專利名稱：Cart作為制備治療阿爾茨海默病藥物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物的應(yīng)用，特別涉及小分子神經(jīng)肽可卡因-苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽 (cocaine and amphetamine-regulated transcript，簡稱CART)作為制備治療阿爾茨海默 病藥物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，簡稱AD)是一種最常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性 疾病，是老年癡呆最常見的原因，表現(xiàn)為進行性智能衰退。65歲以上的人群患病率已達(dá)5 10%，85歲以上人群患病率達(dá)20%-40%。其主要病理機制為A 0在大腦神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)、外沉 積，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡。A0來源于其前體蛋白(amyloidprecursor protein，APP)，腦中的 APP 經(jīng) 3 分泌酶-site APP-c 1 eavingenzyme 1, BACE1)酶切產(chǎn)生 sAPP3 和 C99，再經(jīng) y 分泌酶切割產(chǎn)生A0 40或A0 42。其中A0 42及其寡聚物是引起神經(jīng)毒性作用的最主要組 分。A3 42神經(jīng)毒性可引起線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、突觸傳遞功能障礙等，最終引起乙酰 膽堿神經(jīng)元壞死，導(dǎo)致癡呆，目前認(rèn)為線粒體功能障礙可能為AD患者腦內(nèi)細(xì)胞凋亡的最主 要途徑。目前，臨床應(yīng)用治療AD的藥物主要有兩類1)增強膽堿能作用的藥物AD患者腦 中膽堿能神經(jīng)元變性、壞死，引起乙酰膽堿(Ach)水平降低。目前應(yīng)用最廣泛的是乙酰膽堿 酯酶抑制劑，如他克林(tacrine)、多奈哌齊(don印ezil)、利凡斯的明(rivastigmine)、加 蘭他敏(galantamin)和石杉堿甲等。此類藥物必須在病情早期，腦內(nèi)有部分正常的膽堿能 神經(jīng)元分泌Ach?？蓵簳r緩解癥狀，不能影響病理過程；2)N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受 體拮抗劑美金剛(memantine)。NMDA受體激活后引起的興奮性毒性是AD腦損傷的重要發(fā) 病機制之一；美金剛是NMDA受體的非競爭性拮抗劑，可通過抑制NMDA受體介導(dǎo)的興奮性毒 性阻止部分AD的病理發(fā)展。但NMDA受體激活后引起的興奮性毒性參與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng) 疾病腦損傷的病理過程，美金剛的特異性有待臨床進一步驗證。因此阻止AD病理發(fā)展成為 將來治療AD的方向，現(xiàn)在AD的防治策略1)調(diào)節(jié)A3的代謝過程，減少A3的生成和促進 A3的降解；2)抑制A3的神經(jīng)毒性作用。CART是一種新的內(nèi)源性神經(jīng)肽，它具有廣泛的生理作用，在獎賞與強化、進食與肥 胖、精神焦慮行為、體液平衡、免疫功能、新陳代謝、內(nèi)分泌以及其他的一些生理過程中均有 作用。廣泛分布于腦、垂體、腎上腺、胰島和胃腸道等組織。