專利名稱：Xyloketal B在制備治療自由基損傷疾病的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及xyloketal B在醫(yī)療領(lǐng)域中的應(yīng)用，具體涉及xyloketal B在制備治療自由基損 傷疾病的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
xyloketal B是從南海紅樹林真菌X;;/an'G取2508中分離到的代謝產(chǎn)物。Xy/a〃'a平2508 的代謝產(chǎn)物包括xyloketal A、 B、 C禾PD，其中，xyloketal B的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下
由于已發(fā)現(xiàn)該化合物可以明顯的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制乙酰膽堿酯酶活性，而乙酰膽堿酯酶抑制劑在 早老性癡呆，即阿爾茨海默病(Alzheimer'disease, AD)的治療中具有重要意義，故該化合物 常被用作AD治療藥物以及學(xué)習(xí)記憶功能改善藥物的活性成分。
缺血性腦卒中，造成腦損傷的主要原因是再灌注中產(chǎn)生了負(fù)面的級(jí)聯(lián)瀑布效應(yīng)，其中尤 以自由基的產(chǎn)生最為重要。因此，尋找一種可以直接清除自由基活性的藥物對(duì)治療缺血性腦 卒中和自由基損傷疾病的預(yù)防和治療尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供xyloketal B在制備治療自由基損傷疾病的藥物中的應(yīng)用。 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
發(fā)明人經(jīng)過長(zhǎng)期的研究發(fā)現(xiàn)，xyloketal B的化學(xué)基團(tuán)具有直接清除自由基的活性，并通 過進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)其可以用于制備治療自由基損傷疾病的藥物。
3由于神經(jīng)元缺血缺氧再灌注損傷過程中，造成損傷的主要原因就是再灌注中產(chǎn)生了自由 基，因此，本發(fā)明還將xyloketalB應(yīng)用于制備治療神經(jīng)元缺血缺氧再灌注損傷的藥品中。 其中，可以將xyloketalB制備成藥物領(lǐng)域可以接受的各種劑型，如片劑、膠囊等等。 與現(xiàn)有的xyloketal B的應(yīng)用相比，本發(fā)明具有如下有益效果(1) 本發(fā)明的化合物xyloketal B在治療自由基損傷疾病中療效顯著，尤其適合于治療神 經(jīng)元缺血缺氧再灌注損傷。(2) 本發(fā)明的化合物xyloketal B安全無(wú)毒，藥理作用強(qiáng)，預(yù)示著很好的藥用前景。
具體實(shí)施方式
下面將描述本發(fā)明的幾個(gè)實(shí)施例，但本發(fā)明內(nèi)容并不局限于此。 實(shí)施例1xyloketal B對(duì)PC12氧氣葡萄糖剝奪-再灌注損傷的影響(一)材料與方法1. 藥物xyloketal B，白色粉末。溶于DMSO，貯存濃度80mmol/L，保存于4"C備用。2. 細(xì)胞培養(yǎng)及模型制備采用PC12(大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞)作為體外研究神經(jīng)元的細(xì)胞體系，851/。 1640 (GIBCO， 8108029)+10%馬血清(GIBCO， 720129)+5%胎牛血清(MOREGATE， 27825123) 于37"C 5%(302培養(yǎng)箱孵育，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%-80%可于實(shí)驗(yàn)。使用離體氧氣葡萄糖剝奪-再灌注模型模擬在體缺血缺氧-再灌注模型把生長(zhǎng)狀態(tài)良好 的PC12接種于96孔板，待其生長(zhǎng)至70%-80%時(shí)將其正常培養(yǎng)基換成缺氧液(2mM CaCl2 0.221g， 3mMKCl 0.224g， 156mMNaCl 9.116g， 1.25mMKH2P04 0.17g， 10mMHEPES 2.383g， 2mMMgSO4 0.492g加入去離子水達(dá)到1L容量，過濾后使用)，再將其置于一個(gè)2L容器中， 向內(nèi)通入95%N2+5% C02混合氣體30分鐘，隨后將容器密閉并放入37°C ， 5%C02培養(yǎng)箱中 4-6小時(shí)，以使細(xì)胞損傷達(dá)40%左右為準(zhǔn)。