個體，其較佳為人類。具體而言，本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)組合物可用于調(diào)節(jié)一個體的免疫反應(yīng)。更具體而言，本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)組合物可提升自然殺手細(xì)胞毒殺活性、促進(jìn)IFN-Y的產(chǎn)生以及抑制IL-4與IL-5的產(chǎn)生。典型地，本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)組合物可作為食品添加物。因此，另一方面，本發(fā)明提供一種免疫調(diào)節(jié)食品，其包括前述蛋黃產(chǎn)物。本發(fā)明的各個具體實例的細(xì)節(jié)說明如后。本發(fā)明的其它特征將會經(jīng)由以下各個具體實例中的詳細(xì)說明及申請專利范圍而清楚呈現(xiàn)。無須進(jìn)一步的闡述，咸相信本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中具有通常知識者基于前述說明即可利用本發(fā)明至最廣的程度。因此，可以理解以下的說明僅僅是作為例示說明之用，而非以任何方式限制其余的揭露內(nèi)容。具體實施例方式在一方面，本發(fā)明提供一種免疫調(diào)節(jié)組合物，其包括一蛋黃產(chǎn)物，該蛋黃產(chǎn)物系來自一經(jīng)幽門螺旋桿菌、其片段或組合致免疫的雌性禽類所產(chǎn)下的蛋。除非另有指明，所有在此處使用的技術(shù)性和科學(xué)性術(shù)語具有如同本發(fā)明所屬技藝中之通常技術(shù)者一般所了解的意義。本文所使用的"一"一詞，如未特別指明，系指至少一個(一個或一個以上)的數(shù)本文所使用的"免疫調(diào)節(jié)"一詞，當(dāng)用于形容一試劑或物質(zhì)時，是指該試劑或物質(zhì)具有改變或調(diào)整至少一種免疫系統(tǒng)的之功能的能力，包括但不限于，改變或調(diào)整免疫系統(tǒng)的成員細(xì)胞或作用分子(例如，細(xì)胞激素及抗體)的數(shù)量(或含量)及/或活性。在相關(guān)領(lǐng)域中，已發(fā)展各種測試方法，以評估一試劑或物質(zhì)的免疫調(diào)節(jié)功能，例如，臺灣行政院衛(wèi)生署公布的健康食品的免疫調(diào)節(jié)功能評估方法，其包括天然殺手活性分析及細(xì)胞激素分泌實驗等。各種免疫調(diào)節(jié)功能評估方法的特定步驟與細(xì)節(jié)例示說明于以下實例。本文所使用的"蛋黃產(chǎn)物"一詞是指一分離自雌性禽類產(chǎn)下的蛋的蛋黃部分，其可為未經(jīng)加工者或經(jīng)加工者，所述加工方式，包括但不限于，冷凍干燥。本文所使用的"致免疫作用"是指將一試劑或物質(zhì)輸送進(jìn)入一個體，使該個體的免疫反應(yīng)受到活化，較佳地，該個體因而產(chǎn)生對抗該試劑或物質(zhì)之特異性免疫反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明，幽門螺旋桿菌系投予雌性禽類，以產(chǎn)生致免疫作用，然后收集該等雌性禽類產(chǎn)下的蛋，取出蛋黃部份，可視需要地進(jìn)行加工(例如，冷凍干燥)，進(jìn)而獲得一蛋黃產(chǎn)物。依據(jù)Shin等人(同上)的揭示，可預(yù)期從該等經(jīng)幽門螺旋桿菌致免疫之雌性禽類產(chǎn)下的蛋之蛋黃部分，可分離出對抗幽門螺旋桿菌的特異性抗體。本發(fā)明并非針對該等特異性抗體的分離及其用于治療幽門螺旋桿菌相關(guān)疾病的用途。吾人首次揭示并證實從一經(jīng)幽門螺旋桿菌致免疫的雌性禽類產(chǎn)下的蛋所獲得的蛋黃產(chǎn)物具有免疫調(diào)節(jié)的功效。如下述實例所示，相較于對照組，服用該等蛋黃產(chǎn)物的小鼠，面臨外來物質(zhì)的挑戰(zhàn)，展現(xiàn)增強的Thl免疫反應(yīng)(IFN-y之分泌上升)及降低的Th2免疫反應(yīng)(11-4及IL-5之分泌下降)。吾人因此建議本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)組合物有助于提升個體對抗外來病原的免疫力且可降低發(fā)炎反應(yīng)的產(chǎn)生，其對個體有相當(dāng)正面的幫助。