專利名稱：：抗腫瘤活性精制番荔枝總內(nèi)酯及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種植物提取物，具體是涉及一種精制番荔枝總內(nèi)酯和其制備方法及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：番荔枝內(nèi)酯是一類從番荔枝科植物中提取分離得到的天然化合物，番荔枝內(nèi)酯類化合物具有廣泛的生物活性，最典型的是殺蟲(chóng)和抗腫瘤細(xì)胞活性，研究顯示番荔枝內(nèi)酯在體內(nèi)外具有強(qiáng)大的腫瘤細(xì)胞毒性，而且對(duì)多種腫瘤細(xì)胞都顯示較好的生物活性，研究表明番荔枝內(nèi)酯抗腫瘤活性的作用機(jī)理是通過(guò)阻斷線立體NADH氧化還原酶，從而阻止呼吸鏈電子的傳遞，抑制腫瘤細(xì)胞ATP的生成，使腫瘤細(xì)胞因饑餓而死亡,其作用機(jī)制獨(dú)特,不同于一般抗腫瘤藥物的作用機(jī)制，被喻為"明曰抗癌之星"?，F(xiàn)有技術(shù)中國(guó)發(fā)明專利(CN1739586A)公開(kāi)了番荔枝粗提取物，中國(guó)發(fā)明專利(CN1224016A)公開(kāi)了番荔枝總內(nèi)酯，但現(xiàn)有技術(shù)中存在成分復(fù)雜，成分組成不明確，低活性成分含量高，難以控制藥物的質(zhì)量和藥效。本發(fā)明提供的精制番荔枝總內(nèi)酯中主要成分史可莫辛(1)和番荔枝塔亭戊(2)的結(jié)構(gòu)式分別如下所示
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明目的本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種成分清楚，質(zhì)量可控，由史可莫辛和番荔枝塔亭戊為主要成份的精制番荔枝總內(nèi)酯和其制備的方法，本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供該精制番荔枝總內(nèi)酯在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。技術(shù)方案本發(fā)明提供的精制番荔枝總內(nèi)酯由番荔枝內(nèi)酯史可莫辛和番荔枝塔亭戊為主要成份，其通過(guò)以下方法制得取番荔枝的根、葉、樹(shù)皮或種子粉碎后用石油醚、氯仿、乙4酸乙酯其中之一或它們的混合溶劑滲漉，在低于6(TC減壓回收得到濃縮液、靜置、離心、取離心所得上層液，加入1至HO倍量的石油醚或石油醚和水的混合溶液，在50至85t:的水浴中加熱溶解，吸取上層石油醚層，重復(fù)上面操作1到5次，合并石油醚溶液、濃縮、得濃縮物后，干燥，得到番荔枝總內(nèi)酯，然后取番荔枝總內(nèi)酯，進(jìn)行硅膠柱層析，用石油醚-乙酸乙酯或氯仿-甲醇梯度洗脫，用薄層色譜跟蹤，收集史可莫辛和番荔枝塔亭戊相應(yīng)流分，濃縮干燥得到由史可莫辛和番荔枝塔亭戊為主要成份的精制番荔枝總內(nèi)酯。本發(fā)明提供的精制番荔枝總內(nèi)酯中史可莫辛和番荔枝塔亭戊的重量百分含量為50%到90%。'本發(fā)明提供的精制番荔枝總內(nèi)酯的制備方法，其包括以下步驟①取番蔡枝植物的根、葉、樹(shù)皮或種子去雜，粉碎后用石油醚、氯仿、乙酸乙酯其中之一或它們的混合溶劑滲漉后，在低于60'C減壓回收得到濃縮液、靜置、離心、得上層濃縮液；②取步驟①離心所得上層液加入1到10倍量的石油醚或石油醚和水的混合溶液，然后在50至85。C的水浴中加熱溶解，吸取上層石油醚層，重復(fù)上面操作l-5次，合并石油醚溶液，濃縮，得濃縮物后，干燥，得到番荔枝總內(nèi)酯；③取步驟②所得的番荔枝總內(nèi)酯，進(jìn)行硅膠柱層析，用石油醚-乙酸乙酯或氯仿-甲醇梯度洗脫，用薄層色譜跟蹤，收集史可莫辛和番荔枝塔亭戊相應(yīng)流分，濃縮干燥得到由史可莫辛和番荔枝塔亭戊為主要成份的精制番荔枝總內(nèi)酯。以上制備方法中步驟③所用的柱層析硅膠為100到300目，番荔枝總內(nèi)酯與柱層析所用硅膠的重量比為1:3到1:6,洗脫劑石油醚-乙酸乙酯或氯仿-甲醇梯度洗脫比例為50:1到2:1。上述硅膠薄層色譜跟蹤所用的硅膠為硅膠G(CMC鈉為粘合劑)，顯色劑為碘蒸汽、堿性苦味酸試劑或kedde試劑即3，5-二硝基苯甲酸和氫氧化鈉試劑，展開(kāi)劑為石油醚-乙酸乙酯(9:2)。