專利名稱：一種禽畜用抗病毒組合物的制作方法
第1/13頁
一種禽畜用抗病毒組合物
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗病毒劑，尤其涉及一種用于家禽家畜的抗病毒劑。背景技術(shù)：
IFN-oc是一個(gè)具有很強(qiáng)抗病毒活性是的細(xì)胞因子，它在治療人的病毒性疾 病中已經(jīng)廣泛應(yīng)用，并成為一種必需的療法。比如，在丙型肝炎的治療中， IFN-oc起著無法替代的作用。由于IFN-a抗病毒的作用是間接的，是通過誘導(dǎo) 體內(nèi)的其它抗病毒機(jī)理而起作用的，它的一個(gè)重要特點(diǎn)是沒有病毒特異性， 也就是說IFN-cx有抗不同病毒的活性；但I(xiàn)FN-ot抗病毒作用的另外一個(gè)重要特 點(diǎn)是種屬特異性，也就是說來自某一個(gè)種屬的IFN-a，只對(duì)那個(gè)種屬感染的 病毒有效，而對(duì)其余種屬感染的病毒無效。比如，人的IFN-oc只對(duì)人的病毒 感染有效，對(duì)其它種屬包括豬、牛、雞等則無效?？蛊渌@些種屬的病毒感 染則需要制備各自種屬特異的IFN-a。 IFN-a可由人或不同種屬動(dòng)物的白細(xì)胞 經(jīng)干擾素誘導(dǎo)劑(比如新城雞瘟病毒，PHA、黃芪提取物等)刺激而產(chǎn)生。但 這類白細(xì)胞干擾素的效價(jià)往往比較低，而且一般都是未加純化的粗制品，所 以普遍療效較差，也難免會(huì)有副作用；早期有給人用的，多年前已經(jīng)禁止給 人用。獸用的白細(xì)胞干擾素還在流行，但最好是制備基因重組干擾素，以保 證最好的療效、最小的毒副作用。由于不同種屬之間的IFN-oc基因序列不同， 所以就需要分別克隆并表達(dá)和純化不同種屬的IFN-a。
藍(lán)藻抗病毒蛋白質(zhì)是從藍(lán)藻里分離純化的一個(gè)具有高度抗病毒活性的植 物蛋白質(zhì)，為了便于大量制備現(xiàn)已通過基因工程的方法生產(chǎn)。最初發(fā)現(xiàn)藍(lán)藻 抗病毒蛋白有抗HIV的作用，后來已證實(shí)它還有抗流感病毒、皰疹病毒、出 血熱病毒、丙肝病毒等多種病毒的活性。但由于它是一個(gè)植物蛋白質(zhì)，進(jìn)入 人體后會(huì)產(chǎn)生抗體反應(yīng)，產(chǎn)生的抗體會(huì)中和后續(xù)進(jìn)入的藍(lán)藻蛋白，從而減弱 其抗病毒作用。也就是說，盡管藍(lán)藻蛋白質(zhì)在體外有很好的抗病毒活性，但 其體內(nèi)抗病毒的應(yīng)用一直受到很大的限制。目前報(bào)道的是用藍(lán)藻抗病毒蛋白做成陰道栓劑，預(yù)防和治療HIV感染，效果比較肯定；還有人正在研究如何 降低其免疫原性，但實(shí)用的方法比較少。鑒于藍(lán)藻抗病毒蛋白的這些特點(diǎn)， 及動(dòng)物生命周期短的特性，本發(fā)明把藍(lán)藻抗病毒蛋白質(zhì)用于治療動(dòng)物的病毒 感染，療效理想。雞和鴨的生長(zhǎng)期只有6周左右，豬和牛的生長(zhǎng)期也只有幾 個(gè)月；而且這些禽畜往往易患急性病毒性感染，比如雞瘟、豬瘟、口蹄疫、
藍(lán)耳病等。從使用藍(lán)藻抗病毒蛋白質(zhì)到產(chǎn)生特異性抗體往往需要一個(gè)月，產(chǎn) 生高效價(jià)的特異性抗體則需要多次使用，也就是說需要幾個(gè)月的多次使用， 實(shí)際上是治療禽畜類的急性病毒性疾病不需要多次也不會(huì)長(zhǎng)期使用。因此， 雖然使用藍(lán)藻抗病毒蛋白質(zhì)治療人的病毒性感染有其局限性，但很適合治療 禽畜類的病毒性感染，尤其是禽畜類的急性病毒性感染。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種能有效治療禽畜病毒病的禽畜用抗病毒組合物。
所述的禽畜用抗病毒組合物是由質(zhì)量比為3:1的藍(lán)藻抗病毒蛋白和動(dòng)物
IFN-oc組成。它可以用于制備治療禽畜用病毒病的藥品。其中，動(dòng)物IFN-a 根據(jù)治療的禽畜種屬選擇相應(yīng)種屬的IFN-a。
當(dāng)禽畜用抗病毒組合物與含抗特異性病毒IgY的雞蛋粉以5:2的質(zhì)量比 混合后，可以用于制備治療禽畜用病毒病的口服藥品。
其中，所述的藍(lán)藻抗病毒蛋白按以下方法制得
(l)從藍(lán)藻中提取總RNA，通過RT-PCR擴(kuò)增藍(lán)藻抗病毒蛋白的基因片段， 藍(lán)藻抗病毒蛋白的氨基酸序列是
SELAAECKTRAQQFVSTKINLDDHIANIDGTLKYE。 藍(lán)藻抗病毒蛋白的核苷酸序列是
cttggtaaattctcccagacctgctacaactccgctatccagggttccgttctgacctccacctgc gaacgtaccaacggtggttacaacacctcctccatcgacctgaactccgttatcgaaaacgttgac ggttccctgaaatggcagccgtccaacttcatcgaaacctgccgtaacacccagctggctggttcc tccgaactggctgctgaatgcaaaacccgtgctcagcagttcgtttccaccaaaatcaacctggac gaccacatcgctaacatcgacggtaccctgaaatacgaataa(2) 經(jīng)測(cè)序確認(rèn)序列無誤后，把上述核苷酸序列克隆到pET26b(+)載體， 在E. coli BL21感受態(tài)細(xì)胞中表達(dá)；
