專利名稱：：一種重組人精氨酸酶融合蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種重組人精氨酸酶融合蛋白及其應(yīng)用。精氨酸在機(jī)體的生長(zhǎng)代謝中，起著十分重要的作用。它是肌酸合成的唯一氨基酸來源，同時(shí)也是多胺合成的前體，在細(xì)胞的分裂、組織的生長(zhǎng)分化中起著十分重要的作用。此外，精氨酸還參與蛋白質(zhì)合成、一氧化氮信號(hào)調(diào)節(jié)等重要的生理事件。精氨酸在體內(nèi)的代謝以肝臟代謝最為人所熟知。肝臟中的精氨酸酶(人肝組織精氨酸酶序列見MasakiTakiguchi，Humanliver-typearginasegene:structureofthegeneandanalysisofthepromoterregion.NucleicAcidsResearch:Volume16Number18，1988.)能有效將精氨酸水解為鳥氨酸與尿。鳥氨酸被肝運(yùn)送至血液循環(huán)或運(yùn)至肝的線粒體部位，由鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶催化生成瓜氨酸。瓜氨酸被進(jìn)一步通過瓜氨酸-NO循環(huán)的方式再生成精氨酸參與代謝。這種循環(huán)代謝的方式已成為哺乳類動(dòng)物清除體內(nèi)蛋白質(zhì)降解物-氨的唯一代謝途徑，有效地維持機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)的正常代謝與機(jī)體生理功能的正常運(yùn)腫瘤細(xì)胞在其生長(zhǎng)、分化、擴(kuò)增過程中需要大量的多胺，主要由機(jī)體內(nèi)的精氨酸經(jīng)過精氨酸酶、鳥氨酸脫羧酶相繼代謝后提供。這為腫瘤治療提供了一種選擇途徑，以往利用這一途徑治療癌癥的策略是抑制精氨酸脫羧酶的活性，使機(jī)體不能產(chǎn)生多胺，從而使腫瘤細(xì)胞因養(yǎng)分匱乏受到抑制直至最后凋亡。最常用的鳥氨酸脫羧酶抑制劑是a-二氟甲基鳥氨酸。但是它的應(yīng)用受到諸多限制。如它是以主動(dòng)運(yùn)輸?shù)姆绞竭M(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，因此需要較高的藥物濃度，需要大劑量對(duì)患者給藥。再者a-二氟甲基鳥氨酸僅僅能降低機(jī)體內(nèi)多胺與亞精胺的水平，但對(duì)精胺并無影響，這種不完全抑制在很大程度上削弱了a-二氟甲基鳥氨酸對(duì)細(xì)胞增生分化的抑制效果。鳥氨酸是多胺合成的重要前體，但鳥氨酸不能直接從食物中大量獲取，只能通過精氨酸酶酶解精氨酸和鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶代謝鳥氨酸獲得。研究發(fā)現(xiàn)，通過限制鳥氨酸的濃度，來調(diào)控細(xì)胞中多胺的生物合成及相應(yīng)DNA的合成，也是一種抑制腫瘤增生的不錯(cuò)選擇。無論是多胺還是鳥氨酸，都是精氨酸的代謝產(chǎn)物。精氨酸的代謝遠(yuǎn)比鳥氨酸與多胺復(fù)雜，其在機(jī)體內(nèi)直接/間接調(diào)控的生理功能也更為復(fù)雜、更為重要，如果有效移除機(jī)體內(nèi)的精氨酸將會(huì)比移除其代謝產(chǎn)物如鳥氨酸、多胺有更好的多效型反應(yīng)效果。更重要的是，Scott等曾對(duì)26種細(xì)胞系(Hela，HelaS_3，IBR3G，IBR3T，A549，KH0S/NP，M0LT4，HL60，WiDr，B16-F10，NIH3T3，Go-G-CCM，u-87-MG，PC3，A431，h麗ndiploidfibroblastsMG2F，humandiploidfibroblastsFF，mousefibroblasts3T3，SV40transformedfibroblasts3T3_SV40，3T3/BIBR，humanbreastcarcinomacellsMCF—7andZR75_1，humanosteosarcomacelllinesu20SandSaos_2，humanovariancarcinomalinePEOl，andPtKl)對(duì)精氨酸匱乏的敏感性做了比較研究。結(jié)果表明，精氨酸剝奪對(duì)腫瘤細(xì)胞造成的損傷要比剝奪其它一種或幾種氨基酸更為顯著。Wheatley等通
背景技術(shù)：
：過比較諸多氨基酸對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響發(fā)現(xiàn)，將精氨酸移除后正常細(xì)胞系會(huì)由細(xì)胞周期的GO期進(jìn)入靜止?fàn)顟B(tài)，且能在這種環(huán)境下存活幾周而無明顯損傷；當(dāng)精氨酸濃度恢復(fù)正常時(shí)，細(xì)胞又能開始恢復(fù)正常的生理周期；而對(duì)于腫瘤細(xì)胞來說，精氨酸的匱乏會(huì)導(dǎo)致其經(jīng)過細(xì)胞周期Gl期的"R"點(diǎn)進(jìn)入S期，并很快凋亡。而這種由于精氨酸匱乏而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的凋亡是不可逆發(fā)生的。因此，科學(xué)家們開始考慮通過控制機(jī)體中精氨酸的水平來對(duì)腫瘤，尤其是營(yíng)養(yǎng)缺陷型月中瘤如肝癌(h印atocellularcarcinoma,HCC)禾口黑素瘤(melanoma)進(jìn)行治療，現(xiàn)今這種方式已被很多科學(xué)家用來研究各種腫瘤細(xì)胞的抑制。如Gonzalez與Yeatman等研究發(fā)現(xiàn)，限制飲食中精氨酸的含量，可顯著抑制轉(zhuǎn)移性腫瘤的生長(zhǎng)。Currie等也發(fā)現(xiàn)機(jī)體內(nèi)降解精氨酸的精氨酸酶能有效殺死V79中國(guó)倉(cāng)鼠肺細(xì)胞，L5178Y淋巴瘤細(xì)胞。當(dāng)機(jī)體內(nèi)低濃度水平精氨酸(<8iimol/L)的狀態(tài)超過24小時(shí)，淋巴肉瘤會(huì)發(fā)生不可逆損傷。上述實(shí)驗(yàn)表明，在細(xì)胞水平上通過控制精氨酸濃度，可有效將腫瘤系細(xì)胞殺死。盡管精氨酸酶在體外顯示很好的抑瘤效果，但在體內(nèi)利用精氨酸酶剝奪精氨酸治療癌癥的多項(xiàng)研究卻沒有顯示樂觀的結(jié)果。目前一般歸結(jié)于這是由于體內(nèi)氨基酸的穩(wěn)態(tài)機(jī)制在發(fā)揮作用，這種氨基酸匱乏的狀態(tài)能通過激活蛋白質(zhì)分解途徑不斷將精氨酸釋放到血液中參與循環(huán)，以補(bǔ)充精氨酸酶的代謝造成的精氨酸匱乏。因此，為有效利用腫瘤細(xì)胞系及正常細(xì)胞系對(duì)精氨酸匱乏敏感性不同進(jìn)行腫瘤有效治療，必須克服機(jī)體內(nèi)氨基酸天然穩(wěn)態(tài)這一問題。精氨酸酶有效代謝腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基中的精氨酸從而使精氨酸依賴型腫瘤如黑色素瘤和肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。但在體內(nèi)利用精氨酸酶治療腫瘤的實(shí)驗(yàn)中，由于機(jī)體的穩(wěn)態(tài)機(jī)制發(fā)揮作用因而未收到如體外實(shí)驗(yàn)獲得的抑瘤效果(Storretal.Br.J.Cancer,1974，V30:50-59.)。這種機(jī)體的氨基酸穩(wěn)態(tài)機(jī)制給利用精氨酸酶耗竭精氨酸治療精氨酸依賴型腫瘤帶來了很大的障礙。為克服這一問題，T印ic在美國(guó)專利UP6，261，557中描述將精氨酸降解酶與蛋白質(zhì)分解抑制劑如胰島素組合使用，以阻斷通過降解機(jī)體肌肉以補(bǔ)充耗竭的精氨酸這一途徑。但胰島素的應(yīng)用受到患者血糖水平的限制?？颠_(dá)醫(yī)藥有限公司在PCT專利PCT/CN2002/0006352002.9.9中描述將人源精氨酸酶進(jìn)行聚乙二醇修飾，以改良人源精氨酸酶的穩(wěn)定性以維持在患者體內(nèi)足夠的精氨酸剝奪效果(低于8微摩爾)而不需要其它蛋白質(zhì)分解抑制劑。在這里，人源精氨酸酶經(jīng)聚乙二醇修飾后能有效延長(zhǎng)人源精氨酸酶在體內(nèi)的存留時(shí)間，有效將體內(nèi)的精氨酸降低到渴望的水平。但在熟知的聚乙二醇修飾領(lǐng)域，這種修飾產(chǎn)物并不能阻斷機(jī)體的氨基酸穩(wěn)態(tài)機(jī)制對(duì)機(jī)體進(jìn)行控制。但Cheng等在2001年的一項(xiàng)臨床實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)3個(gè)自發(fā)肝細(xì)胞癌破裂患者在未使用任何藥物治療的情況下，其肝臟腫瘤在破裂性肝損傷后均自行消退，其中一例患者其肝細(xì)胞癌消退達(dá)6個(gè)月(Chengetal.CancerLett,2005，V224:67-80.)。隨后Cheng等設(shè)計(jì)了一系列實(shí)驗(yàn)，顯示經(jīng)肝動(dòng)脈栓塞后內(nèi)源性的肝精氨酸酶從肝臟中釋放，導(dǎo)致全身精氨酸剝奪。如在一項(xiàng)治療方案中加入高劑量胰島素輸注以提高機(jī)體自行釋放內(nèi)源性精氨酸酶。在治療的6個(gè)患者中，有4個(gè)肝癌肝外消退。一個(gè)患者經(jīng)CT和PET放射線檢查其肝臟和肝外疾病(腹腔腺病)持續(xù)完全消退。目前增加蛋白質(zhì)靶向性的策略大體可分為以下2種，一種是在目標(biāo)蛋白質(zhì)的恰當(dāng)位置融合目標(biāo)靶點(diǎn)高表達(dá)分子(在本領(lǐng)域也稱為分子標(biāo)記物)的抗體，利用抗體-抗原間的特異結(jié)合達(dá)到引導(dǎo)目標(biāo)分子到達(dá)治療靶標(biāo)。如Mylotarg是一種重組的人IgG4與抗腫瘤4抗生素calicheamicin組成的k抗體。