本發(fā)明制備精制番荔枝總內(nèi)酯的另一種制備方法，其包括以下步驟①把番荔枝植物的根、葉、樹(shù)皮或種子去雜，粉碎過(guò)20目后，用醇類(乙醇、甲醇、正丁醇、丙二醇或異丙醇)溶劑做夾帶劑，采用超臨界二氧化碳方法萃取，得到二氧化碳萃取液，在低于60'C減壓回收得濃縮液；②取步驟①所得的濃縮液加入1到10倍量的石油醚或石油醚和水的混合溶液，然后在50至85'C的水浴中加熱溶解，吸取上層石油醚層，重復(fù)上面操作l-5次，合并石油醚溶液，濃縮，得濃縮物后，干燥，得到番荔枝總內(nèi)酯；③取步驟②所得的番荔枝總內(nèi)酯，進(jìn)行硅膠柱層析，用石油醚-乙酸乙酯或氯仿-甲醇梯度洗脫，用薄層色譜跟蹤，收集史可莫辛和番荔枝塔亭戊相應(yīng)流分，濃縮干燥得到由史可莫辛和番荔枝塔亭戊為主要成份的精制番荔枝總內(nèi)酯。以上制備方法中步驟①所用的夾帶劑(乙醇、甲醇、正丁醇、丙二醇或異丙醇)的用量5以毫升記為藥材質(zhì)量克的0%到50%，萃取溫度為20'C到50°C，萃取壓強(qiáng)為10Mpa到40Mpa，萃取時(shí)間為1到4小時(shí)。本發(fā)明超臨界二氧化碳萃取方法，一個(gè)優(yōu)選萃取條件為夾帶劑為乙醇，其用量毫升為藥粉的重量克的20%，萃取溫度為35'C，萃取壓強(qiáng)為25Mpa，萃取時(shí)間為2小時(shí)。本發(fā)明超臨界二氧化碳萃取方法，另一個(gè)優(yōu)選萃取條件為夾帶劑為甲醇，其用量毫升為藥粉的重量克的30%,萃取溫度為35'C,萃取壓強(qiáng)為30Mpa,萃取時(shí)間為3小時(shí)。上述硅膠薄層色譜所用的硅膠為硅膠G(CMC鈉為粘合劑)，顯色劑為碘蒸汽、堿性苦味酸試劑或kedde試劑即3，5-二硝基苯甲酸和氫氧化鈉試劑，展開(kāi)劑為石油醚-乙酸乙酯(9:2)。以上兩種制備精制番蕩枝總內(nèi)酯方法的步驟②中采用1到IO倍量的石油醚或石油醚和水的混合溶液，在50至85'C的水浴中加熱溶解，番荔枝總內(nèi)酯能很好的溶于上層石油醚層，可以快速有效的去除其它極性大的色素等雜質(zhì)，經(jīng)過(guò)重復(fù)上面操作1-5次，能得到高純度的番荔枝總內(nèi)酯。為了更好的控制本發(fā)明提供的精制番荔枝總內(nèi)酯的質(zhì)量，本發(fā)明采用比色法控制精制番荔枝總內(nèi)酯中番荔枝總內(nèi)酯的含量和采用高效液相色譜法控制精制番荔枝總內(nèi)酯中史可莫辛和番荔枝塔亭戊的含量。比色法的條件為精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品或樣品適量加入lX堿性苦味酸溶液0.5ml(即1%苦味酸乙醇溶液與5%NaOH水溶液用前等體積混合)再用95%乙醇定容至10ml，于70'C水浴鍋中水浴10min，冷卻至室溫后于470nm處測(cè)吸光度，用外標(biāo)法計(jì)算精制番荔枝總內(nèi)酯中番荔枝總內(nèi)酯的含量。高效液相色譜條件和儀器參數(shù)為安捷倫1200系列，反相碳18柱(220cm，4.6mm,0.5拜)，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm，流速為1ml/min，柱溫為3(TC，流動(dòng)相是甲醇-水(85:15)，用峰面積積分，外標(biāo)法計(jì)算精制番荔枝總內(nèi)酯中史可莫辛和番荔枝塔亭戊的含量。它們的回歸方程為番荔枝內(nèi)酯回歸方程相關(guān)系數(shù)r線性范圍(pg/ml)最低檢測(cè)限(ug/ml)1.番荔枝塔亭戊Y=6362.9x-777.380.99953.8~45.60.082.史可莫辛Y=3632.8X—423.930.99954.3—51.70.17為實(shí)現(xiàn)精制番荔枝總內(nèi)酯在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，把番荔枝內(nèi)酯和藥學(xué)上可接受的載體制成片劑，膠囊劑，噴霧劑，注射劑，脂肪乳劑，栓劑，微囊，軟膏劑或透皮控釋貼劑，用于口服或外用。為實(shí)現(xiàn)精制番荔枝總內(nèi)酯在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，做成片劑或膠囊劑時(shí)加入乳糖和淀粉，必要時(shí)加入潤(rùn)滑劑硬脂酸鎂，整粒、干燥、壓片成片劑或裝膠囊成膠囊劑；做成栓劑時(shí)加入可可脂、蜂蠟或聚乙二醇,混勻，制成栓劑；做成注射劑時(shí)加入脂肪乳劑、花生油、卵6磷脂或甘油，過(guò)濾、滅菌制成注射劑；做成外用制劑時(shí)加入賦形劑凡士林、丙二醇或聚氧化乙烯。