專(zhuān)利名稱(chēng)：一種羥基磷灰石納米顆粒放射性核素標(biāo)記產(chǎn)物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種羥基磷灰石納米顆粒放射性核素標(biāo)記產(chǎn)物及其標(biāo)記技術(shù)，具體地 說(shuō)，是一種標(biāo)記有放射性核素125I的羥基磷灰石納米顆粒及其制備方法。
背景技術(shù)：
羥磷灰石(Hydroxyapatite，HA)是種弱堿性的磷酸鈣鹽，分子式為 Caltl(PCM)6(OH)2，是人體和動(dòng)物骨骼、牙齒等硬組織的主要無(wú)機(jī)成分。機(jī)體硬組織中的天然 羥基磷灰石是種呈針狀六方棱形的納米結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)度為200-400nm，厚度為15-30nm。人工合 成的羥基磷灰石具有優(yōu)良的生物相容性和化學(xué)穩(wěn)定性，廣泛地應(yīng)用骨缺損的修復(fù)治療。羥 基磷灰石納米顆粒不但具有良好的生物相容性和生物活性，還具有納米材料獨(dú)特的小尺寸 效應(yīng)和表面效應(yīng)。將納羥基磷灰石納米顆粒植入于骨組織后，能與骨組織形成牢固的化學(xué) 鍵結(jié)合，且具有骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性，已廣泛地應(yīng)用于各種骨缺損的修復(fù)治療，是目前組織 工程植入材料研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一。由于羥基磷灰石納米顆粒具有納米材料的獨(dú)特性能，表現(xiàn)出尺寸小、比表面積大、 表面活性高、吸附能力強(qiáng)等優(yōu)良特性和新的功能，能夠有選擇性地作用于特殊組織和細(xì)胞。 有研究將羥基磷灰石納米顆粒作為載體，應(yīng)用于緩釋藥物的開(kāi)發(fā)；也有研究利用羥基磷灰 石納米顆粒診斷和治療各種腫瘤。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，納米材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用將日趨廣泛，關(guān)于納米材 料的生物安全性問(wèn)題也將逐漸被人們所重視。研究納米材料的生物安全性，就有必要對(duì)納 米材料在機(jī)體中的應(yīng)用進(jìn)行示蹤，以研究納米材料在機(jī)體中代謝的生物學(xué)分布和評(píng)價(jià)納米 材料對(duì)機(jī)體功能的影響。對(duì)納米材料進(jìn)行放射性核素標(biāo)記是研究納米材料體內(nèi)生物學(xué)分布 的重要方法。另外，通過(guò)對(duì)羥基磷灰石納米顆粒的放射性核素標(biāo)記，可以為開(kāi)發(fā)以羥基磷灰 石納米顆粒為載體的放射性治療藥物提供技術(shù)基礎(chǔ)。目前，對(duì)羥基磷灰石納米顆粒進(jìn)行放射性核素標(biāo)記的常用方法主要是采用吸附法 分別將標(biāo)記有放射性核素的膦酸鹽配體吸附于羥基磷灰石表面或采用離子交換法將放射 性核素與羥基磷灰石中的離子進(jìn)行交換，實(shí)現(xiàn)對(duì)羥基磷灰石納米顆粒進(jìn)行標(biāo)記，用于羥基 磷灰石納米顆粒標(biāo)記的放射性核素有153Sm、9°Y、99mTc等。但現(xiàn)有的羥基磷灰石納米顆粒標(biāo) 記技術(shù)對(duì)其在體內(nèi)顯像和生物學(xué)分布研究應(yīng)用方面存在諸多不足，主要?dú)w納有以下幾點(diǎn)(1)體內(nèi)穩(wěn)定性差現(xiàn)有的標(biāo)記方法中通過(guò)吸附配體對(duì)羥基磷灰石納米顆粒進(jìn)行 放射性核素標(biāo)記，這種吸附性結(jié)合在體內(nèi)穩(wěn)定性較差，標(biāo)記物容易在體內(nèi)脫落。