專利名稱：17-aag在制備眼部rpe細胞vegf抑制劑中的應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于眼科學及基因工程領域，涉及17-AAG在制備眼部RPE細胞 VEGF抑制劑中的應用。
背景技術(shù)：
17-AAG (17-丙烯胺基，17-去甲氧基格爾德霉素)作為一種新的熱休克 蛋白90抑制劑，體內(nèi)、體外實驗已經(jīng)證明其有很強的抗腫瘤作用，而且毒性 較小[1。最近已經(jīng)進入臨床II/m期實驗。17-AAG不僅可以抑制腫瘤細胞增 殖，也可以抑制供應腫瘤的血管形成[2。17-AAG抑制新生血管的機制已經(jīng)有 了一定的研究，初步研究發(fā)現(xiàn)其不僅可以抑制VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)， 還可以抑制多種與新生血管相關的分子，如Akt， HIF-lci (低氧誘導因子一 1 a )等,。
VEGF是目前已知在脈絡膜新生血管(choroidal noevascularization，CNV) 生成的微環(huán)境中最重要的促血管生成因子之一,大量研究證實，VEGF在 AMD、糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變等病理性新 生血管形成過程中起著關鍵的作用[5]。 VEGF既能破壞正常眼的血4見網(wǎng)膜屏 障，造成視網(wǎng)膜的滲出、出血和水腫，也能誘導血管內(nèi)皮細胞的分裂、增生， 并促使內(nèi)皮細胞遷移，增強了毛細血管通透性,使血漿外滲，有利于新生血管以 出芽的方式促成大量血管形成，還可以使非內(nèi)皮細胞分泌VEGF，再通過旁 分泌機制作用于其他細胞。此外，VEGF還可增加視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞間黏 附分子的蛋白質(zhì)水平，促進白細胞瘀滯，破壞血管壁,激活血小板，引起血流緩 慢和血栓形成,導致局部視網(wǎng)膜缺血缺氧，最終形成新生血管[6]-[7]。靈長類及轉(zhuǎn) 基因動物實驗中也已證實其促CNV發(fā)生的作用。用可溶性VEGFR1或VEGF抗體抑制VEGF可減少CNV的形成和發(fā)展。因此,針對VEGF的藥物治療成 為當前新生血管研究的重點[8]。雖然Avastin等抗VEGF的一類藥物給視網(wǎng)膜 和脈絡膜新生血管的治療帶來了希望，也取得了一定的治療效果，但這類藥 物作用位點單一，治療效果有限，有一定的并發(fā)癥。所以抑制視網(wǎng)膜和脈絡 膜新生血管的藥物仍在不斷的研發(fā)中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供17-AAG在制備眼部RPE細胞VEGF抑制劑中的應 用以及17-AAG在制備眼部RPE細胞VEGF受體抑制劑中的應用，本發(fā)明還 提供17-AAG在制備脈絡膜新生血管抑制劑中的應用。
本發(fā)明的技術(shù)方案是發(fā)明人發(fā)現(xiàn)17-AAG對RPE細胞中的VEGF及其 受體有抑制作用，尤其對VEGFA的抑制作用較強。具體情況為低濃度的 17-AAG只能抑制RPE細胞中的VEGFA，隨著17—AAG濃度的增加，VEGFB 和VEGFR1的表達水平也下調(diào)，呈劑量依賴型。其中VEGFA下調(diào)較明顯,而 VEGFR2只有在高濃度17-AAG時才能被抑制，這些結(jié)果說明，17-AAG對 于脈絡膜新生新生血管疾病的治療很有價值。故提出17-AAG在制備眼部RPE 細胞VEGF抑制劑中的應用、17-MG在制備眼部RPE細胞VEGF受體抑制 劑中的應用以及17-AAG在制備脈絡膜新生血管抑劑中的應用。
本發(fā)明的有益效果l、現(xiàn)有技術(shù)雖然公開了 17-MG可抑制VEGF及其受 體，但研究的是其它組織或器官中的VEGF及其受體，本發(fā)明通過研究首次 發(fā)現(xiàn)了 17-AAG對眼部RPE細胞VEGF及其受體具有抑制作用。2、 17-AAG 與現(xiàn)有的抗VEGF的藥物在治療眼病方面相比優(yōu)點是作用靶點不僅局限在 VEGF和VEGFR， 17-AAG對新生血管相關因子Akt也有明顯的抑制作用。


圖1 RT-PCR反應后瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。 圖2熔解曲線分析。
A圖為VEGFA基因的熔解曲線，B為VEGFB基因的熔解曲線，C為VEGFR1基因的熔解曲線，D為VEGFR2基因的熔解曲線，E為AKT基因的熔解曲線，F(xiàn)為Act in 基因的熔解曲線
圖3 17-AAG對VEGF、 VEGF受體及Akt的作用。
A: 17-MG濃度對VEGF、 VEGF受體及Akt的作用
B: 17-AAG作用時間對VEGF、 VEGF受體及Akt的作用
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的說明。 實施例l給藥組和對照組細胞制備
