專利名稱：：一種特異性阻斷PKCα信號傳遞的siRNA及其應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種生物靶點藥物及其應用，具體地說，涉及一種特異性阻斷PKCa信號傳遞的siRNA及其在制備治療眼病理增生性疾病藥物中的應用。
背景技術：
：眼病理增生性疾病包括增生性玻璃體視網膜病變(proliferativevitreoretinopathy，PVR)、外傷性增生性玻璃體視網膜病變(T-PVR)、糖尿病增生性玻璃體視網膜病變(PDR)和青光眼術后濾過泡瘢痕化等。它們共同的病理特征是眼內細胞的過度增生導致的瘢痕化，引起視網膜脫離和堵塞濾過泡，是一組嚴重的致盲性眼病，是在細胞和分子水平上，由多種細胞和體液因素形成復雜的網絡關系，進而調控眼內以視網膜色素上皮(retinalpigmentepithelium,RPE)細胞為主，還包括膠質細胞、成纖維細胞和血管內皮細胞等的過度增生反應。目前的治療藥物，如用糖皮質激素抑制炎癥過程，用抗代謝藥抑制細胞增殖過程，這些藥物均是抗腫瘤的細胞毒性藥物，包括5-FU(5-fluoroumcil,5-FU)，道諾霉素或稱柔紅霉素(daunorubicinordaunomycin)、秋水仙緘(colchicine)和絲裂霉素等。然而這些藥物都存在藥效較弱、毒性較大等問題，并且缺乏對照的前瞻研究。因此需要尋找一些更安全、更有效的藥物來防治這類疾病。研究這類疾病復雜網絡中的某一因子或某一細胞的阻斷可能比較困難，對這些復雜因素作用細胞的下游匯合處的信號調控進行研究也許更有效。而蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)是轉導細胞外信號到細胞內反應的細胞內酶家族，廣泛參與細胞信息傳遞、分泌、離子通道調節(jié)、細胞增生、分化及癌變等一系列與生命現象有關的過程，是理想的信號阻斷靶點。國內外諸多研究顯示，在PVR發(fā)生中，RPE細胞的增生(proliferation)、移行(migration)、吞噬(phagocytosis)和膠原纖維收縮(gelcontraction)等行為與RPE細胞自身的PKC有非常重要的關系。這些結果提示我們要研究致病因素作用RPE細胞后，產生的PKC信號是如何調控細胞并導致其行為失常的。本發(fā)明的發(fā)明人應用PKC的特異性抑制劑首次在國內外發(fā)現它通過抑制RPE細胞的鈣離子內流，來抑制PVR的發(fā)生(OphthalmicRes.2005.37:128-35)，應用PKC特異性抑制劑金絲桃素可以有效抑制兔實驗性PVR的發(fā)生(高前應，惠延年，王雨生.金絲桃素抑制兔外傷性增生性玻璃體視網膜病變，眼科學報，2002，18(4):240-245)。從細胞、蛋白和基因水平確定了在PKC的12種亞型中，有IO種PKC亞型在RPE細胞表達，且主要分布在細胞漿中。PKC在成纖維細胞、膠質細胞和血管內皮細胞中也有廣泛表達，研究顯示應用PKC抑制劑也可以阻斷這類細胞的增生，對外傷性增生性玻璃體視網膜病變(T-PVR)、糖尿病增生性玻璃體視網膜病變(PDR)和青光眼術后濾過泡瘢痕化等眼病理增生性疾病具有防治作用。但若從PKC水平阻斷生物信號傳遞，PKC所有亞型的信號傳遞都會被阻斷，影響細胞的生理功能。aprinoearsen(ISIS3521)是一種專一抑制靶向PKCa的mRNA的反義寡核苷酸，可以抑制腫瘤細胞的異常增生和誘導腫瘤細胞凋亡，主要用于惡性腫瘤病人，如非小細胞(型)肺癌、卵巢癌等患者，目前處于臨床試驗階段。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于提供一種小分子siRNA，該siRNA可特異性地阻斷PKCa亞型的信號傳遞。