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的優(yōu)點(diǎn)有1.本發(fā)明所用的原材料可以是根葉、樹(shù)皮或種子，原材料的來(lái)源豐富，價(jià)格低廉，易得。2.本發(fā)明提供的精制番荔枝總內(nèi)酯含量高，成分清楚，活性強(qiáng)，不確定低活性成分少，藥效好，質(zhì)量安全可控。'3.本發(fā)明提供的由史可莫辛和番荔枝塔亭戊為主要組成的精制番荔枝總內(nèi)酯，藥理活性表明不是兩者的簡(jiǎn)單的疊加，相互有協(xié)同作用。4.本發(fā)明提供的精制番荔枝總內(nèi)酯的制備方法工藝簡(jiǎn)單、消耗低、得率高，能實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大生產(chǎn)，特別是本發(fā)明提供的超臨界二氧化碳萃取方法提取效率高，只需少量的乙醇，避免采用有毒有機(jī)試劑，且萃取的溫度低，能更好的保證精制番荔枝總內(nèi)酯結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，保證藥效。制備方法中采用溶劑萃取法精制番荔枝總內(nèi)酯，即采用1到IO倍量的石油醚或石油醚和水的混合溶液，在50至85'C的水浴中加熱溶解，吸取上層石油醚層，重復(fù)上面操作l-5次，合并石油醚溶液，濃縮，得濃縮物后，干燥得到精制番荔枝總內(nèi)酯，該方法能快速的去除雜質(zhì)，得到純度高的精制番荔枝總內(nèi)酯，工藝簡(jiǎn)單，成本低，效率高。5.本發(fā)明提供的精制番荔枝總內(nèi)酯可以和不同的賦形劑制備成不同的藥物劑型，能方便臨床應(yīng)用。圖1為本發(fā)明精制番荔枝總內(nèi)酯的制備工藝流程圖。具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實(shí)施例1:番荔枝總內(nèi)酯的提取，取番荔枝干燥種子2千克，粉碎，種子粗粉用IO倍量的氯仿滲漉二次，用硅膠薄層色譜檢測(cè)，番荔枝內(nèi)酯近滲漉提取完全，在低于60'C減壓回收得到濃縮液，靜置24小時(shí)，離心，3000轉(zhuǎn)每分鐘，然后取離心所得上層濃縮液(88.7g),即得番荔枝總內(nèi)酯粗提取物。取番荔枝總內(nèi)酯粗提取物80g，加入l倍量的石油醚，置6(TC水浴中加熱溶解，混勻，靜置分層后，吸取上層石油醚層，濃縮，干燥，重復(fù)上面操作3次，得到番荔枝總內(nèi)酯46g。取上述番荔枝總內(nèi)酯46g，拌等量的硅膠后，研勻，上硅膠(400g，200到300目，青島海洋化工廠)柱層析，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，石油醚-乙酸乙酯(50:l)1到20流份，石油醚-乙酸乙酯(20:1)21到50流份，石油醚-乙酸乙酯(10:1)51到68流份，石油醚-乙酸乙酯(2:1)69到85流份每份接收l(shuí)OOml。用硅膠薄層色譜跟蹤，分別收集史可莫辛(17到31流份沐番荔枝塔亭戊42到59流份)，合并，在低于60'C減壓回收，得到精制的由史可莫辛和番荔枝塔亭戊組成的番荔枝總內(nèi)酯5.28。(批號(hào)Ol)實(shí)施例2:按實(shí)施例l的方法提取番荔枝總內(nèi)酯粗提取物，從2千克番荔枝干燥種子中提取得到總內(nèi)酯提取物86.6g，取上述番荔枝總內(nèi)酯粗提取物82g，加入10倍量的石油醚-水(5:l)，置80°C水浴中加熱溶解，混勻，靜置分層后，吸取上層石油醚層，濃縮，干燥，重復(fù)上面操作3次，得到番荔枝總內(nèi)酯47g。取上述番荔枝總內(nèi)酯47g，拌等量的硅膠后，研勻，上硅膠(400g，200到300目，青島海洋化工廠)柱層析，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，石油醚-乙酸乙酯(50:1)1到21流份，石油醚-乙酸乙酯(20:1)22到55流份，石油醚-^酸乙酯、(10:1)56到70流份，石油醚-乙酸乙酯(2:1)71到88流份每份接收100ml用硅膠薄層色譜跟蹤，分別收集史可莫辛(19到32流份)和番荔枝塔亭戊(40到55流份)，合并，在58'C減壓回收，得到精制的由史可莫辛和番荔枝塔亭戊組成的番荔枝總內(nèi)酯5.6g。