專利名稱：：一種木瓜總酚酸提取物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，是木瓜的總酚酸提取物及其在制備抗炎藥物或食品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：木瓜為常用中藥，具有平肝舒筋、和胃化濕等功效，《中國藥典》2005年版一部收載木瓜為薔薇科植物貼梗海棠"ae/7，e幾sspecial(Sweet)Nakai的干燥近成熟果實，皺皮木瓜是其果實加工而形成的產(chǎn)品。另外還有兩種薔薇科植物也廣泛作木瓜使用光皮木瓜為薔薇科植物棋楂Cw'/7e/7Si's(Thouin)Koehen的果實；木瓜海棠為薔薇科植物毛葉木瓜C.cs^3"/7si5(Hemsl)Schneid的果實。木瓜主產(chǎn)安徽、山東、浙江、湖北、云南、貴州、四川等地，主要含有機酸、三萜類、黃酮類、多糖等成分。據(jù)報道木瓜總苷對大鼠免疫性關(guān)節(jié)炎模型具有較強的防治作用，藥理實驗表明，佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠經(jīng)木瓜總苷(30，60，120mg/kg)灌胃后，明顯降低模型大鼠異常升高的全血漿黏度、紅細胞的聚集性和纖維蛋白原含量；且具有對抗模型大鼠凝血時間縮短的作用(中國中醫(yī)藥信息雜志，2002，12(9):202H，但至今未見有關(guān)從木瓜中提取總酚酸以及木瓜總酚酸提取物用于抗炎方面的報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種木瓜總酚酸提取物及其用于制備抗炎藥物或食品的用途。本發(fā)明木瓜總酚酸提取物的制備方法如下1.制備木瓜提取液按常規(guī)將木瓜果實粉碎后，以30%-80%含水乙醇常溫下浸泡24-48小時，得浸泡液，再于常溫下用30%-80%含水乙醇滲漉提取2-5次，合并浸泡液和滲漉液，即為木瓜提取液；2.純化將上述木瓜提取液濃縮后離心或過濾，棄沉淀，將上清液或濾液用聚苯乙烯多孔性大孔樹脂吸附，以蒸餾水淋洗去除雜質(zhì)，然后再以5%-20%含水乙醇進行洗脫，收集洗脫液，濃縮至無醇味，按同法再用大孔樹脂吸附和洗脫，合并洗脫液并濃縮至無醇味，干燥后即為木瓜總酚酸提取物。經(jīng)成分分析，本發(fā)明木瓜提取物主要成分為原兒茶酸、氯原酸等多種酚酸類化合物，其中含原兒茶酸30-35%，含氯原酸20-25%，酚酸類化合物占木瓜提取物的50-60%，故稱為木瓜總酚酸提取物。本發(fā)明木瓜總酚酸提取物經(jīng)如下動物實驗，說明其具有抗炎活性。1.通過二甲苯所致小鼠耳廓腫脹模型，觀察木瓜總酚酸提取物對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響。木瓜總酚酸提取物低、中、高三個劑量組(按體重給藥劑量分別為100mg/kg，200rag/kg，400mg/kg)與模型對照組比較，均對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹有明顯的抑制作用，且高劑量組的腫脹率低于陽性對照組，表明木瓜總酚酸提取物有顯著的抗炎作用。2.通過冰醋酸誘發(fā)小鼠腹腔毛細血管通透性增加，觀察木瓜總酚酸提取物的抗炎作用。木瓜總酚酸提取物的三個劑量組(同上)與模型對照組比較，均能顯著的抑制腹腔毛細血管通透性增加，且木瓜總酚酸提取物高劑量組抗炎強度與陽性對照組相近，表明木瓜總酚酸提取物通過抑制毛細血管的擴張，降低通透性，使?jié)B出減少以達到抗炎作用3.通過建立大鼠的慢性炎癥模型-棉球肉芽腫，觀察木瓜總酚酸提取物的抗炎作用。木瓜總酚酸提取物的三個劑量組(按體重給藥劑量分別為50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg)與模型對照組比較，均能明顯抑制大鼠棉球肉芽腫增生，表明木瓜總酚酸提取物各劑量組對棉球肉芽腫有明顯的抑制作用，因此有顯著的抗炎效果。4.通過冰醋酸所致小鼠炎癥疼痛模型，觀察木瓜總酚酸提取物對小鼠的鎮(zhèn)痛作用。