專利名稱：抑制腫瘤細胞而不影響正常細胞的藥物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及藥物組合物和治療癌癥的方法。特別地，涉及包括柔毛 水楊梅提取物和藥學上可接受的載體的藥物組合物及其在治療癌癥中的 用途。
背景技術：
根據(jù)癌癥所來源的細胞類型和細胞位置，癌癥可以分成數(shù)種類型，
即癌(cacinomas)，其發(fā)生自覆蓋身體外部和內(nèi)部表面的細胞，例如皮膚、 消化道或腺體；白血病，其從血液形成組織例如骨髓開始，并造成大量 的異常血細胞產(chǎn)生并進入血流；淋巴癌，其為起源自淋巴結(jié)和機體免疫 系統(tǒng)的組織的癌癥；黑素瘤，其發(fā)生在黑素細胞中；肉瘤，其來自骨骼 或肌肉的結(jié)締組織；及畸胎瘤，其來自生殖細胞中。
2007年，僅在美國就有超過140萬人被診斷患有癌癥，而約56萬人 死于癌癥，這僅次于心臟病。當前，常使用細胞毒性藥劑抑制或殺傷腫 瘤，這種清除針對快速生長細胞包括腫瘤細胞和正常細胞兩者。理想地， 下 一 代藥劑能夠抑制腫瘤細胞而不影響正常細胞。
在治療癌癥方面，植物的應用具有悠久的歷史(Cragg GM, Newman DJ: Medicinals for the millennia: The historical record(千年醫(yī)藥歷史的記 錄)爿朋iVn^ 5W 953:3-25, 2001; Newman DJ, Cragg GM, Snader KM: The influence of natural products on drug discovery(天然產(chǎn)物對藥物發(fā)現(xiàn)的 影響)iVaf 17:215-234, 2000; Cragg GM， Newman DJ， Snader KM:
Natural products in drug discovery and development(藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)中的 天然產(chǎn)物)J淑尸rod 60:52-60, 1997; Perry, L.M. Me血zW戶/aw" o/￡w
SoW/zeaW v4w'a(東亞及東南亞藥用植物).Cambridge, Mass: MIT Press, 133,(1980))。例如，紅豆杉中的紫杉醇適用于卵巢癌和乳腺癌，對肺癌、 大腸癌、黑色素瘤、頭頸部癌、淋巴瘤、腦瘤也都有一定療效。而長春花中的長春堿可以用于治療何杰金氏病和絨毛膜上皮癌，療效較好；對
淋巴肉瘤、網(wǎng)狀細胞肉瘤、急性白血病、乳腺癌、腎母細胞瘤、卵巢癌、 睪丸癌、神經(jīng)母細胞瘤和惡性黑色素瘤等也有一定療效。
發(fā)明概述
本發(fā)明涉及柔毛水楊對每(Gewm7z; om'CMw)有效成分、尤其是治療癌癥 的有效成分的提取方法，包括步驟a)用選自Cl-C4的第一醇溶液對柔 毛水楊梅進行提取；任選地b)依次用氯仿和選自Cl-C4的第二醇溶液對 步驟a)得到的提取物進行提取；和任選地c)對步驟b)得到的提取物進行 柱層析，其中使用選自Cl-C4的第三醇溶液平tf層析柱，使用選自Cl-C4 的第四醇溶液洗脫，收集洗脫組分。
另 一 方面，涉及使用本發(fā)明的提取方法產(chǎn)生的柔毛水楊梅提取物。 再一方面，涉及藥物組合物，包括本發(fā)明的柔毛水楊梅提取物和藥 學上可接受的載體。
又一方面，涉及本發(fā)明的柔毛水楊梅提取物在制備治療癌癥、或者 抑制腫瘤細胞生長和/或殺傷腫瘤細胞和/或誘導腫瘤細胞的凋亡或向良 性分化的藥物上的用途，優(yōu)選地所述腫瘤細胞為癌癥細胞。


通過參照以下附圖，本領域所屬技術人員能夠很好地理解本發(fā)明的 特征。
圖1表示從柔毛水楊梅分離GJ-B-3的流程圖。 圖2表示從柔毛水楊4每分離GJ-n-3的流程圖。
