專利名稱：具靶向性的嵌段聚合物膠束給藥系統(tǒng)的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物技術(shù)領(lǐng)域的制備方法，具體地說，涉及的是一種具靶向 性的嵌段聚合物膠束給藥系統(tǒng)的制備方法，即具靶向性的聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯(PE0-PP0-PE0)嵌段聚合物膠束給藥系統(tǒng)的制備方法。
背景技術(shù)：
耙向給藥系統(tǒng)(targeted drug delivery system, TDDS)，又稱靶向制劑， 是指將藥物通過局部或全身血液循環(huán)而濃集定位于病變組織、器官、細(xì)胞或細(xì)胞 內(nèi)，以提高藥物在作用部位的治療濃度而降低毒副作用的一種新型給藥系統(tǒng)。 TDDS被認(rèn)為是抗癌藥的適宜劑型。TDDS要求藥物作用于靶組織、靶器官、靶細(xì)胞， 甚至細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)，并要求有一定濃度的藥物停留相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間以便發(fā)揮治 療作用，故理想的TDDS應(yīng)具備3個(gè)要素定位蓄積、控制釋藥、可生物降解。TDDS 已在多種臨床疾病的防治中顯示出優(yōu)勢(shì)，如肝病、胃結(jié)腸疾病、皮膚、腦病及眼 部疾病等。TDDS就其導(dǎo)向機(jī)理而論可分為被動(dòng)靶向、主動(dòng)靶向和物理靶向。其中 被動(dòng)耙向即自然耙向， 一般的微粒給藥系統(tǒng)都具有被動(dòng)靶向給藥的性能，被動(dòng)靶 向無主動(dòng)結(jié)合靶部位細(xì)胞的作用，因此在發(fā)揮藥效的同時(shí)，不可避免對(duì)正常組織 造成損傷；物理靶向指通過磁場(chǎng)、電場(chǎng)、溫度、超聲波響應(yīng)、紅外線響應(yīng)等因素 把藥物導(dǎo)向到靶部位，如磁球、熱敏脂質(zhì)體等，物理靶向在靶向精確性、保證靶 部位藥物濃度方面較有優(yōu)勢(shì)，是一個(gè)很有前途的方法；主動(dòng)靶向指表面經(jīng)修飾后 的藥物微粒躲避單核吞噬系統(tǒng)識(shí)別，利用抗原-抗體或配體-受體等分子親和作用 將藥物定向分布在靶組織或靶細(xì)胞內(nèi)。主動(dòng)靶向依賴在納米粒表面偶聯(lián)特異性的 靶向分子(特異性的配體、單克隆抗體等)，通過靶向分子與細(xì)胞表面特異性受 體結(jié)合實(shí)現(xiàn)靶向治療，因此具有高度特異性、靶向過程無需外部因素影響、抗干 擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是一種較有發(fā)展前景的靶向技術(shù)。
聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯(PE0-PP0-PE0)嵌段共聚物是用共價(jià)鍵將親 水的PEO鏈段和疏水的PPO鏈段鏈結(jié)在一起的高分子化合物，是一類非離子型的高分子表面活性劑，商品名Pluronic (BASF公司)或Poloxamer ( ICI公司)，與 低分子表面活性劑相比，PE0-PP0-PE0共聚物具有更加優(yōu)越的性能，如極低的臨 界膠束濃度、多樣化的分子化學(xué)組成結(jié)構(gòu)以及由此導(dǎo)致的多樣化兩親性質(zhì)、極低 的毒性、良好的生物相容性和蛋白抗性等，使它們?cè)趶U水處理、介孔材料的制備、 生物醫(yī)用材料、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、生物大分子分離和藥物載體研究等方面有廣闊的 應(yīng)用前景，如PEO-PPO-PEO共聚物在水溶液中所形成的膠束疏水核心可以與難溶 