木瓜總酚酸提取物的三個劑量組(按體重給藥劑量分別為100mg/kg，200mg/kg，400mg/kg)與模型對照組比較，均能顯著降低冰醋酸誘發(fā)的小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)，表明木瓜總酚酸提取物具有較強的鎮(zhèn)痛抗炎作用。本發(fā)明木瓜總酚酸提取物制備方法簡便，具有明顯的抗炎活性，因此可用于制備抗炎藥物或食品。本發(fā)明為尋求新的抗炎藥物提供了一個新途徑。具體實施例方式下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明作進一步描述。實施例1制備木瓜總酚酸的提取物取100kg皺皮木瓜干燥藥材，粉碎后過10目篩，投入提取罐，以70%含水乙醇200L常溫下浸泡24h，收集浸泡液，藥材于常溫下再用70%含水乙醇1500L滲漉提取3次，收集滲漉液，合并浸泡液及滲漉液并濃縮至50L，過濾，將濾液按常規(guī)用聚苯乙烯多孔性大孔樹脂吸附，柱內(nèi)大孔樹脂裝量為200L，以1500L蒸餾水淋洗去除雜質(zhì)，然后再以2000L10。/。含水乙醇進行洗脫，收集洗脫液并濃縮至無醇味，再用同法進行二次大孔樹脂吸附、洗脫，干燥后即得棕褐色粉末狀木瓜總酚酸提取物0.25kg。按生藥投藥量計算，木瓜總酚酸提取物得率為0.25%。成分分析取實施例1制得的木瓜總酚酸提取物2g，用50。％甲醇溶解后上SephadexLH-20凝膠柱，用50%甲醇洗脫，洗脫過程中用薄層層析法監(jiān)測，將收集的相同洗脫液部分合并，經(jīng)ESI-MS、麗R等光譜技術(shù)和化學(xué)方法鑒定，主要為兩個酚酸類單體化合物，即原兒茶酸和氯原酸。再用高效液相色譜法檢測木瓜提取物中原兒茶酸和氯原酸的含量，分別為30-35%、20-25%，酚酸類化合物占木瓜提取物的50-60%以上，因此稱作木瓜總酚酸提取物。原兒茶酸和氯原酸ESI-MS、麗R等光譜技術(shù)和化學(xué)方法檢測數(shù)據(jù)原兒茶酸無色針晶(甲醇)，mp:199201。C.ESI-MSm/z:153[M-H]—。'H-麗R(600MHz，DMSO-cOS:7.326(1H，d，/:DHz，H-2)，7.27(1H'dd，/二&《2.0Hz，H-6)，6.763(1H，d，/二《.ZHz，H-5).13C-NMR(150MHz，DMSO-d)S:167.29(CO)，149.99(C-4)，144.87(C-3)，121.89(C-6)，121.67(C-l)，116.56(C-2)，115.15(C-5).以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致，鑒定化合物為原兒茶酸(中國中藥雜志，2005，30(20):1591-1593)。綠原酸白色粉末(Me0H),mp207209。C。ESI-MSm/z:355[M+H]+。'H-麗R(DMS0-d)5:1.790(4H，m,H-2，6)、3.894(1H，H-4)、3.457(1H，d，/二7.8Hz，H-5)、5.161(1H,H—3)、6.213(1H,d,/=16.3Hz,a-H)、6.744(1H，d，/二7.8Hz，H-5，)、6.956(1H，d，7.8Hz，H-6，)、7.055(1H，H-2，)、7.433(1H，d，/二16.3Hz,H)。'3C—麗R(DMS0-o9:75.23(C—1)、39.51(C—2)、71.59(C—3)、73.29(C-4)、71.42(C—5)、38.01(C-6)、114.53(C-a)、144.63(C-化125.43(C-1')、U5.80(C-2')、145.75(C-3')、148.57(C-4')、114.68(C-5，)、121.68(C_6，)、176.52(C-7)、166.32(08)。MS、1H-醒R和13C-麗R譜數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致，故該化合物被鑒定為綠原酸(中藥化學(xué)對照品工作手冊，1999.154-155)。