實(shí)施例3:番荔枝總內(nèi)酯的提取，取番荔枝干燥種子2千克，粉碎，種子粗粉用IO倍量的乙酸乙酯滲漉二次，用硅膠薄層色譜檢測(cè)，番荔枝內(nèi)酯近提取完全，在低于60'C減壓回收得到濃縮液，靜置24小時(shí)，離心，3000轉(zhuǎn)每分鐘，然后取離心所得上層濃縮液(76.8g)，即番荔枝總內(nèi)酯粗提取物。取番荔枝總內(nèi)酯粗提取物75g，加入5倍量的石油醚-水(l:l)，置50'C水浴中加熱溶解，混勻，靜置分層后，吸取上層石油醚層，濃縮，干燥，重復(fù)上面操作1次，得到番荔枝總內(nèi)酯41g。取上述番荔枝總內(nèi)酯40g，拌等量的硅膠后，研勻，上硅膠(400g，200到300目，青島海洋化工廠)柱層析，用氯仿-甲醇梯度洗脫，氯仿-甲醇(50:1)1到18流份，氯仿-甲醇(20:l)19到30流份,氯仿-甲醇(10:1)31到58流份，氯仿-甲醇(2:1)59到80流份每份接收100ml。用硅膠薄層色譜跟蹤，分別收集史可莫辛(14到28流份)和番荔枝塔亭戊36到50流份)，合并，在55°0減壓回收，得到精制的由史可莫辛和番荔枝塔亭戊組成的番荔枝總內(nèi)酯4.6g。實(shí)施例4:按實(shí)施例3的方法提取番荔枝總內(nèi)酯粗提取物，從2千克番荔枝千燥種子中提取得到總內(nèi)酯提取物77.2§，取上述番荔枝總內(nèi)酯粗提取物75g，加入8倍量的石油醚-水(3:l)，置70°C水浴中加熱溶解，混勻，靜置分層后，吸取上層石油醚層，濃縮，干燥，重復(fù)上面操作3次，得到番荔枝總內(nèi)酯38g。取上述番荔枝總內(nèi)酯38g，拌等量的硅膠后，研勻，上硅膠(350g，200到300目，青島海洋化工廠)柱層析，用氯仿-甲醇梯度洗脫，氯仿-甲醇(50:1)1到13流份，氯仿-甲醇(20:l)14到35流份，氯仿-甲醇(10:1)36到53流份，氯仿-甲醇(2:1)54到70流份每份接收100ml，用硅膠薄層色譜跟蹤，分別收集史可莫辛(ll到26流份)和番荔枝塔亭戊(30到45流份)，合并，在5(TC減壓回收，得到精制的由史可莫辛和番荔枝塔亭戊組成的番荔枝總內(nèi)酯4.1g。(批號(hào)02)實(shí)施例5:番荔枝總內(nèi)酯的提取，取番荔枝干燥種子1200g，粉碎過(guò)20目，在萃取溫度35'C,萃取壓25Mpa,萃取時(shí)間2小時(shí)和夾帶劑乙醇的用量為240ml的條件下進(jìn)行超臨界二氧化碳萃取。得到萃取物，在低于6(TC減壓回收得到濃縮液，干燥，得到番荔枝總內(nèi)酯粗提物52g。取番荔枝總內(nèi)酯粗提物50g，加入5倍量的石油醚-水(10:l)，置50'C水浴中加熱溶解，混勻，靜置分層后，吸取上層石油醚層，濃縮，干燥，重復(fù)上面操作3次，得到番荔枝總內(nèi)酯26g。取上述番荔枝總內(nèi)酯26g，拌等量的硅膠后，研勻，上硅膠(250g，200到300目，青島海洋化工廠)柱層析，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，石油醚-乙酸乙酯(50:1)1到20流份，石油醚-乙酸乙酯(20:1)21到40流份，石油醚-乙酸乙酯(10:1)41到58流份，石油醚-乙酸乙酯(2:1)59到75流份每份接收100ml。用硅膠薄層色譜跟蹤，分別收集史可莫辛(17到31流份)和番蒸枝塔亭戊(35到48流份)，合并，在60'C減壓回收，得到精制的由史可莫辛和番荔枝塔亭戊組成的番荔枝總內(nèi)酯3.5g。(批號(hào)03)實(shí)施例6:按實(shí)施例5的方法提取番蔡枝總內(nèi)酯粗提物，從1200g番蔡枝干燥種子中提取得到番荔枝總內(nèi)酯粗提物53g，取上述番荔枝總內(nèi)酯50g，加入6倍量的石油醚-水(3:l)，置85'C水浴中加熱溶解，混勻，靜置分層后，吸取上層石油醚層，濃縮，干燥，重復(fù)上面操作3次，得到番荔枝總內(nèi)酯26.6g。取上述番蔡枝總內(nèi)酯26g，拌等量的硅膠后，研勻，上硅膠(250g，200到300目，青島海洋化工廠)柱層析，用氯仿-甲醇梯度洗脫，氯仿-甲醇(50:1)1到21流份，氯仿-甲醇(20:1)22到40流份，氯仿-甲醇(10:1)41到58流份，氯仿-甲醇(2:1)59到76流份每份接收100ml。用硅膠薄層色譜跟蹤，分別收集史可莫辛(16到32流份)和番荔枝塔亭戊(36到46流份)，合并，在6(TC減壓回收，得到精制的由史可莫辛和番荔枝塔亭戊組成的番荔枝總內(nèi)酯3.6g。