圖3表示50 pg/ml濃度下，在處理后不到24小時，GJ-n-3便開始侵襲 癌癥細胞，并且在48小時內(nèi)殺死60%-80%的癌癥細胞。
圖4表示GJ-B-3誘導的HepG2細胞凋亡。圖4a. GJ-B-3處理的HepG2 細胞(24小時)變得小而圓。圖4b.在處理開始時，綠色熒光的強度暗淡。然 而，處理24小時下，觀察到更多的焚光，從而說明更多的細胞(約90°/。)在經(jīng) 歷凋亡。圖4c.用作陰性對照的DMSO處理的HepG2細胞形態(tài)不規(guī)則。圖 4d.在用作陰性對照的DMSO處理的HepG2細胞中，沒有在核內(nèi)^r測到熒光。
圖5表示MIX對肝癌的治療性作用的評價。在右側(cè)的3只小鼠中，以 15嗎/ml每曰胃內(nèi)給藥3周，MIX明顯抑制腫瘤的生長并減小了腫瘤的大小。 經(jīng)比較，胃內(nèi)僅給H20的對照具有最大的腫瘤(左側(cè)的3只小鼠)。
圖6表示GJ-B-3誘導體內(nèi)所接種癌癥細胞的凋亡。圖6a表明與腫瘤細 胞共集中的顯著更多的熒光。圖6b表明來自受治動物的所接種癌癥細胞已 經(jīng)開始皺縮、變小并變圓。圖6c表明在來自用5。/。DMSO(GJ-B-3溶劑)處理 的動物的胂瘤細胞的核內(nèi)未顯示熒光。圖6d表明來自用5% DMSO(GJ-B-3 溶劑)處理的動物的腫瘤細胞具有顯著更大的尺寸。
圖7表示電鏡下的肺瘤細胞外觀。圖7a表明受治肺瘤細胞變得皺縮、 更小且更圓，所觀察細胞的表面幾乎沒有微絨毛。圖7b表明未治療HepG2 細胞的外形是不規(guī)則的，胂瘤細胞的尺寸顯著更大。未治療腫瘤細胞的表面 有豐富的微絨毛。
圖8表示MIX i秀導的體內(nèi)癌細胞凋亡和免疫反應。圖8a顯示MIX處 理的癌癥細胞。圖8b是圖8a上框部分的放大圖，圖8a和圖8b表明受治腫 瘤顯著地顯示癌癥細胞凋亡，存活的只是外面^f艮薄的一層和里面的少數(shù)團 塊。圖8c是圖8a下框部分的放大圖，圖8a和圖8c表明受治腫瘤周圍出現(xiàn) 許多淋巴細胞。圖8d顯示作為對照的腫瘤細胞。圖8e是圖8d上框部分的 放大圖。圖8d和圖8e表明采自對照個體的腫瘤具有大量存活的癌細胞。圖 8f是圖8d下框部分的放大圖。圖8d和圖8f表明對照腫瘤周圍幾乎沒有淋 巴細』包。
具體實施例方式
本發(fā)明提供柔毛水楊梅有效成分、尤其是治療癌癥的有效成分的提 取方法，包括步驟a)用選自Cl-C4的第一醇溶液對柔毛水楊梅進行提 取，任選地包括步驟b)依次用氯仿和選自Cl-C4的第二醇溶液對步驟 a)得到的提取物進行提取，以及任選地包括步驟c)對步驟b)得到的提 取物進行柱層析，其中^f吏用選自Cl-C4的第三醇溶液平tf層析柱，使用 選自Cl-C4的第四醇溶液洗脫，收集洗脫組分。
在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供柔毛水楊梅有效成分、尤其是治療癌癥的有效成分的提取方法，包括步驟a)用選自Cl-C4的第一醇溶液對柔毛水楊梅進行提取；b)依次用氯仿和選自Cl-C4的第二醇溶液對步驟a)得到的提取物進行提取；和c)對步驟b)得到的提取物進行柱層析，其中使用選自Cl-C4的第三醇溶液平衡層析柱，使用選自Cl-C4的第四醇溶液洗脫，收集洗脫組分。
化的步驟。
在本發(fā)明的實施方式中，所述步驟a)的柔毛水楊4每包括但不限于野生或種植的柔毛水楊梅以及遺傳改造的柔毛水楊梅，其植林和其離體培養(yǎng)物，及其一個或多個部分。所述柔毛水楊梅離體培養(yǎng)物例如是柔毛水楊梅原生質(zhì)體，又例如是柔毛水楊梅愈傷組織。
在本發(fā)明的實施方式中，第一醇溶液是曱醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇或^又丁醇，或其與水的混合物。例如，第一醇溶液是70%的乙醇。第一醇溶液相對于待提取柔毛水楊梅的用量，優(yōu)選為待提取柔毛水楊梅重量的l-20倍，更優(yōu)選1-10倍，最優(yōu)選10倍。