本發(fā)明所需幽門螺旋桿菌可由商業(yè)上獲得(例如，美國菌種保藏中心)，在適當(dāng)環(huán)境下培養(yǎng)。取出適量幽門螺旋桿菌，經(jīng)離心后，以超音波震蕩瓦解，再離心，收集上清液，此即為幽門螺旋桿菌溶胞產(chǎn)物。取適當(dāng)?shù)挠拈T螺旋桿菌溶胞產(chǎn)物與佐劑混合，以肌肉注射方式，投予母雞，以達(dá)成致免疫作用。適當(dāng)時間之后，收集該雌性禽類產(chǎn)下的蛋，分離出蛋黃部分，進(jìn)而獲得所述蛋黃產(chǎn)物。上述以幽門螺旋桿菌致免疫雌性禽類、收集該禽類產(chǎn)下的蛋及取得蛋黃部分的相關(guān)技術(shù)已為此一領(lǐng)域所熟知，并揭示于，例如，Shin等人(同上)。特定的步驟及細(xì)節(jié)系例示說明于以下實例。此外，本發(fā)明所使用的雌性禽類，包括但不限于雞、鴨及鵝，較佳為雞。典型地，本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)組合物所含蛋黃產(chǎn)物系進(jìn)一步加工為冷凍干燥粉末。在一具體實例中，本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)組合物系呈一膠囊形式，較佳地，所述蛋黃產(chǎn)物為冷凍干燥粉末，其系并入該膠囊中。又，本發(fā)明所使用的蛋黃產(chǎn)物可進(jìn)一步與一非活性成分混合調(diào)配，形成調(diào)配物。較佳地，所述蛋黃產(chǎn)物可調(diào)配成口服調(diào)配物，例如，錠劑形式、丸劑形式、液體形式或顆粒形式。適用于本發(fā)明之免疫調(diào)節(jié)組合物之非活性成分包括，但不限于，稀釋劑、黏結(jié)劑、潤滑劑、抗氧化劑、著色劑、填充劑、保藏劑及安定劑。可用的稀釋劑包括羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇、滑石、葡聚糖、乳糖、蔗糖、甘露醇及其類似物?？捎玫酿そY(jié)劑包括阿拉伯膠、海藻酸鈉、乙基纖維素、洋菜、明膠、淀粉、羥基纖維素、羥丙基纖維素及其類似物?？捎玫臐櫥瑒┌ㄓ仓?、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、滑石、氫化油、臘及其類似物。可用的抗氧化劑包括生育醇、二丁基羥基甲苯、丁基羥基甲氧苯、抗壞血酸及其類似物。本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
具通常知識者可依習(xí)知技術(shù)及參酌本案說明書內(nèi)容選用適當(dāng)成分調(diào)配本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)組合物。典型地，本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)組合物系經(jīng)口服投予一個體。具體而言，本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)組合物可用于調(diào)節(jié)一個體的免疫反應(yīng)。更具體而言，本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)組合物可提升自然殺手細(xì)胞毒殺活性、促進(jìn)IFN-y的產(chǎn)生以及抑制IL-4與IL-5的產(chǎn)生。吾人因此建議本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)組合物有助于提升個體對抗外來病5原的免疫力且可降低發(fā)炎反應(yīng)的產(chǎn)生，其對個體有相當(dāng)正面的幫助。吾人更進(jìn)一步建議本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)組合物可用于正常個體的平日保健或免疫功能不佳的虛弱個體(例如，癌癥或艾滋病患者)的免疫功能改善。本文所使用的"個體"一詞，包括但不限于，人類及非人類動物，例如，牛、羊、豬、馬、狗及貓。本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)組合物可直接投予個體，或作為食品添加物，添加至食品中。因此，在另一方面，本發(fā)明系提供一種免疫調(diào)節(jié)食品(例如，糖果)，其包括前述蛋黃產(chǎn)物，亦即，該蛋黃產(chǎn)物系來自一經(jīng)幽門螺旋桿菌、其片段或組合致免疫的雌性禽類所產(chǎn)下的蛋，其中該禽類較佳為雞、鴨、鵝，更佳為雞。