專利名稱：：苦茶堿在制備消炎鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及天然化合物苦茶堿(1,3,7,9-四甲基尿酸)新藥物用途。
背景技術(shù)：
：天然的苦茶堿由T.B.Johnson于1937年發(fā)現(xiàn)，他從數(shù)百萬磅提取咖啡堿后的茶渣中分離出少量該《七合物(T.B.Johnson.Purinesintheplantkingdom:thediscoveryofanewpurineintea.J.Am.Chem.Soc.,1937，59:1261-1264)。苦茶堿在茶葉中含量甚微，無法通過常規(guī)分析方法從茶葉中檢出。1999年，我們?cè)趯?duì)苦茶中的嘌呤生物堿組成進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)了該化合物在苦茶中的大量存在?？嗖枋菑埡赀_(dá)教授1984年發(fā)表的新變種C.W脫附紅var.^c/^ChangetWang(張宏達(dá)，茶葉植物資源的訂正，中山大學(xué)(自然科學(xué)版)，1984,1:10-11)，后來在中國(guó)植物志他又將其轉(zhuǎn)移為普洱茶的變種C.owa/w'CGvarhc/zaChangetWang(張宏達(dá)，任善相.中國(guó)植物志，四十九巻第三分冊(cè)136.北京:科學(xué)出版社,1998)。2008年，我們根據(jù)苦茶具有小苞片3-4，萼片4-6mm，外面無毛，內(nèi)面被白色短柔毛，外面2枚花瓣內(nèi)面被白色短柔毛而不同于普洱茶，又根據(jù)其芽葉含特殊生物堿苦茶堿，不同于普洱茶，把它提升為種C.尺wcto(ChangetWang)Chang(石祥剛，鄭新強(qiáng)，宋曉虹，王園園，葉創(chuàng)興.苦茶新組合.中山大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2008,47(6):129-130)?？嗖鑹A在大果咖啡(Coffealiberica)中也微量存在，但是經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，它只是中間代謝產(chǎn)物，很快轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌蛩犷愇镔|(zhì)，不形成積累(BaumannTW，OechslinM，WannerH.Caffeineandmethylateduricacid:chemicalpatternsduringvegetativedevelopmentofCoffealiberioa.Biochemphysiolpflanzen,1976,170:217-225)。通過加入合成嘌呤堿的"C前體，如蛋氨酸、腺嘌呤，對(duì)苦茶體內(nèi)嘌呤堿的生物代謝途徑進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)苦茶堿最后是由咖啡堿在N-9位置上通過甲基轉(zhuǎn)移酶將蛋氨酸提供的甲基鍵合上去，形成了苦茶堿(ZhengXQ,YeCX,KatoM,CrozierA,AshiharaH.Theacrine(1，3，7，9-tetramethyluricacid)synthesisinleavesofaChinesetea,kucha(Cfl附e〃Zaowa/w'cofvar.^wc/w).Phytochemistry,2002,60(2):129-134)。由此可見，苦茶堿在苦茶中的積累是穩(wěn)定的。非甾體類消炎鎮(zhèn)痛藥物廣泛用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)、強(qiáng)直性脊柱炎、腫瘤疼痛等，目前用于臨床的此類藥物常會(huì)產(chǎn)生一定的毒副作用，因此，非甾體類消炎鎮(zhèn)痛藥物仍是藥物開發(fā)熱點(diǎn)，每年都有此類新藥上市。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供天然苦茶堿在制備消炎鎮(zhèn)痛藥物中的用途。本發(fā)明的化合物苦茶堿(l,3,7，9-四甲基尿酸)結(jié)構(gòu)式如式(I)所示:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>本發(fā)明的化合物苦茶堿從苦茶芽葉中提取。