在本發(fā)明的實施方式中，所述步驟a)的提取可以是浸泡或滲濾。
在本發(fā)明的實施方式中，步驟a)在通常的提取溫度下進行，優(yōu)選在室溫下進行。步驟a)的提取可以進行多達數(shù)天，例如進行3天。步驟a)的提取可以是重復多次的提取，所得提取物可以是多次重復后合并的產(chǎn)物。步驟a)的提取物可以是經(jīng)過干燥的提取物，例如是噴霧干燥后的固體殘留物。
在本發(fā)明的一些實施方式中，本發(fā)明所述步驟b)的提取包括首先將步驟a)的提取物溶于或混懸于與氯仿不相溶的溶劑。特別地，首先將步驟a)的提取物溶于或混懸于水。特別地，步驟b)的氯仿相對于所述步驟a)的提取物的溶液或混懸液的用量為體積比不小于1，優(yōu)選為等體積。
第二醇溶液是曱醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇或叔丁醇，或其與水的混合物。例如，第二醇溶液是正丁醇。第二醇溶液相對于氯仿的用量優(yōu)選體積比不小于1，更優(yōu)選等體積。
在本發(fā)明的一些實施方式中，步驟b)的提取可以是重復多次的提取，例如重復2次。步驟b)的提取可以是萃取。步驟b)得到的提取物，即所述第二醇溶液提取物可以是過濾并干燥的提取物，其中干燥例如是噴霧干燥。
本發(fā)明所述步驟C)的層析柱的類型可以是任何用于對中藥提取物進
行層析的可商業(yè)購買的柱子。例如，所述層析柱是Sephadex，或DiaionHP20和反相柱。
在本發(fā)明的一些實施方式中，第三醇溶液是曱醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇或叔丁醇，或其與水的混合物。第四醇溶液是曱醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇或^又丁醇，或其與水的混合物。第三醇溶液和第四醇溶液可以是相同的醇溶液。
在一個實施方案中，所述柱層析使用10%乙醇溶液平衡的SephadexLH-20柱，用梯度濃度漸增的乙醇溶液洗脫，所述濃度選自10%-100%,并收集洗脫組分。特別地，采用濃度范圍為20% - 100°/。且梯度為10%的乙醇溶液洗脫，收集約30%乙醇溶液洗脫的組分。
在另一個實施方案中，所述柱層析使用10%曱醇溶液平衡的Sephadex LH-20柱，使用梯度濃度漸增的甲醇溶液洗脫，所述濃度選自10%-100%，并收集洗脫組分。特別地，采用濃度范圍為10%-100%且梯度為10°/。的曱醇溶液洗脫，收集約20%-40%曱醇溶液洗脫的組分。特別地，采用濃度范圍為10%- 100%且梯度為10%的曱醇溶液洗脫，收集約30%-50%曱醇溶液洗脫的組分。
另一方面，提供使用本文上述的提取方法產(chǎn)生的柔毛水楊梅提取物。
本發(fā)明的柔毛水楊梅提取物可以是主要含有單寧類和三萜皂苷類的提
本發(fā)明的柔毛水楊梅提取物抑制腫瘤細胞生長和/或殺傷腫瘤細胞和/或誘導腫瘤細胞的凋亡或向良性分化，但不影響或損傷正常細胞，即特異性抑制腫瘤細胞生長和/或殺傷腫瘤細胞和/或誘導腫瘤細胞的凋亡或向良性分化。本文所述腫瘤指良性或惡性腫瘤，優(yōu)選所述腫瘤細胞指癌癥細胞。本文所用術語"正常細胞"是尚未異常增殖而轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤細胞的細胞。
另一方面，涉及藥物組合物，包括本發(fā)明的柔毛水楊梅提取物和藥學上可接受的載體。優(yōu)選地，所述藥物組合物包括0.1- 1倍的治療有效量的柔毛水楊梅提取物。
再 一 方面，涉及本發(fā)明的柔毛水楊梅提取物在制備藥物或藥物組合物中的用途，所述藥物或藥物組合物用于治療癌癥，或者用于抑制腫瘤細胞生長和/或殺傷肺瘤細胞和/或誘導腫瘤細胞的凋亡或向良性分化。