(3) 工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)可溶性抗病毒蛋白，用DEAD葡聚糖離子交換 層析純化即可。
所述的動(dòng)物IFN-a按以下方法制得
(1) 從動(dòng)物脾臟中提取總RNA，通過RT-PCR擴(kuò)增動(dòng)物IFN-ct的基因片段；
(2) 經(jīng)測(cè)序確認(rèn)序列無誤后，把上述核苷酸序列克隆到pIC9K載體，在 Pichia pastoris載體中表達(dá)；
(3) 通過甲醇誘導(dǎo)，培養(yǎng)5天，收集培養(yǎng)液，從上清中經(jīng)DEAE葡聚糖離子 交換層析純化即可。
當(dāng)用于制備豬病毒病藥品時(shí)，所述的動(dòng)物IFN-a為豬IFN-ot，它是按以 下方法制得
(l)從豬脾臟中提取總RNA，通過RT-PCR擴(kuò)增豬的IFN-oc的基因片段，其
中，
豬IFN-a的的氨基酸序列是
GGNQVQKAQAMALVHEMLQQTFQLFSTEGS嵐麗ESLLHQFCTGLDQQL亂EACVMQEAGLEGT
PLLEEDSILAVRKYFHRLTLYLQEKSYSPCAWEIVRAEVMRSFSSSRNLQDRLRKKE.
豬IFN-a的核苷酸序列是
atggccccaacctcagccttcctcacggccctggtgctactcagctgcaatgccatctgctctctg ggctgtgacctgcctcagacccacagcctggctcacaccagggccctgaggctcctggcacaaatg aggagaatctctcccttctcctgcctggaccacagaagggactttggatcccctcatgaggctttt gggggcaaccaggtccagaaggctcaagccatggctctggtgcatgagatgctccagcagaccttc cagctcttcagcacagagggctcggctgctgcctggaa/tgagagcctcctgcaccagttctgcact ggactggatcagcagctcagggacctggaagcctgtgtcatgcaggaggcggggctggaagggacc cccctgctggaggaggactccatcctggctgtgaggaaatacttccacagactcaccctctatctg caagagaagagctacagcccctgtgcctgggagatcgtcagggcagaagtcatgagatccttctct t c c t c caga^c c t gc angac agac t c agga^gaagg恥t(2) 經(jīng)測(cè)序確認(rèn)序列無誤后，把上述核苷酸序列克隆到pIC9K載體，在 Pichia pastoris載體中表達(dá)；
(3) 通過甲醇誘導(dǎo)，培養(yǎng)5天，收集培養(yǎng)液，從上清中經(jīng)DEAE葡聚糖離子 交換層析純化即可。
當(dāng)用于制備牛病毒病藥品時(shí)，所述的動(dòng)物IFN-a為牛IFN-a，它是按以 下方法制得
(l)從牛脾臟中提取總RNA，通過RT-PCR擴(kuò)增牛的IFN-ot的基因片段，其
中，
牛IFN-a的的氨基酸序列是
PLLKEDSSLAVRKYF服LTLYLQEKRHSPCAWEWRAE爾AFSSSTNLQESFRRKD. 牛IFN-a的核苷酸序列是
atggccccagcctggtccttcctgcta/tccctgttgctgctcagctgcaacgccatctgctctctg ggttgccacctgcctcacacccacagcctggccaacaggagggtcctgatgctcctgcaacaactg agaagggtctccccttcctcctgcctgcaggacagaaatgacttcgaattcctccaggaggctctg ggtggcagccagttgcagaaggctcaagccatctctgtgctccacgaggtgacccagcacaccttc cagctcttcagcacagagggctcgcccgccacgtgggacaagagcctcctggacaagctacgcgct gcgctggatcagcagctcactgacctgcaagcctgtctgacgcaggaggaggggctgcgaggggct cccctgctcaaggaggactccagcctggctgtgaggaaatacttccacagactcactctctatctg caagagaagagacacagcccttgtgcctgggaggttgtcagagcagaagtcatgagagccttctct t c c t caac aaac ttgcaggagagtttc aggagaaaggac t ga
(2) 經(jīng)測(cè)序確認(rèn)序列無誤后，把上述核苷酸序列克隆到pIC9K載體，在 Pichia pastoris載體中表達(dá)；
(3) 通過甲醇誘導(dǎo)，培養(yǎng)5天，收集培養(yǎng)液，從上清中經(jīng)DEAE葡聚糖離子 交換層析純化即可。