性藥物結(jié)合，從而達(dá)到增加藥物溶解性、代謝穩(wěn)定性和體內(nèi)循環(huán)時(shí)間的作用， PEO-PPO-PEO共聚物的膠束水溶液還具有獨(dú)特的溫度敏感膠束化和熱可逆凝膠化 特點(diǎn)，因此作為藥物載體能改變細(xì)胞內(nèi)的藥物排出機(jī)制，抑制藥物通過血腦屏障 或小腸時(shí)的排出，提高對(duì)腦部給藥和口服給藥的生物利用度，增加多重耐藥癌細(xì) 胞對(duì)抗癌藥物的敏感性等，這對(duì)提高藥物特別是難溶性藥物的臨床適應(yīng)性，方便 藥物制劑生產(chǎn)、運(yùn)輸、使用等具有重要價(jià)值。PE0-PP0-PE0共聚物無毒、無刺激、 無免疫原性，膠束外殼的PEO嵌段能阻止血小板的聚集，膠束尺寸和病毒相仿， 大小適合在體內(nèi)傳輸，是一種難溶性藥物的優(yōu)良載體。
然而PEO-PPO-PEO共聚物膠束作為給藥系統(tǒng)由于其粒徑小、無免疫原性等自 身特點(diǎn)雖具有一定的天然被動(dòng)耙向作用，卻無任何主動(dòng)靶向性，因此在作用于靶 細(xì)胞的同時(shí)不可避免地對(duì)周圍正常細(xì)胞造成損害，形成嚴(yán)重的藥物毒副作用。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，Li-mei HAN等在《Acta Pharmacologica Sinica》(中國(guó)藥理學(xué)報(bào))(2006年第27期第747頁(yè))上發(fā)表的"Pharmacokinetics and biodistribution of polymeric micelles of paclitaxel with Pluronic P123"(紫杉醇Pluronic P123聚合物膠束藥物動(dòng)力學(xué)和組織分布學(xué)研究)，該文 中提出以PE0-PP0-PE0共聚物P123膠束作為紫杉醇的給藥載體，其不足在于該 給藥系統(tǒng)無主動(dòng)特異靶向性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種具耙向性的嵌段聚合物膠束給藥系 統(tǒng)的制備方法，該方法操作簡(jiǎn)單，條件溫和，可以在保持載藥PE0-PP0-PE0膠束 粒徑小、無免疫原性等原有自身特點(diǎn)的前提下實(shí)現(xiàn)其主動(dòng)靶向作用，從而減小治 療藥物對(duì)周圍正常組織細(xì)胞的損害，減小毒副作用及用藥劑量。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明利用羧基化的PE0-PP0-PE0嵌段共聚物為載體構(gòu)建難溶性藥物的膠束水溶液，以羧基活化劑活化PE0-PP0-PE0的 羧基，制備連接有相關(guān)配體或抗體等靶向分子的PEO-PPO-PEO載藥膠束體系，經(jīng) 過濾除菌、冷凍干燥后得到該靶向給藥膠束體系的凍干制劑。
本發(fā)明包括如下步驟
第一步，將羧基化PE0-PP0-PE0嵌段共聚物、難溶性藥物溶于有機(jī)溶劑，使 載體材料和藥物充分溶解，制備以羧基化PE0-PP0-PE0為載體的難溶性藥物膠束 水溶液。
所述羧基化PE0-PP0-PE0嵌段共聚物的分子式為 RO(C2H40) a(C3H60) b(C2H40)c MCOOH 結(jié)構(gòu)式
這里的R是—C2H4C00H、 一H、 -CH3、 —C2H5、 —<:3^等基團(tuán)，M是-(CH2)廠、—(CH2)3— 等基團(tuán)，其中a、 c為2 200、 b為15 100的整數(shù)。
所述難溶性藥物，是指在無任何助溶劑的情況下，lg需要30mL以上水才能完 全溶解的藥物，特別是指抗腫瘤類難溶性藥物，如紫杉醇、多西紫杉醇、羥基喜 樹堿等。
所述有機(jī)溶劑，包括但不限于脂肪烴類及其衍生物、芳烴類及其衍生物、環(huán) 垸烴類及其衍生物等溶劑，單獨(dú)或混合使用。