為了實現上述目的，本發(fā)明采取了以下技術方案一種特異性阻斷PKCa信號傳遞的siRNA，所述siRNA為以下針對人PKCa的雙鏈RNA分子中的任意一種正義鏈5'-CGACGACUGUCUGUAGAAA-3'，反義鏈5'-UUUCUACAGACAGUCGUCG-3';正義鏈5'-GGAUGGUACAAGUUGCUUA-3'，反義鏈5'-UAAGCAACUUGUACCAUCC-3';或正義鏈5'-GGCGUCCUGUUGUAUGAAA-3'，反義鏈5'-UUUCAUACAACAGGACGCC-3';或所述siRNA為以下針對小鼠PKCa的雙鏈RNA分子中的任意一種正義鏈5'-GAAUGAGAGCAAACAGAAA-3'，反義鏈5'-UUUCUGUUUGCUCUCAUUC-3';正義鏈5'-GCAAAGGACUUAUGACCAA-3'，反義鏈5'-UUGGUCAUAAGUCCUUUGC-3';或正義鏈5'-GCCCAAAGUGUGUGGCAAA-3'，反義鏈5'-UUUGCCACACACUUUGGGC-3'。優(yōu)選地，所述雙鏈RNA分子3'末端還設有以兩個脫氧核苷組合的懸掛堿基(Over-hang)，以增加siRNA的穩(wěn)定性。優(yōu)選地，所述雙鏈RNA分子為正義鏈5'-GGCGUCCUGUUGUAUGAAAdAdT-3'，反義鏈5'UUUCAUACAACAGGACGCCdAdT-3'。本發(fā)明的另一目的是提供該siRNA在制備治療眼病理增生性疾病藥物中的應用，該siRNA能有效阻斷眼病理增生性疾病，為這類嚴重的致盲性眼病提供一個新的特異性生物治療靶點和干預方法。為實現上述目的，本發(fā)明采取了以下技術方案特異性阻斷PKCoi信號傳遞的siRNA在制備治療眼病理增生性疾病藥物中的應用，所述眼病理增生性疾病為增生性玻璃體視網膜病變、外傷性增生性玻璃體視網膜病變、糖尿病增生性玻璃體視網膜病變和青光眼術后濾過泡瘢痕化等眼病理增生性疾病。本發(fā)明siRNA可以制成眼科用滴眼液、注射液等不同劑型。本發(fā)明的發(fā)明人應用分子生物學技術研究體外人RPE細胞周期的多種因子和PKC亞型的關系，發(fā)現只有PKCa通過下調p27K^調控RPE細胞的增生和PVR的形成，在PVR發(fā)生中起著關鍵作用。PKCa能調控RPE細胞周期的Gl/S轉折點，即能控制細胞從靜止狀態(tài)(G1期)進入DNA合成期(S期)，也稱為限制點(restrictionpoint),是細胞能否越過靜止期進入細胞增生的關鍵點。參與調控的是細胞周期素(Cyclin)和細胞周期蛋白依賴激酶(cyclin-dependentkinases,CDKs)形成的復合物Cdk2-CyclinE或Cdk2-CyclinA，而細胞周期蛋白依賴激酶抑制劑(cyclindependentkinaseinhibitors,CKIs)主要是p27Kipl。本發(fā)明具有以下有益效果1)siRNA-PKCa特異性針對PKCa亞型，在阻斷PKCa的同時，并不會引起PKC其它亞型的信號傳遞阻斷而影響細胞的生理功能，從而為治療這類嚴重的致盲性眼病提供了一種新的藥物特異性干預靶點的基因藥物；2)首次應用PKCa信號特異性抑制劑siRNA-PKCa阻斷眼病理增生性疾病，效果顯著，且沒有目前所用藥物的副作用。圖1為小鼠眼球HE染色比較；其中A:正常小鼠眼球；B:陰性對照組(NotargetsiRNA);C:50nM濃度組；D:100nM濃度組；E:150nM濃度組；F:200nM濃度組；G:300nM濃度組；圖2為小鼠PVR的發(fā)生率；其中contrast:陰性對照組(NotargetsiRNA);1:50nM濃度組；2:lOOnM濃度組；3:150nM濃度組；4:200nM濃度組；5:300nM濃度組；圖3為RPE細胞接受各種處理24小時后的RT-PCR結果圖；圖4為P27kipl接受PMA和Thy處理0-24小時的mRNA(A)和蛋白(B)的表達情況；圖5為RPE細胞接受各種處理后PKCa的mRNA表達情況；圖6為各種處理對RPE細胞增殖的影響圖；圖7為Westernblot法檢測各處理組RPE細胞中PKCa蛋白的表達量。具體實施方式以下通過具體實施例來說明本發(fā)明。