吾人可依公知技術(shù)及個別需要并參酌本案說明書內(nèi)容制得本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)食品。實例藥品卵蛋白(ovalbumin,ova)、肝素(h印arin)、刀豆球蛋白A(ConA)、脂多醣(LPS)、溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑(MTT)、二甲基亞砜(DMS0)、弗氏佐劑(Fre皿d'sadjuvants)、Hank's平衡鹽溶液(HBSS)、Delbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、RPMI1640、臺盼蘭(trypanblue)、吐溫_20(Tween-20)以及牛血清蛋白(BSA)系購自美國Sigma-Aldrich公司。胎牛血清(FBS)系購自澳洲IPAALaboratoriesGmbH公司(Pasching，澳洲)。DuoSetELISA發(fā)展系統(tǒng)系購自美國R&D系統(tǒng)公司(明尼阿波里斯市，明尼蘇達(dá)州，美國)。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)及統(tǒng)計以下實例的實驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(Mean士SD)表示。以學(xué)生t檢驗(Student'st-test)進(jìn)行各組比較，p<0.05者代表有顯著差異。實例1:幽門螺旋桿菌的制備幽門螺旋桿菌的制備主要依據(jù)Shin等人(同上)所揭示的方法進(jìn)行。簡言之，將美國菌種保藏中心編號ATCC43504之幽門螺旋桿菌培養(yǎng)于布氏肉湯(brucellabroth，Difco實驗室，底特律市，密執(zhí)安州，美國)，其含有5%的胎牛血清及抗體(包括2.5iig/ml之兩性霉素B，10iig/ml的萬古霉素、5iig/ml的三甲氧芐氨嘧啶；及2.5IU/ml的多粘菌素B，均購自美國Sigma化學(xué)公司)，培養(yǎng)條件為37°C、10%C02及200rpm震蕩速度。取出培養(yǎng)的幽門螺旋桿菌，以12，000xg離心10分鐘后，以超音波處理。再離心后，取得上清液，此為幽門螺旋桿菌溶胞物。以二辛可寧酸方法(bicinchoninicacidmethods,Pierce,Rockford，III)測量幽門螺旋桿菌溶胞物之蛋白質(zhì)濃度。實例2:母雞的致免疫作用及免疫蛋黃凍干粉末的制備取前述實例1的幽門螺旋桿菌溶胞物(蛋白質(zhì)含量為200g/ml)與相同體積的弗氏完全佐劑(Difco實驗室，底特律市，密執(zhí)安州，美國)混合后，以肌肉注射的方式投予母雞(25周齡，BrownLeghornhens，n=15)。每一只母雞在腿肌肉上有4個位置接受注射，每個位置劑量為250iU。在第一次注射后，每隔二周，以混合弗氏不完全佐劑的幽門螺旋桿菌溶胞物，進(jìn)行三次增強反應(yīng)。在完成最后一次增強反應(yīng)一個月后，收集母雞產(chǎn)下的雞蛋，取出蛋黃部份，進(jìn)行冷凍干燥，獲得免疫蛋黃凍干粉末(下稱"IgY-HP")。實例3:小鼠的處理方法1.小鼠的來源及其伺養(yǎng)管理此處使用的小鼠為6周齡、雌性BALB/c小鼠，其系購自樂斯科生物科技股份有限公司(BioLASCOTaiwanCo.，Ltd,Taipei,Taiwan)。實驗小鼠的飼養(yǎng)管理經(jīng)臺灣新竹市食品工業(yè)發(fā)展研究所的動物實驗管理小組審核通過。簡言之，小鼠自購進(jìn)后觀察兩周，表現(xiàn)不正常情形(如畏光、脫水等)或?qū)嶒炃绑w重落在平均體重士2標(biāo)準(zhǔn)差以外者，均淘汰不用。小鼠籠內(nèi)放置美國NEPCO公司(Warrensburg，NY)實驗動物專用木屑墊料，經(jīng)滅菌后使用，每周更換2次。實驗飼料則是美國Purina公司的實驗鼠專用飼料PMI5001。飼養(yǎng)環(huán)境為23±2"的溫度、50±10%的相對濕度以及12小時光照與黑暗交替。2.小鼠的喂食實驗將小鼠隨機分成二組，每組12只，一組為IgY-HP實驗組，一組為水對照組。針對IgY-HP實驗組的小鼠，取約5.119mg的IgY-HP溶于約0.2ml的去離子水，形成IgY-HP懸浮液，每日以胃管口服給予該懸浮液，連續(xù)十周(從6周齡至16周齡)；而針對水對照組的小鼠，則是每日給予等量的去離子水。