另外，一些 配體在體內(nèi)對(duì)某些組織具有較高的特異性結(jié)合能力，如膦酸鹽對(duì)骨組織具有較強(qiáng)的吸附 性，這有可能影響羥基磷灰石納米顆粒在體內(nèi)的分布情況。(2)沒(méi)有合適的半衰期由于羥基磷灰石是種化學(xué)性能穩(wěn)定的無(wú)機(jī)物質(zhì)，在體內(nèi)降解周期長(zhǎng)，所以要研究羥基磷灰石納米顆粒在體內(nèi)的生物學(xué)分布，就要求標(biāo)記的放射性 核素具有合適的半衰期。目前能與羥基磷灰石進(jìn)行離子交換的放射性核素中，大多半衰期過(guò)短，如153Sm的半衰期為46. 3h，9°Y的半衰期為64. lh, 99mTc的半衰期為6. 02h，這些放射性 核素的半衰期都不適合用于研究羥基磷灰石納米顆粒的體內(nèi)生物學(xué)分布。
(3)放射性活度檢測(cè)的不便為研究羥基磷灰石納米顆粒的體內(nèi)生物學(xué)分布情 況，需要對(duì)體內(nèi)重要臟器進(jìn)行放射性活度的定量檢測(cè)。目前，常用的放射性核素的放射性活 度多采用液體閃爍技術(shù)檢測(cè)。在進(jìn)行體內(nèi)生物學(xué)分布研究時(shí)，需在對(duì)器官組織內(nèi)的放射性 活度檢測(cè)前將器官組織進(jìn)行消化，使其變成液態(tài)，如果液體有顏色還要進(jìn)行脫色，同時(shí)放射 性測(cè)量時(shí)要進(jìn)行淬滅校正，這將極大增加器官組織放射性活度測(cè)定的難度和成本。125I是種常用的放射性核素，具有合適的半衰期，廣泛地應(yīng)用于各種生物標(biāo)記及生 物檢測(cè)。羥基磷灰石納米顆粒作為一種無(wú)機(jī)納米顆粒，表面缺少可以直接用來(lái)進(jìn)行放射性 核素125I標(biāo)記的官能基團(tuán)，所以很難將125I直接標(biāo)記到羥基磷灰石納米顆粒上。硅烷偶聯(lián)劑是種具有特殊結(jié)構(gòu)的低分子有機(jī)硅化物，也是種重要的無(wú)機(jī)納米顆粒 表面改性材料。硅烷偶聯(lián)劑的通式為RSix3,R代表氨基、巰基、乙烯基、環(huán)氧基、氰基及甲基 丙乙烯酰氧基等基團(tuán)，X代表能夠水解的基團(tuán)，如鹵素、烷氧基、酰氧基等。硅烷偶聯(lián)劑對(duì)無(wú) 機(jī)納米材料的表面改性主要是通過(guò)形成化學(xué)鍵實(shí)現(xiàn)的。羥基磷灰石納米顆粒表面存在羥基，它可以與硅烷偶聯(lián)劑中的烷氧基、酰氧基等 基團(tuán)形成化學(xué)鍵結(jié)合，而硅烷偶聯(lián)劑另一段的氨基、環(huán)氧基等基團(tuán)可以標(biāo)記上1251，從而實(shí) 現(xiàn)對(duì)羥基磷灰石納米顆粒進(jìn)行放射性核素標(biāo)記。由于硅烷偶聯(lián)劑與羥基磷灰石納米顆粒是 通過(guò)化學(xué)鍵的形式結(jié)合的，125I也是標(biāo)記在硅烷偶聯(lián)劑中的氨基、環(huán)氧基等基團(tuán)上。所以，設(shè) 計(jì)這種方法對(duì)羥基磷灰石納米進(jìn)行125I標(biāo)記，能夠獲得比較穩(wěn)定的標(biāo)記產(chǎn)物，所獲得的標(biāo)記 產(chǎn)物能夠應(yīng)用于羥基磷灰石納米顆粒的體內(nèi)顯像和生物學(xué)分布研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能夠應(yīng)用于羥基磷灰石納米顆粒的體內(nèi)顯像和生物 學(xué)分布研究的羥基磷灰石納米顆粒125I標(biāo)記產(chǎn)物。本發(fā)明的另一目的在于提供所述標(biāo)記產(chǎn)物的制備方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開(kāi)以下技術(shù)方案首先，硅烷偶聯(lián)劑稀釋溶液處理羥基 磷灰石納米顆粒，使其硅烷氨基化。其中硅烷偶聯(lián)劑為氨基丙基三乙氧基硅烷(分子式為 (CH3CH2O)3SiCH2CH2CH2NH2)；其氨基丙基三乙氧基硅烷的稀釋溶液配比為偶聯(lián)劑乙醇= 1 5V/V;其稀釋溶液的PH值為8。