當(dāng)用于制備雞病毒病藥品時(shí)，所述的動(dòng)物IFN-a為雞IFN-a，它是按以 下方法制得(l)從雞脾臟中提取總RNA，通過RT-PCR擴(kuò)增雞的IFN-oc的基因片段，其
中，
雞IFN-ot的的氨基酸序列是
SDTRSRTRWP亂HLTIKKHFSCLHTFLQDNDYSACAWE證LQA廳FL證NLTGNTRT 雞IFN-a的核苷酸序列是
atggctgtgcctgcaagcccacagcacccacgggggtacggcatcctgctgctcacgctccttctg aaagctctcgccaccaccgcctccgcctgcaaccaccttcgctcccaggatgccaccttctctcac gacagcctccagctcctccgggacatggctcccacactaccccagctgtgcccacagcacaacgcg tcttgctccttcaacgacaccatcctggacaccagcaacacccggcaagccgacaaaaccacccac gacatccttcagcacctcttcaaaatcctcagcagccccagcactccagcccactggaacgacagc caacgccaaagcctcctcaaccggatccaccgctacacccagcacctcgagcaatgcttggacagc agcgacacgcgctcccggacgcgatggcctcgcaaccttcacctcaccatcaaaaaacacttcagc tgcctccacaccttcctccaagacaacgattacagcgcctgcgcctgggaacacgtccgcctgcaa gctcgtgcctggttcctgcacatccacaacctcacaggcaacacgcgcacttag
(2) 經(jīng)測(cè)序確認(rèn)序列無誤后，把上述核苷酸序列克隆到pIC9K載體，在 Pichia pastoris載體中表達(dá)；
(3) 通過甲醇誘導(dǎo)，培養(yǎng)5天，收集培養(yǎng)液，從上清中經(jīng)DEAE葡聚糖離子 交換層析純化即可。
本發(fā)明首次把藍(lán)藻抗病毒蛋白用于治療禽畜類的病毒性感染，首次把用基 因重組的方法制備的高效價(jià)、高純度的來自豬、雞、牛等不同種屬的具有抗 病毒作用的動(dòng)物IFN-a與有直接抗病毒作用的藍(lán)藻抗病毒蛋白聯(lián)合應(yīng)用；抗 病毒蛋白的作用直接快速、IFN-oc的抗病毒作用廣泛持久，比單獨(dú)使用抗病毒 蛋白或IFN-a的都要好。
此外，本發(fā)明所述的藍(lán)藻抗病毒蛋白的制備純化方法，所得的產(chǎn)物純度高 達(dá)98%以上，產(chǎn)量高達(dá)每升0.7克。所述的動(dòng)物IFN-a的制備純化方法，所得 的產(chǎn)物純度高達(dá)97%，產(chǎn)量高達(dá)每升0.5克。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例一
一、 制備藍(lán)藻抗病毒蛋白
(1) 從藍(lán)藻中提取總RNA，通過RT-PCR擴(kuò)增藍(lán)藻抗病毒蛋白的基因片段，
藍(lán)藻抗病毒蛋白的氨基酸序列是
SELAAECKTRAQQFVSTKINLDDHIANIDGTLKYE。 藍(lán)藻抗病毒蛋白的核苷酸序列是
cttggtaaattctcccagacctgctacaactccgctatccagggttccgttctgacctccacctgc gaacgtaccaacggtggttacagLcacctcctccatcgacctgaactccgttatcgaaaacgttgac ggttccctgaaatggcagccgtccaacttcatcgaaacctgccgtaacacccagctggctggttcc tccgaactggctgctgaatgcagiaacccgtgctcagcagttcgtttccaccaaaatcaacctggac g3ccacatcgct aaca t c ga_c gg t ac c c t gaaa t ac gaat an
(2) 經(jīng)測(cè)序確認(rèn)序列無誤后，把上述核苷酸序列克隆到pET26b (+)載體， 在E. coli BL21感受態(tài)細(xì)胞中表達(dá)；
(3) 工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)可溶性抗病毒蛋白，用DEAD葡聚糖離子交換 層析純化。
二、 制備豬IFN-a
(l)從豬脾臟中提取總認(rèn)A，通過RT-PCR擴(kuò)增豬的IFN-a的基因片段，其
中，
豬IFN-a的的氨基酸序列是
MAPTSAFLTALVLLSCNAICSLGCDLPQTHSLAHTRALRLLAQMRRISPFSCLDHRRDFGSPHEAF GGNQVQKAQA亂VHEMLQQTFQLFSTEGSMA麗ESLLHQFCTGLDQQLRDLEACVMQEAGLEGT PLLEEDSILAVRKYF服LTLYLQEKSYSPCAWEIVRAEVMRSFSSSRNLQDRLRKKE. 豬IFN-a的核苷酸序列是