治療有效量是足以誘發(fā)對受治個體的治療性作用的量。治療有效量的變化取決于受治疾病類型、給藥途徑、藥學上可接受的載體以及與其它治療性療法的可能的共同應用。
在一些實施方式中，本發(fā)明的柔毛水楊梅提取物是藥物組合物中唯一的治療活性成分。
在另 一些實施方式中，本發(fā)明的藥物組合物還包括其他治療活性成分。例如，本發(fā)明的藥物組合物還包括其他細胞毒性藥劑，所述細胞毒性藥劑選自放射性同位素、化療劑和毒素。
藥學上可接受的載體包括在藥物制劑中的非治療活性成分，例如與藥物給藥相容的任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包被物、抗細菌劑和抗真菌劑、等張劑和吸收延遲劑。
本領域技術人員已知將柔毛水楊梅提取物組方成或配制成藥物制劑的方法，例如在美國藥典以及類似參考文獻中描述或指出的標準方法。本發(fā)明的藥物組合物可以以各種劑型存在，包括但不限于片劑、丸劑、懸浮劑、霜劑和糊劑。
所述癌癥是諸如大鼠、小鼠和靈長類的哺乳動物的癌癥，優(yōu)選是人的癌癥。
所述癌癥包括但不限于前列腺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、肺癌、腎癌、膀胱癌和/或結(jié)腸直腸癌。特別地，所述癌癥是前列腺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌和肺癌的一種或多種。在優(yōu)選實施方式中，所述癌癥是前列腺癌、乳腺癌和肺癌的一種或多種。
所述癌癥包括原發(fā)性癌癥和轉(zhuǎn)移性癌癥。
所述癌癥的治療包括抑制腫瘤細胞生長和/或殺傷腫瘤細胞和/或誘導肺瘤細胞的凋亡或向良性分化。胂瘤細胞生長的抑制和/或腫瘤細胞的殺傷可以通過免疫系統(tǒng)進行，例如通過'淋巴細胞進4亍。肺瘤細胞的凋亡
誘導可以通過激活諸如caspase-8的凋亡相關蛋白來完成。所述腫瘤細胞包括但不限于前列腺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、肺癌、腎癌、膀胱癌和結(jié)腸直腸癌的肺瘤細月包。
所述癌癥的治療可以是無副作用的。所述副作用包括但不限于，消化障礙出現(xiàn)的胃腹胞脹、食欲減退、惡心干嘔、腹瀉等；骨髓抑制所出
現(xiàn)的白細胞下降、血小板減少、貧血；機體衰弱導致的全身疲乏、四肢無力、精神不振、甚至心慌、氣短、失眠、出虛汗、口干舌燥及脫發(fā)；以及發(fā)燒，患部疼痛、靜脈炎、口腔炎、食管粘膜充血水腫及潰瘍等炎癥反應。
所述癌癥的治療可以是無副作用的。在細胞水平上，抑制肺瘤細胞生長和/或殺傷腫瘤細胞和/或誘導腫瘤細胞的凋亡或向良性分化可以不伴隨對正常細胞的影響或損傷。
在本發(fā)明的 一 些實施方式中，所述藥物組合物的治療活性成分僅為本發(fā)明的柔毛水楊梅提取物，所述藥物組合物用于抑制腫瘤細胞生長和/或殺傷腫瘤細胞和/或誘導肺瘤細胞的凋亡或向良性分化但不影響或損傷正常細胞。
所述藥物或藥物組合物可以制備成用于包括但不限于口服、腸胃外、通過吸入、局部或全身性給藥的給藥途徑的制劑。腸胃外給藥例如靜脈、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、直腸或陰道給藥。吸入給藥例如鼻內(nèi)或口腔吸入給藥。局部給藥例如向表皮外部、口腔給藥，以及向耳、眼和鼻中以及不顯著進入血流的部位滴注給藥。全身性給藥例如口服、靜脈、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)給藥。
在特定實施方式中，所述藥物或藥物組合物可制備成通過靜脈或皮下給藥。在另一實施方式中，所述藥物或藥物組合物可制備成通過胃內(nèi)給藥。
