專利名稱：一種婦炎康片指紋圖譜的測定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及中藥制劑檢測技術領域，是一種中藥制劑指紋圖譜的測定方法，特別是中 藥婦炎康片指紋圖譜測定方法的建立。
背景技術：
中藥制劑婦炎康片為《衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑》第18冊收載的品種，是國家 中藥保護品種，由赤芍、丹參、黃柏、芡實、當歸、土茯苓、山藥、三棱等13味藥組成， 具有活血化瘀、軟堅散結、清熱解毒、消炎止痛、除濕止痛等功效，為婦科常用中藥。適 用于慢性附件炎、盆腔炎、陰道炎、膀胱炎、慢性闌尾炎、尿路感染等癥。其療效已得到 臨床的驗證。藥理實驗表明，婦炎康片對小鼠巴豆油、大鼠角叉菜膠致炎及大鼠棉球肉芽
腫均有抑制作用能抗致炎劑所致組織液滲出對熱板及醋酸致痛有鎮(zhèn)痛作用；提高動物 胸腺及脾臟重量；對金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、大腸桿菌、白色念珠菌均有抑 制作用。
隨著科學技術的發(fā)展，現(xiàn)代分析檢測儀器的普及應用，使中藥檢測分析水平有了顯著 提高，藥品質量控制方法不斷完善。其中，指紋圖譜技術在中藥質量控制中發(fā)揮越來越重 要的作用。中藥指紋圖譜是指某種中藥材或中成藥中所共有的、具有特征性的某類或數(shù)類 成分的色譜或光譜的圖譜。在現(xiàn)階段，中藥的有效成分絕大多數(shù)沒有明確的情況下，中藥 指紋圖譜對于有效控制中藥材或中成藥的質量具有重要的意義。日本漢方藥主要生產(chǎn)企業(yè) 在20世界80年代就已經(jīng)在企業(yè)內(nèi)部采用高效液相指紋圖譜控制質量。美國FDA最近幾年 制定的植物草藥指南中已經(jīng)明確把指紋圖譜作為混合物質群的質量控制方法(FM， Guidance of Industry : Botanical Drug (Draft) 2004)。隨著研究的深入，作為中醫(yī) 理論的實踐產(chǎn)物，中藥，尤其是復方中藥，其中所含的任一成分都不能代表其整體療效， 單一的含量測定指標也無法全面反映并控制制劑質量。人們逐漸認識到，現(xiàn)行的參照西藥 (合成藥)質量控制模式的質量標準不能恰當?shù)胤从持匾獌?nèi)在的質量。未來，中藥的發(fā)展 趨勢將從現(xiàn)行的質量控制模式向一種綜合的、宏觀的、可量化的鑒別與主要有效成分含量 測定結合的模式轉變。中藥指紋圖譜采用光譜、色譜等分析方法，對中藥材(中成藥)的 成分進行檢測，形成特有的專屬化學圖譜，該圖譜能全面反映中藥所含內(nèi)在化學成分的種 類和數(shù)量，具有相對唯一性。另外，中藥指紋圖譜正好體現(xiàn)了中醫(yī)藥的整體、宏觀、復雜 的特點。
4婦炎康片是臨床常用的婦科藥物。是否能夠保證藥物質量以及有效成分的含量，是決 定婦炎康片療效的基礎。目前，生產(chǎn)婦炎康片有數(shù)家廠家，其質量良莠不齊，因而其穩(wěn)定 性難以保證。建立婦炎康片有效的質量評價方法，確保婦炎康片的質量穩(wěn)定，直接關系到 婦炎康片產(chǎn)品的有效性、安全性、穩(wěn)定性。因此，采用指紋圖譜技術對婦炎康片實行質量 控制，以保證婦炎康片的質量更加安全、穩(wěn)定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種中藥復方制劑婦炎康片高效液相色譜指紋圖譜的測定方 法，采用此指紋圖譜測定方法，可以有效控制婦炎康片的質量，保證婦炎康片的安全性、 穩(wěn)定性。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案 一種婦炎康片指紋圖譜的測定方法，其 特征在于包括以下步驟
① 供試品溶液的制備取婦炎康片成品，研細，精密稱取一定量粉末，精密加入乙醇， 密塞，稱定重量，超聲處理，放冷，用乙醇補足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過微 孔濾膜，即得；