所述使載體材料和藥物充分溶解，其方法包括但不限于使用加熱、攪拌、超 聲等促進(jìn)溶解的方法。
所述制備以羧基化PE0-PP0-PE0為載體的難溶性藥物膠束水溶液，其方法包 括但不限于使用透析法、薄膜水化法或溶劑揮發(fā)法等方法。
第二步，活化PE0-PP0-PE0嵌段共聚物的羧基，加入靶向分子(配體或抗體)， 制備連有靶向分子的PE0-PP0-PE0載藥膠束水溶液。
所述靶向分子，是指可與人體內(nèi)的特定正?；虿∽兘M織、器官、細(xì)胞或細(xì)胞
內(nèi)特定部位產(chǎn)生特異性結(jié)合、以氨基酸為基本單位的物質(zhì)，特別是指多肽類、蛋
白類及抗體蛋白類物質(zhì)。
所述活化PE0-PP0-PEO嵌段共聚物的羧基，采用羧基活化劑進(jìn)行，羧基活化劑包括但不限于使用N，N'-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、 1-乙基-(3-二甲基氨基丙 基)碳二亞胺(EDC)、 N, N， -二異丙基碳二亞胺(DIC)、 N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 等，單獨(dú)或混合使用。
第三步，在連有耙向分子的PEO-PPO-PEO載藥膠束水溶液中加入凍干保護(hù)劑， 經(jīng)過濾除菌，冷凍干燥后得到該靶向載藥膠束體系的凍干制劑。
所述凍干保護(hù)劑，包括但不限于使用蔗糖、海藻糖、甘露醇、乳糖、葡萄 糖、麥芽糖、葡聚糖、白蛋白等，單獨(dú)或混合使用，每100毫升凍干溶液所需凍 干保護(hù)劑的重量可在1°/。 50%，常用量為2% 20%。
所述經(jīng)過過濾除菌，是指經(jīng)過0. 22 y m微孔濾膜過濾除菌。
本發(fā)明所述的水溶液就是指水。
本發(fā)明利用可生物降解并具有良好生物相容性的兩親性PEO-PP0-PE0嵌段
共聚物構(gòu)建水溶性膠束，包載難溶性藥物于PPO分子鏈形成的膠束疏水內(nèi)核，并
直接鏈接靶向配體或抗體分子于PE0鏈，實(shí)現(xiàn)難溶性藥物與靶向分子的有機(jī)結(jié)
合，制備包載難溶性治療藥物的納米靶向兩親性嵌段共聚物膠束給藥系統(tǒng)。 本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)
1、 操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、制備過程不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，適于大量制備 和工業(yè)化生產(chǎn)；
2、 條件溫和、穩(wěn)定，借助單一的無毒、無免疫原性PE0-PP0-PE0嵌段共聚物 載體材料，利用其可在水溶液中自組裝形成膠束的特點(diǎn)，無需借助第二載體或構(gòu) 建復(fù)合載體，即實(shí)現(xiàn)靶向分子與藥物的有機(jī)結(jié)合，從而增加了實(shí)現(xiàn)藥物靶向傳遞 的可控性及可行性。
具體實(shí)施例方式
下面實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn) 行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于 下述實(shí)施例。
實(shí)施例1
稱取40mg羧基化的P123型PE0-PP0-PE0嵌段共聚物、lmg紫杉醇，加入2mL 乙腈，200rpm攪拌2h使載體材料和藥物充分溶解，溶液經(jīng)4(TC水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮 盡乙腈，25。C真空干燥過夜后得到無色透明藥膜，以lmL純水為水化介質(zhì)，將藥膜于25'C旋轉(zhuǎn)水化lh，得無色透明紫杉醇PE0-PP0-PE0膠束溶液；