該嵌合體是利用抗體對(duì)唾液酸依賴的粘蛋白CD33抗原的特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)的，這種抗原存在于正常髓細(xì)胞和90%的急性髓細(xì)胞性白血病患者的白血病細(xì)胞原始細(xì)胞表面。Mylotarg對(duì)表達(dá)CD33抗原的細(xì)胞毒性是不表達(dá)該抗體原細(xì)胞的7萬多倍。Mylotarg的臨床療效已被多項(xiàng)臨床實(shí)驗(yàn)證明。對(duì)首次復(fù)發(fā)的急性髓性白血病的三項(xiàng)開放研究中，277名患者CD33抗原均為陽(yáng)性。每例患者接受Mylotarg間隔4天2次滴注，每次劑量為9mg/m2體表面積。一個(gè)療程后，總有效率達(dá)26%，緩解時(shí)間達(dá)60余天，治療平均生存期達(dá)5.9月。另一種策略是利用噬菌體顯示技術(shù)篩選出的靶向多肽融合到目標(biāo)蛋白質(zhì)的恰當(dāng)位置。如腫瘤組織與正常組織相比其中一項(xiàng)主要的生理差別是腫瘤周圍的新生血管密度高。這種高密度的新生血管的內(nèi)皮表達(dá)大量的整合素如avP3，通過噬菌體技術(shù)篩選的RGD短肽能與其特異性結(jié)合。利用此種技術(shù)張英起等構(gòu)建了RGD-TNF(腫瘤壞死因子)融合蛋白，周雪等設(shè)計(jì)了兩個(gè)在水蛭素C端融合RGD的嵌合分子。與野生型蛋白質(zhì)相比，這些融合蛋白都出示了更好的活性結(jié)果。這種靶向多肽融合的嵌合分子與抗體分子融合的嵌合分子相比，具有更好的穿透能力。腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移很大程度上取決于通過血管獲得的營(yíng)養(yǎng)需求是否充足。因此通過控制血管增生現(xiàn)已成為腫瘤治療的一大手段。研究表明實(shí)體腫瘤新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)幾種蛋白，包括av整聯(lián)蛋白、血管生長(zhǎng)因子受體及一些跨膜分子，這些蛋白在成熟血管中幾乎不表達(dá)或表達(dá)很低。其中腫瘤新生血管高表達(dá)氨肽酶N就是這樣一種跨膜蛋白。通過噬菌體展示技術(shù)篩選出GCNGRC多肽(SEQIDN0:1)能特異性與新生血管內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)的氨肽酶N分子特異性結(jié)合。Ellerby等通過流式細(xì)胞術(shù)證明了GCNGRC短肽能與新生內(nèi)皮細(xì)胞作用并被內(nèi)吞進(jìn)胞槳(Ellerbyetal.NatureMedicine,1999，V5:1032-1038)，能有效作為導(dǎo)向腫瘤的分子彈頭。在此研究的基礎(chǔ)上，Curnis等將GCNGRC短肽融合在鼠源腫瘤壞死因子(TNF)上，嵌合分子在腫瘤動(dòng)物模型上與野生型蛋白相比其抑瘤有效性提高12-15倍，但毒性并未相應(yīng)增加。將GCNGRC短肽融合在人源腫瘤壞死因子(TNF)上，嵌合分子在腫瘤動(dòng)物模型上與野生型蛋白相比其有效性更為顯著；相同的抑瘤率嵌合分子的用量只有野生蛋白的1/30(Curnisetal.NatureBiotechnology，2000，V18:1185-1190)。Pastorino等將GCNGRC短肽外延接到阿霉素脂質(zhì)體的表面用來治療成神經(jīng)細(xì)胞瘤研究(Pastorinoetal.CancerResearch,2003，V63:7400-7409)。研究顯示，期嫁接GCNGRC短肽的阿霉素脂質(zhì)體在SCID小鼠體內(nèi)獲得更長(zhǎng)的半衰期，他們能夠通過內(nèi)含體/溶酶體通路被腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞。結(jié)果顯示當(dāng)給藥24小時(shí)后，接有GCNGRC短肽的脂質(zhì)體在細(xì)胞內(nèi)的水平至少是未嫁接脂質(zhì)體的10倍。從受試組動(dòng)物取腫瘤做冷凍切片組織學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)GCNGRC嫁接脂質(zhì)體組的動(dòng)物腫瘤血管收到顯著損傷，且血管密度與其它組相比顯著降低；免疫組化結(jié)果也支持了上述結(jié)論。嫁接的脂質(zhì)體動(dòng)物組腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡從而引起腫瘤凋亡與其它組相比非常明顯。很多人腫瘤細(xì)胞都表達(dá)生長(zhǎng)激素抑制素(somastatin)受體(Reubietal.TrendsPharmacol.Sci.，1995，V16:110-115)，生長(zhǎng)激素抑制素受體屬于G蛋白偶聯(lián)的細(xì)胞膜受體，具有7各跨膜螺旋結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)已明確生長(zhǎng)激素抑制素受體有5種不同的分子亞型，分別被命名為SSTl-5。在人體的多種腫瘤中，SST-2表達(dá)頻率最高。近些年研究表明，人肝癌細(xì)胞也表達(dá)生長(zhǎng)激素抑制素受體，且生長(zhǎng)激素抑制素受體直接參與調(diào)節(jié)肝細(xì)胞性肝癌。最近研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)生長(zhǎng)激素抑制素(FCFWKTCT多肽，SEQIDNO:2)與腫瘤及其周圍的受體結(jié)合后，可產(chǎn)生強(qiáng)烈的血管收縮效應(yīng)，直接減少腫瘤的循環(huán)血量，導(dǎo)致腫瘤局部組織缺氧性壞死。尿激酶型纖維蛋白溶酶原及其受體表達(dá)增強(qiáng)是惡性腫瘤的特征之一(Ellisetal.Ann.NYAcad.Sci.，1992，V667:13-)。大量研究已經(jīng)證實(shí)尿激酶型纖維蛋白溶酶原及其受體參與腫瘤的轉(zhuǎn)移過程。當(dāng)給Lewis肺癌小鼠靜脈滴注尿激酶型纖維蛋白溶酶原時(shí)，可使腫瘤轉(zhuǎn)移明顯增強(qiáng)；反之，用分泌原尿激酶型纖維蛋白溶酶原的細(xì)胞株及抗尿激酶型纖維蛋白溶酶原抗體孵育后注入裸鼠的淋巴結(jié)，觀察到轉(zhuǎn)移數(shù)較對(duì)照組顯著減少。同樣，尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活質(zhì)(urokinase-typeplasminogenactivator)受體被發(fā)現(xiàn)在腫瘤患者的侵入性病灶高表達(dá)。因此，尿激酶型纖維蛋白溶酶原受體稱為惡性腫瘤的一個(gè)分子標(biāo)記物。尿激酶型纖維蛋白溶酶原氨基酸的第12-32序列片段為DCLNGGTCVSNKYFSNIHWCN(SEQIDNO:3)形成表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域，已被闡明是人源尿激酶與其受體高度特異性結(jié)合的區(qū)域(A卯ellaetal.J.Biol.Chem.，1987，V262:4437-4440)。由于DCLNGGTCVSNKYFSNIHWCN只具有與尿激酶型纖維蛋白溶酶原受體結(jié)合的能力，而缺失其纖溶活性。Peron等將DCLNGGTCVSNKYFSNIHWCN序列與蛋氨酸酶融合制備的分子嵌合體在乳腺癌細(xì)胞MCF-7上與野生蛋氨酸酶相比出示了很好的抑制腫瘤遷移及增生能力(Peronetal.CancerChemoth.Pharma.2003，V52:270-276)。目前，尚未有使外源精氨酸酶快速、高濃度富集在腫瘤細(xì)胞的周圍，以模擬內(nèi)源性精氨酸酶的釋放，同時(shí)具有高的穩(wěn)定性和循環(huán)時(shí)間，以達(dá)到腫瘤有效治療效果的融合蛋白。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種靶向于腫瘤新生血管和/或腫瘤表面，達(dá)到快速有效去除腫瘤細(xì)胞周圍精氨酸濃度，從而使腫瘤發(fā)生凋亡的重組精氨酸酶融合蛋白。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供上述融合蛋白在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明人認(rèn)識(shí)到之所以內(nèi)源性精氨酸酶的釋放能非常有效的使肝臟腫瘤自行消退，而這種效果無論是將人源精氨酸酶聚乙二醇修飾還是與胰島素組成藥用組合物都很難達(dá)到，是因?yàn)檫@樣的事實(shí)內(nèi)源性精氨酸酶能在高濃度、高活性的富集在腫瘤周圍，在非常短的時(shí)間內(nèi)將腫瘤周圍的精氨酸代謝使腫瘤細(xì)胞快速缺乏精氨酸。由于腫瘤細(xì)胞增殖非?？?，對(duì)精氨酸需求量非常大，且與正常細(xì)胞相比精氨酸依賴型腫瘤細(xì)胞對(duì)精氨酸耗竭更為敏感。因此，腫瘤細(xì)胞由于精氨酸缺乏而進(jìn)入凋亡狀態(tài)，而此時(shí)正常細(xì)胞卻仍處于靜止期。增加蛋白質(zhì)的靶向性可有效模擬內(nèi)源性精氨酸酶釋放的效果(區(qū)域性、高濃度)，從而有效降低目標(biāo)藥物的毒副反應(yīng)，提高目標(biāo)蛋白質(zhì)的治療指數(shù)，提高目標(biāo)蛋白質(zhì)的生物利用度。我們針對(duì)肝細(xì)胞腫瘤與正常細(xì)胞間的差別，優(yōu)選3種通過噬菌體展示技術(shù)篩選的靶向多肽(SEQIDN0:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3)，將其與精氨酸酶進(jìn)行融合，使之獲得足夠的靶向性，以達(dá)到在機(jī)體的肝腫瘤區(qū)域?qū)崿F(xiàn)區(qū)域性、高濃度富集的效果。