實施例1:利用小鼠siRNA治療小鼠PVR1、試驗模型小鼠PVR模型(C57BL/6小鼠，購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心)本實驗選擇5-6周的SPF級C57BL/6小鼠共36只，按照Frenzel等(FrenzelEM,NeelyKA,WalshAW，etal.Anewmodelofproliferativevitreoretinopathy,InvestOphthalmolVisSci.1998Oct;39(ll):2157-2164)的方法，在無需進行玻璃體切割、視網膜切開或冷凍的條件下用10pL的微量進樣器于小鼠右眼角鞏膜緣后3mm向玻璃體腔注射2pL(0.2u/nL)的dispase(中性蛋白酶，GIBCO公司)，一般48周時即有明顯的PVR形成，形成了小鼠PVR模型。2、PKCasiRNA的設計與合成首先在美國國立生物技術信息中心NCBI數據庫中獲取小鼠PKCamRNA的序列全長，設計三條PKCa-siRNA和一條陰性對照siRNA(NotargetsiRNA)。此外，設計了dTdT兩個堿基的懸掛末端，以增加siRNA的穩(wěn)定性。設計的siRNA由廣州市銳博生物科技有限公司合成。將合成的siRNA粉末用無RNA酶的ddH20溶解，配制成20pM的siRNA母液于-20'C保存?zhèn)溆?。?小鼠PKCa-siRNA及陰性對照NotargetsiRNA<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>3、試驗方法將36只C57BL/6小鼠隨機分為6組，每組6只，A組為陰性對照組(NotargetsiRNA)，1-5組為實驗組，分別代表PKCasiRNA4終濃度為50nM(1組)、I00nM(2組)、150nM(3組)、200nM(4組)和300nM(5組)。小鼠玻璃體腔注射dispase1周后使用水合三氯乙醛(4.3%)麻醉小鼠，用復方托吡卡胺滴眼液散大小鼠瞳孔，在手術顯微鏡下，用IOML的微量進樣器沿小鼠角鞏緣進針，抵達視神經乳頭表面，在玻璃體腔內注射2pL的藥物。其中陰性對照組注射2pL濃度為500nM的NotargetsiRNA，眼內終濃度為100nM，實驗組分別注射2pL濃度為250nM、500nM、750nM、1000nM、1500nM的PKCasiRNA4，眼內終濃度分別為50nM(1組)、100nM(2組)、150nM(3組)、200nM(4組)、300nM(5組)。玻璃體腔注射藥物后，使用CUY21EDIT多功能活體電轉化儀，進行活體電轉染。使用前檢查儀器，測量空氣電阻，設置參數(Resistance:0.8-1.5kohm;Volt:80-100V;Pon:50msec;Poff:950msec;Number:5;Ampere:0.08-0.15A)。將小鼠兩眼涂上羥丙基甲基纖維素滴眼液，然后用電極(CUY650P7)貼緊角膜，然后按下Start,開始進行轉染。電轉染后連續(xù)觀察4周，頸椎脫臼法處死小鼠，收集標本。用眼科彎鑷摘取小鼠雙側眼球，去除球外組織，用OCT包埋眼球，制作冰凍切片并進行常規(guī)HE染色和免疫組化檢測。4、試驗結果A.眼球結構變化藥物作用4周后，將小鼠眼球冰凍切片后進行HE染色。圖1結果表明，陰性對照組和實驗組50nM濃度組6眼球視網膜全脫離，視網膜基本結構發(fā)生改變；實驗組100nM組、150nM組、200nM濃度組有4眼發(fā)生視網膜脫落，2眼未發(fā)生視網膜脫落，且眼球基本結構完好；實驗組300nM濃度組有3眼發(fā)生視網膜脫落，3眼未發(fā)生視網膜脫落，且眼球結構完好，說明100nM-300nM的PKCasiRNA對PVR的發(fā)生有一定的抑制作用。B.PVR發(fā)生率如圖2所示，陰性對照組和實驗組50nM濃度組視網膜嚴重脫離，PVR發(fā)生率為100%,實驗組100nM組、150nM組、200nM組，PVR發(fā)生率均為66.7%，300nM組PVR發(fā)生率為50%。C.免疫熒光檢測1)RPE細胞、Mllller細胞表達通過免疫熒光檢測RPE細胞的標志性蛋白RPE65，和MlUler細胞的標志性蛋白GS的表達分布，結果表明正常小鼠視網膜中可見RPE細胞和MUller細胞呈弱陽性表達，陰性對照組、50nM濃度組、lOOnM濃度組、150nM濃度組脫落的視網膜組織RPE細胞和Muller細胞呈強陽性表達，200nM組和300nM組脫落的視網膜組織RPE細胞和Muller細胞呈弱陽性表達。