加入O. 3mL 0. 25M濃度1-乙基-3_(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)及 0. 3raL 0. 25M濃度N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) ， 200rpm旋轉(zhuǎn)攪拌15rain以活化羧基， 加入400 ii g抗c-eWB-2單克隆抗體，200rpm旋轉(zhuǎn)攪拌2h，以氫氧化鈉調(diào)整pH 值至7，得抗c-e/力B-2紫杉醇PEO-PPO-PEO免疫膠束；
加入0. 3g蔗糖作為凍干保護(hù)劑，補(bǔ)足溶液總體積至2mL，過0. 22 u m微孔 濾膜除菌，將溶液分裝于無菌青霉素小瓶中，每支lmL，冷凍干燥，得白色疏松 狀抗c-er胡-2紫杉醇PEO-PPO-PEO免疫膠束凍干制劑，每支含紫杉醇0. 5mg， 抗c-er泌-2單克隆抗體200 u g，該凍干制劑加入lmL葡萄糖注射液或氯化鈉注 射液經(jīng)振搖可于lmin內(nèi)完全復(fù)溶，所得膠束溶液澄清透明，狀態(tài)可保持3d以上， 疏水性藥物紫杉醇位于膠束中，穩(wěn)定性良好。
實(shí)施例2
稱取80mg羧基化的F127型PEO-PPO-PEO嵌段共聚物、lmg多西紫杉醇，加 入lmL二甲基甲酰胺(DMF)，水浴超聲10min使載體材料和藥物充分溶解，溶液 裝入MWCO2000透析袋中，用1. 5L去離子水透析24h，透析后溶液經(jīng)1000rpm離 心10min，上清液過0.45pm微孔濾膜，濾液補(bǔ)足體積至lmL，得無色透明多西 紫杉醇PEO-PPO-PEO膠束溶液；
加入O. 3mL 0. 2M濃度N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)及0. 3mL 0. 2M濃度 N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)， 200rpm旋轉(zhuǎn)攪拌15min以活化羧基，加入800iig抗 BRCAA1單克隆抗體，200rpm旋轉(zhuǎn)攪拌2h，以碳酸氫鈉調(diào)整pH值至pH=7，得抗 BRCAA1多西紫杉醇PEO-PPO-PEO免疫膠束；
加入0.25g甘露醇作為凍干保護(hù)劑，補(bǔ)足溶液總體積至2mL，過0. 22 u m微 孔濾膜除菌，將溶液分裝于無菌青霉素小瓶中，每支lmL，冷凍干燥，得抗BRCAA1 多西紫杉醇PE0-PP0-PE0免疫膠束凍干制劑，該凍干制劑加入lmL葡萄糖注射液 或氯化鈉注射液經(jīng)振搖可于lrain內(nèi)完全復(fù)溶，所得膠束溶液澄清透明，狀態(tài)可 保持3d以上，疏水性藥物多西紫杉醇位于膠束中，穩(wěn)定性良好。
實(shí)施例3稱取lOOmg羧基化的F68型PE0-PP0-PE0嵌段共聚物、0. 5mg羥基喜樹堿， 加入lmL二氯甲烷與三氯甲垸的混合液(1:1),水浴超聲10min使載體材料和藥 物充分溶解，加入lmL純水，細(xì)胞破碎儀超聲處理至形成均勻白色乳液，60°C 水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮盡有機(jī)溶劑至形成無色透明水溶液，補(bǔ)足溶液體積至lmL，得無 色透明羥基喜樹堿PE0-PP0-PE0膠束溶液
加入0. 3mL 0. 15M濃度N， N-二異丙基碳二亞胺(DIC)及0. 3mL 0. 15M濃度 N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)， 200rpm旋轉(zhuǎn)攪拌15min以活化羧基，加入300ixg表 皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)單克隆抗體，200rpm旋轉(zhuǎn)攪拌2h，以碳酸氫鈉調(diào)整pH 值至pH=7，得抗EGFR羥基喜樹堿PEO-PPO-PEO免疫膠束；