本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)的—種重組人精氨酸酶融合蛋白，該融合蛋白為融合了氨基酸序列為SEQIDNO:l、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3多肽中任一種的重組人精氨酸酶。所述的融合蛋白，其中多肽融合在重組人精氨酸酶的C末端和/或N末端。6所述的融合蛋白，其中多肽通過接頭融合在重組人精氨酸酶的C末端和/或N末丄山順。聚乙二醇修飾的所述的重組人精氨酸酶融合蛋白。所述的融合蛋白，其中聚乙二醇的分子量為2000-100000道爾頓。優(yōu)選聚乙二醇分子量為5000-40000道爾頓?！N藥物組合物，其中含有治療有效量的上述任意一種或多種重組人精氨酸酶融合蛋白。制備上述的聚乙二醇修飾重組人精氨酸酶融合蛋白質(zhì)制品的方法，包括如下步驟a.在pH3-10的條件下，將重組人精氨酸酶融合蛋白質(zhì)與活化的聚乙二醇反應(yīng)；b.任選地從反應(yīng)混合物中分離聚乙二醇修飾的重組人精氨酸酶融合蛋白質(zhì)制品。所述的方法，其中活化的聚乙二醇包括單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯、單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺丙酸酸酯、單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺琥珀酸酯、單甲氧基聚乙二醇乙酸酯。所述的任一融合蛋白在制備治療肝細(xì)胞腫瘤的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明將CNGRC嵌合到重組人精氨酸酶上，以獲得靶向于腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的藥物。本發(fā)明將FCFWKTC序列與重組人精氨酸酶嵌合，達(dá)到重組精氨酸酶靶向于作用腫瘤血管及發(fā)揮生長(zhǎng)激素抑制素抑制腫瘤細(xì)胞DNA合成與復(fù)制的雙重效果。本發(fā)明將DCLNGGTCVSNKYFSNIHWCN序列與重組人精氨酸酶融合，可將重組人精氨酸酶靶向到腫瘤。這些精氨酸酶融合蛋白輸入體內(nèi)后，可實(shí)現(xiàn)通過血液循環(huán)不斷與相應(yīng)受體結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)精氨酸酶在肝腫瘤細(xì)胞周圍的富集。這種富集可有效規(guī)避藥物對(duì)正常細(xì)胞的損傷，最大程度降低藥物的毒副作用，有效提高對(duì)靶向區(qū)域腫瘤的殺傷效果。這種靶向策略不會(huì)對(duì)機(jī)體造成額外的如發(fā)明背景中提到的利用肝動(dòng)脈栓塞后從肝臟中釋放內(nèi)源性的肝精氨酸酶損傷，但卻能實(shí)現(xiàn)精氨酸酶局部的、高濃度富集的效果；同時(shí)，這種靶向融合蛋白藥物還能在一定程度上有效阻止機(jī)體的氨基酸穩(wěn)態(tài)機(jī)制(無靶向性的精氨酸酶在體內(nèi)的分布將不被破壞)，從而能有效提高藥物的治療效果。圖1出示融合不同活性氨基酸序列的精氨酸酶質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。圖2A出示菌種arg229(融合CNGRC序列的精氨酸酶)在生物反應(yīng)器中IPTG(異丙基-1-硫代-P_呋喃半乳糖苷)誘導(dǎo)前后目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。泳道1:生物反應(yīng)器中培養(yǎng)2h的菌體；泳道2:生物反應(yīng)器中培養(yǎng)4h的菌體；泳道3:生物反應(yīng)器中培養(yǎng)5h的菌體；泳道4:分子量marker;泳道5:IPTG誘導(dǎo)lh的菌體；泳道5:IPTG誘導(dǎo)3h的菌體；泳道6:IPTG誘導(dǎo)4h的菌體；泳道7:IPTG誘導(dǎo)5h的菌體；泳道8:IPTG誘導(dǎo)6h的菌體；泳道9:IPTG誘導(dǎo)8h的菌體；泳道10:人源精氨酸酶標(biāo)準(zhǔn)品。SDS-PAGE的濃縮膠濃度為5%(重量百分比)，分離膠濃度為12%(重量百分比)。圖2B出示菌種arglll(融合FCFWKTC序列的精氨酸酶)在生物反應(yīng)器中IPTG(異丙基-1-硫代_呋喃半乳糖苷)誘導(dǎo)前后目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。泳道1:生物反應(yīng)器中培養(yǎng)2h的菌體；泳道2:生物反應(yīng)器中培養(yǎng)4h的菌體；泳道3:生物反應(yīng)器中培養(yǎng)5h的菌體；泳道4:分子量marker;泳道5:IPTG誘導(dǎo)lh的菌體；泳道5:IPTG誘導(dǎo)3h的菌體；泳道6:IPTG誘導(dǎo)4h的菌體；泳道7:IPTG誘導(dǎo)5h的菌體；泳道8:IPTG誘導(dǎo)6h的菌體；泳道9:人源精氨酸酶標(biāo)準(zhǔn)品。SDS_PAGE的濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12%。圖2C出示菌種arg316(融合DCLNGGTCVSNKYFSNIHWCN序列的精氨酸酶)在生物反應(yīng)器中IPTG(異丙基-l-硫代-e-呋喃半乳糖苷)誘導(dǎo)前后目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。泳道1:生物反應(yīng)器中培養(yǎng)4h的菌體；泳道2:生物反應(yīng)器中培養(yǎng)6h的菌體；泳道3:分子量marker;泳道4:IPTG誘導(dǎo)2h的菌體；泳道5:IPTG誘導(dǎo)3h的菌體；泳道6:IPTG誘導(dǎo)4h的菌體；泳道7:IPTG誘導(dǎo)5h的菌體；泳道8:IPTG誘導(dǎo)6h的菌體。SDS-PAGE的濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12%。圖3A出示菌種arg229表達(dá)的目標(biāo)蛋白(u229)的陽(yáng)離子層析圖譜。層析緩沖液BufferA:120mM乙酸鈉(pH6.0);BufferB:含1.OM氯化鈉的120mM乙酸鈉(pH6.0);層析介質(zhì)為SPS印haroseFastFlow;層析柱XK26/40(26*400mmi.d.)。柱頭吸入式上樣，待穿透峰PO的紫外吸收信號(hào)歸至基線后，用80%(體積百分比)BufferA+20%(體積百分比)BufferB洗脫目標(biāo)蛋白峰；用100%(體積百分比)BufferB再生介質(zhì)。圖3B出示圖3A中各純化峰的SDS-PAGE鑒定。泳道1:菌體的破碎上清；泳道2:穿透峰P0;泳道3:洗脫峰PI;泳道4_6:洗脫峰P2，目標(biāo)蛋白峰；泳道7:洗脫峰P3;泳道8:洗脫峰P2，目標(biāo)蛋白峰；泳道9:分子量marker。SDS-PAGE的濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12%。圖3C出示在3A中通過陽(yáng)離子層析系統(tǒng)制備的目標(biāo)蛋白在高效反相液相色譜中的純度表征圖譜。層析條件如下SolventA:含0.1%(體積百分比)三氟乙酸的超純水；SolventB:含0.1%(體積百分比)三氟乙酸的乙腈；分析柱Vydac214TP54(4.6X250mmi.d.)，10iim，300A。系統(tǒng)Agilent1200，DAD檢測(cè)器。檢測(cè)方法(線性梯度)O-lOmin，O.5ml/min;75%(體積百分比)solventA/25%(體積百分比)solventB;10-55min，0.5ml/min;25%(體積百分比)solventB_70%(體積百分比)solventB;55-60min，0.5ml/min;70%(體積百分比)solventB-100%(體積百分比)solventB。圖4A出示菌種arglll表達(dá)的目標(biāo)蛋白(Ulll)的陽(yáng)離子層析圖譜。層析緩沖液BufferA:120mM乙酸鈉(pH6.0);BufferB:含1.OM氯化鈉的120mM乙酸鈉(pH6.0);層析介質(zhì)為SPS印haroseFastFlow;層析柱XK26/40(26*400mmi.d.)。柱頭吸入式上樣，待穿透峰PO的紫外吸收信號(hào)歸至基線后，用80%(體積百分比)BufferA+20%(體積百分比)BufferB洗脫目標(biāo)蛋白峰；用100%(體積百分比)BufferB再生介質(zhì)。圖4B出示圖4A中各純化峰的SDS-PAGE鑒定。泳道1:菌體的破碎上清；泳道2:穿透峰PO;泳道3:洗脫峰PI;泳道4_5:洗脫峰P2，目標(biāo)蛋白峰；泳道6:洗脫峰P3;泳道7:洗脫峰P2，目標(biāo)蛋白峰；泳道8:分子量marker。SDS-PAGE的濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12%。圖4C出示在4A中通過陽(yáng)離子層析系統(tǒng)制備的目標(biāo)蛋白在高效反相液相色譜中的純度表征圖譜。層析條件如下SolventA:含0.1%(體積百分比)三氟乙酸的超純水；SolventB:含0.1%(體積百分比)三氟乙酸的乙腈；分析柱Vydac214TP54(4.6X250mmi.d.)，10iim，300A。系統(tǒng)Agilent1200，DAD檢測(cè)器。檢測(cè)方法(線性梯度)O-lOmin，O.5ml/min;75%(體積百分比)solventA/25%(體積百分比)solventB;10-55min，0.5ml/min;25%(體積百分比)solventB_70%(體積百分比)solventB;55-60min，0.5ml/min;70%(體積百分比)solventB-100%(體積百分比)solventB。圖5A出示菌種arg316表達(dá)的目標(biāo)蛋白(U316)的陽(yáng)離子層析圖譜。