在特定實施方式中，本發(fā)明的藥物組合物以50-200 pg/ml的治療活性成分柔毛水楊梅提取物給藥。治療有效量的實例還包括以治療活性成分柔毛水楊梅提取物計60嗎/ml、 125嗎/ml和180 pg/ml。在一個實施方式中，治療有效量是80mg-300mg/kg體重/日。在另一個實施方式中，治療有效量是50mg-100mg/kg體重/每日。在又一實施方式中，治療有效量是25-50 mg/kg/體重。給藥期間通常取決于藥劑的相對效力、受治疾病的嚴重性和治療有效量。給藥期間的實例包括不足24小時、24小時、48 小時、3周、23天、l個月和不足3個月。
本發(fā)明的藥物組合物可以與其它藥劑聯(lián)用以提供聯(lián)合治療。所述其 它藥劑可以組成同一組合物的一部分，或作為用于在同一時間或不同時 間給藥的分開的組合物。
實施例
參照以下實施例對本發(fā)明進行更詳盡的描述。但本發(fā)明的范圍不局限 于這些實施例。
用于本發(fā)明的所有操作步驟均遵從美國國立衛(wèi)生院出版的實驗室動物 看護及4吏用才旨南(Ae G^We々r Ae G^e am/ t/se o/丄"6on3to^y爿m'wa/力，并且 得到了香港中文大學動物實驗倫理委員會的批準。
除本文另外指明以外，本發(fā)明所用方法為本領域常規(guī)方法，本文不再贅述。
實施例1
從柔毛水楊梅分離活性組分
從植物柔毛水楊梅獲得活性組分，以進行下文公開的實驗。 如圖1所示，于7月從中國湖南省張家界采集所述植物，干燥(100kg)， 室溫下使用10倍體積的70。/。乙醇溶液(1000L)浸泡3天，收集提取液，重復 2次。合并所述提取物，將其噴霧干燥，以得到固體殘留物(10 kg)。將所述 固體殘留物懸浮于100LH2O,繼而用氯仿(100L)萃取2次，隨后用n-丁醇 (100L)萃取2次，以產(chǎn)生相應的組分。過濾并噴霧干燥所述n-丁醇(GJ-B)可 溶性組分，以產(chǎn)生#^狀組分。將n-丁醇可溶性組分應用于10%乙醇溶液平衡 的SephadexLH-20柱，并用梯度濃度漸增的(20%, 30%, 40%， 50%, 60%, 70%， 80%, 90%， 100%)乙醇溶液洗脫，分別從20%, 30%, 40%， 50%, 60%, 70%， 80%的乙醇梯度洗脫過程中解析出7種組分。
用約30%的乙醇溶液洗脫的組分3(GJ-B-3)表現(xiàn)強有力的抗肺瘤活性。 所述亞組分GJ-B-3包含約15種化合物(主要含有單寧類和三萜皂苷類)。實施例2
從柔毛水楊梅分離活性組分
從植物柔毛水楊梅獲得活性組分，以進行下文公開的實驗。
如圖2所示，于8月從中國廣東省采集所述植物，干燥(20kg),室溫下 使用70%乙醇溶液(2000 L)浸泡3天，收集提取液，重復1次。合并所述提 取物，將其噴霧干燥，以得到固體殘留物MIX。
將所述固體殘留物懸浮于10LH2O，繼而用氯仿(10L)萃取2次，隨后 用n-丁醇(10L)萃取2次，以產(chǎn)生相應的組分。過濾并噴霧干燥所述n-丁醇 (GJ-n)可溶性組分，以產(chǎn)生粉狀組分。隨后將其應用于10%曱醇溶液平衡的 SephadexLH-20柱，并用濃度漸增的(10%， 20%, 30%, 40%， 50%， 60%， 70%, 80%, 90%, 100%曱醇溶液洗脫，分別從10%， 20%， 30%， 40%, 50%, 60%, 70%, 80%的曱醇梯度洗脫過程中解析出9種組分。
用約20°/。-40%的曱醇溶液洗脫的組分2(GJ-n-2)和用約30%-50%的曱醇 溶液洗脫的組分3(GJ-n-3)表現(xiàn)強有力的抗腫瘤活性。
實施例3
GJ-B-3和GJ-n-3誘導的體外癌癥細胞系死亡
分別使用GJ-B-3和GJ-n-3在體外測試了 8種癌癥細胞系，包括PC3 (前 列腺癌)、MCF7(乳腺癌)、HepG2和SK-HEP-1 (肝癌)、腎癌細胞抹GRC-1、 膀胱癌細胞系T24、 MKN28 (胃癌)以及H292 (肺癌)。大鼠骨髓衍生的間充 質(zhì)干細胞和C2C12 (小鼠成肌細胞細胞系)被用作正常對照。