加入0. 05g蔗糖和0. 05g海藻糖作為凍干保護(hù)劑，補(bǔ)足溶液總體積至2mL， 混勻，過0.22iim微孔濾膜除菌，將溶液分裝于無菌青霉素小瓶中，每支lmL， 冷凍干燥，得抗EGFR羥基喜樹堿PEO-PP0-PEO免疫膠束凍干制劑，每支含羥基 喜樹堿0. 25mg，抗EGFR單克隆抗體150u g，該凍干制劑加入lmL葡萄糖注射液 或氯化鈉注射液經(jīng)振搖可于lmin內(nèi)完全復(fù)溶，所得膠束溶液澄清透明，狀態(tài)可 保持2d以上，疏水性藥物羥基喜樹堿位于膠束中，穩(wěn)定性良好。
實(shí)施例4
稱取40mg羧基化的P123型PEO-PPO-PEO嵌段共聚物、lmg紫杉醇，加入2mL 乙腈，水浴超聲20min使載體材料和藥物充分溶解，溶液經(jīng)40'C水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā) 揮盡乙腈，25。C真空干燥過夜后得無色透明藥膜，以lmL純水為水化介質(zhì)，將藥 膜于25"C旋轉(zhuǎn)水化2h，得無色透明紫杉醇PEO-PPO-PEO膠束溶液；
加入0. 3mL 0. 25M濃度1_乙基_3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)及 0. 3mL 0. 25M濃度N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) ， 200rpm旋轉(zhuǎn)攪拌15min以活化羧基， 加入400 u g抗缺氧誘導(dǎo)因子-1 a (HIF-1 a )單克隆抗體，200rpm旋轉(zhuǎn)攪拌2h， 以氫氧化鈉調(diào)整pH值至7，得抗HIF-1 a紫杉醇PEO-PPO-PEO免疫膠束；
加入0. lg海藻糖作為凍干保護(hù)劑，補(bǔ)足溶液總體積至2mL，過0. 22 y m微 孔濾膜除菌，將溶液分裝于無菌青霉素小瓶中，每支lmL，冷凍干燥，得白色疏 松狀抗hif-1 a紫杉醇peo-ppo-PEO免疫膠束凍干制劑，每支含紫杉醇0. 5mg， 抗HIF-1 a單克隆抗體200 u g，該凍干制劑加入lmL葡萄糖注射液或氯化鈉注射
9液經(jīng)振搖可于lmiri內(nèi)完全復(fù)溶，所得膠束溶液澄清透明，狀態(tài)可保持3d以上， 疏水性藥物紫杉醇位于膠束中，穩(wěn)定性良好。
采用ELISA雙抗夾心法檢測(cè)抗HIF-1 a紫杉醇PE0-PP0-PE0免疫膠束的主動(dòng) 耙向性:以每孔100 u 1 200 ug/mL羊抗鼠IgG包被96孔ELISA板，洗滌后每孔 以200ul 1。/。BSA封閉，洗滌，分別加入lOOu 1抗HIF-la紫杉醇PEO-PP0-PEO 免疫膠束復(fù)溶液、陽(yáng)性對(duì)照100 u 1濃度為200u g/mL的抗HIF-1 a 、陰性對(duì)照 PBS (pH=7. 4)各五孔，充分反應(yīng)后洗滌，各孔均加入服P標(biāo)記羊抗鼠IgG做二抗， 免疫反應(yīng)后充分洗滌，各孔加入等量0. 5mg/mL四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液(pH:5) 顯色15min，再加入50ixl 2M硫酸中止顯色反應(yīng)，450nm處酶標(biāo)儀測(cè)吸光度OD 值，結(jié)果見表1，免疫膠束組的OD平均值比陽(yáng)性對(duì)照增加近一倍，說明抗HIF-1 a紫杉醇PE0-pp0-pE0免疫膠束具有顯著的免疫尋靶活性。
表l ELISA雙抗夾心法檢測(cè)抗HIF-1 a紫杉醇PEO-PPO-PEO免疫膠束主動(dòng)靶向性
樣品名稱123OD值 45
免疫膠束0. 3180. 2940.2860. 3370. 3230. 312±0, 021
陽(yáng)性對(duì)照0. 1030. 1210. 1270. 1160. 1060. 115±0. 010
陰性對(duì)照0. 0650. 0800. 0710. 0680. 0930. 075±0. 011
實(shí)施例5