實驗組中隨著siRNA濃度的升高,RPE細胞和MUller細胞表達明顯減少。2)成纖維細胞、星型膠質細胞表達通過免疫熒光檢測成纖維細胞的標志性蛋白a-SMA，和星型膠質細胞的標志性蛋白GFAP的表達分布，結果表明正常小鼠視網膜中可見成纖維細胞、星型膠質細胞呈弱陽性表達，陰性對照組、50nM濃度組、100nM濃度組、150nM濃度組脫落的視網膜組織成纖維細胞、星型膠質細胞呈強陽性表達，200nM組和300nM組成纖維細胞、星型膠質細胞呈弱陽性表達。實驗組中隨著siRNA濃度的升高，成纖維細胞和星型膠質細胞表達明顯減少。利用小鼠siRNA治療小鼠PVR,結果表明PKCasiRNA能夠抑制PVR的發(fā)生，100-300nM的siRNA對PVR的發(fā)生有一定的抑制作用，濃度越高，抑制作用越明顯；siRNA通過抑制與眼病理增生性疾病相關的細胞的表達來抑制PVR的發(fā)生，隨著siRNA濃度的升高,RPE細胞、MUller細胞、成纖維細胞和星型膠質細胞表達明顯減少。實施例2:利用人siRNA抑制RPE細胞的增殖1、實驗細胞RPE細胞:在中山眼科中心眼庫中取捐獻者死后24小時內的眼球，在無菌條件下自赤道布環(huán)形切開眼球，棄去眼前節(jié)，清除玻璃體，分離視網膜神經上皮層，將后節(jié)眼杯置于眼球托上，將質量百分比為0.25%的胰酶加入眼杯，37'C孵育消化約IO分鐘后用吸管輕輕吹打，使RPE細胞脫落，將含RPE細胞的消化液移入預加有含質量百分含量為20%的胎牛血清和10/o的抗生素的DMEM中，終止胰酶作用。離心、漂洗后用含質量百分含量為20%的胎牛血清和1%的抗生素的DMEM制成濃度為2X104cellZmlRPE細胞懸液，用于接種培養(yǎng)。2、PKCasiRNA的設計與合成首先在美國國立生物技術信息中心NCBI數據庫中獲取人PKCamRNA的序列全長，設計三條PKCasiRNA和一條陰性對照siRNA(NotargetsiRNA)。此外，設計了兩個堿基的懸掛末端，以增加siRNA的穩(wěn)定性。設計的siRNA由廣州市銳博生物科技有限公司合成。將合成的siRNA粉末用無RNA酶的ddH20溶解，配制成20nM的siRNA母液于-20'C保存?zhèn)溆?。?人PKCa-siRNA及陰性對照NotargetsiRNA名稱耙標位置正義鏈序列反義鏈序列SEQ(Target/bp)Sense(5'-3，)Antisense(5'-3，)PKCasiRNAl756~774CGACGACUGUCUGUAGAAAdGdTU跳UACAGACAGUCGUCGdGdT1、2PKCasi腿2861~879GGAUGGUACAAGUUGCUUAdAdCUAAGCAACUUGUACCAUCCdAdC3、4PKCasi腿31617~1635GGCGUCCUGUUGUAUGAAAdAdTUUUCAUACAACAGGACGCCdAdT5、6陰性對照ProductNoAGAUAAGGUUCGAGGAGAAdTdTCCCUCGMCCU畫CUdTdT7、8(2005527113152)3、實驗方法(1)細胞培養(yǎng)將RPE細胞懸液接種于6孔培養(yǎng)板，當細胞融合率達50%時，去除原培養(yǎng)基，每孔加入2ml含質量百分含量為20%的胎牛血清的無抗生素的DMEM培養(yǎng)基。(2)制備轉染復合物取60pl濃度為2mg/ml的脂質體LipofectAMINE2000,加入300^1DMEM混勻，室溫下靜置5分鐘得A液；分別取180^1濃度為lOOnM的PKCasiRNA3和NotargetsiRNA，各加300WDMEM混勻得B液，將A液與B液混合，輕輕地顛倒混勻，不要震蕩，室溫下溫育20分鐘，形成siRNA-LipofectAMINE2000和NotargetsiRNA-LipofectAMINE2000的轉染復合物。(3)轉染當細胞融合率達60%時，進行轉染處理。各組每個孔內均加入lml對應的液體，前后輕柔推搖培養(yǎng)板以混勻液體，將培養(yǎng)板送入細胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。