實驗表明，20嗎/ml濃度下，在處理后約12-18小時，GJ-B-3便開始侵 襲癌癥細胞，并且在48小時內(nèi)殺死60%-80%的癌癥細胞。48小時處理后， 殘留的癌癥細胞喪失其分裂潛能，即使將其再在不含GJ-B-3的培養(yǎng)基培養(yǎng) 也是如此。所有^皮測癌癥細胞系對GJ-B-3處理均產(chǎn)生了顯著反應，其中PC3、 MCF7和H292對GJ-B-3治療最為敏感。
50昭/ml濃度下，在處理后不到24小時，GJ-n-3便開始侵襲癌癥細胞， 并且在48小時內(nèi)殺死60%-80%的癌癥細胞(圖3)。 48小時處理后，殘留的 癌癥細胞完全喪失或者幾乎喪失其分裂潛能，即使將其再在不含GJ-n-3的培 養(yǎng)基培養(yǎng)也是如此。所有被測癌癥細胞系對GJ-n-3處理均產(chǎn)生了顯著反應，其中PC3、 MCF7和H292最為敏感。 實施例4
GJ-B-3誘導的和GJ-n-3誘導的體外癌癥細胞凋亡
Tunnel實驗提示GJ-B-3誘導的和GJ-n-3誘導的體外諸如HepG2細胞的 癌癥細胞生長抑制的可能機制在于激活諸如HepG2細胞的癌癥細胞凋亡途 徑。這由可商購的caspase-8焚光分析試劑盒證明。在分別用10-20 ng/ml GJ-B-3和GJ-n-3處理HepG2細胞后，相對于對照組，caspase-8活性均漸增 并在18小時達到峰值。
隨著GJ-B-3或GJ-n-3濃度的增加，caspase-8的活性也增加，高濃度 GJ-B-3或GJ-n-3(20 i!g/ml)下caspase-8的活性顯著高于低濃度GJ-B-3或 GJ-n-3(10嗎/ml)下的活性(367.3 ± 6.7對286.6 ± 6.3, P O.Ol),而空白對照 組的caspase-8活性更4氐(76.5 ± 5.3)。
GJ-B-3或GJ-n-3處理組中，H印G2細胞凋亡速率顯著高于空白對照組 中的凋亡速率(P <0.001)。因此提示GJ-B-3或GJ-n-3能夠通過caspase-8信 號轉(zhuǎn)導通路，以時間依賴或濃度依賴方式誘導所培養(yǎng)HepG2細胞的凋亡。
為進一步確定GJ-B-3或GJ-n-3的抗增殖作用機制，用20 |ig/ml的GJ-B-3 或GJ-n-3以時間進程方式處理HepG2細胞，以確定該生物活性組分是否通 過凋亡或壞死特異性^"導HepG2細胞死亡。
用GJ-B-3或GJ-n-3處理24小時的HepG2細胞表現(xiàn)凋亡活性，用焚光 12 dUTP標記核內(nèi)片段化的DNA。在治療開始時，綠色熒光的強度暗淡。 然而，治療24小時下，觀察到更多的熒光，從而說明更多的細胞(約90%) 在經(jīng)歷凋亡。在用作陰性對照的DMSO處理的HepG2細胞中，沒有在核內(nèi) 檢測到熒光，這提示片段化的DNA的含量低于GJ-B-3處理組(圖4)。
在GJ-B-3或GJ-n-3處理后，凋亡細胞的百分比以時間進程方式增加。 24小時下大于50%，而至48小時為約90%。代表對照的未處理細胞顯示僅 有5%的凋亡造成的細胞死亡。
實施例5
MIX誘導的和GJ-B-3誘導的HepG2來源的肝腫瘤生長抑制為評價MIX或GJ-B-3對肺瘤的潛在治療性作用，測試了肝癌動物模型 中MIX或GJ-B-3的抗癌作用。
取對數(shù)生長期的人肝癌HepG2細胞，2.5 g/L胰酶消化后，用無血清 DMEM配成1 x 101G細胞/L的單細胞懸液。在無菌條件下接種于棵鼠皮下， 0.2 mL/只(相當于每只棵鼠接種2xl(^個腫瘤細胞)。接種1周后，可見腫瘤 生長。當腫瘤大小達到直徑約為3-4mm時(接種IO天以后)，將荷瘤棵鼠按 腫瘤大小隨機分為2組，每組7-8只棵鼠，雌雄兼有(l)給藥組。每日給藥， 共給3周；(2)未治療對照組。自接種后每日測量棵鼠體質(zhì)量，每周測量棵鼠 腫瘤的長徑a和短徑b，并按以下公式計算相對體積V = 0.5ab2。各組按時 間點的平均瘤體積作生長曲線圖。末次給藥后24h時處死動物，剝離腫瘤稱 取質(zhì)量。做大體和病理觀察。實驗重復2次。