稱取80mg羧基化的F127型PEO-PPO-PEO嵌段共聚物、lmg多西紫杉醇，加 入lmL二甲基甲酰胺(DMF)，水浴超聲10min使載體材料和藥物充分溶解，溶液 裝入MWC02000透析袋中，用1. 5L去離子水透析24h，透析后溶液經(jīng)1000rpm離 心10min，上清液過0.45pm微孔濾膜，濾液補(bǔ)足體積至lmL，得無色透明多西 紫杉醇PEO-PPO-PEO膠束溶液；
加入0. 3mL 0. 2M濃度N， N' -二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)及0. 3mL 0. 2M濃度 N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)， 200rpm旋轉(zhuǎn)攪拌15min以活化羧基，加入800ug抗 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)單克隆抗體，200rpm旋轉(zhuǎn)攪拌2h，以碳酸氫鈉調(diào)整 pH值至pH=7，得抗VEGF多西紫杉醇PEO-PPO-PEO免疫膠束；
加入0. 2g葡萄糖作為凍干保護(hù)劑，補(bǔ)足溶液總體積至2mL，過0. 22 y m微孔濾膜除菌，將溶液分裝于無菌青霉素小瓶中，每支lmL，冷凍干燥，得抗VEGF 多西紫杉醇PE0-PP0-PE0免疫膠束凍干制劑，該凍干制劑加入lmL葡萄糖注射液 或氯化鈉注射液經(jīng)振搖可于lmin內(nèi)完全復(fù)溶，所得膠束溶液澄清透明，狀態(tài)可 保持3d以上，疏水性藥物多西紫杉醇位于膠束中，穩(wěn)定性良好。
采用細(xì)胞ELISA法檢測(cè)抗VEGF多西紫杉醇PE0-PP0-PE0免疫膠束的主動(dòng)靶 向性以在96孔板上以每孔5萬個(gè)細(xì)胞的密度接種MGC-803胃癌細(xì)胞，待細(xì)胞 貼壁后吸去培養(yǎng)基，每孔加40 y 1細(xì)胞維持液，再分別加入10iil抗VEGF多西 紫杉醇PEO-PPO-PEO免疫膠束復(fù)溶液、陽(yáng)性對(duì)照l(shuí)Oii 1濃度為400y g/mL的抗 VEGF單克隆抗體、陰性對(duì)照PBS(p^7.4)各五孔，37。C孵育lh，以PBS(p^7.4) 洗滌細(xì)胞，每孔以200 u 1 1%BSA封閉2h，洗滌，各孔均加入1:4000稀釋的HRP 標(biāo)記羊抗鼠IgG第二抗體，37'C孵育lh，充分洗滌，各孔加入等量0. 5mg/mL四 甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液(p弘5)顯色15min，再加入50u 1 2M硫酸中止顯色反應(yīng)， 450nm處酶標(biāo)儀測(cè)吸光度OD值，結(jié)果見表2，免疫膠束組的OD平均值比陽(yáng)性對(duì) 照增加近一倍，說明抗VEGF多西紫杉醇PE0-PP0-PE0免疫膠束具有顯著的尋靶 活性。
表2細(xì)胞ELISA法檢測(cè)抗VEGF多西紫杉醇PEO-PPO-PEO免疫膠束主動(dòng)靶向性
免疫膠束 0.485 0.494 0.486 0.537 0.523 0.505 ±0.024 陽(yáng)性對(duì)照 0.525 0.596 0.534 0.480 0.574 0.542 ±0.045 陰性對(duì)照 0.204 0.198 0.231 0.178 0.211 0.204±0.019
實(shí)施例6
稱取100mg羧基化的F68型PE0-PP0-PEO嵌段共聚物、0. 5mg羥基喜樹堿， 加入lmL二氯甲烷與三氯甲垸的混合液(1:1)，水浴超聲10min使載體材料和藥 物充分溶解，加入lmL純水，細(xì)胞破碎儀超聲處理至形成均勻白色乳液，60°C 水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮盡有機(jī)溶劑至形成無色透明水溶液，補(bǔ)足溶液體積至lmL，得無 色透明羥基喜樹堿PE0-PP0-PE0膠束溶液；