本發(fā)明所用的分離原料苦茶芽葉采自野生苦條植株。用于藥理測(cè)試的苦茶堿的分離工藝包括以下步驟A、苦茶堿提取液的制備取苦茶50g，加入20倍體積沸水保溫9(TC浸提30min，每隔10min振搖一次，過濾，濾渣加IO倍體積沸水再浸提兩次，每次20min，合并三次濾液，得苦茶堿提取液。B、苦茶堿粗品的制備向苦茶堿提取液中加入飽和堿式醋酸鉛水溶液至不再出現(xiàn)沉淀，過濾，以少量沸水洗滌濾渣，濾液濃縮至300ml，等體積氯仿萃取3次，合并氯仿層，減壓濃縮，收集殘物淡黃色固體，即為苦茶堿粗品。C、苦茶堿純品的制備苦茶堿粗品以200-300目硅膠為固定相，乙酸乙酯石油醚=80:20為洗脫劑，進(jìn)行柱層析，收集含苦茶堿流分，同樣條件再層析一次，甲醇重結(jié)晶，即得到純度95%以上的苦茶堿。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果醋酸致小鼠扭體試驗(yàn)顯示，小鼠的扭體次數(shù)隨著苦茶堿給藥劑量的增加而減少，苦茶堿8mg/kg、16mg/kg、32mg/kg、64mg/kg劑量組對(duì)冰醋酸致小鼠疼痛的鎮(zhèn)痛率分別為30.4%、32.3%、36.6%和61.5%;陽性藥消炎痛的鎮(zhèn)痛率為41.6%。熱板法致小鼠疼痛實(shí)驗(yàn)顯示，給予苦茶堿8mg/kg-64mg/kg后30min至120min，小鼠舔后足的時(shí)間呈現(xiàn)不同程度的延長(zhǎng)，其中64mg/kg組小鼠給藥30min和60min時(shí)的痛閾值明顯提高。由此提示，苦茶堿給藥量64mg/kg時(shí)可在給藥后30min產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。甲醛致小鼠足腫脹實(shí)驗(yàn)顯示，給予苦茶堿8mg/kg-64mg/kg后，小鼠足腫脹度隨著給藥劑量的增加而降低，其中32mg/kg和64mg/kg組小鼠的腫脹度與同期空白對(duì)照組相比，具有顯著性差異。二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)顯示，給予苦茶堿32mg/kg、64mg/kg時(shí)，對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的抑制率分別為47.2%和48.4%;陽性藥消炎痛的抑制率為66.6%。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明化合物苦茶堿可用于制備鎮(zhèn)痛消炎藥物。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例l:苦茶堿的分離純化A、苦茶堿提取液的制備取苦茶50g，加入20倍體積沸水保溫90。C浸提30min，每隔10min振搖一次，過濾，濾渣加10倍體積沸水再浸提兩次，每次20min，合并三次濾液，得苦茶堿提取液。B、苦茶堿粗品的制備向苦茶堿提取液中加入飽和堿式醋酸鉛水溶液至不再出現(xiàn)沉淀，濾過，少量沸水洗滌濾渣，濾液濃縮至300ml，等體積氯仿萃取3次，合并氯仿層，減壓濃縮，收集殘物淡黃色固體，即為苦茶堿粗品。C、苦茶堿純品的制備苦茶堿粗品以200-300目硅膠為固定相，乙酸乙酯石油醚=80:20為洗脫劑，進(jìn)行柱層析，收集含苦茶堿流分，同樣條件再層析一次，甲醇重結(jié)晶，即得到純度95%以上的苦茶堿。實(shí)施例2:苦茶堿對(duì)醋酸致小鼠扭體實(shí)驗(yàn)選取健康NIH雄性小鼠60只，體重18-22g，動(dòng)物檢疫合格后，隨機(jī)分成6組，分別是空白對(duì)照組、苦茶堿4個(gè)劑量組和消炎痛對(duì)照組，每組10只小鼠。實(shí)驗(yàn)前各組小鼠先灌胃給藥，空白對(duì)照組小鼠每日給予等體積的純凈水；連續(xù)給藥3天；陽性藥消炎痛于實(shí)驗(yàn)結(jié)束前給藥一次，給藥劑量為10mg/kg，相當(dāng)于70kg成人日服用175mg(含輔料)的1倍。腹腔注射樣品，給藥后lh每鼠腹腔注射1.44。/。冰醋酸0.2ml/20g，記錄注射致痛劑20min后內(nèi)各鼠扭體次數(shù)，比較組間差異，然后計(jì)算藥物鎮(zhèn)痛百分率。