結(jié)果表明，MIX在控制肝癌細胞生長和擴散上是有效的。在以 50-200ng/ml(80-300mg/kg體重/日)每日胃內(nèi)給藥3周后，MIX顯著減小了腫 瘤尺寸(圖5)。
GJ-B-3在控制肝癌細胞生長和擴散上是有效的。在以50mg-100mg/kg 體重/每日口月13周后，GJ-B-3同樣也顯著減小了腫瘤尺寸。
實施例6
GJ-B-3誘導的體內(nèi)癌癥細胞凋亡
為證明GJ-B-3諸導的體內(nèi)癌癥細胞死亡是通過在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中發(fā) 現(xiàn)的凋亡，將HepG2細胞接種于棵小鼠皮下。每日接種所述癌癥細胞， 連續(xù)2周。接種結(jié)束1周后，通過實驗動物的尾靜脈注射GJ-B-3(25mg/kg 體重)。
結(jié)果證明GJ-B-3誘導體內(nèi)所接種癌癥細胞的凋亡。來自受治動物的 所接種癌癥細胞已經(jīng)開始皺縮、變小并變圓。觀察到與腫瘤細胞共集中 的顯著更多的熒光，這說明這些腫瘤細胞正顯著地經(jīng)歷凋亡。經(jīng)比較， 來自用5% DMSO(GJ-B-3溶劑)處理的動物的腫瘤細胞顯示顯著更大的尺 寸，并且在腫瘤細胞的核內(nèi)未顯示熒光(圖6)。這一發(fā)現(xiàn)與體外實驗的結(jié) 果一致。
在電鏡下，未治療HepG2細胞的外形是不規(guī)則的，腫瘤細胞的尺寸顯著更大。未治療腫瘤細胞的表面有豐富的微絨毛。經(jīng)比較，受治腫瘤 細胞變得皺縮、更小且更圓。所觀察細胞的表面幾乎沒有微絨毛(圖7)。
實施例7
MIX誘導的體內(nèi)癌癥細胞凋亡和免疫反應
受治腫瘤的HE(蘇木精和伊紅)染色結(jié)果顯著表明癌癥細胞的凋亡，這與 體外研究獲得的結(jié)果一致，即存活的只是外面很薄的一層和里面的少數(shù)團 塊。另外，在受治腫瘤中，出現(xiàn)大量淋巴細胞圍繞所述腫瘤。經(jīng)比較，采自 對照組的腫瘤表現(xiàn)出更有活力的癌細胞，并且?guī)缀鯖]有淋巴細胞圍繞(圖8)。
根據(jù)所述結(jié)果，MIX在體外和體內(nèi)的抗肺瘤作用更加令人確信。另夕卜， 在體內(nèi)，MIX激活了對癌癥細胞的免疫反應。
實施例8
MIX誘導的對患者的抗癌作用
在已使用MIX作抗肺瘤藥的全部3例患者中，均具有顯著的治療作用。 簡述如下
a. 來自美國的乳腺癌患者1例用70%乙醇提取液5克/天，口服，給 藥23天后，她的CEA水平便分別從4.5至3.8降到4.12至2.59。用螺旋計 算機X光斷層造影掃描(CAT)與正子放射型計算機斷層攝影(PET)檢查未發(fā) 現(xiàn)乳腺癌及轉(zhuǎn)移病灶。
b. 來自美國的前列腺癌患者1例用70%乙醇提取液5克/天，口服， 給藥23天后，他的PSA水平便保持穩(wěn)定。用螺旋計算機X光斷層造影掃描 (CAT)與正子放射型計算機斷層攝影(PET)檢查，發(fā)現(xiàn)他的肺部轉(zhuǎn)移病灶縮 小。
c. 來自澳門的前列腺癌患者l例(體重=65公斤)，用70%乙醇提取液 5-9克/天，口服，頭兩周5克/天，后兩周9克/天。給藥30天后，他的PSA 水平便分別從4.4至4.0降到3.6。用螺旋計算機X光斷層造影掃描(CAT) 與正子放射型計算機斷層攝影(PET)檢查未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶。
在所有3個病例中，對他們的給藥均沒有出現(xiàn)副作用。在本發(fā)明中引用的所有參考文獻，包括但不限于公開和未公開的發(fā)