層析緩沖液BufferA:120mM乙酸鈉(pH6.0);BufferB:含1.0M氯化鈉的120mM乙酸鈉(pH6.0);層析介質(zhì)為SPS印haroseFastFlow;層析柱XK26/40(26*400mmi.d.)。柱頭吸入式上樣，待穿透峰PO的紫外吸收信號(hào)歸至基線后，用80%BufferA+20%BufferB洗脫目標(biāo)蛋白峰；用100%BufferB再生介質(zhì)。圖5B出示圖5A中各純化峰的SDS-PAGE鑒定。泳道1:菌體的破碎上清；泳道2:穿透峰PO;泳道3:洗脫峰PI;泳道4_6:洗脫峰P2，目標(biāo)蛋白峰；泳道7:洗脫峰P3;泳道8:分子量marker。SDS-PAGE的濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12%。圖5C出示在5A中通過陽(yáng)離子層析系統(tǒng)制備的目標(biāo)蛋白在高效反相液相色譜中的純度表征圖譜。層析條件如下SolventA:含0.1%三氟乙酸的超純水；SolventB:含0.1%三氟乙酸的乙腈;分析柱Vydac214TP54(4.6X250mmi.d.)，10iim，300A。系統(tǒng)Agilent1200，DAD檢測(cè)器。檢測(cè)方法(線性梯度)O-lOmin，O.5ml/min;75%(體積百分比)solventA/25%(體積百分比)solventB;10-55min，0.5ml/min;25%(體積百分比)solventB_70%(體積百分比)solventB;55-60min，0.5ml/min;70%(體積百分比)solventB-100%(體積百分比)solventB。圖6A出示經(jīng)陽(yáng)離子層析純化的目標(biāo)蛋白U229用單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯(分子量20kDa)修飾，反應(yīng)混合物的反相高效液相色譜圖。層析條件如下SolventA:含0.1%三氟乙酸的超純水；SolventB:含0.1%三氟乙酸的乙腈;分析柱Vydac214TP54(4.6X250mmi.d.)，10iim，300A。系統(tǒng)Agilent1200，DAD檢測(cè)器，蒸發(fā)光檢測(cè)器。檢測(cè)方法(線性梯度)0-5min，0.5ml/min;60%(體積百分比)solventA/40%(體積百分比)solventB;5-50min，0.5ml/min;45%(體積百分比)solventA_55%(體積百分比)solventB;50-55min，0.5ml/min;0%(體積百分比)solventA-100%(體積百分比)solventB。圖6B出示經(jīng)凝膠過濾色譜(SuperdexG200Prepgrad)純化的聚乙二醇修飾產(chǎn)品(P229)的反相高效液相色譜圖。層析條件如下SolventA:含0.1%三氟乙酸的超純水；SolventB:含0.1%三氟乙酸的乙腈;分析柱Vydac214TP54(4.6X250mmi.d.)，10iim，300A。系統(tǒng)Agilent1200，DAD檢測(cè)器，蒸發(fā)光檢測(cè)器。檢測(cè)方法(線性梯度)0-5min，0.5ml/min;60%(體積百分比)solventA/40%(體積百分比)solventB;5-50min，0.5ml/min;45%(體積百分比)solventA_55%(體積百分比)solventB;50-55min，0.5ml/min;0%(體積百分比)solventA-100%(體積百分比)solventB。圖7A出示經(jīng)陽(yáng)離子層析純化的目標(biāo)蛋白Ulll用單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯(分子量20kDa)修飾，反應(yīng)混合物的反相高效液相色譜圖。層析條件如下SolventA:含0.1%(體積百分比)三氟乙酸的超純水；SolventB:含0.1%(體積百分比)三氟乙酸的乙腈；分析柱Vydac214TP54(4.6X250mmi.d.)，10iim，300A。系統(tǒng)Agilent1200，DAD檢測(cè)器，蒸發(fā)光檢測(cè)器。檢測(cè)方法(線性梯度)0-5min，0.5ml/min;60%(體積百分比)solventA/40%(體積百分比)solventB;5-50min，0.5ml/min;45%(亍本積、百分比)solventA—55%(亍本積、百分比)solventB;50-55min，0.5ml/min;0%(體積百分比)solventA-100%(體積百分比)solventB。圖7B出示經(jīng)凝膠過濾色譜(SuperdexG200PrepgMd)純化的聚乙二醇修飾產(chǎn)品(Pill)的反相高效液相色譜圖。層析條件如下SolventA:含0.1%三氟乙酸的超純水；SolventB:含0.1%三氟乙酸的乙腈;分析柱Vydac214TP54(4.6X250mmi.d.)，10iim，300A。系統(tǒng)Agilent1200，DAD檢測(cè)器，蒸發(fā)光檢測(cè)器。檢測(cè)方法(線性梯度)0-5min，0.5ml/min;60%(體積百分比)solventA/40%(體積百分比)solventB;5-50min，0.5ml/min;45%(亍本積、百分比)solventA—55%(亍本積、百分比)solventB;50-55min，0.5ml/min;0%(體積百分比)solventA-100%(體積百分比)solventB。圖8A出示經(jīng)陽(yáng)離子層析純化的目標(biāo)蛋白U316用單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯(分子量20kDa)修飾，反應(yīng)混合物的反相高效液相色譜圖。層析條件如下SolventA:含0.1%三氟乙酸的超純水；SolventB:含0.1%三氟乙酸的乙腈;分析柱Vydac214TP54(4.6X250mmi.d.)，10iim，300A。系統(tǒng)Agilent1200，DAD檢測(cè)器，蒸發(fā)光檢測(cè)器。檢測(cè)方法(線性梯度)0-5min，0.5ml/min;60%(體積百分比)solventA/40%(體積百分比)solventB;5-50min，0.5ml/min;45%(體積百分比)solventA_55%(體積百分比)solventB;50-55min，0.5ml/min;0%(體積百分比)solventA-100%(體積百分比)solventB。圖8B出示經(jīng)凝膠過濾色譜(SuperdexG200Prepgrad)純化的聚乙二醇修飾產(chǎn)品(P316)的反相高效液相色譜圖。層析條件如下SolventA:含0.1%三氟乙酸的超純水；SolventB:含0.1%三氟乙酸的乙腈;分析柱Vydac214TP54(4.6X250mmi.d.)，10iim，300A。系統(tǒng)Agilent1200，DAD檢測(cè)器，蒸發(fā)光檢測(cè)器。檢測(cè)方法(線性梯度)0-5min，0.5ml/min;60%(體積百分比)solventA/40%(體積百分比)solventB;5-50min，0.5ml/min;45%U本積、百分比)solventA_55%H本積、百分比)solventB;50-55min，0.5ml/min;0%(體積百分比)solventA-100%(體積百分比)solventB。圖9是經(jīng)陽(yáng)離子層析純化的菌種arg229(a)表達(dá)的目標(biāo)蛋白及P229(b)的尺寸排阻色譜。色譜條件為緩沖液含0.15M氯化鈉的50mM磷酸鹽(pH7.4);流速0.5ml/min;柱子SuperdexG200(GEHealthcare);上樣體積100ii1。圖10是純化、除菌、除病毒的P229與其未修飾形式蛋白對(duì)昆明小鼠尾靜脈給藥后蛋白質(zhì)在體內(nèi)活性變化曲線。圖11是各劑量(40mg/kg、13.3mg/kg、4.4mg/mg)P229對(duì)荷人肝癌H印G2裸鼠抑制模型抑瘤效果照片。具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。實(shí)施例1A:NGR-精氨酸酶融合蛋白重組菌株的構(gòu)建(a)分離編碼人精氨酸酶I的基因根據(jù)公布的人精氨酸酶I的cDNA序列(NM_000045)設(shè)計(jì)引物。使用TIANGEN的PlatinumI進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)以分離編碼人精氨酸酶I的基因。弓l物ARGl:(5，_cggg^￡￡cgccaagtccagaaccatag_3，，SEQIDNO:4);ARG2:(5，-cccaagcttttacttaggtgggttaaggtag-3，，SEQIDNO:5)購(gòu)自SANGON。ARG1含有一個(gè)BamHI限制酶識(shí)別位點(diǎn)(下劃線)，引物ARG2含有一個(gè)HindIII限制酶識(shí)別12位點(diǎn)(下劃線)。將這兩個(gè)引物(各自終濃度為400nM)加入到一個(gè)0.2ml小試管中的1y1人肝臟cDNA文庫(kù)(Clontech)中。另外加入DNAPlatinumI(1yl，5單位)，4種脫氧核糖核酸(終濃度各為0.ImM)和反應(yīng)緩沖液(2.51)和去離子水(17.5iU)。使用以下條件進(jìn)行PCR:預(yù)PCR(94°C，5分鐘)，30次PCR循環(huán)(94°C，1分鐘；58°C，1分鐘；72°C，1分鐘)，后PCR(72t:，7分鐘)。將PCR產(chǎn)物(5iU)在1%(重量百分比)的瓊脂糖凝膠電泳分析，觀察到一個(gè)lkb條帶，這就是編碼人精氨酸酶I的基因。(反應(yīng)緩沖液為現(xiàn)有技術(shù))(b)將所述lkbPCR產(chǎn)物亞克隆入質(zhì)粒Pet-25b形成質(zhì)粒Pet-25b-ARG將使用上述方法制備的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII(TakaRa)在37t:處理2小時(shí)。