鎮(zhèn)痛率％=(空白組扭體次數(shù)一給藥組扭體次數(shù))+空白組扭體次數(shù)乂100%苦茶堿對(duì)冰醋酸致小鼠扭體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。表l苦茶堿對(duì)冰醋酸致小鼠扭體實(shí)驗(yàn)結(jié)果(；士SD，n=10)組另lj給藥劑量(mg/kg)扭體次數(shù)(n)鎮(zhèn)痛率(％)空白對(duì)照組等體積32±7—苦茶堿4組822±8"30.4苦茶堿5組1622±9"32.3苦茶堿6組3220±6**36.6苦茶堿7組6412±8***61.5消炎痛對(duì)照組1019±9"41.6注與同期空白對(duì)照組比較***P<0.001，AP>0.05(標(biāo)志略)；t檢驗(yàn)。由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得，苦茶堿8mg/kg—64mg/kg劑量組小鼠的扭體次數(shù)隨著給藥劑量的增加而減少，對(duì)冰醋酸致小鼠疼痛的鎮(zhèn)痛率分別為30.4%、32.3%、36.6%和61.5%;與同期空白對(duì)照組相比，具有顯著性差異(PO.OI、PO.OOl)。陽性藥消炎痛組小鼠的扭體次數(shù)與同期空白對(duì)照組相比，具有顯著性差異(PO.Ol)，鎮(zhèn)痛率為41.6%，與其臨床適應(yīng)癥相符合。由此提示，苦茶堿具有一定的對(duì)抗外周神經(jīng)痛的作用。實(shí)施例3:苦茶堿對(duì)熱板法致小鼠疼痛實(shí)驗(yàn)選取健康NIH雌性小鼠60只，體重18-22g，動(dòng)物檢疫合格后，隨機(jī)分成6組，分別是空白對(duì)照組、苦茶堿4個(gè)劑量組和消炎痛對(duì)照組，每組10只小鼠。實(shí)驗(yàn)前各組小鼠先灌胃給藥，空白對(duì)照組小鼠每日給予等體積的純凈水；連續(xù)給藥3天；陽性藥消炎痛于實(shí)驗(yàn)結(jié)束前給藥一次，給藥劑量為10mg/kg，相當(dāng)于70kg成人日服用75mg(含輔料)的1倍。把小鼠放于預(yù)先加熱到55'C的GJ-8402型熱板測(cè)痛儀上，用秒表記錄小鼠自投入熱板至出現(xiàn)舔后足的時(shí)間(秒)作為該鼠的痛閾值。給藥前先測(cè)定每只小鼠的痛閾(不超過30秒者為合格)。給藥后30、60、90、120、180min測(cè)定一次，如痛閾值超過60秒，即停止測(cè)試而按60秒計(jì)算。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，按所測(cè)之痛閾平均值計(jì)算痛閾提高百分率。痛閾提高百分率％=(用藥后平均痛閾值一用藥前平均痛閾值)+用藥前平均痛閾值乂100%?？嗖鑹A對(duì)熱板法致小鼠疼痛實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。6表2苦茶堿對(duì)熱板法致小鼠疼痛的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(5士SD，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注與同期空白對(duì)照組比較*P<0.05，AP>0.05(標(biāo)志略)；t檢驗(yàn)。由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得，致炎前各給藥組小鼠對(duì)熱板的閾值與空白對(duì)照組相比，無顯著性差異(P>0.05);給藥后30min至120min，苦茶堿各劑量組小鼠舔后足的時(shí)間呈現(xiàn)不同程度的延長(zhǎng)，其中64mg/kg組小鼠的給藥30min和60min時(shí)的痛閾值明顯提高，與同期空白對(duì)照組相比，具有顯著性差異(PO.01、P《.001);當(dāng)致炎后120min時(shí)，8mg/kg和16mg/kg組小鼠的痛閾值達(dá)峰值，與同期空白對(duì)照組相比，具有顯著性差異(P<0.05、P<0.001):而64mg/kg組小鼠的痛閾值呈現(xiàn)回落。消炎痛對(duì)照組小鼠在給藥后30miri至180min內(nèi)，與同期空白對(duì)照組相比，均無顯著性差異(P>0.05)，與其對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的鎮(zhèn)痛效果不佳有關(guān)。