3.小鼠的致免疫作用實驗前述小鼠亦在喂食期間接受ova致免疫作用。詳言之，在小鼠6周齡尚未開始喂食實驗時，先由尾部采血，其后分別在小鼠7、10及13周齡時，進(jìn)行3次致免疫作用，其中以ova作為抗原與完全弗氏佐劑混合后，以皮下注射投予小鼠，進(jìn)行第1次致免疫作用，以及以ova作為抗原與不完全弗氏佐劑混合，以皮下注射投予小鼠，進(jìn)行第2次及第3次致免疫作用。3次免疫的ova使用劑量分別為2iig、10iig及10iig，每次注射體積為lOOiU。每次致免疫作用后定期自尾部采血。在小鼠16周齡完成最后一次喂食實驗后，以二氧化碳迷昏小鼠，以心臟采血方式采取約0.7至1.0ml血液，然后將小鼠安樂死后，全身噴酒精消毒，移至生物安全操作臺中，進(jìn)行后續(xù)采取脾臟的步驟。表1顯示所述之小鼠處理流程。表l:小鼠處理流程7實驗時間小鼠周齡(周)購入，適應(yīng)環(huán)境06秤重分籠，采血，開始灌食17第1次致免疫作用2839采血410第2次致免疫作用11612采血713第3次致免疫作用8149151016采血，犧牲小鼠實例4:小鼠的體重分析在前述十周的喂食期間，每周定時測量小鼠之體重，并觀察小鼠生長狀況。表2顯示小鼠體重測量結(jié)果。表2:小鼠體重測量結(jié)果實驗時間小鼠周齡水對照組IgY-HP實驗組_(n=12)_(n=12)620.9士1.020.9±0.7721.3±0.721.4±0.3819.6±0.619.8±0.6012921,2±1.021.3±0.741022.2±0.922.2±0.61123.4±0.723.1±0.761224.7士0.823.7±0.6*71325.1±0.824.1±0.6*81425.2±0.724.8±0.7*91525.8±1.225.1±0.6101625.9±1.125.3±0.61.結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean士SD)表示。體重單位為克(gm)。2.*表示與水對照組間有顯著差異(p<0.05)。如表2所示，在第6至8周期間，IgY-HP實驗組小鼠的體重出現(xiàn)低于水對照組者的現(xiàn)象，但后續(xù)第9至10周期間，IgY-HP實驗組與水對照組的小鼠體重則恢復(fù)無差異。因此，推測IgY-HP實驗組小鼠在第6至8周期間的體重降低為暫時性，與喂食成份無關(guān)。實例5:非特異性抗體總量分析將前述完成十周喂食實驗的小鼠犧牲后取得的全血，保存于4t:，以抗體檢測試劑(MouseIgELISAQuantitationKit,Bethyl公司，蒙哥馬利市，德州，美國)，依說明方式使用三明治型酵素連結(jié)免疫分析法(sandwichenzyme-linkedimmunosorbentassay,sandwich-ELISA)測定血液所含IgG抗體的總量。表3顯示非特異性IgG抗體總量之測量結(jié)果。表3:非特異性抗體總量測量結(jié)果IgG抗體總量(嗎/mL)水對照組IgY-HP實驗組(n=9)(n.致免疫作用前57±1251±8第1次致免疫作用120±14133士26第2次致免疫作用344±99533±173*第3次致免疫作用830±2461010±3171.結(jié)果以平均值+標(biāo)準(zhǔn)差(mean+SD)表示。2.*表示與水對照組間有顯著差異。如表3所示，IgY-HP的攝取可促使小鼠血液IgG抗體總量提升(第2次致免疫作用后)，到第3次致免疫作用后，IgY-HP實驗組的IgG抗體總量平均值仍高于水對照組者9(惟，二者間未顯示統(tǒng)計上的差異，推測是過早激活所致)。實例6:非特異性自然殺手細(xì)胞毒殺活性的分析將前述完成十周喂食實驗的小鼠犧牲后取出的脾臟，置于5ml培養(yǎng)液中。利用針筒推進(jìn)器的平尾端輕輕壓住脾臟并將之磨碎，直到顏色變成白色，表示結(jié)締組織間的脾臟細(xì)胞已游離至培養(yǎng)液中。然后，將含有脾臟細(xì)胞的培養(yǎng)液吸取至離心管，靜置5至IO分鐘，使得結(jié)締組織或大顆粒碎屑沈淀至下方。其后，將上方的細(xì)胞懸浮液吸取至另一離心管中，以250xg離心5分鐘。丟棄上清液后，輕拍管壁，使管底的細(xì)胞均勻散開。加入5ml冰冷的ACK紅血球瓦解緩沖液，與管中的細(xì)胞均勻混合，作用1分鐘后，加入5ml已回溫并含血清的培養(yǎng)液。接著再以250xg離心5分鐘，丟棄上清液后，以10ml的HBSS緩沖液清洗2次，將細(xì)胞懸浮于10ml培養(yǎng)基中。以臺盼蘭染色計算細(xì)胞懸浮液的濃度。