完成后將反應(yīng)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(1%濃度)，并使用普通凝膠回收試劑盒(TIANGEN)從凝膠中回收lkbDNA片斷。載體Pet-25b使用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindlII在37t:處理2小時(shí)。完成后將反應(yīng)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(1%)，并使用普通凝膠回收試劑盒(TIANGEN)從凝膠中回收5.5kbDNA片斷。使用T4連接酶(TakaRa)將兩DNA片斷于16t:連接8小時(shí)。該連接混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，使用商品化感受態(tài)細(xì)胞DH5a(全式金)，并鋪板于含有100i!g/ml氨芐青霉素的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上。使用T7(5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'，SEQIDNO:12)和PRMER3-ANTISENSEPCR篩選菌落，將這兩個(gè)引物(各自終濃度為50ng)加入到一個(gè)O.2ml小試管中，DNAPlati皿mI(1yl，2.5單位)，4種脫氧核糖核酸(終濃度各為0.lmM)和反應(yīng)緩沖液(2.5yl)和去離子水(17.5iU)，沾取單克隆為模板。使用以下條件進(jìn)行PCR:預(yù)PCR(94°C，5分鐘)，30次PCR循環(huán)(94°C，1分鐘；54°C，1分鐘；72°C，1分鐘)，后PCR(72°C，7分鐘)。將PCR產(chǎn)物(5y1)在1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，觀察到一個(gè)lkb條帶，由此獲得具有適當(dāng)插入片段的質(zhì)粒。該構(gòu)建質(zhì)粒稱為Pet-25b-ARG。使用T7正向引物進(jìn)行DNA測(cè)序(三博遠(yuǎn)志公司)，證實(shí)含編碼該精氨酸酶的基因。(c)GCNGRC與精氨酸酶I融合蛋白的質(zhì)粒構(gòu)建及菌株構(gòu)建設(shè)計(jì)含有編碼GCNGRCNGR基因的引物PRMER1-SENSE(5'-TATGGGATGTAATGGAAGATGTG-3，，SEQIDNO:6)PRMER1-ANTISENSE(5'GATCCACATCTTCCATTACATCCCA-3'，SEQIDNO:7)購(gòu)自SANGON，含有NdeI和BamHI粘末端，將這兩個(gè)引物(共2，各自終濃度為50ng)加入到一個(gè)O.2ml小試管中，并加入PCR反應(yīng)緩沖液(2iU)和去離子水(16iil)，共20ii1反應(yīng)體系。在下列條件進(jìn)行配對(duì)5次循環(huán)(94°C，1分鐘；55°C，1分鐘；72°C，1分鐘)。將載體Pet-25b使用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII在37。C處理2小時(shí)。完成后將反應(yīng)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(1%)，并使用普通凝膠回收試劑盒(TIANGEN)從凝膠中回收6.5kb的DNA片斷。將該DNA片斷與含有NGR的引物退火后得到的DNA產(chǎn)物使用T4連接酶(TakaRa)于16t:連接8小時(shí)。該連接混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌，使用商品化感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)(全式金)，并鋪板于含有100g/ml氨芐青霉素的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上。使用T7和含有NGR的引物PCR篩選菌落，獲得具有適當(dāng)插入片段的質(zhì)粒。使用T7正向引物進(jìn)行DNA測(cè)序，已證實(shí)該編碼精氨酸酶的基因。該質(zhì)粒構(gòu)建稱為Pet-25b-229，該菌在本專利中命名為arg229，示意圖見圖1。實(shí)施例IB:FCFWKTCT-精氨酸酶融合蛋白重組菌株的構(gòu)建設(shè)計(jì)含有編碼FCFWKTCT基因的引物PRMER2-SENSE(5'TATGTTCTGTTTCTGGAAGACGTGTACGG3，，SEQIDNO:8);PRMER2-ANTISENSE(5'GATCCCGTACACGTCTTCCAGAAACAGAACA3，，SEQIDNO:9)購(gòu)自SANGON，含有NdeI和BamHI粘末端，將這兩個(gè)引物(共2，各自終濃度為50ng)加入到一個(gè)O.2ml小試管中，并加入PCR反應(yīng)緩沖液(2iU)和去離子水(16yl)，共20反應(yīng)體系。在下列條件進(jìn)行配對(duì)5次循環(huán)(94°C，1分鐘；55°C，1分鐘；72°C，1分鐘)。將載體Pet-25b使用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII在37。C處理2小時(shí)。完成后將反應(yīng)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(1%)，并使用普通凝膠回收試劑盒(TIANGEN)從凝膠中回收6.5kb的DNA片斷。將該DNA片斷與含有FCFWKTCT的引物退火后得到的DNA產(chǎn)物使用T4連接酶(TakaRa)于16t:連接8小時(shí)。該連接混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，使用商品化感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)(全式金)，并鋪板于含有100yg/ml氨芐青霉素的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上。使用T7和PRMER3-ANTISENSEPCR篩選菌落，獲得具有適當(dāng)插入片段的質(zhì)粒。使用T7正向引物進(jìn)行DNA測(cè)序，證實(shí)含編碼該精氨酸酶的基因。該構(gòu)建質(zhì)粒稱為Pet-25b-316，該菌在本專利中命名為arg316，示意圖見圖1。實(shí)施例1C:DCLNGGTAVSNKYFSNIHWCN-精氨酸酶融合蛋白重組菌株的構(gòu)建設(shè)計(jì)含有編碼尿激酶片段基因的引物TCTCCAACAT3，，SEQIDNO:10);PRMER3-ANTISENSESEQIDNO:11)購(gòu)自SANG0N，含有NdeI和BglII粘末端，將這兩個(gè)引物(各自終濃度為50ng)加入到一個(gè)O.2ml小試管中，另外加入DNAPlati皿mI(1yl，5單位)，4種脫氧核糖核酸(終濃度各為O.ImM)和反應(yīng)緩沖液(2.5ill)和去離子水(17.5ill)。使用以下條件進(jìn)行PCR:預(yù)PCR(94t:，5分鐘)，IO次PCR循環(huán)(94°C，0.5分鐘；58°C，0.5分鐘；72°C，10秒)，后PCR(72t:，7分鐘)。將PCR產(chǎn)物使用限制性內(nèi)切酶BglII和NdeI在37。C處理2小時(shí)。將載體Pet-25b使用限制性內(nèi)切酶BamHI和NdeI在37。C處理2小時(shí)。完成后將反應(yīng)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(1%)，并使用普通凝膠回收試劑盒(TIANGEN)從凝膠中回收6.5kb的DNA片斷。將該DNA片斷與酶切后得到的尿激酶DNA產(chǎn)物使用T4連接酶(TakaRa)于16t:連接8小時(shí)。該連接混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，使用商品化感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)(全式金)，并鋪板于含有100yg/ml氨芐青霉素的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上。使用T7和PRMER3-ANTISENSE篩選菌落，獲得具有適當(dāng)插入片段的質(zhì)粒。使用T7正向引物進(jìn)行DNA測(cè)序，證實(shí)含編碼該精氨酸酶的基因。該質(zhì)粒構(gòu)建稱為Pet-25b-lll，該菌在本專利中命名為arglll，示意圖見圖1。實(shí)施例2A:菌種arg229的發(fā)酵將含Pet-25b-229質(zhì)粒的菌種涂布在瓊脂平板上，37。C下培養(yǎng)過夜。從平板上挑取一株單克隆，接種到已滅菌的含100mlLB培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉5g/L)的500ml錐形瓶中，200rpm，37t:下培養(yǎng)過夜。將此100ml培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接入5L的Braim發(fā)酵罐中。所述發(fā)酵罐含有3500ml發(fā)酵培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉5g/L，氨芐青霉素濃度100iig/ml)。在37t:下培養(yǎng)，通過氨水和20%磷酸控制培養(yǎng)基14的pH在7.0。當(dāng)溶解氧急劇下降至20%左右的空氣飽和度時(shí)，開始流加培養(yǎng)基(250g/L葡萄糖，100g/L酵母提取物，7g/LMgS047H20)，當(dāng)溶解氧降至10%空氣飽和度時(shí)停止補(bǔ)料；當(dāng)溶解氧升至70%空氣飽和度時(shí)再次開始補(bǔ)料，如此循環(huán)。