研究報道可研制為治療肥胖、藥物成癮、焦慮和抑郁癥等疾病的治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就在于克服上述缺陷，研制一種CART作為制備治療阿爾茨海默病 藥物的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案是CART作為制備治療阿爾茨海默病藥物的應(yīng)用，其主要技術(shù)特征在于將CART制備成治療阿爾茨海默病的注射制劑。本發(fā)明的優(yōu)點和效果在于治療阿爾茨海默病時，由于CART 1、是一種內(nèi)源性小分子神經(jīng)肽，靜脈用藥，可透過血腦屏障；2、多靶點作 用于AD的病理過程，符合當(dāng)今研制治療AD藥物的決策；首先阻斷Αβ 在腦內(nèi)的過度形成和沉積通過抑制BACEl減少A β形成；增強NEP、LRP表達(dá)，從而加快腦 內(nèi)Αβ的降解和向腦外的轉(zhuǎn)運；其次直接抑制Αβ神經(jīng)毒性作用，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡和腦損 傷。本發(fā)明從整體到細(xì)胞、分子水平，系統(tǒng)探討CART對A β的生成、降解及其神經(jīng)毒性 的影響及其分子機制。以發(fā)現(xiàn)具有多靶點作用的治療AD的具有潛力的新型藥物。我們前 期對CART在缺血性腦損傷中的保護作用及分子機制進行的系列研究，表明CART是一種內(nèi) 源性的神經(jīng)保護劑。作用有1)雌激素治療癡呆有效，而雌激素可上調(diào)腦內(nèi)的CART ；2) CART 在腦內(nèi)海馬分布較多，而海馬在癡呆發(fā)病中具有明顯的解剖學(xué)聯(lián)系；3)CART存在腦內(nèi)乙酰 膽堿能神經(jīng)元中，促進乙酰膽堿釋放，而AD患者腦內(nèi)的乙酰膽堿神經(jīng)元壞死，乙酰膽堿減 少；4)Αβ神經(jīng)毒性誘導(dǎo)的線粒體功能障礙為其引起神經(jīng)元凋亡的主要通路。而CART可與 線粒體琥珀酸脫氫酶亞基B直接作用，維持線粒體的呼吸和能量產(chǎn)生、減輕氧化應(yīng)激、穩(wěn)定 線粒體膜電位、防止線粒體受損，從而抑制細(xì)胞凋亡。以上研究結(jié)果提示CART作用于AD病理過程中多個靶點而具有治療作用。進一步 研究發(fā)現(xiàn)CART不僅抑制腦內(nèi)Αβ的形成而且又能抑制其神經(jīng)毒性，這種雙重作用，恰好符 合當(dāng)今AD的防治策略。本發(fā)明的其他優(yōu)點和效果將在下面繼續(xù)說明。


圖1—小鼠morris水迷宮試驗結(jié)果圖A—APP小鼠與WT小鼠水迷宮平均逃避潛伏期圖B-CART處理后小鼠水迷宮平均逃避潛伏期圖。圖2—免疫熒光方法檢測小鼠腦內(nèi)A β結(jié)果圖。A—WT組腦內(nèi)A β結(jié)果圖B—APP組腦內(nèi)A β結(jié)果圖C—CART+APP 組 A β 結(jié)果 3—Western blot 檢測 A β 表達(dá)圖。圖4—western blot檢測A β表達(dá)灰度值圖Α—為皮質(zhì)的灰度值B—為海馬的灰度值。圖5—神經(jīng)元生存能力測定(MTT)圖A-不同濃度Αβ?lián)p傷神經(jīng)元曲線圖B—不同濃度CART處理神經(jīng)元存活率圖C—不同時間Αβ?lián)p傷神經(jīng)元曲線圖。圖6—流式細(xì)胞儀檢測神經(jīng)元死亡率圖。
圖7—CART對A β代謝酶mRNA水平的影響圖。
圖8-CART對A 0代謝酶蛋白表達(dá)的影響圖。圖9—CART對A0誘導(dǎo)的神經(jīng)元線粒體膜電位水平的影響圖。圖10—CART對A 3誘導(dǎo)神經(jīng)元的R0S影響圖。圖11—CART對A 0誘導(dǎo)神經(jīng)元的R0S流式結(jié)果。