② 對照品溶液的制備精密稱取芍藥苷對照品、丹酚酸B對照品、鹽酸小檗堿對照品， 加甲醇制成含各對照品的適宜濃度的混合溶液，搖勻，過微孔濾膜，即得對照品溶液；
③ 測定精密吸取供試品溶液、對照品溶液，分別注入高效液相色譜儀，照高效液相 色譜法測定，得色譜指紋圖譜，其中色譜條件采用以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的 色譜柱；以乙腈為流動相A，以0.04mol/L磷酸二氫鉀(含0. 1。/。磷酸)水溶液為流動相B， 進行梯度洗脫；檢測波長分別為230nm、 286nm、 265nm。
本發(fā)明突出的實質性特點及優(yōu)點如下
1. 本發(fā)明以婦炎康片中主要有效成分芍藥苷、丹酚酸B、鹽酸小檗堿為指標建立指紋 圖譜，代表了婦炎康片的藥效活性，能有效地控制婦炎康片的質量，適用于婦炎康片中化 學成分的檢測，對成品質量進行全面控制。
2. 本發(fā)明對芍藥苷、丹酚酸B、鹽酸小檗堿等3種化學有效成分同時進行檢測，注重 圖譜的"整體特征"，并可根據(jù)圖譜進行上述各有效成分的含量測定，避免了只測定某一 個化學成分來判定婦炎康片質量的片面性。本發(fā)明為完整、準確評價婦炎康片的質量提供 了新的標準，能有效控制婦炎康片的質量。
3. 本發(fā)明的指紋圖譜檢測方法，其優(yōu)點是簡便、穩(wěn)定、精密度高、重復性好、易于操 作，能從色譜的整體特征中把握婦炎康片的質量情況。


圖l是230nm波長下對照品芍藥苷、丹酚酸B、鹽酸小檗堿的色譜圖； 圖2是230nm波長下婦炎康片HPLC指紋圖譜；
圖3是286rai波長下對照品芍藥苷、丹酚酸B、鹽酸小檗堿的色譜圖； 圖4是286nm波長下婦炎康片HPLC指紋圖譜；
圖5是265nm波長下對照品芍藥苷、丹酚酸B、鹽酸小檗堿的色譜圖6是265nm波長下婦炎康片HPLC指紋圖譜。
具體實施例方式
本發(fā)明的婦炎康片指紋圖譜的測定方法，包括以下步驟-
① 供試品溶液的制備取婦炎康片成品，研細，精密稱取一定量粉末，精密加入乙醇， 密塞，稱定重量，超聲處理，放冷，用乙醇補足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過微 孔濾膜，即得；
② 對照品溶液的制備精密稱取芍藥苷對照品、丹酚酸B對照品、鹽酸小檗堿對照品， 加甲醇制成含各對照品的適宜濃度的混合溶液，搖勻，過微孔濾膜，即得對照品溶液；
③ 測定精密吸取供試品溶液、對照品溶液，分別注入高效液相色譜儀，照高效液相 色譜法測定，得色譜指紋圖譜，其中色譜條件采用以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的 色譜柱；以乙腈為流動相A，以0. 04niol/L磷酸二氫鉀(含0. 1%磷酸)水溶液為流動相B， 進行梯度洗脫；檢測波長分別為230nra、 286nm、 265nm。
本發(fā)明所述的指紋圖譜，供試品所得圖譜與對照品所得圖譜，其相應峰的保留時間應 --對應。
本發(fā)明所述的供試品溶液制備方法取婦炎康片成品5 20片，除去包衣，研細，取 樣品0.1 0.5g，精密稱定，精密加入乙醇50mL，密塞，稱定重量，超聲處理10 30分 鐘，放冷，稱定重量，用乙醇補足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.45um微孔濾 膜，即得。所用乙醇為體積比70%乙醇。超聲處理條件功率為100 250W,頻率20 50kHz， 較佳的條件是功率250W，頻率50kHz:超聲處理時間為30分鐘較好。
本發(fā)明所述的對照品溶液制備方法精密稱取芍藥苷對照品、丹酚酸B對照品、鹽酸 小檗堿對照品，加甲醇制成每lml含芍藥苷對照品60pg、丹酚酸B對照品80嗎、鹽酸小 檗堿對照品40Mg的混合溶液，搖勻，過0.45^微孔濾膜，即得。