atggccccaacctcagccttcctcacggccctggtgctactcagctgcaatgccatctgctctctg ggctgtgacctgcctcagacccacagcctggctcacaccagggccctgaggctcctggcacaaatg aggagaatctctcccttctcctgcctggaccacagaagggactttggatcccctcatgaggcttttgggggcaaccaggtccagaaggctcaagccatggctctggtgcatgagatgctccagcagaccttc cagctcttcagcacagagggctcggctgctgcctggaMgagagcctcctgcaccagttctgcact ggactggatcagcagctcagggacctggaagcctgtgtcatgcaggaggcggggctggaagggacc cccctgctggaggaggactccatcctggctgtgaggaaatacttccacagactcaccctctatctg caagagaagagctacagcccctgtgcctgggagatcgtcagggcagaagtcatgagatccttctct tcctccagaaacctgcaagacagactcaggaagaaggagtga
(2) 經(jīng)測(cè)序確認(rèn)序列無誤后，把上述核苷酸序列克隆到pIC9K載體，在 Pichia pastoris載體中表達(dá)；
(3) 通過甲醇誘導(dǎo)，培養(yǎng)5天，收集培養(yǎng)液，從上清中經(jīng)DEAE葡聚糖離子 交換層析純化。
三、 將藍(lán)藻抗病毒蛋白和豬IFN-a按質(zhì)量比3: l混合。
四、 口服抗病毒試驗(yàn)
(一) 口服抗病毒試驗(yàn) 將步驟三所得的抗病毒組合物與含抗特異性病毒IgY的雞蛋粉按5: 2
的質(zhì)量比混合，形成抗病毒口服制劑(以下稱免力快)，用于治療患有豬口蹄
疫的豬
患口蹄疫的豬30頭，分3組，每組各10頭。第一組不做任何特殊治療， 作為陰性對(duì)照；第二組用菌毒快克拌料(用量為5克/公斤飼料)，作為陽性 對(duì)照；第三組用免力快拌料(用量為5克/公斤飼料)，作為治療組。結(jié)果5 天后，第一組全部死亡，第二組僅存2頭，第三組全部存活。
(二) 注射抗病毒試驗(yàn) 將步驟三所得的抗病毒組合物凍干，制成抗病毒粉針劑，用于治療患有
豬口蹄疫的豬
患口蹄疫的豬30頭，分3組，每組各10頭。第一組不做任何特殊治療， 作為陰性對(duì)照；第二組用口蹄疫抗血清O. 5ml/kg體重皮下注射，作為陽性對(duì) 照；第三組皮下注射抗病毒粉針劑(用量為O. lg/kg體重)，作為治療組。結(jié) 果3天后，第一組全部死亡，第二組僅存4頭，第三組全部存活。序列表
<110〉廣州羅森生物科技有限公司
<120〉一種禽畜用抗病毒組合物
<16〇〉4
<210> 1
<211〉 306
<212> DNA
<213〉藍(lán)藻抗病毒蛋白
<221〉 CDS
<222〉 (1)...(306)
<4〇〇> 1
ctt Leu 1
tcc Ser
sec Thr
tcc Ser
3CC
Thr
cgt Arg
stc lie
ggt Gly
gtt Val
tcc Ser
ctg Leu
cag Gin
get Ala
get Ala
333
Lys
ctg Leu
tcc Ser
Lys
ctg Leu
cag Gin
ttc Phe
sec Thr
stc lie
tgg Trp
get Ala
csg Gin
stc lie
tcc Ser
tcc
Ser
20
gsc
Asp
35
csg
Gin
50
ggt
Gly
65
ttc
Phe
80
gsc
Asp 95
cag Gin
sec Thr
ctg Leu
ccg Pro
tcc Ser
gtt Val
ggt Gly
acc tgc Thr Cys
tgc gss Cys Glu
tcc Asn Gsr
tCC
Ser Asn
tcc gaa Ser Glu
tcc 3CC Ser Thr
see ctg Thr Leu
t3C
Tyr
Asn 10
tcc Ser
cgt acc aac Arg
gtt Val
ttc Phe
ctg Leu
Lys
Lys
Thr 25 stc lie 4〇 3tc lie 55 get Ala 70
3tC
lie
85
tsc
Tyr 100
Asn
Glu
gaa Glu
get Ala
Asn
Glu
get Ala
ggt Gly
Asn
3CC
Thr
Glu
ctg Leu
lie
ggt Gly
gtt Val
tgc Cys
tgc Cys
gac Asp
Gin
tsc Tyr
gsc Asp
cgt Arg
Lys
gac Asp
ggt 4 5
Gly
15
9〇
Asn
30
ggt 135
Gly
45
180
Asn
60
acc 225 Thr 75
esc 270
His
90
tsa 306<210〉 2 <211〉 570 <212> DMA <213>豬工FN-a <221> CDS <222> (1)...(570) <4〇0> 2
atg Met 1
tgc Cys
sgc Ser
aga Arg
tec Ser
gec Ala
ttc Phe
C3C
His
gec Ala
sst Asn
ctg Leu
stc lie
cct Pro
atg Met
age Ser
cag Gin
CC3 tC3
Pro Thr Ser 5
gec ate tgc Ala工le Cys 2〇
get Ala
tct Ser
est His
get Ala
Thr
ttc Phe
C3C 3CC
His
Pro
gag Glu
ctg Leu