具體實施例方式對CART在缺血性腦損傷中的保護作用及分子機制進行了系列的研究，研究結(jié)果 提示CART是一種內(nèi)源性的神經(jīng)保護劑。本發(fā)明首先，從整體角度，通過行為學(xué)、病理學(xué)、等 方法驗證CART能改善認(rèn)知功能，降低A 0神經(jīng)毒性所致的神經(jīng)損傷，從而證明CART對AD 具有治療作用；其次，從離體水平，用分子生物學(xué)等技術(shù)研究CART抑制A0對神經(jīng)元的神經(jīng) 毒性作用；最后，從整體到從離體水平，用分子生物學(xué)等技術(shù)研究CART對AD病理過程中不 同靶點的影響，以證明CART可制備為一多靶點治療AD的新型藥物的應(yīng)用。實驗發(fā)現(xiàn)，CART可作用于AD病理過程中的多個靶點。首先作用腦內(nèi)的BACE1，可 能通過抑制其表達(dá)和活性減少A 0生成；其次可能提高腦內(nèi)NEP和LRP的功能，增加A 3的 降解和向腦外轉(zhuǎn)運；最后，對已沉積的A0引起的神經(jīng)毒性也具有直接抑制作用。具體如下。實施例1 采用CART55-102，分子量為5243.21，白色粉狀，規(guī)格是lOOug/瓶，干燥保存于 0-5°C ；與生理鹽水混合，按照lug 4000ul，制成治療阿爾茨海默病的注射液制劑；體內(nèi) CART靜脈注射2. 5ug/Kg/次。該劑量范圍內(nèi)CART未見毒、副作用。實施例2:采用CART62-102，分子量為4385. 3，與生理鹽水混合，按照lug 4000ul，制成注 射液制劑。余同實施例1。實施例3 采用CART1-89，與生理鹽水混合，按照lug 4000ul，制成注射液制劑。余同實施 例1。實施例4 采用CART1-102，與生理鹽水混合，按照lug 4000ul制成注射液制劑。余同實施 例1。實驗1 體內(nèi)研究證明CART對A 0沉積所致的AD具有治療作用以B6C3_Tg雙轉(zhuǎn)基因小鼠(APP/PS1小鼠-簡稱APP小鼠)為AD動物模型，待小 鼠出現(xiàn) AD 癥狀后(8-10 月)予 CART (CART55-102，Phoenix Pharmaceutical, USA)靜脈注 射治療。通過行為學(xué)、病理學(xué)證明，CART對AD具有治療作用。1)材料和方法以APP小鼠為A3沉積所引起的AD動物模型，待小鼠出現(xiàn)行為學(xué)改變后(8-10月) 予CART 2. 5ug/kg靜脈注射，隔日1次治療，分別治療10、30天，生理鹽水為治療對照組，每 組12只小鼠，雌雄各半。野生小鼠為正常對照組。行為學(xué)檢測水迷宮試驗為用于檢測動物學(xué)習(xí)記憶能力的公認(rèn)方法，Morris水
5迷宮圓形水池直徑為120cm，高60cm，平臺高度50cm，直徑10cm，平臺低于水面1cm，水溫 25士 1°C，水的表面覆蓋白色塑料泡沫顆粒。實驗期間迷宮外參照物保持不變。實驗前1天， 讓小鼠熟悉水迷宮環(huán)境。實驗歷時5天，每天訓(xùn)練1次，分別從東、南、西、北4個點入水，入 水時，小鼠面向池壁，記錄小鼠找到平臺所需時間即逃避潛伏期。潛伏期越長，認(rèn)知功能越差。免疫熒光染色腦組織冰凍切片，使用々042特異性抗體，通過以免疫熒光法檢測 小鼠腦內(nèi)A0的沉積情況。冰凍切片4%甲醛/PBS，室溫固定lOmin，PBS洗滌兩次，每次 5min，加入Triton-100，室溫下放置5min，用PBS洗滌5min，2%正常山羊血清封閉30min ； 加入兔源多克隆抗A0 42(Chemicon)抗體(1 500)，4°C冰箱過夜。PBS洗滌5minX3次， IgG(l 100)30min，37°C;免疫熒光標(biāo)記的二抗FITC-conjuga ted抗兔 IgG(H+L) (Jackson ImmuneoResearch)室溫30_60min。熒光顯微鏡攝像。免疫印跡(Western blot)定量測定腦內(nèi)海馬和皮層A0的含量腦皮層和海馬提 取蛋白質(zhì)，并定量蛋白濃度，然后溶解在4X蛋白上樣緩沖液(loadingBuffer)中，煮沸5分 鐘。