實(shí)施例7:番荔枝總內(nèi)酯的提取，取番荔枝干燥種子1200g，粉碎過(guò)20目，在萃取溫度35'C，萃取壓30Mpa,萃取時(shí)間3小時(shí)和夾帶劑甲醇的用量為360ml的條件下進(jìn)行超臨界二氧化碳萃取，得到萃取物，在低于6(TC減壓回收得到濃縮液，干燥，得到番荔枝總內(nèi)酯粗提物55g。取番荔枝總內(nèi)酯粗提物55g，加入5倍量的石油醚-水(l:l)，置60'C水浴中加熱溶解，混勻，靜置分層后，吸取上層石油醚層，濃縮，干燥，重復(fù)上面操作5次，得到番荔枝總內(nèi)酯28g。取上述番荔枝總內(nèi)酯28g，拌等量的硅膠后，研勻，上硅膠(250g，200到300目，青島海洋化工廠)柱層析，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，石油醚-乙酸乙酯(50:1)1到21流份，石油醚-乙酸乙酯(20:1)22到40流份，石油醚-乙酸乙酯(10:1)41到58流份，石油醚-乙酸乙酯(2:1)59到76流份每份接收100ml。用硅膠薄層色譜跟蹤，分別收集史可莫辛(16到32流份)和番荔枝塔亭戊(36到46流份)，合并，在60'C減壓回收，得到精制的由史可莫辛和番荔枝塔亭戊組成的番荔枝總內(nèi)酯3.8g。(批號(hào)04)實(shí)施例8:按實(shí)施例7的方法提取和富集番荔枝總內(nèi)酯有效部位，從1200g番荔枝干燥種子中提取得到番荔枝總內(nèi)酯粗提取物58g，取上述番荔枝總內(nèi)酯粗提取物55g，加入7倍量的石油醚-水(6:1)，置6(TC水浴中加熱溶解，混勻，靜置分層后，吸取上層石油醚層，濃縮，干燥，重復(fù)上面操作4次，得到番荔枝總內(nèi)酯30g。取上述番荔枝總內(nèi)酯28g，拌等量的硅膠后，研勻，上硅膠(300g，200到300目，青島海洋化工廠)柱層析，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，石油醚-乙酸乙酯(50:1)1到23流份，石油醚-乙酸乙酯(20:1)24到42流份，石油醚-乙酸乙酯(10:1)43到55流份，石油醚-乙酸乙酯(2:1)56到75流份每份接收100ml。用硅膠薄層色譜跟蹤，分別收集史可莫辛(18到35流份)和番荔枝塔亭戊(38到49流份)，合并，在6(TC減壓回收，得到由史可莫辛和番荔枝塔亭戊組成的精制番荔枝總內(nèi)酯5.2g。實(shí)施例9:采用比色法(堿性苦味酸法)測(cè)定精制番荔枝總內(nèi)酯中總內(nèi)酯的含量，其方法為精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品或樣品適量,加1%堿性苦味酸溶液0.5ml(1%苦味酸乙醇溶液與5%NaOH水溶液用前等體積混合)95X乙醇定容至10ml，于7CTC水浴鍋中水浴10min，冷卻至室溫后于470nm處測(cè)吸光度。含量測(cè)定結(jié)果如表1所示。表1精制番荔枝總內(nèi)酯中總內(nèi)酯的含量精致番蔡枝總內(nèi)酯含量(g)總內(nèi)酯的百分含量(％)批號(hào)01:5.280.76批號(hào)02:4.1卯.24批號(hào)03:3.591.42批號(hào)04:3.892.11采用高效液相色譜法，以色譜條件:反相碳18柱(220cm,4.6mm，0.5nm)，檢測(cè)波長(zhǎng)220nm,流速lml/min，柱溫30'C，流動(dòng)相是甲醇-水(85:15)，用峰面積積分，外標(biāo)法計(jì)算精制番蔡枝總內(nèi)酯中史可莫辛和番荔枝塔亭戊的含量，含量測(cè)定結(jié)果如表2所示。表2番荔枝總內(nèi)酯中史可莫辛和番荔枝塔亭戊的含量<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>實(shí)施例10:精制番荔枝總內(nèi)酯的急性毒性實(shí)驗(yàn)。按Bliss法計(jì)算小鼠半數(shù)致死量LD50值，測(cè)定結(jié)果如下腹腔注射ipxlLD50=0.318±0.06mg/kg靜脈注射ivxlLD50=0.186±0.08mg/kg口月艮poxlLD50=0.896±0.10mg/kg由實(shí)驗(yàn)所得LD50值說(shuō)明精制番荔枝總內(nèi)酯的急性毒性較低，三種給藥途徑中口服給藥的毒性反映最小，靜脈注射由于藥物迅速達(dá)到各器管，呈現(xiàn)較敏感的量-效(死亡)關(guān)系，在高劑量時(shí)給藥后8小時(shí)出項(xiàng)死亡，中劑量在24小時(shí)有小鼠死亡，低劑量未見(jiàn)小鼠死亡.