6木瓜總酚酸提取物抗炎動物實驗(一)木瓜總酚酸提取物對耳殼炎癥小鼠的治療通過給小鼠灌胃給予不同劑量的木瓜總酚酸提取物，觀察其對耳殼炎癥的改善和治療作用。材料1)木瓜總酚酸提取物木瓜總酚酸提取物由實施例l制備，用0.8%羧甲基纖維素鈉配成所需濃度的木瓜總酚酸提取物溶液。2)二甲苯廣東光華化學(xué)廠有限公司批號20060908。3)阿司匹林SIGMA公司批號88H4012實驗動物昆明種小鼠南方醫(yī)科大學(xué)動物中心(清潔級，合格證號2006A042)實驗方法昆明種小鼠50只，體重18土2g，雌雄各半，隨機分成5組，即模型對照組、陽性對照組、木瓜總酚酸提取物低、中、高劑量組，每組10只小鼠。按小鼠體重，給藥劑量分別為陽性對照組，其推薦臨床平均阿司匹林劑量為15mg/Kg/人/日(人按60Kg體重計算)，轉(zhuǎn)換為小鼠劑量為180mg/kg;木瓜總酚酸提取物組，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，木瓜總酚酸提取物配制成相應(yīng)濃度，每鼠按體重以10ml/kg灌胃，使低、中、高劑量組給藥劑量分別為100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg;模型對照組給予等量生理鹽水。各組按上述給藥劑量連續(xù)灌胃給藥五天，每天一次，第六天給藥后30min，按常規(guī)將0.05ml二甲苯涂于小鼠右側(cè)耳殼，左側(cè)不涂作為對照。致炎30min后處死小鼠，沿耳廓基線剪下雙耳，用直徑6mm的打孔器打下左右耳同一部位的圓片，在分析天平上稱重，以耳廓腫脹率比較藥物的抗炎作用。腫脹率(%)=(右耳重量-左耳重量)/左耳重量X100。/。；腫脹抑制率(％)二(給藥組腫脹率-模型對照組腫脹率)/模型對照組腫脹率X100%實驗數(shù)據(jù)采用SPSS13.0進行統(tǒng)計分析，組間多項數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)以(Hs)表示，尸<0.05作為顯著性差異。實驗結(jié)果結(jié)果見表l。表l.木瓜總酚酸提取物對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響組別腫脹率(％)腫脹抑制率(％)模型對照組51.1±23.1陽性對照組23.3±10.1"54.4低劑量組38.7±12.8*24.3中劑量組22.9±9.8**55.2高劑量組12.8±4.6"75.0與模型對照組相比**尸<0.01;*尸<0.05由表1可見，本發(fā)明提取物三個劑量組與模型對照組相比，均能顯著降低小鼠耳廓腫脹程度0°<0.01、尸<0.05)，高劑量組的腫脹率甚至低于陽性對照組，表明木瓜總酚酸提取物有顯著的抗炎作用。(二)木瓜總酚酸提取物對冰醋酸所致小鼠腹腔毛細血管通透性增高的影響。通過給小鼠灌胃給予不同劑量的木瓜總酚酸提取物，觀察其對冰醋酸所致小鼠腹腔毛細血管通透性增高的影響。材料與方法木瓜總酚酸提取物、阿司匹林、實驗動物來源以及木瓜總酚酸提取物、阿司匹林的給藥劑量同實驗(一)；伊文思藍上海新中化學(xué)廠產(chǎn)品，批號1-64-10-16，用生理鹽水配成0.5%伊文思藍溶液；冰醋酸汕頭市光華化學(xué)廠產(chǎn)品，批號20060525，用生理鹽水配成0.7%冰醋酸溶液。各組按上述給藥劑量連續(xù)灌胃給藥7d，每天一次。各組末次給藥后lh，于小鼠尾靜脈注射0.5%伊文思藍溶液，按小鼠體重給藥劑量為0.lml/10g，隨后立即腹腔注射0.7%冰醋酸溶液0.lml/只，20min后脫頸椎處死，腹腔注入5ml生理鹽水，輕揉腹部lmin后剪開腹部，收集腹腔洗出液5ml，1500r/min離心10min，取上清液用722型光柵分光光度計于590nm波長下比色測定0D值。抑制率(%)=(給藥組0D值-模型對照組0D值)/模型對照組0D值X100%。