利用細(xì)胞毒性分析套組(LIVE/DEADcell-mediatedcytotoxicitykit，美國分子探針公司，尤金市，美國)，檢測小鼠脾臟細(xì)胞中自然殺手細(xì)胞毒殺活性。簡言之，先以染劑DI0C18標(biāo)幟自然殺手細(xì)胞的標(biāo)的細(xì)胞Yac-l(37°C、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)，作用16小時)，然后將脾臟細(xì)胞與標(biāo)的細(xì)胞(E/T)以l:100或l:200的比例混合，于37°〇、5%0)2培養(yǎng)箱內(nèi)，作用4小時。陰性對照組則是以RPMI1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)取代脾臟細(xì)胞與標(biāo)的細(xì)胞混合。以流式細(xì)胞儀分"實驗組的標(biāo)的細(xì)胞死亡率一陰性對照組的標(biāo)的細(xì)胞死亡率"。表4顯示自然殺手細(xì)胞毒殺活性的分析結(jié)果。表4:自然殺手細(xì)胞活性分析結(jié)果自然殺手細(xì)胞活性(％)水對照組IgY-HP實驗組(n,自然殺手細(xì)胞活性(％)E/T=100:135.2±3,439.0±5.0E/T=200:139.9土3.145.8±5.3*1.結(jié)果以平均值+標(biāo)準(zhǔn)差(mean+SD)表示。2.*表示與水對照組間有顯著差異。如表4所示，IgY-HP實驗組的自然殺手細(xì)胞活性明顯地較水對照組者為高(p<0.05)，顯示IgY-HP具有促進(jìn)自然殺手細(xì)胞毒殺活性的作用。實例7:非特異性細(xì)胞激素分泌分析在24孔培養(yǎng)盤中，分別加入培養(yǎng)液(對照組)、含ConA(最終濃度5iig/ml)或LPS(最終濃度10iig/ml)之培養(yǎng)液，并加入實例4的脾臟細(xì)胞懸浮液，使每孔細(xì)胞總數(shù)為0.4X106個細(xì)胞。于37°C、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24及48小時后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。使用細(xì)胞激素檢驗套組(DuoSetELISADevelopmentSystem,美國R&D系統(tǒng)公司，明尼阿波里斯市，明尼蘇達(dá)州，美國)，以三明治型酵素連結(jié)免疫分析法(sandwichenzyme-linkedimmunosorbentassay,sandwich-ELISA)，測量細(xì)胞培養(yǎng)上清液中非特異性細(xì)胞激素IL_2、IFN-y、IL-4及IL-5的含量。表5顯示非特異性細(xì)胞激素的測量結(jié)果。10表5:非特異性細(xì)胞激素之測量結(jié)果水對照組IgY-HP實驗組(n=10)(n=10)IL-2(pg/mL)培養(yǎng)液17±9913±7ConA9423±246310225±2099LPS19土618±3IFN-y(pg/mL)i、-、.'-、、-0±00.37±1.18ConA3013±8143549±1213LPS960±5291513±658IL-4(pg/mL)培養(yǎng)彼0±00±1ConA337±189349±153LPS12±29±2*IL-5(pg/mL)培養(yǎng)液0±00±0ConA470土272260±93*LPS25±526±71.結(jié)果以平均值+標(biāo)準(zhǔn)差(mean+SD)表示。2.*表示與水對照組間有顯著差異。如表5所示，與水對照組相較，IgY-HP實驗組的Th2細(xì)胞激素IL_4、IL_5的分泌量明顯較低(P<0.05);顯示IgY具有抑制Th2免疫反應(yīng)的作用。實例8:特異性細(xì)胞激素分析以前述實例5的相同方式進(jìn)行特異性細(xì)胞激素的分析。簡言之，在24孔培養(yǎng)盤中，分別加入培養(yǎng)液(對照組)或含ova(最終濃度為100iig/ml)的培養(yǎng)液，并加入實例411的脾臟細(xì)胞懸浮液，使每孔細(xì)胞總數(shù)為0.4X106個細(xì)胞。于37°C、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24及48小時后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。