gsg Glu
tgc Cys
gec tgt gtc 3tg
Thr
35
ttc
Phe
50
get
Ala
65
gtg
Val
8〇
ggc
Gly
95
set
Thr
11〇
cag
gec Ala
tct Ser
sgg Arg
tec Ser
ttt Phe
cat His
teg Ser
gga Gly
ttc Phe
ctg Leu
gec Ala
tgc Cys
ggg
Gly
g3g Glu
get Ala
ctg Leu
etc Leu
ggc Gly
ctg Leu
ctg Leu
ggc
Gly
atg Met
get Ala
gat Asp
acg Thr
tgt
Cys Arg Asp
gec Ala 10 gsc Asp 25 etc Leu 4 0
C3C
His 55
gsg gcg ggg
Gin 70 csg Gin 85 tgg Trp 1〇0 csg Gin 115 ctg gs3
Asn
etc Leu
gec Ala
csg Gin
ctg Leu
ctg Leu
ctg Leu
sgs Arg
gtc Val
cag Gin
Asn
etc Leu
gtg Val
cct Pro
gca Ala
sgg
Arg
csg Gin
sec Thr
gsg
Glu Arg
Ct3
Leu
ca^g Gin
Gin
Asp
aag Lys
ttc Phe
3gc Ser
gsc Asp
etc Leu
3CC
Thr
stg Met
ttt Phe
get Ala
cag Gin
etc Leu
ctg Leu
135
180
age 4 5
Ser
15
esc 90 His 30 agg Arg 45 ggs Gly 60
caa 225
Gin
75
etc 27 0
!Leu
90
ctg 315
Leu
105
gaa 360
Glu 120
ggg acc ccc ctg ctg 4 05Ala Cys Val Met Gin Glu Ala Gly Leu 125
gag gsg gsc tec stc ctg get gtg agg Glu Glu Asp Ser lie Leu Ala Val Arg 140
3CC
Thr
工le
ctg Leu
etc Leu
gtc Val
Gin
Tyr Arg Asp
ctg Leu
gca Ala
Arg
Gin
155
g33
Glu
17〇
etc
Leu 185
gag Glu
gtc Val
sgg Arg
Lys
atg Met
Lys
age Ser
Lys
Tyr
tec Ser
Glu
Glu Gly Thr Pro Leu 130
333 t3C
Lys 145 age Ser 160 ttc Phe 175 tga
Tyr
Pro
tct Ser
57 0
ttc Phe
tgt Cys
tec Ser
His
gec Ala
tec Ser
Arg
tgg
Trp Arg
450
Leu 135 etc Leu 150 gag Glu 165
sac 540
Asn
180
495
<210> 3 <211〉 534 <212> DNA <213>牛工FN-a <221> CDS <222〉 (1)".(534) <40〇〉3
atg gec Met Ala
gec Asn Ala
gec 3sc Ala Asn
cct tec Pro Ser 50
Pro
3tC
工le
sgg Arg 35
tec
Ser
gec Ala
tgc Cys 20
agg Arg
tgc Cys
tgg
Trp 5
tct Ser
gtc Val
ctg Leu
tec Ser
ctg Leu
ctg Leu
csg Gin
ttc Phe
ggt
Gly
atg Met
gac Asp 55
ctg Leu
tgc Cys
etc Leu 40
Arg
Leu
His 25
ctg Leu
Asn
tec Ser 10
ctg Leu
Gin Asp
ctg ttg Leu Leu
cct Pro
Gin
ttc Phe
C3C
His
ctg Leu
Glu 60
ctg Leu
Thr
ags Arg 45
ttc
Phe
etc Leu
age Ser 15
esc sgc His Ser 30
agg gtc
Arg Val
etc csg Leu Gin
tgc 48 Cys
ctg 96 Leu
tec 144 Ser
gag 192 Gluget Ala 65
C3C
His
ctg Leu
Lys 145
ctg Leu
Glu
ccc gec Pro Ala
gst cag Asp Gin
cga Arg 130
tsc Tyr
cct tgt Pro Cys
tec Ser
Ser
ggt ggc Gly Gly
gtg acc Val Thr
acg tgg Thr Trp 100
csg etc Gin Leu 115
ggg get Gly Ala
ttc C3C
Phe His
gec tgg Ala Trp
Thr Asn 180
age Ser
cag Gin 85
gsc Asp
set Thr
ccc Pro
aga Arg
cag Gin 70
C3C
His
Lys
gsc Asp
ctg lieu
etc Leu 150
gag gtt Glu Val 165
ttg csg Leu Gin
ttg csg Leu Gin
sec ttc Thr Phe
age etc Ser !Leu
ctg csa Leu Gin 120