在4-20%聚丙烯酰胺凝膠上電泳。將此蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上。浸在5%牛奶/TBST室 溫1小時，從而去除非特異性結(jié)合。分別加第一抗體(多克隆兔源抗A0 42(ChemiCOn)抗 體(1 500)4°C過夜，辣根過氧化酶標(biāo)記二抗(1 5000)結(jié)合1小時，用增強的化學(xué)發(fā)光 法測定其蛋白表達(dá)。2)結(jié)果(1)行為學(xué)結(jié)果Mori 8水迷宮試驗結(jié)果提示，APP小鼠10個月后，與野生鼠相比， APP小鼠逃避潛伏期明顯延長(見圖1A)。CART治療30天后，APP小鼠逃避潛伏期對照組 (生理鹽水組)明顯縮短(見圖1B)。每組10只小鼠。(2)免疫熒光方法檢測小鼠腦內(nèi)A 0結(jié)果提示，APP小鼠出現(xiàn)AD癥狀后其海馬區(qū) 內(nèi)可見典型的AD病理變化即A0沉積增多(見圖2B)，而予CART治療后，其海馬等腦區(qū)內(nèi) A3沉積較未治療組減少(見圖2C)，提示CART可降低腦內(nèi)A0的沉積(見圖2)，野生型小 鼠為正常對照組(WT)。(3)免疫印跡結(jié)果(Western blot)與免疫熒光結(jié)果一致，Western blot檢 測A3表達(dá)(見圖3)圖3為APP小、鼠組皮層及海馬中的A3表達(dá)(1.09 士 0. 10)比 WT(0. 57士0.09)組明顯增高，CART處理組(0.66士0.04)低于癡呆組。所有實驗均獨立重 復(fù)三次。圖3-A為Western blot條帶，圖3_B為直方圖，圖4分別為皮質(zhì)、海馬的灰度值 (均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差，*p < 0. 05)。實驗2 體外研究證明CART抑制A ^的神經(jīng)毒性對AD具有治療作用1)材料和方法原代皮層神經(jīng)元培養(yǎng)懷孕15-17d野生型昆明小鼠，斷頸處死后，取其胚胎，置于 盛有冷HBSS的培養(yǎng)皿中，分離大腦皮層，IX胰酶消化后，置多聚賴氨酸處理后的24孔培養(yǎng) 板中培養(yǎng)，2 3X 106細(xì)胞/ml，每2-3d部分換液，共培養(yǎng)10_14d。細(xì)胞培養(yǎng)在無血清、無 酚紅和無雌激素的培養(yǎng)液(Neurobasal加上H印es、B27和谷氨酰胺)中，37°C，5% C02培養(yǎng)箱。神經(jīng)元細(xì)胞活力檢測使用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)檢測神經(jīng)元的細(xì)胞活力。向100 μ 1培養(yǎng)液/孔中加入MTT，37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6h，然后傾去全部培養(yǎng)液，每孔中加入100 μ 1 DMSO溶液，搖床上搖動至藍(lán)紫色的結(jié)晶完全溶解，酶標(biāo)計數(shù) 儀測定各組OD值。藥物處理Aβ處理神經(jīng)元(0.5，1，2，411] )2411后，加〇六肌(0.2，0.4，0.8，1.611]\0 再維持24h。最終選擇A β劑量為2uM，CARTO. 4nM。神經(jīng)元凋亡率檢測AnneXin-V/PI雙染法使用流式細(xì)胞儀檢測神經(jīng)元凋亡率。收 集神經(jīng)元離心(2000rpm離心5min) ；PBS洗滌細(xì)胞二次(2000rpm離心5min)收集1-5X105 細(xì)胞；加入500μ L的Binding Buffer懸浮細(xì)胞；加入5 μ L Annexin V-FITC混勻后，加入 5μ L Propidium Iodide，混勻；室溫、避光、反應(yīng)5 15min ；流式細(xì)胞儀檢測。