缺氧后把裝有細(xì)胞的96孔板從密閉容器中取出并 換入各自的正常培養(yǎng)基，恢復(fù)氧氣和葡萄糖供應(yīng)24小時(shí)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的檢測(cè)。3、 細(xì)胞活性檢測(cè)——MTT法將PC12和SVAREC分別接種于96孔板，每組使用6個(gè)復(fù)孔，待處理完成后各孔加入 180pL 1640+20pL MTT (噻唑藍(lán))，在37。C溫箱中避光孵育4小時(shí)后吸出MTT，加入lOO)iL DMSO溶解結(jié)晶，搖床混勻15分鐘，于熒光/化學(xué)發(fā)光分析儀(BIO-TEK)以540nm波長(zhǎng)檢 測(cè)各組分光度，將各組分光度與空白對(duì)照組相比較，從而計(jì)算各組細(xì)胞的存活比例。4、 統(tǒng)計(jì)分析本實(shí)驗(yàn)為多組定量數(shù)據(jù)間兩兩比較，且符合正態(tài)性及方差齊性的要求，因此選 用方差分析(One-way ANOVA)作為統(tǒng)計(jì)分析的方法。使用SPSS軟件執(zhí)行統(tǒng)計(jì)分析操作。剝奪-再灌注損傷的保護(hù)作用如表1 。 表1不同劑量Xyloketal B處理對(duì)PC12氧氣葡萄糖剝奪-再灌注損傷程度的影響序號(hào) 組別 樣品數(shù)(？L)分光光度值 比例(％)1空白對(duì)照組61.4212 ± 0.1254100.002缺氧組60.8728 ± 0.0934 *61.413xyloketal B 12.5 +缺氧組60.8213 ± 0.133757.794xyloketal B 25 +缺氧組60.9445 ± 0.060666.46xyloketal B 50 +缺氧組60.9948 ± 0.0615**70.006xyloketal B 100 +缺氧組61.1213 ± 0.0431 **78.907xyloketal B 200 +缺氧組61.2738 ± 0.0969 **89.63*經(jīng)單因素方差分析得到缺氧組與空白對(duì)照組的細(xì)胞活性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P < 0.05);**經(jīng)單因素方差分析得到xyloketal B 50)iM/100nM/20(VM處理組與缺氧組的細(xì)胞活性具有 統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P < 0.05)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明PC12細(xì)胞氧氣葡萄糖剝奪-再灌注模型構(gòu)建成功，損傷比例約為40%; 同時(shí)，xyloketal B具有減輕PC12缺氧再灌注損傷的作用，且呈現(xiàn)劑量依賴(25-200 pM)效應(yīng)。 實(shí)施例2 xyloketal B抗氧化活性的研究(一)材料與方法1. 藥物Xyloketal B，白色粉末。溶于DMSO，貯存濃度80mmol/L，保存于4。C備用。2. 細(xì)胞培養(yǎng)及模型制備采用PC12 (大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞)作為體外研究神經(jīng)元的細(xì)胞體系，培養(yǎng)方 法同前。使用過氧化氫(H202)損傷模型把生長(zhǎng)狀態(tài)良好的PC12接種于96孔板，待其生長(zhǎng) 至70。/。-80。/。時(shí)將其正常培養(yǎng)基換成100pM的H2O2培養(yǎng)基(100 1640中加入1 pL 10mM的H202溶液)l小時(shí)，隨后可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的檢測(cè)。3. 細(xì)胞活性檢測(cè)——MTT法同前所述。4. 丁苯酞還原活性檢測(cè)——DPPH法使用DPPH (1,1-二苯基-2-苦基偕腙肼)作為檢測(cè)丁苯酞是否具有直接清除自由基作用的 試劑。將80pM的DPPH溶于0.2ml乙醇配成DPPH溶液，將0.2ml的DPPH溶液加入0.6ml 樣品中(Asample)，并以0.2ml的DPPH溶液加入0.6ml乙醇中作為對(duì)照(Ac。ntroI)，避光于室 溫孵育30分鐘,在熒光/化學(xué)發(fā)光分析儀(BIO-TEK)以517nm波長(zhǎng)檢測(cè)各組分光度，以(l-Awn^e/Ac。^。