專利名稱：衣霉素在制備腫瘤細胞逆轉(zhuǎn)藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是一種利用衣霉素在制備腫瘤細胞逆轉(zhuǎn)藥物中應(yīng)用的技術(shù)。
背景技術(shù)：
眾所周知，百余年來，腫瘤的治療一直采用手術(shù)、放射及化學藥物治療，特別是對血液腫瘤包括骨髓瘤均采用敵我不分的聯(lián)合化療，其著眼點在于殺
傷腫瘤細胞。1986年我國科學家在國際上首先應(yīng)用全反式維甲酸誘導分化治療急性早幼粒細胞白血病獲得顯著效果，開創(chuàng)了誘導分化治療腫瘤的新紀元。誘導分化治療的提出，打破了 "一旦成了癌細胞，便永遠是癌細胞"觀點。目前，惡性腫瘤的誘導分化治療已成為腫瘤生物學和腫瘤治療學的研究熱點和前沿領(lǐng)域，其作為惡性腫瘤的一種新型治療方法日益引起醫(yī)學工作者的關(guān)注和興趣。相比在急性早幼粒細胞白血病取得的顯著成果而言，在誘導分化治療多發(fā)性骨髓瘤及其他腫瘤的基礎(chǔ)研究領(lǐng)域十分薄弱，臨床研究尚處于空白。
衣霉素(tunicamycin)為方夂線菌Str印tomyces lysosuperf icus產(chǎn)生的核苷酸抗生素?？梢种凭哂斜荒?envelope,含糖蛋白)的病毒的繁殖。作用機理是抑制合成糖蛋白糖鏈必需的擬脂(多萜醇，dolichol)中間產(chǎn)物的生成。又因為它可抑制在合成細菌細胞壁的肽聚糖或胞壁酸中必需的擬脂(細菌萜醇，多聚萜醇)中間產(chǎn)物的形成，所以顯示對革蘭氏陽性菌的抗菌性。最近，利用這種抑制擬脂中間產(chǎn)物形成的作用，來探索糖類復合物的活體合成及其功能。衣霉素可以抑制高爾基體中n-乙酰葡糖胺酶功能，進而抑制蛋白質(zhì)的糖基化，而誘導未折疊蛋白反應(yīng)。衣霉素濃度在2"g/ml左右，經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)其可以殺死胃癌、前列腺癌、乳腺癌細胞。(參見文獻Calnexin-d印endent regulation of tunicamycin induced印optosis inbreast carcinoma MCF-7 cells, Delom F, Emadali A， Cocolakis E et alCell Death and Differentiation, 2007; 14:586-96; Tunicamycin EnhancesTumor Necrosis Factor - Related Apoptosis-Inducing Ligand -InducedApoptosis in Human Prostate Cancer Cells, Shiraishi T， Yoshida T,Nakata S et al Cancer Res. 2005;65:6364-70;衣霉素增強胃腺癌細胞對TRA工L誘導凋亡的敏感性，程文晉；吳萍；陳思等，安徽醫(yī)科大學學2008; 43:119-123)
誘導分化治療腫瘤不同于傳統(tǒng)的細胞毒療法，不會因為"剿滅"腫瘤細胞而殃及正常細胞。不會對正常細胞尤其是處于增殖狀態(tài)的細胞，如正常骨髓、消化道、上皮組織等產(chǎn)生殺傷效應(yīng)而導致諸如骨髓抑制、消化道反應(yīng)、脫發(fā)、肝腎損害等嚴重的不良反應(yīng)。因此制備腫瘤細胞逆轉(zhuǎn)藥物具有廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供衣霉素的新的用途，即其在制備腫瘤細胞逆轉(zhuǎn)藥物中的應(yīng)用。
通過實驗研究，在采用衣霉素低劑量的濃度條件下，通過適度修飾未折疊蛋白反應(yīng)，可以誘導腫瘤細胞分化，使腫瘤細胞逆轉(zhuǎn)成為正常細胞，因此用衣霉素來制備腫瘤細胞逆轉(zhuǎn)藥物的技術(shù)可望在將來用于腫瘤的治療方面。
本發(fā)明提供了衣霉素在制備腫瘤細胞逆轉(zhuǎn)藥物中的應(yīng)用。所采用的衣霉素是美國sigma公司合成的實驗試劑。通過體外實驗證明用低劑量的衣霉素，對惡性腫瘤細胞具有誘導分化的作用，惡性腫瘤細胞可逆轉(zhuǎn)為正常細胞，因而可用于制備腫瘤細胞逆轉(zhuǎn)藥物中的應(yīng)用，復蘇實驗相關(guān)用的細胞株RPMI-8226骨髓瘤細胞系，U266骨髓瘤細胞系等。