2)結(jié)果①MTT提示A β明顯降低神經(jīng)元的生存率，CART抑制A β的神經(jīng)毒性我們用A β 的不同劑量(圖5Α)和不同時間(圖5Β)處理神經(jīng)元，MTT檢測神經(jīng)元的生存率，結(jié)果提示 l)2uM處理神經(jīng)元48h，為本研究體外造模的最佳劑量，A β減少神經(jīng)元的生存率，呈劑量 和時間依賴性。2)體外不同濃度CART抑制A β的神經(jīng)毒性(圖5C)結(jié)果提示最佳劑量為 0. 4ηΜ。②流式細(xì)胞儀檢測神經(jīng)元死亡率A β明顯誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡，CART抑制其神經(jīng)毒 性，降低A β引起神經(jīng)元死亡率。(見圖6，*ρ < 0.05)進一步證明CART抑制A β毒性和 神經(jīng)保護作用。實驗3 CART通過多靶點影響AD的主要病理過程治療AD 我們的研究發(fā)現(xiàn)CART不僅影響Αβ的生成、轉(zhuǎn)運和降解，而且抑制Αβ引起的氧 化應(yīng)激作用。1)材料和方法實時熒光定量PCR:本發(fā)明中Αβ代謝酶的mRNA水平通過實時熒光定量PCR 檢測。弓丨物為BACE1 :F 5-TTGCCCAAGAAAGTATTTGA-3, R :5-TGATGCGGAAGGACTGATT_3. LRP :F :5-GGACTTCAGTTATGCCAATG-3, R 5-GGCTGAGGGAGATGTTGA-3.NEP :F 5-GACCTACCGGCCAGAGTA-3, R 5-AAACCCGACATTTCCTTT-3.根據(jù)分子生物學(xué)技術(shù)常規(guī)，提取 腦組織中總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再作實時熒光定量PCR。反應(yīng)條件95°C，5分鐘40個循 環(huán)。95°C，30 秒，60°C，1 分鐘。Western Blot 方法同上，分別加第一抗體(Αβ 1-42,1 500，ΑΒ5078Ρ, Chemicon ；BACEl，1 500,ΜΑΒ5308,Chemicon ；NEP, 1 500，BAF1126，R&D ;GAPDH為內(nèi)參)， 4°C過夜，辣根過氧化酶標(biāo)記二抗(1 5000)結(jié)合1小時，用增強的化學(xué)發(fā)光法測定其蛋白表達(dá)。線粒體膜電位及ROS檢測均使用熒光探針檢測法檢測。神經(jīng)元線粒體膜電位水 平使用JC-I熒光探針，ROS檢測使用DCFH-DA熒光探針，結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測各相應(yīng)熒光 強度。收集不多于IXlO6的細(xì)胞；用PBS洗滌細(xì)胞二次，取JC-I工作液將細(xì)胞均勻懸浮， 371，5%0)2的培養(yǎng)箱中孵育15 201^11 ；室溫離心，用1 X Incubation Buffer洗兩次；懸 浮細(xì)胞；流式細(xì)胞儀分析。2)結(jié)果
①CART對APP小鼠腦內(nèi)A β代謝酶mRNA水平的影響實時定量PCR檢測顯示，APP小鼠腦內(nèi)皮層(C)和海馬(H)腦區(qū)內(nèi)BACEl的mRNA 水平較對野生組明顯增高，而NEP和LRP的mRNA水平明顯降低，給予CART治療可抑制 BACElmRNA水平的增高，并能提高NEP和LRP的mRNA水平(見圖7)。提示CART可通過調(diào) 節(jié)Αβ的代謝酶降低腦內(nèi)Αβ的水平。②CART可抑制APP小鼠腦內(nèi)BACEl提高NEP的蛋白表達(dá) Western Blot檢測顯示，APP小鼠腦皮層和海馬(H)BACEl蛋白水平較對照組明顯 增高，NEP明顯低于對照組。CART可抑制BACE1、提高NEP的蛋白表達(dá)(見圖8)。