人RPE細胞株ARPE-19細胞(ATCC公司)，培養(yǎng)基為DMEM/F12 (Hyclone 公司)和100ml/L胎牛血清(Gibco公司)，加100mg/L青霉素和100mg/L鏈 霉素(Gibco公司)，置于37-C含有50ml/L C02的飽和濕度培養(yǎng)箱中。等細 胞處于對數(shù)生長期時加入n-AAG(Sigma公司)，按給藥濃度2， 5， 1Oumol/L 將細胞分為3組濃度梯度組，對照組加入等體積DMSO，作用24h后收集4組 細胞。另按3umol/L的17-AAG處理時間16， 24， 48h將細胞分為3組時間 梯度組，對照組加入DMSO。
實施例2 cDNA的制備(所用試劑盒為美國Invitrogen公司的Superscript III First-Strand合成試劑盒)
收集處理組和對照組的細胞(約IX 107)，分別加入lml Trizol(INVITROGEN公司)，按試劑說明書中的操作步驟進行RNA提取，加 DEPC水，-8(TC保存。然后通過瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測抽提 RNA的質(zhì)量和濃度；最后用MO-MLV反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA ，其25 U 1的反應體系包括KNA 2 P 1 ，反轉(zhuǎn)錄酶2 P 1， RNase抑制劑2 u 1，隨機引 物(0. 5 u g) 1 u 1， 5 X buf fer5 u 1以及2mmo1 dNTP 6. 25 u 1,合成的cDNA 置于-20 'C保存?zhèn)溆谩?br> 實施例3利用RT-PCR擴增目的基因片段根據(jù)VEGFA (Genbank編號NM—001025368)， VEGFB (Genbank編號NM—003377)， VEGFR1 (Genbank編號NM—002019) ， VEGFR2 (Genbank編號NM—002253) ，Akt (Genbank 編號NM—001014431.1)和P-actin (購于美國Invitrogen公司)的mRNA基因序列, 用Primer Premier引物設計軟件設計6對引物(VEGFA上游引物序列為SEQ IDNO.l， VEGFA下游引物序列為SEQ ID NO.2; VEGFB上游引物序列為SEQ IDN0.3, VEGFB下游引物序列為SEQIDNO.4; VEGFR1上游引物序列為SEQ IDN0.5，VEGFR1下游引物序列為SEQ IDNO.6; VEGFR2上游引物序列為SEQ ID NO.7 ， VEGFR2下游弓|物序列為SEQ ID NO.8; Akt上游引物序列為SEQ ID N0.9，Akt下游引物序列為SEQIDNO.10; P -actin上游引物序列為SEQID NO.ll， 0-actin下游引物序列為SEQ IDNO.12)。然后每次加入一對引物 分別進行RT-PCR，反應條件如下95°C30s變性，55°C40s退火，72°C90s 延伸。循環(huán)25次。1%瓊脂糖凝膠電泳分析引物的特異性。瓊脂糖凝膠電泳結(jié) 果顯示RT-PCR反應所得的產(chǎn)物條帶為單一條帶，并且與預期的擴增產(chǎn)物長 度一致(圖1)。
實施例4實時熒光定量PCR檢測17-AAG的作用
1) 實驗方法應用SYBRGreenABI 7300熒光PCR儀和配套的美國應用生物 技術(shù)公司的POWER SYBRGreen PCR Master Mix進行實時熒光定量PCR。
20 u 1反應體系中包括cDNA 5 u 1 ， 2 XPOWER SYBRGreen PCR Master Mix lOul，上下游引物5ul。反應在96孔板上進行，用透明膜覆蓋于板上，使 反應體系密閉于反應孔中，設置PCR反應程序50 °C 2min激活UNG酶去 除殘余的產(chǎn)物污染，95°C 10 min激活Taq Gold酶，開始擴增，95°C15s變 性，60°C lmin退火及延伸，重復40個循環(huán)。在60 °C lmin收集熒光信號， 循環(huán)結(jié)束后執(zhí)行融解曲線程序。為進一步確定擴增產(chǎn)物的特異性，反應結(jié)束 后每個反應產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。
2) 統(tǒng)計學分析實時PCR的結(jié)果以Ct值表示。相對定量采用比較Ct法，根 據(jù)等式Fold = rMet來計算處理組和對照組之間目的基因的相對表達差異， △△Ct值表示處理組和對照組間的ACt值差異。17-AAG處理組和對照組間的目的基因比較采用REST2005統(tǒng)計軟件分析標準誤，95%可信區(qū)間，p值， 變化倍數(shù)等。
運用上述建立的實時熒光定量PCR方法,分析17-AAG對人RPE細胞基因表達 的影響作用，所有樣本均重復3次檢測。 3)結(jié)果
熔解曲線分析顯示，6對引物都擴增出了特異性的產(chǎn)物，其峰值所對應 的溫度與預期產(chǎn)物的Tm值一致，未出現(xiàn)其它異常波形,波的形狀也較銳利(圖 2)。表明實驗中所應用的實時檢測系統(tǒng)能分別擴增出各自特異性的產(chǎn)物。