本發(fā)明所述的指紋圖譜測定方法，采用高效液相色譜儀器檢測，適用于HP1100、 Waters、 DI0NEX、島津等各種品牌高效液相色譜儀(含DAD檢測器)。色譜條件以十八烷基硅垸鍵合硅膠為填充劑的色譜柱(4.6mm x250mm， 5pm)，檢測波長為230nm、 286nm、
265nm，柱溫30'C，進樣量10pL,記錄時間為45分鐘；流速1.0mL/min，以乙腈為流動
相A，以磷酸二氫鉀水溶液為流動相B，采用梯度洗脫，梯度洗脫程序如表l:
表1流動相梯度洗脫表 時間(min) 流動相A(y。) 流動相B(W
0 10 14—15 86—85
10 14 15—18 85—82
14 28 18—23 82—77
28 40 23—33 77—67
40 45 33 67
上述流動相A和流動相B溶液的配制比例是按體積比配制。較好的，流動相B為 0.04mol/L磷酸二氫鉀(含0.1%磷酸)水溶液。色譜柱較好的為DIKMA Kromasil C18色譜柱， 其規(guī)格為4.6咖X250咖，5拜。檢測波長為230nm、 286咖、265咖，該三個波長同時測定， 分別為芍藥苷、丹酚酸B、鹽酸小檗堿的法定測定波長。
本發(fā)明所述婦炎康片的色譜指紋圖譜測定方法，參照高效液相色譜法(《中國藥典》 2005年版一部附錄VI D)，結合指紋圖譜的要求進行測定。
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗采用DIKMA Kromasil C18色譜柱(4. 6咖X250mra， 5pm)， 以乙腈為流動相A, 0.04mol/L磷酸二氫鉀(含0.1%磷酸)水溶液為流動相B，按比例進行梯 度洗脫，流速為1.0 mL/min，柱溫30。C，檢測波長為230nm、 286nm、 265nm。理論板數(shù) 按芍藥苷峰(230nm)計算應不低于8000，按丹酚酸B峰(286nm)計算應不低于10000， 按鹽酸小檗堿峰(265nm)計算應不低于20000。
測定法分別精密吸取供試品溶液及對照品溶液各lOpL，注入高效液相色譜儀，照高 效液相色譜法測定，記錄色譜指紋圖譜。
下述結合較佳的實施方案作進一步的解釋說明，對本發(fā)明不構成限制。對于本領域技 術人員而言，根據(jù)本發(fā)明所公開的技術內(nèi)容，本領域技術人員將很清楚本發(fā)明的其他實施 方式，本發(fā)明實施例僅作為示例。在不違反本發(fā)明主旨及范圍的情況下，可對本發(fā)明進行 各種改變和改造，但只要使用本發(fā)明所屬的指紋圖譜測定方法，均在本發(fā)明保護范圍之內(nèi)。 實施例l:婦炎康片指紋圖譜的測定
儀器及材料Agilent 1100高效液相色譜儀(HP ChemStation化學工作站)；色譜柱 DIKMAKromasUC18柱(4.6mmX250醒，5)ini);電子天平(Sartorious CP225D、 Sartorious BP110S);超聲波清洗儀(SB-5200,寧波新芝科器研究所)；婦炎康片(薄膜衣)。供試品溶液的制備取婦炎康片20片，除去薄膜衣，研細，取粉末樣品0.3g，精密 稱定，置100mL錐形量瓶中，精密加入70%乙醇50mL，稱定重量，超聲處理(功率250W， 頻率50kHz)30分鐘，放冷，稱定重量，用70%乙醇補足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液， 過0.45陶微孔濾膜，即得。
對照品溶液的制備精密稱取芍藥苷對照品、丹酚酸B對照品、鹽酸小檗堿對照品， 加甲醇制成每lml含芍藥苷對照品6(mg、丹酚酸B對照品801^、鹽酸小檗堿對照品40Pg 的混合溶液，搖勻，即得。
測定方法照高效液相色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VI D)測定。色譜條件和
系統(tǒng)適用性試驗色譜柱DI腿A Kromasil C18 (4.6mmx250咖，5nm);以乙腈為流動相