實(shí)施例ll:精制番荔枝總內(nèi)酯體外對(duì)人腫瘤細(xì)胞的抑制作用。以人肺癌(MCF-7),乳腺癌(A-5408)，人肝癌(SMMC-7451)，人宮頸癌(Hela)和人胃癌(SGC-7901)5種瘤株，采用噻唑藍(lán)還原法(MTT)進(jìn)行體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)，精制番荔枝總內(nèi)酯，史可莫辛和番荔枝塔亭戊單體各設(shè)5個(gè)濃度，以紫衫醇為陽(yáng)性對(duì)照組，以樣品的溶劑即二甲亞砜為陰性對(duì)照組。所用小鼠為清潔級(jí)昆明小鼠。由表3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出精制番荔枝總內(nèi)酯對(duì)5株人腫瘤細(xì)胞的顯示不同的抑制作用，特別其中對(duì)人宮頸癌(Hela)的IC5o為4.16xl(T3，人肺癌(MCF-7)的ICw為2.46xl(T3，顯示了比史可莫辛，番荔枝塔亭戊單體和紫衫醇更強(qiáng)大的細(xì)胞選擇抑制活性，精制番荔枝總內(nèi)酯對(duì)人乳腺癌(A-5408池顯示較強(qiáng)的抑制活性，其ICso為2.36xl(T2。上述體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明提供的主要由史可莫辛，番荔枝塔亭戊組成的精制番荔枝總內(nèi)酯顯示了比史可莫辛，番荔枝塔亭戊單體和紫衫醇更強(qiáng)的細(xì)胞選擇抑制活性。同是說(shuō)明本發(fā)明提供的由史可莫辛和番荔枝塔亭戊為主要組成的精制番荔枝總內(nèi)酯不是兩者簡(jiǎn)單的組分疊加。表3精制精制番荔枝總內(nèi)酯和紫衫醇對(duì)5株腫瘤細(xì)胞的抑制作用(ICso半數(shù)抑制率)腫瘤細(xì)胞株精制番荔枝總內(nèi)酯IC50(—1)史可莫辛番荔枝塔亭戊陽(yáng)性藥TaxolIC50Oig/ml)MCF-72.46x10-33.86xl(T31.31x10-21.02x10-2A-54082.36xl(T22.76x10-28.72x10-22.08x10-2SMMC-74517.04x10"7.96x10"9.87x10"3.79x10-2Hela4.16x10-36.86xl(T31.16xIO'26.3lx10-3SGC-7卯11.39x10-13.39x10"8.79x10"1.36x10-2實(shí)施例12:精制番荔枝總內(nèi)酯體內(nèi)對(duì)移植性腫瘤生產(chǎn)的抑制作用。以小鼠移植性肝瘤Heps和小鼠肉瘤S180進(jìn)行小鼠體內(nèi)腫瘤生產(chǎn)的抑制實(shí)驗(yàn)，精制番荔枝總內(nèi)酯，史可莫辛和番荔枝塔亭戊各設(shè)3個(gè)劑量組，即高、中、低3組，以紫衫醇為陽(yáng)性對(duì)照組，以樣品的溶劑即大豆油為陰性對(duì)照組，每組各設(shè)10只小鼠，每天每組小鼠腹腔注射0.2ml,連續(xù)7天，于第8天處死小鼠，取腫瘤，稱重，計(jì)算抑瘤率.結(jié)果見(jiàn)表4和表5。表4精制番荔枝總內(nèi)酯腹腔給藥對(duì)小鼠肝癌HepS的抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果組別動(dòng)物數(shù)始/終劑量(jjg/mg，7天)瘤重(;士SD,mg)抑瘤率(％)P值陰性組10/10*1.132±0.146紫衫醇Taxol畫(huà)o20.426±0.10862.9<0.001史可莫辛高濃度10/1030.442±0.02660.9<0扁史可莫辛中濃度10/101.50.583±0.04749.5<0扁史可莫辛低濃度10/100.750.813±0.02628.2<0.01番荔枝塔亭戊高濃度10/1030.468±0.03258.7<0細(xì)番荔枝塔亭戊中濃度10/101.50.607±0.01746.4<0細(xì)番荔枝塔亭戊低濃度10/100.750.962±0.02615.1>0.1番荔枝總內(nèi)酯髙濃度10/1030.410±0.11063.8<0.001番荔枝總內(nèi)酯中濃度10/101.50.526±0.12053.6<0.001番荔枝總內(nèi)酯低濃度10/100.750.796±0.10329.7<0.01抑瘤率(％)=(1-藥物組瘤重/陰性組瘤重>100%*給與相同量溶解樣品的溶液，下同。