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS13.0進行統(tǒng)計分析，組間多項數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)以(^s)表示，尸<0.05作為顯著性差異。實驗結(jié)果結(jié)果見表2.表2.木瓜總酚酸提取物對醋酸所致小鼠腹腔毛細血管通透性增高的影響組別OD值抑制率(％)0.044±0.0090.Oll士O.006"750.032±0.008*27.30.020±0.007"54.5模型對照組陽性對照組低劑量組中劑量組高劑量組0.014±0.005"68.2注與模型對照組相比**尸<0.01;*尸<0.05由表2可見，與模型對照組比較，木瓜總酚酸提取物各劑量組均能顯著抑制小鼠腹腔毛細血管通透性的增加(尸<0.01、尸<0.05)，且高劑量組抗炎強度與陽性對照組相近。木瓜總酚酸提取物對毛細血管滲出的抑制是抗炎作用的一個方面，說明其具有抗炎作用。(三)木瓜總酚酸提取物對大鼠慢性炎癥模型-棉球肉芽腫的作用通過給大鼠灌胃給予不同劑量的中藥木瓜總酚酸提取物，觀察其對大鼠慢性炎癥模型-棉球肉芽腫的作用。材料1)木瓜總酚酸提取物同實驗(一)2)水合氯醛中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司，批號20030227實驗動物SD大鼠南方醫(yī)科大學(xué)動物中心(清潔級，合格證號2006B023)實驗方法SD大鼠50只，體重(160土20)g，雌雄各半，隨機分成5組，即模型對照組、陽性對照組、木瓜總酚酸提取物低、中、高劑量組，每組10只大鼠。按大鼠體重，給藥劑量分別為-陽性對照組，其推薦臨床平均阿司匹林劑量為15mg/Kg/人/日(人按60Kg體重計算)，轉(zhuǎn)換為大鼠劑量為90mgZkg;木瓜總酚酸提取物組，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，木瓜總酚酸提取物低、中、高劑量組分別為50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg;模型對照組給予等量生理鹽水。各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹部剪毛并用碘酒消毒，再用75%酒精脫碘。于腹中線切開皮膚約lcm長，止血鉗擴充皮下組織至雙側(cè)腹股溝皮下并植入滅菌棉球(每個棉球10mg，高壓滅菌)，隨即縫合皮膚。從手術(shù)當天開始各組灌胃給予相應(yīng)藥物，連續(xù)給藥七天，每天一次，按大鼠體重給藥劑量為0.lml/100g。第八天處死大鼠，將棉球連同結(jié)締組織一起取出，剔除脂肪組織，稱濕重，置6(TC烘干12h，稱濕、干重。按mg/100g體重表示，計算抑制率(％)，進行組間比較。肉芽腫凈濕重=(棉球肉芽腫總濕重一原棉球凈重)/大鼠體重X100肉芽腫凈干重二(棉球肉芽腫總干重一原棉球凈重)/大鼠體重X100濕重抑制率(％)=(給藥組肉芽腫凈濕重—模型對照組肉芽腫凈濕重)/模型對照組肉芽腫凈濕重X100%千重抑制率(％)=(給藥組肉芽腫凈干重一模型對照組肉芽腫凈干重)/模型對照組肉芽腫凈干重xio(m實驗數(shù)據(jù)采用SPSS13.0進行統(tǒng)計分析，組間多項數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)以(m)表示，尸<0.05作為顯著性差異。實驗結(jié)果結(jié)果見表3。表3木瓜總酚酸提取物對大鼠棉球肉芽腫的影響級別肉芽腫凈濕重(mg/100g)濕重抑制率(%)肉芽腫凈干重(mg/100g)干重抑制率(%)模型對照組0.072±0.0120.016±0.002陽性對照組0.051±0.007**29.20.011±0.002*31.3低劑量組0.062±0.018*13.90.015±0.002"6.2511中劑量組0.056±0.Oil**22.20.012±0.002*25.0高劑量組0.052±0.008"27.80.011±0.002*31.3注與模型對照組相比**尸<0.01;*尸<0.05由表3可見，與模型對照組比較，木瓜總酚酸提取物組各劑量組均能顯著抑制小鼠腹腔毛細血管通透性的增加(尸〈0.01、尸<0.05)，且高劑量組抗炎強度與陽性對照組相近。