etc aag lieu Lys 135
set etc Thr Leu
gtc ags Val Arg
gag agt Glu Ser
33g Lys
csg Gin
ctg Leu 105
gec Ala
gsg Glu
tst Tyr
gca Ala
ttc
Phe 185
get Ala
etc Leu 90
gsc Asp
tgt Cys
gsc Asp
ctg Leu
g33 Glu 170
agg Arg
Gin
75
ttc Phe
33g Lys
ctg Leu
tec Ser
Gin 155
gtc Val
gec Ala
sgc Ser
eta Leu
acg Thr
age Ser 140
gag Glu
atg Met
3tC
工le
Thr
cgc Arg
c3g Gin 125
ctg Leu
asg Lys
aga Arg
tct Ser
gag Glu
get Ala 110
gsg Glu
get Ala
sgs Arg
gec Ala
gtg Val
ggc Gly 95
gcg Ala
etc 240
Leu
80
teg 288 Ser
ctg 336 ;Leii
sga aag gac tga Arg Lys Asp *
gag ggg 38 4 Glu Gly
gtg agg 432 Val Arg
cac age 480 His Ser 160
ttc tct 528 Phe Ser 175
570
<210> 4 <211> 546 <212> DNA <213>雞IFN-oc <221> CDS <222> (1)...(546) <400> 4
atg get gtg cct ges age ccs cag esc cca egg ggg tsc ggc 3tc ctg 48 Met Ala Val Pro Ala Ser Pro Gin His Pro Arg Gly Tyr Gly工le Leu 15 10 15ctg etc acg etc ctt ctg aaa get etc gec acc acc gec tec gec tgc 96
Leu Leu Thr Leu Leu !Leu Lys Ala Leu Ala Thr Thr Ala Ser Ala Cys
2〇 25 30
a_a_c catc ctt cgc tec ca_g gst gec sec ttc tct cac gsc sgc etc csg 14 4
Asn His Leu Arg Ser Gin Asp Ala Thr Phe Ser His Asp Ser Leu Gin
35 40 45
etc etc egg gac 3tg get ccc acs cts ccc cag ctg tgc ccs cag cac 192
Leu Leu Arg Asp Met Ala Pro Thr Leu Pro Gin Leu Cys Pro Gin His
50 55 60
sac gcg tct tgc tec ttc 33c gsc acc ate ctg gac acc age 33c acc 24 0
Asn Ala Ser Cys Ser Phe Asn Asp Thr工le Leu Asp Thr Ser Asn Thr
65 70 75 80
egg C3a gec gac asa sec sec esc gsc stc ctt csg cac etc ttc 33a 288
Arg Gin Ala Asp Lys Thr Thr His Asp工le Leu Gin His Leu Phe Lys
85 90 95
ate etc sgc sgc ccc sgc set ccs gec cac tgg 33c gsc age ess cgc 336 工le Leu Ser Ser Pro Ser Thr Pro Ala His Trp Asn Asp Ser Gin Arg
100 105 110
cm age etc etc 3￡ic egg ate esc cgc tsc sec cag esc etc gaig ess 384 Gin Ser Leu Leu Asn Arg工le His Arg Tyr Thr Gin His Leu Glu Gin
115 120 125
tgc ttg gsc sgc age gsc acg cgc tec egg scg cga tgg cct cgc asc 432 Cys Leu Asp Ser Ser Asp Thr Arg Ser Arg Thr Arg Trp Pro Arg Asn
130 135 140
ctt esc etc acc 3tc 33a aa3 cac ttc age tgc etc cac sec ttc etc 480 Leu His Leu Thr 工le Lys Lys His Phe Ser Cys Leu His Thr Phe Leu 145 150 155 160
cas gac 33c gat tac age gec tgc gec tgg gsa esc gtc cgc ctg caa 528 Gin Asp Asn Asp Tyr Ser Ala Cys Ala Trp Glu His Val Arg Leu Gin165 170 175
get cgt gcc tgg ttc ctg cac ate cac aac etc aca ggc aac acg cgc 576 Ala Arg Ala Trp Phe Leu His lie His Asn Leu Thr Gly Asn Thr Arg 180 185 190