由此提示，苦茶堿高濃度時(shí)可在給藥后30min時(shí)產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用，而苦茶堿低濃度時(shí)的鎮(zhèn)痛作用時(shí)間呈現(xiàn)延長(zhǎng)，可能與其對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制作用有關(guān)。實(shí)施例4:苦茶堿對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)選取健康NIH雄性小鼠60只，體重18-22g，動(dòng)物檢疫合格后，隨機(jī)分成6組，分別是空白對(duì)照組、苦茶堿4個(gè)劑量組和消炎痛對(duì)照組，每組10只小鼠。實(shí)驗(yàn)前各組小鼠先灌胃給藥，空白對(duì)照組小鼠每日給予等體積的純凈水；連續(xù)給藥3天；陽性藥消炎痛于實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)前給藥一次，給藥劑量為10mg/kg，相當(dāng)于70kg成人日服用75mg(含輔料)的1倍。實(shí)驗(yàn)開始前各組小鼠分別給藥，30min后開始進(jìn)行致炎作用。將二甲苯0.03ml滴于小鼠的右耳，以左耳作為對(duì)照。滴加致炎劑后30min后將小鼠脫頸椎處死，沿耳廓基線剪下兩耳，用直徑6mm的打孔器分別在左右兩耳同一部位打下圓耳片，稱重，求左、右耳片重量之差作為腫脹度，比較組間差異。腫脹度(mg)=左耳片重量一右耳片重量抑制率％=(空白組平均腫脹度一給藥組平均腫脹度)+空白組平均腫脹度乂100%苦茶堿對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3所示。表3苦茶堿對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)果(；士SD，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注與同期空白對(duì)照組比較***P<0.001，AP>0.05(標(biāo)志略)；t檢驗(yàn)。由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得，苦茶堿8mg/kg—64mg/kg劑量組小鼠的腫脹度隨著給藥劑量的增加而降低，對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的抑制率分別為10.0%、10.3%、47.2%和48.4%;其中32mg/kg和64mg/kg組小鼠的耳腫脹度與同期空白對(duì)照組相比，具有顯著性差異(PO.OOl)。陽性藥消炎痛組小鼠的腫脹度最小，與同期空白對(duì)照組相比，具有顯著性差異(PO.OOl)，抑制率為66.6%，與其臨床適應(yīng)癥相符合。由此提示，苦茶堿高濃度時(shí)具有一定的抗炎作用。實(shí)施例5:苦茶堿對(duì)甲醛致小鼠足腫脹實(shí)驗(yàn)選取健康NIH雄性小鼠120只，體重18-22g，動(dòng)物檢疫合格后，隨機(jī)分成9組，分別是空白對(duì)照組、苦茶堿7個(gè)劑量組和地西泮片^"-照組，其中空白對(duì)照組包括預(yù)實(shí)驗(yàn)40只小鼠，其余各組10只小鼠。實(shí)驗(yàn)前各組小鼠先灌胃給藥，空白對(duì)照組小鼠每日給予等體積的純凈水；連續(xù)給藥3天；陽性藥消炎痛于實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)前給藥一次，給藥劑量為10mg/kg，相當(dāng)于70kg成人日服用75mg(含輔料)的1倍。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，分別用足體積測(cè)量?jī)x測(cè)定小鼠的足體積，先取得致炎前小鼠足部數(shù)據(jù)，然后進(jìn)行給藥，30min后于小鼠同一部位(右后足)足底注射2%的甲醛生理鹽水注射液20ul/只，分別在注射致炎劑后0.5h、lh、1.5h、2h時(shí)，測(cè)量小鼠的足體積值，分別計(jì)算腫脹度和抑制率。