提示CART 可通過抑制BACEl、提高NEP的表達(dá)來降低腦內(nèi)A β的水平。③CART可抑制A β誘導(dǎo)的神經(jīng)元線粒體膜電位下降正常神經(jīng)元線粒體保持一定的膜電位水平(ΔΨπι)，呈極化狀態(tài)，JC-I熒光探針 染色可檢測Δ Ψπι(見圖9)，正常(WT)時顯示為橙色熒光(見圖9Α)，而A β作用30min 后絕大數(shù)細(xì)胞線粒體膜電位水平下降，呈去極化狀態(tài)，顯示為綠色熒光(見圖9B) ；CART處 理可抑制A β誘導(dǎo)的神經(jīng)元Δ Ψπι水平下降(見圖9C)。④流式細(xì)胞儀測定提示CART可抑制A β誘導(dǎo)的ROS升高(圖10)Aβ處理神經(jīng)元后，誘導(dǎo)神經(jīng)元氧化應(yīng)激，釋放大量活性氧(ROS)，CART通過抑制 氧化應(yīng)激，減少ROS釋放，保護神經(jīng)元損傷(流式結(jié)果見圖11)。
權(quán)利要求
CART作為制備治療阿爾茨海默病藥物的應(yīng)用，其特征在于將CART制備成治療阿爾茨海默病的注射制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CART作為制備治療阿爾茨海默病藥物的應(yīng)用，其特征在于 CART 為 CART55-102，分子量為 5243. 21Da。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CART作為制備治療阿爾茨海默病藥物的應(yīng)用，其特征在于 CART 為 CART62-102，分子量為 4385. 3Da。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CART作為制備治療阿爾茨海默病藥物的應(yīng)用，其特征在于 CART 為 CART1-89。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CART作為制備治療阿爾茨海默病藥物的應(yīng)用，其特征在于 CART 為 CART1-102。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5所述的CART作為制備治療阿爾茨海默病藥物的 應(yīng)用，其特征在于CART注射制劑為每次靜脈注射2. 5ug/Kg。
全文摘要
本發(fā)明涉及CART作為制備治療阿爾茨海默病藥物的應(yīng)用。本發(fā)明是將CART制備成治療阿爾茨海默病的注射制劑。本發(fā)明解決了現(xiàn)在使用的增強膽堿能作用的藥物和N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體拮抗劑各自存在的缺陷。本發(fā)明對Aβ的生成、降解及其神經(jīng)毒性的影響及其分子機制，具有多靶點作用的治療AD的新型藥物。作用表現(xiàn)在雌激素治療癡呆有效，可上調(diào)腦內(nèi)的CART；CART在腦內(nèi)海馬分布較多；CART存在腦內(nèi)乙酰膽堿能神經(jīng)元中，促進乙酰膽堿釋放；Aβ神經(jīng)毒性誘導(dǎo)的線粒體功能障礙為其引起神經(jīng)元凋亡的主要通路。而CART可與線粒體琥珀酸脫氫酶亞基B直接作用，維持線粒體的呼吸和能量產(chǎn)生、減輕氧化應(yīng)激、穩(wěn)定線粒體膜電位、防止線粒體受損，從而抑制細(xì)胞凋亡。
文檔編號A61P25/28GK101874895SQ20091002505
公開日2010年11月3日 申請日期2009年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月17日
發(fā)明者徐運, 李玲玲, 章玲 申請人:南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院