每個組設置5個重復。siRNA組siRNA-LipofectAMINE2000轉染復合物；陰性對照組NotargetsiRNA-LipofectAMINE2000轉染復合物；Thy組含thymdeatoxin(—種特異性激活PKCa的化學物質)的培養(yǎng)基，終濃度為lOOnM;Control組空白對照組。4、實驗結果RT-PCR結果顯示細胞接受siRNA、Thy(100nM)或PMA(100nM)處理24小時后，在主要細胞周期調節(jié)因子中，只有p27k^mRNA的表達量發(fā)生了變化，提示細胞周期抑制性蛋白P27kipl是PKCa促人RPE增殖相關的細胞周期相關蛋白(圖3)。P27kipl蛋白分別在1小時(PMA)和3小時(Thy)明顯下降(圖4)。RPE細胞在接受各種處理3小時后，測定PKCamRNA的表達情況，結果表明，Thy和PMA作用RPE細胞后，PKCamRNA的表達量增加，siRNA作用RPE細胞后，PKCamRNA的表達量下降(圖5)。轉染2天后，每個處理組均取3孔細胞，采用細胞計數板法分別計數并計算平均數，其余2孔提蛋白做Westernblot檢測靶蛋白PKCa的表達。與Control組相比，siRNA組的RPE細胞數明顯減少，表明siRNA能顯著抑制RPE細胞的增殖，抑制效率達到39.9%(圖6)。不同處理組中的p-Actin條帶亮度幾乎無差異，說明總蛋白量基本一致，Control組的PKCa蛋白表達有明顯條帶，而轉染了PKCasiRNA3的細胞幾乎檢測不到PKCa蛋白的表達，實驗結果進一步證實了PKCasiRNA在蛋白水平對靶基因表達的抑制及作用的特異性(圖7)。本發(fā)明的siRNA均能不同程度下調PKCa的mRNA水平從而抑制RPE細胞的增殖，其中以50-300nM濃度效果最佳，以PKCasiRNA3的抑制作用最明顯。在人RPE細胞轉染了100nM的siRNA3后，細胞增殖的抑制效率為39.9%，且此濃度的siRNA對RPE細胞的形態(tài)無影響。中心<120>—種特異性阻斷PKCa信號傳遞的siRNA及其應用<160>14<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>1cgacgacugucuguagaaa19<210>2<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>2uuucuacagacagucgucg19<210>3<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>3ggaugguacaaguugcuua19<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>4uaagcaacuuguaccaucc19<210>5<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>5ggcguccuguuguaugaaa19<210>6<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>6uuucauacaacsgg3cgcc19<210>7<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>7agauaagguucgaggag33<210>8<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>8cuuuccucgaaccuuaucu<210>9<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>9gaaugagagcaaacagaaa<210>10<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>10uuucuguuugcucucauuc<210>11<