進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理并比較組間差異。腫脹度(ml)=致炎后足體積值一致炎前足體積值抑制率％=(空白組平均腫脹度一給藥組平均腫脹度)十空白組平均腫脹度X100。/?？嗖鑹A對(duì)注射甲醛致小鼠足腫脹的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。表4苦茶堿對(duì)注射甲醛致小鼠足腫脹的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(S土SD，n=10)組另l」給藥劑致炎前致炎后腫脹度(ml)(mg/kg)足體積(ml)30min60min90min120min空白對(duì)照組等體積0.222±0.0190.0840.031±0.058±.0190.0490.025±0.0410.031±苦茶堿4組80.203±0.0290.0620.022±0.0480.023±0.0410.025±0.0430.028±苦茶堿5組160.214±0.0310.0610.039±0.0470.026±0.0360.023±0.0400細(xì)±苦茶堿6組320.212±0.0170馬0.023*±0.0390.021*±0惡0.018*±0.0360.019±苦茶堿7組640.225±0.0250.0420.028**±0.0310.019"±0扁0.014**±0.0340.023±消炎痛對(duì)照組100.217±0.0360.0370.027**±0.0290.018**±0.0280.021±0.0280扁±注與同期空白對(duì)照組比較*P<0.05，AP>0.05(標(biāo)志略)；t檢驗(yàn)。由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得，致炎前各給藥組小鼠足體積與空白對(duì)照組相比，無顯著性差異(P>0.05);致炎后30min至90min，苦茶堿各劑量組的腫脹度隨著給藥劑量的增加而降低，其中32mg/kg和64mg/kg組小鼠的腫脹度與同期空白對(duì)照組相比，具有顯著性差異(P0.05、PO.01);當(dāng)致炎后120min時(shí)，各組小鼠的腫脹度呈現(xiàn)回升，與同期空白對(duì)照組相比，無顯著性差異(P>0.05)。消炎痛對(duì)照組小鼠腫脹度自致炎后30min至90min內(nèi)，與同期空白'對(duì)照組相比，具有顯著性差異(PO.Ol)，2小時(shí)后仍可保持；與其臨床效果相符合。由此提示，苦茶堿高濃度時(shí)具有一定的抗炎作用。權(quán)利要求1、苦茶堿在制備消炎鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了苦茶堿(1，3，7，9-四甲基尿酸)在制備消炎鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用?？嗖鑹A系從野生苦茶C.Kucha(ChangetWang)Chang中提取得到。新鮮苦茶經(jīng)殺青鍋炒干燥后，以水提取，堿式醋酸鉛沉淀茶多酚、氯仿萃取物經(jīng)硅膠柱層析、重結(jié)晶，得到純度為95％以上的苦茶堿。甲醛致小鼠足腫脹實(shí)驗(yàn)和二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)顯示，給予32mg/kg和64mg/kg苦茶堿時(shí)，可顯著抑制小鼠足腫脹和耳腫脹。醋酸致小鼠扭體試驗(yàn)證明，給予8mg/kg-64mg/kg苦茶堿，均表現(xiàn)出顯著的鎮(zhèn)痛作用。熱板法致小鼠疼痛實(shí)驗(yàn)顯示，給藥量64mg/kg時(shí)可在給藥后30min產(chǎn)生顯著的鎮(zhèn)痛作用。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明苦茶堿可用于制備消炎鎮(zhèn)痛藥物。文檔編號(hào)A61P29/00GK101543498SQ20091003923公開日2009年9月30日申請(qǐng)日期2009年5月5日優(yōu)先權(quán)日2009年5月5日發(fā)明者仰曉莉,葉創(chuàng)興,宋曉虹,李凱凱,李成仁,李琳琳,楊曉絨,王冬梅,王園園,王金發(fā),石祥剛申請(qǐng)人:中山大學(xué)