本說明書的一部分。當通過參考方式引入的公開和專利或?qū)＠l(fā)明與本
代和/或優(yōu)先于任何這樣的抵觸材料。
以上描述公開了本發(fā)明的多種方法、產(chǎn)物、組合物和用途。本發(fā)明 允許對所述方法、產(chǎn)物、組合物和用途進行修飾。這樣的修飾對于考慮 本公開的本領域所屬技術人員而言是顯而易見的。因此，本發(fā)明并非意 在限于本文所公開的特定實施方式，而是覆蓋了在本發(fā)明真正范圍和精 神之內(nèi)的全部修飾和改變。
權利要求
1.藥物組合物，包括治療有效量的柔毛水楊梅(Geum japonicum)提取物和藥學上可接受的載體，所述柔毛水楊梅提取物的制備包括如下步驟a)用選自C1-C4的第一醇溶液對柔毛水楊梅進行提??；任選地，b)依次用氯仿和選自C1-C4的第二醇溶液對步驟a)得到的提取物進行提取；和任選地，c)對步驟b)得到的提取物進行柱層析，其中使用選自C1-C4的第三醇溶液平衡層析柱，使用選自C1-C4的第四醇溶液洗脫，收集洗脫組分。
2. 如權利要求1所述的藥物組合物，其中所述第一醇溶液是70°/。 乙醇溶液。
3. 如權利要求1或2所述的藥物組合物，其中所述第二醇溶液是 正丁醇。
4. 如權利要求1-3中任一項所述的藥物組合物，其中所述第三醇 溶液是10%曱醇溶液，所述第四醇溶液是梯度濃度漸增的曱醇溶液。
5. 如權利要求4所述的藥物組合物，其中收集的洗脫組分是約 30%-50%曱醇溶液洗脫的組分。
6. 如權利要求1-3中任一項所述的藥物組合物，其中所述第三醇 溶液是10%乙醇溶液，所述第四醇溶液是梯度濃度漸增的乙醇溶液。
7. 如權利要求6所述的藥物組合物，其中收集的洗脫組分是約 3 0 %乙醇溶液洗脫的組分。
8. 如權利要求5或7所述的藥物組合物，其中所述層析柱是 Sephadex LH-20柱。
9. 柔毛水楊梅(Gewm y'a/ om'cwm)提取物在制備用于治療癌癥的藥 物上的用途，所述柔毛水楊梅提取物通過以下步驟產(chǎn)生a)用選自Cl-C4的第一醇溶液對柔毛水楊梅進行提取； 任選地，b)依次用氯仿和選自Cl-C4的第二醇溶液對步驟a)得到的提取物進行提?。缓腿芜x地c)對步驟b)得到的提取物進行柱層析，其中使用選自Cl-C4的第三醇溶液平4軒層析柱，使用選自Cl-C4的第四醇溶液洗脫，收集洗脫組分。
10. 如權利要求9所述的用途，其中所述第一醇溶液是70%乙醇 溶液。
11. 如權利要求9或IO所述的用途，其中所述第二醇溶液是正丁醇。
12. 如權利要求9-11中任一項所述的用途，其中所述第三醇溶液 是10%曱醇溶液，所述第四醇溶液是梯度濃度漸增的曱醇溶液。
13. 如權利要求12所述的用途，其中收集的洗脫組分是約 30%-50%曱醇溶液洗脫的組分。
14. 如權利要求9-11中任一項所述的用途，其中所述第三醇溶液 是10%乙醇溶液，所述第四醇溶液是梯度濃度漸增的乙醇溶液。
15. 如權利要求14所述的用途，其中收集的洗脫組分是約30%乙 醇溶液洗脫的組分。
16. 如權利要求13或15所述的藥物組合物，其中所述層析柱是 Sephadex LH-20柱。
17. 如權利要求9-16中任一項所述的用途，其中所述癌癥是前列 腺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、肺癌、腎癌、膀胱癌和結(jié)腸直腸癌的一 種或多種。
全文摘要
本發(fā)明涉及藥物組合物和治療癌癥的方法。特別地，涉及包括治療有效量的植物提取物和藥學上可接受的載體的藥物組合物以及使用其治療癌癥的方法。
文檔編號A61K36/185GK101632735SQ20091000524
公開日2010年1月27日 申請日期2009年1月20日 優(yōu)先權日2007年7月19日
發(fā)明者張捷婷, 明 李, 林曉莉, 蕾 程, 趙文超, 浩 陳, 陳樂宗 申請人:香港中文大學