當(dāng)培養(yǎng)物的OD達(dá)到10時(shí)，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。當(dāng)OD達(dá)到30左右，停止培養(yǎng)，4000rpm下收集菌體，各生長(zhǎng)階段蛋白的表達(dá)情況見圖2A。實(shí)施例2B:菌種arg316與arglll的發(fā)酵培養(yǎng)方法同實(shí)施例2A所用方法，但單克隆分別換為含Pet-25b-111與含Pet-25b-316質(zhì)粒的單克隆，各生長(zhǎng)階段蛋白的表達(dá)情況見圖2B(Pet-25b-111)和2C(Pet-25b-316)。實(shí)施例2C:各質(zhì)粒菌種發(fā)酵產(chǎn)率的對(duì)比表1對(duì)比了含Pet-25b-lll、Pet-25b-229、Pet-25b-316質(zhì)粒的菌種在5L發(fā)酵罐中，分批次補(bǔ)料模式下菌體收率的比較。表l質(zhì)粒Pet-25b-111Pet-25b-229Pet-25b-316菌體收率33g/L35g/L41g/L實(shí)施例3A:菌種arg229的表達(dá)目標(biāo)蛋白U229(含NGR序列的arginase)的純化將沉淀的菌體(100g)重懸于120mM乙酸鈉鹽緩沖液中(pH6.0)，菌體重/緩沖液體積約l:3(W/V)。重懸物超聲破碎，條件為東芝破碎儀10號(hào)探頭，功率600赫茲，工作5S間隔IOS，冰水浴下破碎180次。破碎液在4t:下10000rpm離心20分鐘，取上清進(jìn)行下一步的層析純化步驟。將一個(gè)裝有100mlSPS印haroseFastFlow介質(zhì)(GEHealthcare)的XK26/40柱用純水充分洗滌后，用120mM乙酸鈉緩沖液(pH6.0，BufferA)平衡5個(gè)柱體積，然后將破碎上清(約150ml)從管路吸入進(jìn)柱中，BufferA洗至電導(dǎo)、紫外信號(hào)到達(dá)基線后，以80%BufferA+20%BufferB(120mM乙酸鈉+1.OM氯化鈉)洗脫目標(biāo)蛋白峰。然后用100%BufferB再生介質(zhì)，洗脫圖示于圖3A，各峰的SDS-PAGE示于圖3B，目標(biāo)蛋白質(zhì)的反相高效液相色譜見圖3C。目標(biāo)峰在20mM磷酸鹽(pH7.4)下透析過夜除鹽，然后-S(TC下保存。Bradford方法(BradfordMM.Anal.Biochem.，1976，V72:248-254.)測(cè)定目標(biāo)蛋白質(zhì)濃度，該目標(biāo)蛋白在本專利中被稱為U229。實(shí)施例3B:菌種arglll的表達(dá)目標(biāo)蛋白Ulll(含DCLNGGTAVSNKYFSNIHWCN序列的arginase)的純化純化方法與實(shí)施例3A相似，洗脫圖示于圖4A，各峰的SDS-PAGE示于圖4B，目標(biāo)蛋白質(zhì)的反相高效液相色譜見圖4C。目標(biāo)峰在20mM磷酸鹽(pH7.4)下透析過夜除鹽，然后-8(TC下保存。Bradford方法(BradfordMM.Anal.Biochem.，1976，V72:248-254.)測(cè)定目標(biāo)蛋白質(zhì)濃度，該目標(biāo)蛋白在本專利中被稱為U111。實(shí)施例3C:菌種arg316的表達(dá)目標(biāo)蛋白U316(含F(xiàn)CFWKTCT序列的arginase)的純化15純化方法與實(shí)施例3A相似，洗脫圖示于圖5A，各峰的SDS-PAGE示于圖5B，目標(biāo)蛋白質(zhì)的反相高效液相色譜見圖5C。目標(biāo)峰在20mM磷酸鹽(pH7.4)下透析過夜除鹽，然后-8(TC下保存。Bradford方法(BradfordMM.Anal.Biochem.，1976，V72:248-254.)測(cè)定目標(biāo)蛋白質(zhì)濃度，該目標(biāo)蛋白在本專利中被稱為U316。實(shí)施例4A:U229的聚乙二醇(PEG)修飾及其產(chǎn)物純化將100mg純化的u229在室溫下融化(20mM磷酸鹽緩沖液，pH7.4)，按l:50摩爾比率(蛋白質(zhì)PEG)加入單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯(Monomethoxypolyetheleneglycolsuccinimidylcarbonate,SC-mPEG，分子量20kDa，購(gòu)自Nektar)，室溫下反應(yīng)2_4小時(shí)，反應(yīng)混合物用磁力攪拌器輕柔攪拌，使反應(yīng)充分進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后加入賴氨酸至終濃度為0.5M，繼續(xù)反應(yīng)1小時(shí)以終止未反應(yīng)的聚乙二醇(PEG)修飾劑。反應(yīng)混合物中未反應(yīng)的PEG利用Superdex200(Pr印grad，GEHealthcare)脫除。柱子為XK16/40，介質(zhì)體積約100ml，蛋白濃度為3-4mg/ml，每次上樣3ml，目標(biāo)修飾產(chǎn)物在外水體積被洗脫，收集并用MinimateTFF(PALLCooperation)超濾濃縮，濾膜的截留分子量為10kDa，至濃度約4mg/ml。蛋白質(zhì)濃度用lowry法進(jìn)行測(cè)定(Lowry0H.，etal.J.Biol.Chem.，1951，V193:265-275.)，該修飾的目標(biāo)蛋白在這本專利中被稱為P229。反應(yīng)混合物及純化的P229的反相高效液相色譜分析分別見圖6A和6B。實(shí)施例4B:Ulll的聚乙二醇(PEG)修飾及其產(chǎn)物純化將100mg純化的ulll在室溫下融化(20mM磷酸鹽緩沖液，pH7.4)，按i:50摩爾比率(蛋白質(zhì)peg)加入單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺丙酸酸酯(Monomethoxypolyetheleneglycolsuccinimidylpropionate,SPA-mPEG，分子量12kDa，購(gòu)自Nektar)，室溫下反應(yīng)4小時(shí)，反應(yīng)混合物用磁力攪拌器輕柔攪拌，使反應(yīng)充分進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后加入賴氨酸至終濃度為0.5M，繼續(xù)反應(yīng)1小時(shí)以終止未反應(yīng)的聚乙二醇(PEG)修飾劑。反應(yīng)混合物中未反應(yīng)的PEG利用Superdex200(Pr印grad，GEHealthcare)脫除。柱子為XK16/40，介質(zhì)體積約100ml，蛋白濃度為3_4mg/ml，每次上樣3ml，目標(biāo)修飾產(chǎn)物在外水體積被洗脫，收集并用MinimateTFF(PALLCooperation)超濾濃縮，濾膜的截留分子量為10kDa，至濃度約4mg/ml。蛋白質(zhì)濃度用lowry法進(jìn)行測(cè)定(Lowry0H.，etal.J.Biol.Chem.，1951，V193:265-275.)，該目標(biāo)蛋白在這本專利中被稱為Plll。反應(yīng)混合物及純化的Plll的反相高效液相色譜分析分別見圖7A和7B。實(shí)施例4C:U316的聚乙二醇(PEG)修飾及其產(chǎn)物純化將lOOmg純化的U316在室溫下融化(20mM磷酸鹽緩沖液，pH7.4)，按l:50摩爾比率(蛋白質(zhì)PEG)加入單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺琥珀酸酯(Monomethoxypolyetheleneglycolsuccinimidylsuccinate,SS-mPEG，分子量10kDa，購(gòu)自Nektar)，室溫下反應(yīng)2小時(shí)，反應(yīng)混合物用磁力攪拌器輕柔攪拌，使反應(yīng)充分進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后加入賴氨酸至終濃度為0.5M，繼續(xù)反應(yīng)1小時(shí)以終止未反應(yīng)的聚乙二醇(PEG)修飾劑。反應(yīng)混合物中未反應(yīng)的PEG利用Superdex200(Pr印grad，GEHealthcare)脫除。柱子為XK16/40，介質(zhì)體積約100ml，蛋白濃度為3_4mg/ml，每次上樣3ml，目標(biāo)修飾產(chǎn)16物在外水體積被洗脫，收集并用MinimateTFF(PALLCooperation)超濾濃縮，濾膜的截留分子量為10kDa，至濃度約4mg/ml。蛋白質(zhì)濃度用lowry法進(jìn)行測(cè)定(Lowry0H.，etal.J.Biol.Chem.，1951，V193:265-275.)，該目標(biāo)蛋白在這本專利中被稱為P316。反應(yīng)混合物及純化的P316的反相高效液相色譜分析分別見圖8A和8B。實(shí)施例5:各聚乙二醇修飾目標(biāo)蛋白內(nèi)毒素及病毒的去除將P229、P316和Plll蛋白質(zhì)對(duì)8mM的磷酸鹽(pH8.0)充分透析，至蛋白液的電導(dǎo)低于3mS/cm。以4:1(蛋白質(zhì)介質(zhì)，W/V)的比例將蛋白質(zhì)溶液加入新鮮的用無熱源的8mM的磷酸鹽(pH8.0)充分洗滌的DEAES印haroseFastFlow介質(zhì)中，4度下在搖床上輕柔搖2小時(shí)，然后靜置待介質(zhì)充分沉淀在錐形瓶的底部后，將上清蛋白液分別傾入無熱源、滅菌處理的小燒杯中，然后在無菌操作臺(tái)內(nèi)利用0.22ym的無菌濾膜對(duì)蛋白除病毒后分裝于無熱源的、滅菌處理的西林瓶中。實(shí)施例6:各目標(biāo)蛋白精氨酸酶活性的測(cè)定取6g尿素，溶解在蒸餾水中，定容至1L，配制成lOOmM尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液。將尿素標(biāo)準(zhǔn)液分別稀釋成0，5，10，20mM的溶液。