A，以0.04mol/L磷酸二氫鉀(含0. 1M粦酸)水溶液為流動相B，進行梯度洗脫，見表2;流 速為1.0ml/min;檢測波長為分別為230nm、 286nm、 265nm;柱溫30。C;進樣量10uL。 分別精密吸取供試品溶液及對照品溶液各10pL，注入高效液相色譜儀，記錄45min色譜(見 圖1 6)，供試品色譜圖中，以對照品溶液中鹽酸小檗堿峰保留時間相應位置上的峰為參 照峰；理論板數(shù)按芍藥苷峰(230nm)計算應不低于8000,按丹酚酸B峰(286nm)計算 應不低于10000，按鹽酸小檗堿峰(265nm)計算應不低于30000。
表2流動相梯度洗脫表 時間(min) 流動相A(W 流動相B(先)
0 10 14—15
10 14 15—18 85—82
14 28 18—23 82—77
28 40 23—33 77—67
40 45 33 67
色譜柱的選擇
曾選用PhenomenexlunaC18 (2)柱(4.6mmX250腿，5nm)、 DIKMA Kromasil Cl8柱 (4.6纖X250mm， 5^im)、 Lichrosher C18柱(4.6mmX250mm, 5pm)、 Agilent Zorbax ODS 柱(4.6mmX250讓，5fim)、 Kromasil Packing C18柱(4.6mmX250mm， 5jim)等色譜柱進行 試驗篩選，比較分離度、出峰數(shù)、峰形、柱效等，結果以Kromasil C18柱(4.6mmX250mm， 5nm)較為合適，故選擇其作為色譜指紋圖譜研究的色譜柱。
流動相的選擇
曾選用甲醇一水、甲醇一磷酸溶液、乙腈一水、乙腈一磷酸溶液、乙腈一磷酸二氫鉀 溶液等多組流動相系統(tǒng)，以不同比例和不同梯度進行梯度系統(tǒng)。結果以乙腈一0.04mol/L
8磷酸二氫鉀溶液(含0. 1%磷酸)的梯度洗脫為佳，色譜圖上各色譜峰分離效果及形狀較好， 故選擇其作為指紋圖譜研究的流動相。 共有峰的選擇及指紋圖譜的建立
根據(jù)10批樣品測定結果，綜合10批樣品色譜圖從5min至40min之間，230nm下有 8個峰是共有峰，其中3號峰是芍藥苷峰；在286nm下有7個峰是共有峰，其中4號峰是 丹酚酸B峰；在265nm下有8個峰是共有峰，其中7號峰是鹽酸小檗堿峰。各批樣品中的 共有峰總面積占總峰面積的80%以上。根據(jù)中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(國家藥典 委員會2004 A版)，采用均值法，各批次樣品指紋圖譜之間的相似度均大于0.90。
在詳細說的較佳實施例之后，熟悉該項技術人士可清楚地了解，在不脫離上述申請專 利范圍與精神下可進行各種變化與修改，凡依據(jù)本發(fā)明的技術實質對以上實施例所作的任 何簡單修改、等同變化與修改，均屬于本發(fā)明技術方案的范圍，且本發(fā)明亦不受限于說明 書中所舉例的實施方式。
權利要求
1、一種婦炎康片指紋圖譜的測定方法，其特征在于包括以下步驟①供試品溶液的制備取婦炎康片成品，研細，精密稱取一定量粉末，精密加入乙醇，密塞，稱定重量，超聲處理，放冷，用乙醇補足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過微孔濾膜，即得；②對照品溶液的制備精密稱取芍藥苷對照品、丹酚酸B對照品、鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成含各對照品的適宜濃度的混合溶液，搖勻，過微孔濾膜，即得對照品溶液；③測定精密吸取供試品溶液、對照品溶液，分別注入高效液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得色譜指紋圖譜，其中色譜條件采用以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱；以乙腈為流動相A，以磷酸二氫鉀水溶液為流動相B，進行梯度洗脫；檢測波長分別為230nm、286nm、265nm。