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>11gcaaaggacuuaugaccaa19<210>12<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>12uuggucauaaguccuuugc19<210>13<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>13gcccaaaguguguggcaaa19<210>14<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>14uuugccacacacu皿gggc權利要求1.一種特異性阻斷PKCα信號傳遞的siRNA，其特征在于所述siRNA為以下針對人PKCα的雙鏈RNA分子中的任意一種正義鏈5′-CGACGACUGUCUGUAGAAA-3′，反義鏈5′-UUUCUACAGACAGUCGUCG-3′；正義鏈5′-GGAUGGUACAAGUUGCUUA-3′，反義鏈5′-UAAGCAACUUGUACCAUCC-3′；或正義鏈5′-GGCGUCCUGUUGUAUGAAA-3′，反義鏈5′-UUUCAUACAACAGGACGCC-3′；或所述siRNA為以下針對小鼠PKCα的雙鏈RNA分子中的任意一種正義鏈5′-GAAUGAGAGCAAACAGAAA-3′，反義鏈5′-UUUCUGUUUGCUCUCAUUC-3′；正義鏈5′-GCAAAGGACUUAUGACCAA-3′，反義鏈5′-UUGGUCAUAAGUCCUUUGC-3′；或正義鏈5′-GCCCAAAGUGUGUGGCAAA-3′，反義鏈5′-UUUGCCACACACUUUGGGC-3′。2.根據權利要求1所述的特異性阻斷PKCa信號傳遞的siRNA，其特征在于所述雙鏈RNA分子的3'末端還設有以兩個脫氧核苷組合的懸掛堿基。3.根據權利要求2所述的特異性阻斷PKCa信號傳遞的siRNA，其特征在于所述雙鏈RNA分子為正義鏈5'-GGCGUCCUGUUGUAUGAAAdAdT-3'，反義鏈5'UUUCAUACAACAGGACGCCdAdT-3'。4.根據權利要求1所述的特異性阻斷PKCa信號傳遞的siRNA，其特征在于所述針對人PKCa的siRNA的濃度為50-300nM，或所述針對小鼠PKCa的siRNA的濃度為100-300nM。5.權利要求1-4任一項所述的siRNA在制備治療眼病理增生性疾病藥物中的應用。6.根據權利要求5所述的siRNA的應用，其特征在于所述眼病理增生性疾病為增生性玻璃體視網膜病變、外傷性增生性玻璃體視網膜病變、糖尿病增生性玻璃體視網膜病變或青光眼術后濾過泡瘢痕化。全文摘要本發(fā)明公開了一種特異性阻斷PKCα信號傳遞的siRNA，所述siRNA為以下針對人PKCα的雙鏈RNA分子中的任意一種正義鏈5′-CGACGACUGUCUGUAGAAA-3′，反義鏈5′-UUUCUACAGACAGUCGUCG-3′；正義鏈5′-GGAUGGUACAAGUUGCUUA-3′，反義鏈5′-UAAGCAACUUGUACCAUCC-3′；或正義鏈5′-GGCGUCCUGUUGUAUGAAA-3′，反義鏈5′-UUUCAUACAACAGGACGCC-3′；或所述siRNA為以下針對小鼠PKCα的雙鏈RNA分子中的任意一種正義鏈5′-GAAUGAGAGCAAACAGAAA-3′，反義鏈5′-UUUCUGUUUGCUCUCAUUC-3′；正義鏈5′-GCAAAGGACUUAUGACCAA-3′，反義鏈5′-UUGGUCAUAAGUCCUUUGC-3′；或正義鏈5′-GCCCAAAGUGUGUGGCAAA-3′，反義鏈5′-UUUGCCACACACUUUGGGC-3′，siRNA-PKCα特異性針對PKCα亞型，為治療這類嚴重的致盲性眼病提供了一種新的藥物特異性干預靶點的基因藥物。文檔編號A61P27/02GK101591655SQ200910039899公開日2009年12月2日申請日期2009年6月1日優(yōu)先權日2009年6月1日發(fā)明者堅葛,高前應申請人:中山大學中山眼科中心