OX100作為公式計(jì)算出脫色度(％)，與溶劑對(duì)照組進(jìn)行比較，從而反映該藥 物清除自由基的能力。5.統(tǒng)計(jì)分析本實(shí)驗(yàn)為多組定量數(shù)據(jù)間兩兩比較，且符合正態(tài)性及方差齊性的要求，因此選 用方差分析(One-wayANOVA)作為統(tǒng)計(jì)分析的方法。使用SPSS軟件執(zhí)行統(tǒng)計(jì)分析操作。 (二)實(shí)驗(yàn)結(jié)果1. Xyloketal B 100 處理對(duì)PC12過氧化損傷的保護(hù)作用如表2。表2 Xyloketal B100 處理對(duì)PC12過氧化損傷程度的影響 序號(hào) 組別 樣品數(shù)(？L) 分光光度值 比例(％)1 空白對(duì)照組 6 0.03885±0.0198 100.002 xyloketal B組 6 0.3640±0.0272 93.693 過氧化氫組 6 0.1490±0.0168* 38.354 xyloketal B +過氧化氧組 6 0.2420 ± 0.0064* * 62.29*經(jīng)單因素方差分析得到過氧化氫組與空白對(duì)照組的細(xì)胞活性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P < 0.05);**經(jīng)單因素方差分析得到xyloketal B 100 pM處理組與過氧化氫組的細(xì)胞活性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差 異CP < 0.05)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明PC12過氧化損傷模型構(gòu)建成功，xyloketal B 100 nM具有顯著減輕PC12過氧 化損傷的作用。2. Xyloketal B直接清除自由基的活性研究如表3。表3不同劑量Xyloketal B清除自由基活性的能力序號(hào)組別樣品數(shù)(孔)分光光度值脫色度(％)1空白對(duì)照組60.1463 ± 0.00200.002溶劑對(duì)照組60.1505 ± 0.00100.003xyloketal B 12.560.1432 ± 0.0015*2.124xyloketal B 25岸60.1307 ± 0.0022 *10.66xyloketal B 50 |xM60.1190 ± 0.0009 *18.666xyloketal B 100岸60.1027 ± 0.0008 *29.807xyloketal B 200 一60.0835 ± 0.0005 *42.938xyloketal B 400 ,60.0670 ± 0.0006 *54.209xyloketal B 800 |iM60.0565 ± 0.0005 *61.38*經(jīng)單因素方差分析得到各個(gè)劑量的xyloketal B與溶劑對(duì)照組的分光光度值均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差6異(P < 0.05)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明xyloketal B具有直接清除自由基的活性，且呈現(xiàn)劑量依賴(12.5-800 )iM)效應(yīng)。
權(quán)利要求
1.xyloketal B在制備治療自由基損傷疾病的藥物中的應(yīng)用。
2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述自由基損傷疾病為神經(jīng)元缺血缺氧再灌注損傷。
全文摘要
本發(fā)明公開了xyloketal B在制備自由基損傷疾病的藥物中的應(yīng)用。該化合物可以直接清除自由基的活性，可顯著減輕自由基過氧化損傷，對(duì)神經(jīng)元的缺血缺氧損傷具有明顯的保護(hù)作用。本發(fā)明xyloketal B在制備自由基損傷疾病的藥物中的應(yīng)用發(fā)掘了xyloketal B新的醫(yī)療用途，開拓了一個(gè)新的應(yīng)用領(lǐng)域，且xyloketal B安全無(wú)毒，藥理作用強(qiáng)，有很好的藥用前景。
文檔編號(hào)A61K31/352GK101647795SQ20091004220
公開日2010年2月17日 申請(qǐng)日期2009年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月27日
發(fā)明者捷 劉, 龐冀燕, 玲 李, 李振興, 林永成, 王冠蕾, 中 裴, 許忠良, 嘉 趙, 艷 錢, 陳文亮, 黃如訓(xùn) 申請(qǐng)人:中山大學(xué)