加入0. 3mL 0. 15M濃度N， N-二異丙基碳二亞胺(DIC)及0. 3mL 0. 15M濃度N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) ， 200rpm旋轉(zhuǎn)攪拌15min以活化羧基，加入300u g抗 黏著斑激酶(FAK)單克隆抗體，200rpm旋轉(zhuǎn)攪拌2h，以碳酸氫鈉調(diào)整pH值至 pH=7 ，得抗FAK羥基喜樹堿PEO-PPO-PEO免疫膠束；
加入0. 08g葡萄糖和0. 08g海藻糖作為凍千保護(hù)劑，補(bǔ)足溶液總體積至2mL， 混勻，過0.22ixm微孔濾膜除菌，將溶液分裝于無菌青霉素小瓶中，每支lmL， 冷凍干燥，得抗FAK羥基喜樹堿PEO-PPO-PEO免疫膠束凍干制劑，每支含羥基喜 樹堿0. 25mg，抗FAK單克隆抗體150 y g，該凍干制劑加入lmL葡萄糖注射液或 氯化鈉注射液經(jīng)振搖可于lmiri內(nèi)完全復(fù)溶，所得膠束溶液澄清透明，狀態(tài)可保 持2d以上，疏水性藥物羥基喜樹堿位于膠束中，穩(wěn)定性良好。
采用間接免疫熒光法檢測(cè)抗FAK羥基喜樹堿PEO-PPO-PEO免疫膠束的靶向性 以每孔5千個(gè)細(xì)胞的密度接種MGC-803胃癌細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后吸去培養(yǎng)基，每孔 加40wl細(xì)胞維持液，再分別加入10ul抗FAK羥基喜樹堿PEO-PPO-PEO免疫膠束 復(fù)溶液、10u 1不含抗FAK的羥基喜樹堿PE0-PP0-PE0膠束復(fù)溶液為陰性對(duì)照，37 。C孵育lh，以PBS(pH:7.4)洗滌，各孔均加入l:5稀釋的FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG第二 抗體，37。C孵育lh，充分洗滌，熒光顯微鏡下觀察，與抗FAK羥基喜樹堿 PEO-PPO-PEO免疫膠束反應(yīng)的細(xì)胞組在熒光顯微鏡下可觀察到細(xì)胞膜有一圈綠色 熒光，而陰性對(duì)照組均無熒光，證明FAK羥基喜樹堿PEO-PPO-PEO免疫膠束有與靶 細(xì)胞結(jié)合的活性。
從以上實(shí)施例可以看出，本發(fā)明操作簡(jiǎn)單、條件溫和、原料低廉、使用載體 材料單一、可控性強(qiáng)，并且可以在保持載藥PEO-PP0-PEO膠束粒徑小、無免疫原 性等原有自身特點(diǎn)的前提下實(shí)現(xiàn)其主動(dòng)靶向作用，從而減小治療藥物對(duì)周圍正常 組織細(xì)胞的損害，減小毒副作用及用藥劑量，并適于大量制備和工業(yè)化生產(chǎn)。
權(quán)利要求
1、一種具靶向性的嵌段聚合物膠束給藥系統(tǒng)的制備方法，其特征在于包括如下步驟第一步，將羧基化PEO-PPO-PEO嵌段共聚物、難溶性藥物溶于有機(jī)溶劑，使羧基化PEO-PPO-PEO嵌段共聚物、難溶性藥物充分溶解，制備以羧基化PEO-PPO-PEO為載體的難溶性藥物膠束水溶液；第二步，活化PEO-PPO-PEO嵌段共聚物的羧基，加入靶向分子，制備連有靶向分子的PEO-PPO-PEO載藥膠束水溶液；第三步，在連有靶向分子的PEO-PPO-PEO載藥膠束水溶液中加入凍干保護(hù)劑，經(jīng)過過濾除菌，冷凍干燥后得到該靶向載藥膠束體系的凍干制劑。
2、 如權(quán)利要求l所述的具靶向性的嵌段聚合物膠束給藥系統(tǒng)的制備方法，其 特征是，所述羧基化PE0-PP0-PE0嵌段共聚物的分子式為<formula>formula see original document page 2</formula>結(jié)構(gòu)式<formula>formula see original document page 2</formula>這里的R是-C2H4C00H、 _H、 -CH3、 -C2H5、 -017基團(tuán)，M是-(CH丄-、_(012)3-基團(tuán)， 其中a、 c為2 200、 b為15 100的整數(shù)。