使用前述細(xì)胞激素檢驗套組，測量細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ova特異性細(xì)胞激素IL-2、IFN-y、IL_4及IL_5的含量。表6顯示特異性細(xì)胞激素的測量結(jié)果。表6:特異性細(xì)胞激素的測量結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>[OO"]1.結(jié)果以平均值+標(biāo)準(zhǔn)差(mean+SD)表示。2.*表示與水對照組間有顯著差異。如表6所示，IgY-HP—方面可抑制ova特異性IL_4及IL_5的分泌，另一方面可促使ova特異性IFN-y的分泌顯著增加(p<0.05)，顯示IgY-HP可促進(jìn)特異性Thl細(xì)胞激素的分泌，并降低特異性Th2細(xì)胞激素的分泌。綜上，本發(fā)明的IgY-HP證實具提升自然殺手細(xì)胞毒殺活性、提高IFN-y的分泌及抑制IL-4及IL-5分泌的功效。吾人推測，本發(fā)明的免疫蛋黃凍干粉末(IgY-HP)含有抗體及各種活化的免疫因子，可促進(jìn)個體的免疫反應(yīng)趨向于Thl免疫反應(yīng)，避免Th2發(fā)炎反應(yīng)的發(fā)生，其有助于對抗外來病原及降低發(fā)炎反應(yīng)。權(quán)利要求一種免疫調(diào)節(jié)組合物，其包括一蛋黃產(chǎn)物，該蛋黃產(chǎn)物系來自一經(jīng)幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori)、其片段或組合致免疫的雌性禽類所產(chǎn)下的蛋。2.如權(quán)利要求l的組合物，其特征在于該禽類為雞、鴨、鵝。3.如權(quán)利要求l的組合物，其特征在于該禽類為雞。4.如權(quán)利要求l的組合物，其特征在于該蛋黃產(chǎn)物為冷凍干燥的粉末。5.如權(quán)利要求l的組合物，其特征在于其呈膠囊形式。6.如權(quán)利要求5的組合物，其特征在于該蛋黃產(chǎn)物為冷凍干燥的粉末，并入該膠囊中。7.如權(quán)利要求l的組合物，其特征在于其呈錠劑形式。8.如權(quán)利要求l的組合物，其特征在于其呈丸劑形式。9.如權(quán)利要求l的組合物，其特征在于其呈懸浮液形式。10.如權(quán)利要求l的組合物，其特征在于其呈顆粒形式。11.如權(quán)利要求l的組合物，其特征在于其系口服形式。12.如權(quán)利要求l的組合物，其特征在于其可用于調(diào)節(jié)一個體的免疫反應(yīng)。13.如權(quán)利要求l的組合物，其特征在于其可提升一個體的自然殺手細(xì)胞毒殺活性。14.如權(quán)利要求1的組合物，其特征在于其可促進(jìn)一個體的IFN-Y的產(chǎn)生。15.如權(quán)利要求1的組合物，其特征在于其可抑制一個體的IL-4的產(chǎn)生。16.如權(quán)利要求1的組合物，其特征在于其可抑制一個體的IL-5的產(chǎn)生。17.如權(quán)利要求12-16任一項的組合物，其特征在于該個體為人類。18.如權(quán)利要求l-4任一項的組合物，其特征在于其可作為食品添加物。19.一種免疫調(diào)節(jié)食品，其包括一蛋黃產(chǎn)物，該蛋黃產(chǎn)物系來自一經(jīng)幽門螺旋桿菌致免疫的雌性禽類所產(chǎn)下的蛋。20.如權(quán)利要求19的免疫調(diào)節(jié)食品，其特征在于該禽類為雞、鴨、鵝。21.如權(quán)利要求19的免疫調(diào)節(jié)食品，其特征在于該禽類為雞。全文摘要本發(fā)明系關(guān)于一種免疫調(diào)節(jié)組合物，其包括一來自經(jīng)幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori)致免疫的雌性家禽所產(chǎn)下的蛋的蛋黃產(chǎn)物。本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)組合物可調(diào)節(jié)一個體的免疫反應(yīng)。具體而言，該免疫調(diào)節(jié)組合物可在一個體中促進(jìn)IFN-γ的產(chǎn)生及抑制IL-4與IL-5的產(chǎn)生。文檔編號A61K35/74GK101766299SQ20091000190公開日2010年7月7日申請日期2009年1月7日優(yōu)先權(quán)日2009年1月7日發(fā)明者鐘宜書,陳昌平申請人:華肝基因股份有限公司