稱取50g三氯乙酸，溶于水，定容至100ml，配制為50wt^三氯乙酸溶液。稱取1.742gL-精氨酸以及O.751g甘氨酸溶解，并用1MNa0H調(diào)節(jié)pH9.5，定容至100ml，配制為100mM的精氨酸反應(yīng)溶液。分別取0.02ml上述不同濃度尿素溶液，按照尿素氮試劑盒(北京化學(xué)試劑公司)操作說明，加入3ml乙二酰試劑及2.5ml氯化鐵試劑，封口后于沸水浴中加熱10分鐘，然后25t:水浴冷卻10分鐘。以不含尿素的反應(yīng)液為空白對(duì)照，在530nm處測(cè)定反應(yīng)液的吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，尿素濃度為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將目標(biāo)蛋白稀釋到適合濃度(一般低于0.025mg/ml)，取0.02ml蛋白液加入到0.06ml反應(yīng)溶液，37t:反應(yīng)10分鐘，然后加入0.02ml三氯乙酸溶液終止反應(yīng)。12000轉(zhuǎn)離心2分鐘后，取一定量上清，稀釋后，測(cè)定其中的尿素含量，該樣品在本專利中稱為反應(yīng)樣品。取O.02ml的反應(yīng)樣品，加入3ml乙二酰試劑，然后加入2.5ml氯化鐵試劑，沸水浴10min后，25度水浴10min后檢測(cè)A530，根據(jù)尿素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相應(yīng)的尿素濃度，乘以稀釋倍數(shù)后即得到反應(yīng)10min體系中增加的尿素濃度C自a(mM)。取反應(yīng)體系中增加的尿素濃度在15mM左右的稀釋樣品用于計(jì)算酶活。在本專利中酶活定義為在37t:，每分鐘生產(chǎn)lymol尿素定義為一單位精氨酸酶酶活。反應(yīng)體系酶活C,/reax0.1ml(反應(yīng)體系體積)反應(yīng)體系蛋白=C,X0.02ml(反應(yīng)體系中蛋白體積)x0.02ml各目標(biāo)蛋白質(zhì)的酶活見表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>實(shí)施例7:各目標(biāo)蛋白體外活性的測(cè)定復(fù)蘇凍存的細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞H印G2、人肝癌細(xì)胞Bel-7402、人肝癌細(xì)胞S匪C-7721、人黑色素瘤細(xì)胞A375):預(yù)先打開恒溫水浴鍋溫度設(shè)定為37。C，等溫度穩(wěn)定復(fù)蘇細(xì)胞。首先在超凈工作臺(tái)準(zhǔn)備好離心管，在離心管中事先加入6ml培養(yǎng)基(1640，下同)，然后從液氮中取出凍存的細(xì)胞迅速轉(zhuǎn)移至37t:水浴孵育使凍存的細(xì)胞溶解，在超凈臺(tái)中把溶解的細(xì)胞轉(zhuǎn)移進(jìn)裝有培養(yǎng)基的離心管，1000rpm離心5min。離心結(jié)束后倒掉上清，重新加入培養(yǎng)基輕輕吹打制成細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)至培養(yǎng)瓶中，37t:0.5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)細(xì)胞復(fù)蘇的細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)24h后，去掉原培養(yǎng)基換成新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞豐度達(dá)到90%時(shí)收集細(xì)胞，消化成單個(gè)細(xì)胞并接種培養(yǎng)板去掉培養(yǎng)基用D-Hank's液清洗一遍，加入2ml0.25wt^胰蛋白酶消化細(xì)胞，消化過程中鏡下觀察當(dāng)細(xì)胞變圓遮光率變強(qiáng)沒有開始脫落的時(shí)候終止消化(直立培養(yǎng)瓶使胰蛋白酶集中到瓶底，用吸管吸走胰蛋白酶)，加入培養(yǎng)基輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)細(xì)胞；接種培養(yǎng)板計(jì)數(shù)細(xì)胞后，調(diào)整細(xì)胞密度為30000個(gè)/毫升然后接種細(xì)胞。使用96孔培養(yǎng)板，100iil/well，每孔的細(xì)胞密度為3000個(gè)/孔，37。C0.5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種時(shí)培養(yǎng)板四周的孔不使用；給藥培養(yǎng)板中的細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)24小時(shí)后給藥。用培養(yǎng)基稀釋蛋白，分別稀釋6個(gè)濃度(0.01iig/ml，0.03iig/ml，0.1iig/ml，0.3iig/ml，1iig/ml，10iig/ml)用含有這6個(gè)濃度蛋白的培養(yǎng)基替換掉原培養(yǎng)基，另設(shè)正常對(duì)照組和溶劑對(duì)照組。37°C0.5%COJ咅養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間72h，培養(yǎng)過程中可以鏡下觀察細(xì)胞的變化；檢測(cè)給藥時(shí)間結(jié)束后加MTT(濃度5mg/ml，10iil/we11)作用4小時(shí)，加入10wt%SDS-O.01NHC1(100iil/孔)37。C，0.5%C02培養(yǎng)箱過夜，第二天490nm檢測(cè)，計(jì)算結(jié)果。其體外細(xì)胞活性(半有效劑量IC50)結(jié)果見表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>實(shí)施例8:各目標(biāo)蛋白體外有效性的驗(yàn)證本專利保護(hù)的3種類型的融合蛋白為靶向性的精氨酸酶融合蛋白，其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷機(jī)理為將細(xì)胞培養(yǎng)基中的精氨酸代謝，使得腫瘤細(xì)胞在細(xì)胞周期內(nèi)無精氨酸可利用從而在S期凋亡。在實(shí)施例7中已經(jīng)證明當(dāng)精氨酸酶與人肝癌細(xì)胞H印G2、人肝癌細(xì)胞Bel-7402、人肝癌細(xì)胞S匪C-7721、人黑色素瘤細(xì)胞A375孵育72小時(shí)后，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞被殺死。為進(jìn)一步證明在這個(gè)過程中是本專利中聲明的精氨酸酶對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，在實(shí)施例8中進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。選取P229和Pill作為受試藥物。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)過程與實(shí)施例7中所述相似。細(xì)胞組分為正常對(duì)照組、藥物組(P111、P229)、精氨酸組、藥物組與精氨酸酶抑制劑(ABH)聯(lián)合給藥組，分別對(duì)H印G2、人肝癌細(xì)胞Bel-7402、人肝癌細(xì)胞S匪C-7721、人黑色素瘤細(xì)胞A375給藥。37°C0.5%(A培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間72h，培養(yǎng)過程中可以鏡下觀察細(xì)胞的變化；給藥時(shí)間結(jié)束后加MTT(濃度5mg/ml，10y1/孑L)作用4小時(shí)，加入10wt%SDS-O.01NHC1(100ii1/孔)37°C，0.5%C02培養(yǎng)箱過夜，第二天490nm檢測(cè)，計(jì)算細(xì)胞的存活率，結(jié)果見表4。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>實(shí)施例9:P229與未修飾形式蛋白質(zhì)在體內(nèi)半衰期的比較。未修飾蛋白質(zhì)由于易受體內(nèi)蛋白酶的降解及腎排除因而具有較短的半衰期；因此對(duì)其進(jìn)行聚乙二醇修飾是獲得更長(zhǎng)體內(nèi)半衰期的一種有效手段。如圖9所示，U229(約105kDa)在Superdex200分析柱上的出峰時(shí)間為15ml左右(a曲線)；但按本專利中所述方法進(jìn)行修飾后，其純化的制品P229在Superdex200分析柱的外水體積被洗脫(b曲線)。因此蛋白經(jīng)聚乙二醇修飾后，能有效增大蛋白的水動(dòng)力學(xué)半徑。蛋白質(zhì)經(jīng)聚乙二醇(PEG)修飾后，還能為蛋白提供一種有效保護(hù)，大大降低體內(nèi)蛋白酶的降解從而從另一個(gè)途徑提高了蛋白質(zhì)的半衰期。分別選用除菌、除熱源的P229及其未修飾形式蛋白(2mg/ml)，以尾靜脈注射方式給昆明小白鼠(體重分別都為20.lg)各給藥0.2ml。在規(guī)定時(shí)間內(nèi)眼眶取血，在4°CT4000g離心30分鐘，去血清，按實(shí)施例6所述的方案測(cè)定血清中的精氨酸酶活力，以酶活力對(duì)給藥時(shí)間作圖(圖io)，然后對(duì)其個(gè)藥物代謝動(dòng)力學(xué)分析，具體數(shù)據(jù)見表5A和表5B。