2、 根據(jù)權利要求1所述的婦炎康片指紋圖譜的測定方法，其特征在于所述步驟① 中，取婦炎康片成品5 20片，除去包衣，研細，取樣品O. 1 0.5g，精密稱定，精密加 入乙醇50mL，密塞，稱定重量，超聲處理10 30分鐘，放冷，稱定重量，用乙醇補足減 失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.45yra微孔濾膜，即得。
3、 根據(jù)權利要求2所述的婦炎康片指紋圖的譜測定方法，其特征在于所述乙醇采 用體積比為70%乙醇；所述的超聲處理條件功率為100 250W，頻率20 50kHz。
4、 根據(jù)權利要求1所述的婦炎康片指紋圖譜的測定方法，其特征在于所述步驟②中，分別精密稱取適量芍藥苷對照品、丹酚酸B對照品、鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成 每lraL含芍藥苷對照品60ug、丹酚酸B對照品80iig、鹽酸小檗堿對照品40y g的混合 溶液，搖勻，過0.45Mm微孔濾膜，得對照品溶液。
5、 根據(jù)權利要求l所述的婦炎康片指紋圖的譜測定方法，其特征在于所述步驟③ 中，以乙腈為流動相A，以0.04mol/L磷酸二氫鉀(含0. 1M粦酸)水溶液為流動相B。
6、 根據(jù)權利要求1所述的婦炎康片指紋圖譜的測定方法，其特征在于所述步驟③ 中，色譜條件為檢測波長分別為230nm、 286nm、 265nm;柱溫30°C;進樣量10uL;按體 積比例，流動相梯度洗脫程序為0 10分鐘，流動相A比例由14%遞升至15%，流動相B比例由86%遞減至85%; 10 14分鐘，流動相A比例由15°/。遞升至18%，流動相B比例由85%遞減至82%; 14 28分鐘，流動相A比例由18%遞升至23%，流動相B比例由82%遞減至77%; 28 40分鐘，流動相A比例由23%遞升至33%，流動相B比例由77%遞減至67%;40 45分鐘，流動相A比例保持33%，流動相B比例保持67%。
7、 權利要求1所述的婦炎康片指紋圖譜的測定方法，其特征在于所述的指紋圖譜記錄時間為45min，在所述檢測波長下有6 8個共有特征峰，理論板數(shù)按芍藥苷峰(230nm) 計算不低于8000，按丹酚酸B峰(286nm)計算不低于10000，按鹽酸小檗堿峰(265nm) 計算不低于30000。
8、 權利要求l所述的婦炎康片的指紋圖譜的測定方法，應用于婦炎康片的質量控制。
9、 權利要求1所述的婦炎康片的指紋圖譜的測定方法，應用于包括片劑、顆?；蚰z 囊的婦炎康劑型的質量控制。
10、 權利要求1所述的婦炎康片的指紋圖譜的測定方法，應用于含有婦炎康處方組 成的中藥復方及其制劑的質量控制。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種婦炎康片指紋圖譜的測定方法，其首先將婦炎康片研細，精密稱取婦炎康片粉，加乙醇溶液浸泡，超聲處理，放冷，補重，搖勻，濾過，續(xù)濾液用微孔濾膜濾過，作為供試品溶液；然后制備對照品溶液；采用以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱；采用梯度洗脫，流動相A為乙腈，流動相B為磷酸二氫鉀水溶液；檢測波長分別為230nm、286nm、265nm；精密吸取供試品溶液及對照品溶液分別注入高效液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得到指紋圖譜。本發(fā)明的指紋圖譜檢測方法，操作簡便、穩(wěn)定方法、精密度高、重復性好，用于婦炎康片的質量控制，能從色譜的整體特征來確保婦炎康片及其相關產(chǎn)品的有效性、穩(wěn)定性和均一性。
文檔編號A61K36/9066GK101502630SQ20091003778
公開日2009年8月12日 申請日期2009年3月11日 優(yōu)先權日2009年3月11日
發(fā)明者景運條, 王德杭, 蔣東旭, 蔣晨光, 謝友良, 陳長青, 黃有帶, 黃鳴清 申請人:江門德鑫制藥有限公司