12表5精制番荔枝總內(nèi)酯腹腔給藥對(duì)小鼠肉癌S180的抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果組別動(dòng)物數(shù)始/終劑量(pg/mg,7天)瘤重(^士SD，mg)抑瘤率(％)P值陰性組10/100.872±0.146紫衫醇Taxol10/1020.383±0駕56.1<0.001史可莫辛高濃度磨30.342±0.02660.8<0.001史可莫辛中濃度10/101.50.399±0.04754.3<0.001史可莫辛低濃度10/100.750.713±0.02618.3>0,1番荔枝塔亭戊高濃度10/1030.368±0.03257.8<0.001番荔枝塔亭戊中濃度10/101.50.407±0.01753.4<0.001番荔枝塔亭戊低濃度10/100.750.732土0.02616.1>0.1番荔枝總內(nèi)酯高濃度10/930.333±0.06361.9<0.001番荔枝總內(nèi)酯中濃度10/101.50.386±0.10455.8<0.001番荔枝總內(nèi)酯低濃度10/100.750.646±0.10325.9<0.5由實(shí)驗(yàn)結(jié)果表4得出精制番荔枝總內(nèi)酯對(duì)小鼠肝瘤Heps生長(zhǎng)顯示強(qiáng)大的抑制活性，相對(duì)于陰性組高、中、低3個(gè)濃度都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高濃度組對(duì)小鼠肝瘤Heps抑制率為63.8%比相應(yīng)濃度的史可莫辛，番荔枝塔亭戊和陽(yáng)性藥紫衫醇具有更好的抑瘤活性。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果表5得出精制番荔枝總內(nèi)酯對(duì)小鼠肝肉瘤S③也顯示較強(qiáng)的抑制活性，相對(duì)于陰性組高,中濃度組都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高濃度組對(duì)小鼠肉瘤Su!o抑制率為61.9%，也顯示比紫衫醇具有更好的抑瘤活性。通過(guò)比較看出精制的番荔枝總內(nèi)酯的高，中，低濃度顯示了比史可莫辛，番荔枝塔亭戊單體相應(yīng)濃度更好的抑瘤效果。以上體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明提供的由史可莫辛和番荔枝塔亭戊為主要組成的精制番荔枝總內(nèi)酯不是兩者簡(jiǎn)單的組分疊加，具有一定的協(xié)同作用。且除高濃度組有l(wèi)只小鼠死亡外，其他濃度組未見(jiàn)小鼠死亡，說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)所設(shè)的濃度范圍內(nèi)，精制番荔枝總內(nèi)酯具有高抗腫瘤活性，低毒副作用，進(jìn)一步證明了本發(fā)明所提供的精制番荔枝總內(nèi)酯的質(zhì)量安全，有效的優(yōu)點(diǎn)。1權(quán)利要求1、一種精制番荔枝總內(nèi)酯，其特征在于由番荔枝內(nèi)酯史可莫辛和番荔枝塔亭戊為主要成分，其通過(guò)以下方法制得取番荔枝的根、葉、樹(shù)皮或種子粉碎后用石油醚、氯仿、乙酸乙酯其中之一或它們的混合溶劑滲漉，在低于60℃減壓回收得到濃縮液、靜置、離心、取離心所得上層液，加入1到10倍量的石油醚或石油醚-水混合溶液，在50至85℃的水浴中加熱溶解，吸取上層石油醚層，重復(fù)上面操作1到5次，合并石油醚溶液、濃縮、得濃縮物后，干燥，得到番荔枝總內(nèi)酯，然后取番荔枝總內(nèi)酯，進(jìn)行硅膠柱層析，用石油醚-乙酸乙酯或氯仿-甲醇梯度洗脫，用薄層色譜跟蹤，收集史可莫辛和番荔枝塔亭戊相應(yīng)流分，濃縮干燥得到由史可莫辛和番荔枝塔亭戊為主要成份的精致番荔枝總內(nèi)酯。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的精制番荔枝總內(nèi)酯，其特征在于精制番荔枝總內(nèi)酯中史可莫辛和番荔枝塔亭戊的重量百分含量為50%到90%。