3、 如權(quán)利要求l所述的具靶向性的嵌段聚合物膠束給藥系統(tǒng)的制備方法，其 特征是，所述難溶性藥物，是指在無任何助溶劑的情況下，lg藥物需要30mL以上 水才能完全溶解的藥物。
4、 如權(quán)利要求1或3所述的具靶向性的嵌段聚合物膠束給藥系統(tǒng)的制備方 法，其特征是，所述難溶性藥物，是指抗腫瘤類難溶性藥物，包括紫杉醇、多西 紫杉醇、羥基喜樹堿。
5、 如權(quán)利要求1所述的具靶向性的嵌段聚合物膠束給藥系統(tǒng)的制備方法， 其特征是，所述有機(jī)溶劑，包括脂肪烴類及其衍生物、芳烴類及其衍生物、環(huán)烷 烴類及其衍生物溶劑，單獨(dú)或混合使用。
6、 如權(quán)利要求1所述的具靶向性的嵌段聚合物膠束給藥系統(tǒng)的制備方法，其特征是，所述使羧基化PE0-PP0-PE0嵌段共聚物、難溶性藥物充分溶解，其方 法包括使用加熱、攪拌、或超聲促進(jìn)溶解。
7、 如權(quán)利要求1所述的具靶向性的嵌段聚合物膠束給藥系統(tǒng)的制備方法， 其特征是，所述制備以羧基化PE0-PPO-PEO為載體的難溶性藥物膠束水溶液，其 方法包括使用透析法、薄膜水化法或溶劑揮發(fā)法。
8、 如權(quán)利要求1所述的具靶向性的嵌段聚合物膠束給藥系統(tǒng)的制備方法， 其特征是，所述活化PE0-PP0-PE0嵌段共聚物的羧基，采用羧基活化劑進(jìn)行，羧 基活化劑包括N， N' -二環(huán)己基碳二亞胺、l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺、 N，N'-二異丙基碳二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺，單獨(dú)或混合使用。
9、 如權(quán)利要求1所述的具靶向性的嵌段聚合物膠束給藥系統(tǒng)的制備方法， 其特征是，所述靶向分子，是指能與人體內(nèi)的特定正?；虿∽兘M織、器官、細(xì)胞 或細(xì)胞內(nèi)特定部位產(chǎn)生特異性結(jié)合、以氨基酸為基本單位的物質(zhì)。
10、 如權(quán)利要求1所述的具靶向性的嵌段聚合物膠束給藥系統(tǒng)的制備方法， 其特征是，所述凍干保護(hù)劑，包括蔗糖、海藻糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、麥 芽糖、葡聚糖、白蛋白，單獨(dú)或混合使用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域的具靶向性的嵌段聚合物膠束給藥系統(tǒng)的制備方法。本發(fā)明利用羧基化的PEO-PPO-PEO嵌段共聚物為載體構(gòu)建難溶性藥物的膠束水溶液，以羧基活化劑活化PEO-PPO-PEO的羧基，制備連接有相關(guān)配體或抗體等靶向分子的PEO-PPO-PEO載藥膠束體系，經(jīng)過濾除菌、冷凍干燥后得到該靶向給藥膠束體系的凍干制劑。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單、條件溫和、原料低廉、無需采用復(fù)合材料、可控性強(qiáng)，可在保持載藥PEO-PPO-PEO膠束粒徑小、無免疫原性等特點(diǎn)的前提下實(shí)現(xiàn)其主動(dòng)靶向作用，減小治療藥物對(duì)周圍正常組織細(xì)胞的損害，減小毒副作用及用藥劑量，并適于大量制備和工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101507705SQ20091004634
公開日2009年8月19日 申請(qǐng)日期2009年2月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月19日
發(fā)明者華 宋, 崔大祥, 蓉 賀, 峰 高 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)