act tag 582
Thr *
19權(quán)利要求
1、一種禽畜用抗病毒組合物，其特征在于其是由質(zhì)量比為3∶1的藍(lán)藻抗病毒蛋白和動(dòng)物IFN-α組成。
2、 如權(quán)利要求1所述的禽畜用抗病毒組合物用于制備治療禽畜用病毒病的藥口FI o
3、 如權(quán)利要求2所述的禽畜用抗病毒組合物用于制備治療禽畜用病毒病的口 服藥品，其制備方法為將禽畜用抗病毒組合物與含抗特異性病毒IgY的雞蛋粉以5: 2的質(zhì)量比混合即可。
4、 如權(quán)利要求1所述的禽畜用抗病毒組合物，其特征在于所述的藍(lán)藻抗病毒蛋白按以下方法制得(1) 從藍(lán)藻中提取總RNA，通過RT-PCR擴(kuò)增藍(lán)藻抗病毒蛋白的基因片段，其中 藍(lán)藻抗病毒蛋白的氨基酸序列是SELAAECKTRAQQFVSTKINLDDHIANIDGTLKYE。 藍(lán)藻抗病毒蛋白的核苷酸序列是cttggtaaattctcccagacctgctacaactccgctatccagggttccgttctgacctccacctgc gaacgtaccaacggtggttacaacacctcctccatcgacctgaactccgttatcgaaaacgttgac ggttccctgaaatggcagccgtccaacttcatcgaaacctgccgtaacacccagctggctggttcc tccgaactggctgctgaatgcaaaacccgtgctcagcagttcgtttccaccaaaatcaacctggac gaccacatcgctaacatcgacggtaccctgaaatacgaataa(2) 經(jīng)測(cè)序確認(rèn)序列無誤后，把上述核苷酸序列克隆到pET26b(+)載體，在E. coli BL21感受態(tài)細(xì)胞中表達(dá)；(3) 工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)可溶性抗病毒蛋白，用DEAD葡聚糖離子交換層析 純化即可。
5、 如權(quán)利要求1所述的禽畜用抗病毒組合物，其特征在于所述的動(dòng)物IFN-ot 按以下方法制得(1) 從動(dòng)物脾臟中提取總RNA,通過RT-PCR擴(kuò)增動(dòng)物IFN-a的基因片段；(2) 經(jīng)測(cè)序確認(rèn)序列無誤后，把上述核苷酸序列克隆到pIC9K載體，在Pichia pastoris載體中表達(dá)s(3)通過甲醇誘導(dǎo)，培養(yǎng)5天，收集培養(yǎng)液，從上清中經(jīng)DEAE葡聚糖離子 交換層析純化即可。
6、 如權(quán)利要求l所述的禽畜用抗病毒組合物，其特征在于所述的動(dòng)物IFN-a 為豬IFN-oc，它是按以下方法制得(1) 從豬脾臟中提取總RNA，通過RT-PCR擴(kuò)增豬的IFN-a的基因片段，其中，豬IFN-a的的氨基酸序列是GGNQVQKAQAMALVHEMLQQTFQLFSTEGSAAA麗ESLLHQFCTGLDQQL亂EACVMQEAGLEGTPLLEEDSILAVRKYFHRLTLYLQEKSYSPCAWEIVRAEVMRSFSSSRNLQDRLRKKE.豬IFN-oc的核苷酸序列是atggccccaacctcagccttcctcacggccctggtgctactcagctgcaatgccatctgctctctg ggctgtgacctgcctcagacccacagcctggctcacaccagggccctgaggctcctggcacaaatg aggagaatctctcccttctcctgcctggaxxacagaagggactttggatcccctcatgaggctttt gggggcaaccaggtccagaaggctcaagccatggctctggtgcatgagatgctccagcagaccttc cagctcttcagcacagagggctcggctgctgcctggaatgagagcctcctgcaccagttctgcact ggactggatcagcagctcagggacctggaagcctgtgtcatgcaggaggcggggctggaagggacc cccctgctggaggaggactccatcctggctgtgaggaaatacttccacagactcaccctctatctg caagagaagagctacagcccctgtgcctgggagatcgtcagggcagaagtcatgagatccttctct tcctccagaaacctgcaagacagactcaggaagaaggagtga(2) 經(jīng)測(cè)序確認(rèn)序列無誤后，把上述核苷酸序列克隆到pIC9K載體，在 Pichia pastoris載體中表達(dá)；(3) 通過甲醇誘導(dǎo)，培養(yǎng)5天，收集培養(yǎng)液，從上清中經(jīng)DEAE葡聚糖離子 交換層析純化即可。