表5A:U229對(duì)小鼠靜脈給藥的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)u-229-IV藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)房室參數(shù)單位參數(shù)值統(tǒng)計(jì)矩參數(shù)單位參數(shù)值tl/2ah0.317AuC(O-t)175.959tl/2ph0.317AuC(O-co)(Jg/L*h176.354tl/2yh0.317AuMC(O-t)67.176VIIVkg50.401AuMC(O-oo)68.609CLIVh/kg87.299MRT(O-t)h0.382AuC(O-t)(ig/L*h200.086MRT(O-oo)h0.389AuC(O-oo)229.099VRT(O-t)hA20.146K101/h1.732VRT(0-①)hA20.17K121/h14821.64Zeta1/h1.583K211/h2.188Zeta回歸尾點(diǎn)234K311/h2.188Cz(尾點(diǎn)回歸值)0.625K131/h-14821.2tl/2zh0.438丁maxh0,083VzL/kg71.638CLzL/h/kg113.408Gmax325.2\表5B:P229對(duì)小鼠尾靜脈給藥的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)P-229-IV藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)21<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>實(shí)施例10:P229體內(nèi)抑瘤率實(shí)驗(yàn)P229:經(jīng)除菌、除熱源處理，濃度為2mg/ml(藥物配置加無菌生理鹽水，依次倍比稀釋至2mg/ml、0.665mg/ml、0.222mg/ml)。注射用順鉑(凍干型)齊魯制藥有限公司，批號(hào)7120161DB(藥物配置加無菌生理鹽水，稀釋至O.3mg/ml)。生理鹽水江蘇鵬鷂藥業(yè)有限公司，批號(hào)0806103。BABL/c裸小鼠SPF級(jí)，雄性，4_5周齡，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)No.0041334。實(shí)驗(yàn)方法復(fù)蘇H印G-2，體外傳三代后將細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增到所需細(xì)胞量；將腫瘤細(xì)胞消化收集，用不含血清培養(yǎng)基配制成2*107/ml單細(xì)胞懸液；接種0.lml，于同一性別裸鼠皮下；待腫瘤體積生長(zhǎng)到約150200mm將荷瘤鼠按瘤體積大小區(qū)組后隨機(jī)分組、編號(hào)、標(biāo)記；開始按設(shè)計(jì)方案給藥；給藥周期中需要記錄測(cè)量腫瘤體積，動(dòng)物體重，一般臨床觀察表現(xiàn)。受試藥P229設(shè)高、中、低三個(gè)劑量組。陰性對(duì)照組給予相應(yīng)體積的生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照采用注射用順鉑每周腹腔注射一次。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組如下，每組8只(l)Control:給予生理鹽水，iv，qdX21(注射次數(shù));(2)P22940mg/kg:0.2ml/10g，iv，q2dXll(藥物濃度2mg/ml);(3)P22913.3mg/kg:0.2ml/10g，iv，q2dX11(藥物濃度0.665mg/ml);(4)P2294.4mg/kg:0.2ml/10g，iv，q2dX11(藥物濃度0.222mg/ml);(5)Cisplatin6mg/kg:0.2ml/10g，ip，qweekX3(藥物濃度0.3mg/ml)。試驗(yàn)結(jié)束后，處死動(dòng)物，剝?nèi)×鰤K稱重(圖11)。P229對(duì)人肝癌H印G2裸鼠移植瘤的抑制作用見表6。表6:P229對(duì)人肝癌H印G2裸鼠移植瘤的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>注1.*表示p<0.05，**表示p<0.01，Tumorvolume(TV)，Relativetumorvolume(RTV);2.月中瘤體積(tumorvolume,TV):TV=1/2XaXb、其中a、b表示長(zhǎng)徑和短徑;3.相對(duì)月中瘤體積(relativetumorvolume,RTV:RTV=TVt/TV。其中TV。為分籠給藥時(shí)(即給藥當(dāng)天d0)腫瘤體積，TVt為每一次測(cè)量時(shí)的腫瘤體積；4.相對(duì)腫瘤增殖率T/C(X):TRTVT/C(%)=-X100CRTVTRTV:治療組RTV;CRTV:陰性對(duì)照組RTV。序列表〈110〉江蘇先聲藥物研究有限公司〈120〉一種重組人精氨酸酶融合蛋白及其應(yīng)用〈160>12〈210>1〈211>6〈212>PRT〈213〉人工序列〈400〉1GlyCysAsnGlyArgCys15〈210>2〈211>8〈212>PRT〈213〉人工序列〈400>2PheCysPheTrpLysThrCysThr15〈210>3〈211>21〈212>PRT〈213〉人工序列〈400>3AspCysLeuAsnGlyGlyThrAlaValSerAsnLysTyrPheSer151015AsnlieHisTrpCysAsn20〈210>4〈211>28〈212>DNA〈213〉人工序列，上游引物〈400>4cgggatcccgccaagtccagaaccatag28〈210>5〈211>3124〈212>DNA〈213〉人工序列，下游引物〈400>5cccaagcttttacttaggtgggttaaggtag31〈210>6〈211>23〈212>DNA〈213〉人工序列，上游引物〈400〉6tatgggatgtaatggaagatgtg23<210>7〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列，下游引物〈400>7gatccacatcttccattacatccca25〈210〉8〈211>29〈212>DNA〈213〉人工序列，上游引物〈400>8tatgttctgtttctggaagacgtgtacgg29〈210>9〈211〉31〈212>DNA<213>人工序列，下游引物〈400>9gatcccgtacacgtcttccagaaacagaaca31〈210>10〈211>60〈212>DNA〈213〉人工序列，上游引物〈400>10gg朋ttccatatggattgtcte朋tggaggcacggcagtatcaaacaagtacttctccaa60cat63〈210>11〈211>59〈212>DNA〈213〉人工序列，下游引物〈400〉11gaagatctgcttccagagccactcccgttacaccagtggatgttggagaagtacttgtt.59〈210〉12〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列，T7正向引物〈400>12taatacgactcactataggg20權(quán)利要求一種重組人精氨酸酶融合蛋白，其特征在于該融合蛋白為融合了氨基酸序列為SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3多肽中任一種的重組人精氨酸酶。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述多肽融合在重組人精氨酸酶的C末端禾口/或N末端。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的融合蛋白，其特征在于所述多肽通過接頭融合在重組人精氨酸酶的C末端和/或N末端。4.聚乙二醇修飾的權(quán)利要求1所述的重組人精氨酸酶融合蛋白。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的融合蛋白，其特征在于所用聚乙二醇的分子量為2000-100000道爾頓。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的融合蛋白，其特征在于聚乙二醇分子量為5000-40000道爾頓。7.—種藥物組合物，其特征在于含有治療有效量的權(quán)利要求16項(xiàng)中任意一種或多種融合蛋白。8.如權(quán)利要求4所述聚乙二醇修飾重組人精氨酸酶融合蛋白質(zhì)制品的制備方法，其特征在于包括如下步驟a.在pH3-10的條件下，將重組人精氨酸酶融合蛋白質(zhì)與活化的聚乙二醇反應(yīng)；b.任選地從反應(yīng)混合物中分離聚乙二醇修飾的重組人精氨酸酶融合蛋白質(zhì)制品。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述的活化的聚乙二醇包括單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯、單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺丙酸酸酯、單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺琥珀酸酯、單甲氧基聚乙二醇乙酸酯。10.權(quán)利要求16所述的任一融合蛋白在制備治療肝細(xì)胞腫瘤的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種重組人精氨酸酶融合蛋白及其應(yīng)用。該重組人精氨酸酶融合蛋白為融合了氨基酸序列為SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3多肽中任一種的重組人精氨酸酶。該融合蛋白能有效實(shí)現(xiàn)藥物在腫瘤部位的富集并能在一定程度上有效阻止機(jī)體的氨基酸穩(wěn)態(tài)機(jī)制以獲得較好的治療效果。文檔編號(hào)A61P35/00GK101781369SQ20091002901公開日2010年7月21日申請(qǐng)日期2009年1月20日優(yōu)先權(quán)日2009年1月20日發(fā)明者于鵬展,周兵,周小林,祝曉梅,秦國(guó)宏,覃丹申請(qǐng)人:江蘇先聲藥物研究有限公司