實時熒光定量PCR相對定量結(jié)果表明，與對照組相比,低濃度的17-AAG 只能抑制RPE細胞中的VEGFA，隨著17—AAG濃度的增加，VEGFB和VEGFR1 的表達水平也下調(diào)，呈劑量依賴型。其中VEGFA下調(diào)較明顯，而VEGFR2只有在 高濃度17-AAG時才能被抑制(圖3A)。與對照組相比，時間梯度組中的VEGFA， VEGFB和VEGFR1的表達水平下調(diào)，呈時間依賴型。而VEGFA在48h時已有部 分恢復(圖3B)。 17-AAG對新生血管相關因子Akt的抑制較明顯。
本發(fā)明未涉及部分均與現(xiàn)有技術(shù)相同或可采用現(xiàn)有技術(shù)加以實現(xiàn)。 參考文獻姜新宇，陳道楨，劉璐。17-丙烯胺基-17-去甲氧基格爾德霉素研究進展.國際腫瘤學雜志 2006;33(9): 646—650. Powers MV，Workman P.Targeting of multiple signalling pathways by heat shock protein 90
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<120> 17-AAG在制備眼部RPE細胞VEGF抑制劑中的應用 <腸12
〈210> 1 <211> 23 <212> DNA <213>人工序列 〈220〉
〈223> VEGFA基因上游引物 <400〉 1
gaatcatcac gaagtggtga agt 23
<210> 2 〈211> 20 <212> ■ <213>人工序列 <220>
〈223〉 VEGFA基因下游引物 <400〉 2
gcacacagga tggcttgaag 20
<210〉 3 〈211> 22 〈212〉 DNA 〈213>人工序列 <220>
<223> VEGFB基因上游引物 〈400> 3
aaaaaaggac agtgctgtga ag 22
<210> 4 <211〉 19 <212> DNA <213>人工序列 <220>
〈223> VEGFB基因下游引物 <400> 4
ggagtgggat gggtgatgt 19〈210〉 5 <211> 23 〈212〉薩 〈213>人工序列 <220〉
<223〉 VEGFR1基因上游引物 <400> 5
ccaagactag atagcgtcac cag
<210> 6
<211> 21
<212〉 ■ 〈213〉人工序列 〈220〉
<223〉 VEGFR1基因下游引物
<400> 6
gaaaccgtca gaatcctcct c
<210> 7 <211> 21 <212> DNA <213>人工序列 <220>
〈223〉 VEGFR2基因上游引物 <400> 7
ggactctctc tgcctacctc a
<210> 8 〈211〉 20 <212〉 DNA 〈213〉人工序列 <220>
<223> VEGFR2基因下游引物 <400> 8
cggctctttc gcttactgtt
<210> 9 <211> 18 〈212〉 DNA〈213>人工序列 <220>
<223〉 Akt基因上游引物 <400> 9
ctttccagac ccacgacc 18
<210〉 10 〈211〉 19 〈212> DNA <213>人工序列 <220>
〈223> Akt基因下游引物 〈400〉 10
ctccgagtgc aggtagtcc 19
<210> 11 <211> 18 <212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈220〉
〈223〉 e-actin基因上游引物 〈400〉 11
ggcacccagc acaatgaa 18
<210> 12 <211〉 18 <212>薩 <213>人工序列 <220>
<223> actin基因下游引物 〈400> 12
gga鄉(xiāng)tgga cagcgagg 18
權(quán)利要求
1、17-AAG在制備眼部RPE細胞VEGF抑制劑中的應用。
2、 17-AAG在制備眼部RPE細胞VEGF受體抑制劑中的應用。
3、 17-AAG在制備脈絡膜新生血管抑制劑中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于眼科學及基因工程領域，公開了17-AAG在制備眼部RPE細胞VEGF抑制劑中的應用。發(fā)明者研究發(fā)現(xiàn)17-AAG對RPE細胞中的VEGF及其受體有抑制作用，尤其對VEGFA的抑制作用較強，這些結(jié)果說明，17-AAG對于脈絡膜新生新生血管疾病的治療很有價值。故提出17-AAG在制備眼部RPE細胞VEGF抑制劑中的應用、17-AAG在制備眼部RPE細胞VEGF受體抑制劑中的應用以及17-AAG在制備脈絡膜新生血管抑劑中的應用。17-AAG與現(xiàn)有的抗VEGF的藥物在治療眼病方面相比優(yōu)點是作用靶點不僅局限在VEGF和VEGFR，17-AAG對新生血管相關因子Akt也有明顯的抑制作用。
文檔編號A61P27/02GK101606932SQ20091003386
公開日2009年12月23日 申請日期2009年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月18日
發(fā)明者姚家奇, 張薇瑋, 徐慶淮, 平 謝 申請人:江蘇省人民醫(yī)院