7、 如權(quán)利要求1所述的禽畜用抗病毒組合物，其特征在于所述的動(dòng)物IFN-oc 為牛IFN-oc，它是按以下方法制得(l)從牛脾臟中提取總RNA，通過RT-PCR擴(kuò)增牛的IFN-oc的基因片段，其中，牛IFN-a的的氨基酸序列是GGSQLQKAQAISVLHEVTQHTFQLFSTEGSPATWDKSLLDKLRAALDQQLTDLQACLTQEEGLRGAPLLKEDSSLAVRKYF亂TLYLQEKRHSPCAWEVV廳VMRAFSSSTNLQESFRRKD.牛IFN-a的核苷酸序列是atggccccagcctggtccttcctgctatccctgttgctgctcagctgcaacgccatctgctctctg ggttgccacctgcctcacacccacagcctggccaacaggagggtcctgatgctcctgcaacaactg agaagggtctccccttcctcctgcctgcaggacagaaatgacttcgaattcctccaggaggctctg ggtggcagccagttgcagaaggctcaagccatctctgtgctccacgaggtgacccagcacaccttc cagctcttcagcacagagggctcgcccgccacgtgggacaagagcctcctggacaagctacgcgct gcgctggatcagcagctcactgacctgcaagcctgtctgacgcaggaggaggggctgcgaggggct cccctgctcaaggaggactccagcctggctgtgaggaaatacttccacagactcactctctatctg caagagaagagacacagcccttgtgcctgggaggttgtcagagcagaagtcatgagagccttctct tcctcaa_caaacttgcagg￡igagtttc￡iggaga￡ia_ggactga(2) 經(jīng)測(cè)序確認(rèn)序列無誤后，把上述核苷酸序列克隆到pIC9K載體，在 Pichia pastoris載體中表達(dá)；(3) 通過甲醇誘導(dǎo)，培養(yǎng)5天，收集培養(yǎng)液，從上清中經(jīng)DEAE葡聚糖離子 交換層析純化即可。
8、如權(quán)利要求1所述的禽畜用抗病毒組合物，其特征在于所述的動(dòng)物IFN-a 為雞IFN-a，它是按以下方法制得(l)從雞脾臟中提取總RNA，通過RT-PCR擴(kuò)增雞的IFN-ot的基因片段，其中，雞IFN-a的的氨基酸序列是SCSFNDTILDTSNTRQADKTTHDILQHLFKILSSPSTPAHWNDSQRQSLLNRIHRYTQHLEQCLDS SDTRSRTRWPRNLHLTIKKHFSCLHTFLQDNDYSACAWEHVRLQARAWFLHIHNLTGNTRT 雞IFN-a的核苷酸序列是atggctgtgcctgcaagcccacagcacccacgggggtacggcatcctgctgctcacgctccttctg aaagctctcgccaccaccgcctccgcctgcaaccaccttcgctcccaggatgccaccttctctcac gacagcctccagctcctccgggacatggctcccacactaccccagctgtgcccacagcacaacgcg tcttgctccttcaacgacaccatcctggacaccagcaacacccggcaagccgacaaaaccacccac gacatccttcagcacctcttcaaaatcctcagcagccccagcactccagcccactggaacgacagc caacgccaaagcctcctcaaccggatccaccgctacacccagcacctcgagcaatgcttggacagc agcgacacgcgctcccggacgcgatggcctcgcaaccttcacctcaccatcaaaaaacacttcagc tgcctccacaccttcctccaagacaacgattacagcgcctgcgcctgggaacacgtccgcctgcaa gctcgtgcctggttcctgcacatccacaacctcacaggcaacacgcgcacttag(2) 經(jīng)測(cè)序確認(rèn)序列無誤后，把上述核苷酸序列克隆到pIC9K載體，在 Pichia pastoris載體中表達(dá)5(3) 通過甲醇誘導(dǎo)，培養(yǎng)5天，收集培養(yǎng)液，從上清中經(jīng)DEAE葡聚糖離子 交換層析純化即可。
9、 如權(quán)利要求6所述的禽畜用抗病毒組合物用于制備治療豬病毒病的藥品。
10、 如權(quán)利要求9所述的禽畜用抗病毒組合物用于制備治療豬口蹄疫的藥品。
全文摘要
本發(fā)明所述的一種禽畜用抗病毒組合物涉及一種抗病毒劑，尤其涉及一種用于家禽家畜的抗病毒劑。其是由質(zhì)量比為3∶1的藍(lán)藻抗病毒蛋白和動(dòng)物IFN-α組成。本發(fā)明首次把藍(lán)藻抗病毒蛋白用于治療禽畜類的病毒性感染，首次把用基因重組的方法制備的高效價(jià)、高純度的來自豬、雞、牛等不同種屬的具有抗病毒作用的動(dòng)物IFN-α與有直接抗病毒作用的藍(lán)藻抗病毒蛋白聯(lián)合應(yīng)用；抗病毒蛋白的作用直接快速、IFN-α的抗病毒作用廣泛持久，比單獨(dú)使用抗病毒蛋白或IFN-α的都要好。
文檔編號(hào)A61K38/21GK101612389SQ200910041418
公開日2009年12月30日 申請(qǐng)日期2009年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月27日
發(fā)明者張明杰 申請(qǐng)人:廣州羅森生物科技有限公司