本發(fā)明在實驗時設(shè)置一系列的濃度梯度，發(fā)現(xiàn)衣霉素濃度超過0.75ixg/ml時表現(xiàn)為誘導凋亡的作用。因此本發(fā)明所采用的低劑量衣霉素濃度在(U-0.5yg/ml，較佳的為0.25 y g/ml、 0.5ug/m，用上述濃度的衣霉素處理骨髓瘤細胞系后，骨髓瘤細胞株形態(tài)上發(fā)生分化，表現(xiàn)為細胞向成熟漿細胞形態(tài)轉(zhuǎn)變，細胞分化抗原CD49e表過上調(diào)，分泌的免疫球蛋白輕鏈也增多。
本發(fā)明的優(yōu)點在于，衣霉素的藥物用量低，效果確切，用衣霉素制備腫瘤細胞逆轉(zhuǎn)藥物，不會因為"剿滅"腫瘤細胞而殃及正常細胞，因此對正常細胞的影響小，有利于改善腫瘤患者的生活狀態(tài)。


圖1為U266骨髓瘤細胞用衣霉素處理后形態(tài)變化顯微鏡下圖(400X )
其中A: U266骨髓瘤細胞對照；B: U266骨髓瘤細胞0. 25 u g/ml衣霉素
處理72小時；C: U266骨髓瘤細胞0. 5 y g/ml衣霉素處理72小時
圖2為RPMI-8226骨髓瘤細胞用衣霉素處理后形態(tài)變化顯微鏡下圖(400X ) 其中A: RPMI-8226骨髓瘤細胞對照；B: RPMI-8226骨髓瘤細胞0.5 y
g/ml衣霉素處理48小時；C:RPMI-8226骨髓瘤細胞0. 5ug/ml衣霉素處理72
小時
圖3為U266骨髓瘤細胞經(jīng)過衣霉素處理后表面分化標記CD49e的表達情況圖 圖4為RPMI-8226骨髓瘤細胞經(jīng)過衣霉素處理后表面分化標記CD49e的表達 情況圖
圖5為EUsa法檢測U266骨髓瘤細胞經(jīng)過衣霉素處理后上清液中X輕鏈含量 變化圖
圖6為Elisa法檢測RPM工-8226骨髓瘤細胞經(jīng)過衣霉素處理后上清液中A輕鏈 含量變化圖
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明進行詳細描述。 實施例l: U266骨髓瘤細胞用衣霉素處理
試劑的種類和來源衣霉素購自美國Sigma公司，貸號T7765，用DMSO 配成5mg/mL母液保存4'C備用，使用時用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng) 液稀釋至所需的濃度(O. 25 y g/ml或0. 5 y g/ml)，其中DMSO的含量低于0. 1%， 在這種濃度條件下DMSO對細胞的作用可以忽略(參見文獻Hou J， Xiong H, Gao W， Jiang H. 2-Methoxyestradiol at low dose induces differentiation of myeloma cells. Leuk Res. 2005:29:1059-1067，在這個低濃度條件下， DMSO對細胞的影響是可以忽略不計的)。檢測上清液中入鏈含量的ElisaKit 為美國Bethy公司生產(chǎn)，貸號E80-116,按說明書操作。美國Southern biotech 的CD49e流式襝測抗體，貸號96-4509。
細胞和培養(yǎng)方法骨髓瘤細胞系U266購自中科院，按細胞培養(yǎng)的操作步 驟(參考《體外培養(yǎng)的原理與技術(shù)》薛慶善主編2001版)，將凍存的細胞 復蘇后，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，溫度37t:，含0)2濃度5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
實驗的方法取增殖期的細胞做實驗，接種細胞密度為ixioVl，衣霉素 濃度設(shè)置為0、 0.25pg/ml、 0.5pg/ml，分別培養(yǎng)48h、 72h后，離心搜集上清 液，用EUsa試劑盒測上清鏈的含量，然后取部分細胞涂片，瑞氏染色后，觀 察形態(tài)變化； 一部分細胞進行CD49e標記后上流式細胞儀檢測CD49e的表達