結(jié)果表明木瓜總酚酸提取物各劑量組對大鼠棉球肉芽腫有明顯的抑制作用，說明木瓜總酚酸提取物有顯著的抗炎作用。(四)木瓜總酚酸提取物對冰醋酸所致小鼠炎癥疼痛的影響通過給小鼠灌胃給予不同劑量的木瓜總酚酸提取物，觀察其對冰醋酸所致小鼠炎癥疼痛的影響。材料與方法冰醋酸油頭市光華化學(xué)廠產(chǎn)品，批號20060525;木瓜總酚酸提取物、阿司匹林、實驗動物來源以及木瓜總酚酸提取物、阿司匹林的給藥劑量同實驗(一)。連續(xù)灌胃給藥五天，每天一次，第六天給藥后30min，每組按體重均腹腔注射0.6%冰醋酸0.lml/10g，并在注射冰醋酸5min后觀察并記錄10min內(nèi)各組小鼠的扭體次數(shù)及計算各藥物組的扭體抑制率，進行組間比較。抑制率(%)二(給藥組小鼠扭體次數(shù)-模型對照組小鼠扭體次數(shù))/模型對照組小鼠扭體次數(shù)X100%實驗數(shù)據(jù)采用SPSS13.0進行統(tǒng)計分析，組間多項數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)以(7±^)表示，尸<0.05作為顯著性差異。實驗結(jié)果結(jié)果見表4.表4.木瓜總酚酸提取物對冰醋酸誘發(fā)小鼠扭體反應(yīng)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>與模型對照組相比**戶<0.01由表4可見，木瓜總酚酸提取物的三個劑量組與模型對照組比較，均能顯著降低冰醋酸誘發(fā)的小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)(戶<0.01)，且高劑量組與陽性對照組基本一致，表明木瓜總酚酸提取物具有明顯的鎮(zhèn)痛作用。鑒于上述動物實驗結(jié)果，本發(fā)明木瓜總酚酸提取物具有抗炎活性，因此可用于制備抗炎藥物或食品。權(quán)利要求1.一種木瓜總酚酸提取物的制備方法，步驟如下按常規(guī)將木瓜果實粉碎后，以30％-80％含水乙醇常溫下浸泡24-48小時，得浸泡液，再于常溫下用30％-80％含水乙醇滲漉提取2-5次，合并浸泡液和滲漉液，即為木瓜提取液。2.純化將上述木瓜提取液濃縮后離心或過濾，棄沉淀，將上清液或濾液用聚苯乙烯多孔性大孔樹脂吸附，以蒸餾水淋洗去除雜質(zhì)，然后再以5%-20%含水乙醇進行洗脫，收集洗脫液，濃縮至無醇味，按同法再用大孔樹脂吸附和洗脫，合并洗脫液并濃縮至無醇味，干燥后即為木瓜總酚酸提取物。3.權(quán)利要求l所述方法制得的木瓜總酚酸提取物。4.權(quán)利要求2所述木瓜總酚酸提取物在制備抗炎藥物或食品中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及醫(yī)藥
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，是木瓜的總酚酸提取物及其在制備抗炎藥物或食品中的應(yīng)用。本發(fā)明用木瓜果實制備木瓜總酚酸提取物，經(jīng)成分分析，本發(fā)明木瓜提取物主要成分為原兒茶酸、氯原酸等多種酚酸類化合物，其中含原兒茶酸30-35％，含氯原酸20-25％，酚酸類化合物占木瓜提取物的50-60％，故稱為木瓜總酚酸提取物。經(jīng)動物實驗，木瓜總酚酸提取物具有顯著的抗炎活性，因此可用于制備抗炎藥物或食品。本發(fā)明為尋求新的抗炎藥物提供了一個新途徑。文檔編號A61K36/732GK101450127SQ200910045169公開日2009年6月10日申請日期2009年1月12日優(yōu)先權(quán)日2009年1月12日發(fā)明者孫連娜,霞李,楊穎博,彥邱,陳萬生申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)