3、權(quán)利要求l所述的精制番荔枝總內(nèi)酯的制備方法，其特征包括以下步驟①取番荔枝植物的根、葉、樹(shù)皮或種子去雜，粉碎后用石油醚、氯仿、乙酸乙酯其中之一或它們的混合溶劑滲漉后，在低于60'C減壓回收得到濃縮液、靜置、離心、得上層濃縮液；②取步驟①離心所得上層液加入1到IO倍量的石油醚或體積比為1:1到10:1的石油醚和水的混合溶液在50至85'C的水浴中加熱溶解，吸取上層石油醚層，重復(fù)上面操作l-5次，合并石油醚溶液，濃縮，得濃縮物后，干燥，得到番荔枝總內(nèi)酯；③取步驟②所得的番荔枝總內(nèi)酯，進(jìn)行硅膠柱層析，用石油醚-乙酸乙酯或氯仿-甲醇梯度洗脫，用薄層色譜跟蹤，收集史可莫辛和番荔枝塔亭戊相應(yīng)流分，濃縮干燥得到由史可莫辛和番荔枝塔亭戊為主要成份的精制番荔枝總內(nèi)酯。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的精制番荔枝總內(nèi)酯的制備方法，其特征在于步驟③所用的柱層析硅膠為100到300目，番荔枝總內(nèi)酯與柱層析所用硅膠的重量比為1:3到1:6，洗脫劑石油醚-乙酸乙酯或氯仿-甲醇梯度洗脫的比例為50:1到2:1。5、權(quán)利要求l所述的精制番荔枝總內(nèi)酯的制備方法，其特征包括以下步驟①把番荔枝植物的根、葉、樹(shù)皮或種子去雜，粉碎過(guò)20目后，用醇類(乙醇、甲醇、正丁醇、丙二醇或異丙醇)溶劑做夾帶劑，采用超臨界二氧化碳方法萃取，得到二氧化碳萃取液，在低于6(TC減壓回收得濃縮液；②取步驟①所得的濃縮液加入1到IO倍量的石油醚或體積比為1:1到10:1的石油醚和水的混合溶液在50至85"C的水浴中加熱溶解，吸取上層石油醚層，重復(fù)上面操作1-5次，合并石油醚溶液，濃縮，得濃縮物后，干燥，得到番荔枝總內(nèi)酯；③取步驟②所得的番荔枝總內(nèi)酯，進(jìn)行硅膠柱層析，用石油醚-乙酸乙酯或氯仿-甲醇梯度洗脫，用薄層色譜跟蹤，收集史可莫辛和番荔枝塔亭戊相應(yīng)流分，濃縮干燥得到由史可莫辛和番荔枝塔亭戊為主要成份的精制番荔枝總內(nèi)酯。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的超臨界二氧化碳萃取方法，其特征在于萃取條件為夾帶劑乙醇、甲醇、正丁醇、丙二醇或異丙醇的用量以毫升記為藥材質(zhì)量克的0%到50%，萃取溫度為20'C到50。C，萃取壓強(qiáng)為10Mpa到40Mpa,萃取時(shí)間為1到4小時(shí)。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的超臨界二氧化碳萃取方法，其特征在于萃取條件為夾帶劑乙醇用量以毫升記為藥材質(zhì)量克的20%，萃取溫度為35'C，萃取壓強(qiáng)為25Mpa，萃取時(shí)間為2小時(shí)。8、根據(jù)權(quán)利要求6所述的超臨界二氧化碳萃取方法，其特征在于萃取條件為夾帶劑甲醇用量以毫升記為藥材'質(zhì)量克的30%，萃取溫度為35'C，萃取壓強(qiáng)為30Mpa，萃取時(shí)間為3小時(shí)。9、權(quán)利要求1或2所述的精制番荔枝總內(nèi)酯在制備治療肺癌、乳腺癌、肝癌、宮頸癌或胃癌藥物中的應(yīng)用。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于把精制番荔枝內(nèi)酯和藥學(xué)上可接受的載體制成片劑、膠囊劑、噴霧劑、注射劑、脂肪乳劑、栓劑、微囊、軟膏劑或透皮控釋貼劑劑型的藥物。全文摘要本發(fā)明涉及一種抗癌精制番荔枝總內(nèi)酯及其制備的方法，采用番荔枝根、葉、樹(shù)皮或種子為原材料，經(jīng)石油醚、氯仿、乙酸乙酯或它們混合溶液滲漉提取，或者用超臨界二氧化碳萃取后，用溶劑法，即用石油醚加熱溶解去雜得到番荔枝總內(nèi)酯，再用硅膠柱層析，石油醚-乙酸乙酯或氯仿-甲醇梯度洗脫，分離精制得到由史可莫辛和番荔枝塔亭戊為主要組成的番荔枝總內(nèi)酯。由本發(fā)明所用原材料的來(lái)源豐富，價(jià)格低廉，易得，得到的精制番荔枝總內(nèi)酯含量高，成分清楚，質(zhì)量可控，其制備方法工藝簡(jiǎn)單，消耗低，得率高，能實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大生產(chǎn)。文檔編號(hào)A61K36/185GK101485700SQ200910024959公開(kāi)日2009年7月22日申請(qǐng)日期2009年3月3日優(yōu)先權(quán)日2009年3月3日發(fā)明者祥李,楊海軍,陳建偉申請(qǐng)人:南京中醫(yī)藥大學(xué)