情況o
結(jié)果與對照細胞相比，用低劑量衣霉素處理骨髓瘤細胞系后，骨髓瘤細 胞株形態(tài)上發(fā)生分化，表現(xiàn)為向成熟漿細胞形態(tài)轉(zhuǎn)變，胞核縮小，出現(xiàn)偏心 位，核漿比縮小，胞漿中出現(xiàn)空泡，(見圖1);顯示細胞分化的表面標志 分化抗原CD49e表過上調(diào)(見圖3)，分泌的免疫球蛋白人輕鏈也增多，且
呈現(xiàn)時間和藥物劑量相關(guān)的關(guān)系。隨著時間的延長，和處理藥物衣霉素濃度
的增高，分泌的輕鏈的量也相應(yīng)的增加(見圖5) 實施例2: RPMI-8226骨髓瘤細胞用衣霉素處理
試劑的種類和來源同實施例l。
細胞和培養(yǎng)方法骨髓瘤細胞系RPMI」8226購自中科院，其余同實施例1。
實驗的方法取增殖期的細胞做實驗，接種細胞密度為ixio'Vl，衣霉素
濃度設(shè)置為0、 0.25嗎/ml、 0.5叱/ml，分別培養(yǎng)48h、 72h后，離心搜集上清 液，用Eisa試劑盒測上清鏈的含量，然后取部分細胞涂片，瑞氏染色后，觀 察形態(tài)變化； 一部分細胞進行CD49e標記后上流式細胞儀檢測CD49e的表達 情況。
結(jié)果與對照細胞相比，用低劑量衣霉素處理骨髓瘤細胞系后，骨髓瘤細 胞株形態(tài)上發(fā)生分化，表現(xiàn)為向成熟漿細胞形態(tài)轉(zhuǎn)變，胞核縮小，出現(xiàn)偏心
位，核漿比縮小，胞漿中出現(xiàn)空泡(見圖2);顯示細胞分化的表面標志分
化抗原CD49e表過上調(diào)，(見圖4);分泌的免疫球蛋白A輕鏈也增多，且呈 現(xiàn)時間和藥物劑量相關(guān)的關(guān)系，呈現(xiàn)時間和藥物劑量相關(guān)的關(guān)系。隨著時間 的延長，和處理藥物衣霉素濃度的增高，分泌的輕鏈的量也相應(yīng)的增加(見 圖6)
權(quán)利要求
1、衣霉素在制備腫瘤細胞逆轉(zhuǎn)藥物中的應(yīng)用，其中的衣霉素濃度為0.1至0.5μg/ml。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的衣霉素在制備腫瘤細胞逆轉(zhuǎn)藥物中的應(yīng)用，其中的衣霉素濃度為0.25iig/ml。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的衣霉素在制備腫瘤細胞逆轉(zhuǎn)藥物中的應(yīng)用，其中的衣霉素濃度為0.5ixg/ml。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的衣霉素在制備腫瘤細胞逆轉(zhuǎn)藥物中的應(yīng)用，其中的腫瘤細胞為骨髓瘤細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。腫瘤的治療一直采用手術(shù)、放射及化學藥物治療，惡性腫瘤的誘導分化治療目前成為腫瘤生物學和腫瘤治療學的研究熱點和前沿領(lǐng)域。本發(fā)明的目的在于提供衣霉素的新的用途，即其在制備腫瘤細胞逆轉(zhuǎn)藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所采用的低劑量衣霉素濃度在0.1-0.5μg/ml，處理骨髓瘤細胞系后，骨髓瘤細胞株形態(tài)上發(fā)生分化，表現(xiàn)為細胞向成熟漿細胞形態(tài)轉(zhuǎn)變，細胞分化抗原CD49e表過上調(diào)，分泌的免疫球蛋白輕鏈也增多。本發(fā)明的優(yōu)點在于，衣霉素的藥物用量低，效果確切，對正常細胞的影響小，有利于改善腫瘤患者的生活狀態(tài)。
文檔編號A61P35/00GK101530420SQ20091004487
公開日2009年9月16日 申請日期2009年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月5日
發(fā)明者健 侯, 華 姜, 鄒劍峰 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學