其次，制備125I-BH標(biāo)記物。再次也是最重要的，125I-BH 標(biāo)記物與氨基化的羥基磷灰石納米顆粒連接。其中氨基化的羥基磷灰石納米顆粒經(jīng)過(guò)以下 處理在0. 05mol/L pH 8. 4的硼酸緩沖液中，并通過(guò)40KHz超聲振蕩15min ；所述連接在以 下條件下進(jìn)行冰浴中攪拌反應(yīng)30min，再加入0. 2mol/L的甘氨酸溶液(0. 05mol/L pH 8. 4 的硼酸緩沖液配制)。本發(fā)明具有以下有益效果(1)選用化學(xué)活潑性高的放射性核素1251，它具有合適的半衰期，為60天，可以用 于羥基磷灰石納米顆粒體內(nèi)顯像和生物學(xué)分布研究，使放射性污染易于控制和處理。放射 性核素125I可以發(fā)射Y射線，穿透力強(qiáng)，可以定量和直觀的檢測(cè)羥基磷灰石納米顆粒的體 內(nèi)生物學(xué)分布和顯像。利用125I發(fā)射Y射線的特性，可以在不進(jìn)行組織消化、不使用液體 閃爍技術(shù)的情況下，使用Y計(jì)數(shù)器簡(jiǎn)便快捷地對(duì)羥基磷灰石納米顆粒進(jìn)行體內(nèi)顯像和生物學(xué)分布研究。(2)采用硅烷偶聯(lián)劑對(duì)羥基磷灰石納米顆粒進(jìn)行表面改性，硅烷偶聯(lián)中烷氧基、酰氧基等基團(tuán)與羥基磷灰石納米顆粒表面的羥基進(jìn)行化學(xué)鍵結(jié)合，125I則標(biāo)記到硅烷偶聯(lián)劑 中的氨基、環(huán)氧基等基團(tuán)上，通過(guò)這種標(biāo)記方法所得到的125I標(biāo)記產(chǎn)物穩(wěn)定，可以用于羥基 磷灰石納米顆粒的體內(nèi)顯像和分布學(xué)研究。(3)硅烷偶聯(lián)劑是通過(guò)與羥基磷灰石納米顆粒表面的羥基進(jìn)行結(jié)合，具有比較高 的穩(wěn)定性；硅烷偶聯(lián)劑屬于低分子的有機(jī)硅化物，通過(guò)它對(duì)羥基磷灰石納米顆粒進(jìn)行125I 標(biāo)記，對(duì)羥基磷灰石納米顆粒的尺寸大小影響很小。通過(guò)X射線衍射(XRD)和透射電鏡 (TEM)檢測(cè)，所得到的標(biāo)記產(chǎn)物為羥基磷灰石組成相，其幾何尺寸在標(biāo)記前后基本未變化， 仍屬于納米顆粒的范疇。


圖1為硅膠薄層紙層析法(ITLC/SG法)對(duì)羥基磷灰石納米顆粒標(biāo)記產(chǎn)物的鑒定 結(jié)果圖；圖2為羥基磷灰石納米顆粒標(biāo)記產(chǎn)物的室溫環(huán)境下32天的穩(wěn)定性變化的結(jié)果 圖；圖3為羥基磷灰石納米顆粒標(biāo)記產(chǎn)物的XRD檢測(cè)結(jié)果；圖4a為羥基磷灰石納米顆粒標(biāo)記前的TEM檢測(cè)圖；圖4b為羥基磷灰石納米顆粒標(biāo)記產(chǎn)物的TEM檢測(cè)圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)驗(yàn)及其結(jié)果分析和相應(yīng)的說(shuō)明書(shū)附圖，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō) 明。(1)羥基磷灰石納米顆粒的硅烷氨基化將羥基磷灰石納米顆粒置于無(wú)水乙醇溶液中，40KHz頻率下超聲30min，用無(wú)水乙 醇反復(fù)清洗后備用。在90mL乙醇溶劑中加入IOmL氨基丙基三乙氧基硅烷(分子式為 (CH3CH2O)3SiCH2CH2CH2NH2)的稀釋溶液(偶聯(lián)劑乙醇=1 5，V/V)，滴加氫氧化鈉溶液使 溶液PH值為8，室溫下繼續(xù)攪拌水解lh。將200mg羥基磷灰石納米顆粒加入到水解偶聯(lián)劑 溶液中，50 60°C的水浴中攪拌反應(yīng)6h，反應(yīng)結(jié)束后，室溫放置2天，過(guò)濾，用乙醇洗滌，真 空干燥得到氨基改性羥基磷灰石納米顆粒。(2) 125I-BH標(biāo)記物的制備將5mg對(duì)羥基苯丙酸琥珀酰亞胺脂試劑(Bolton-himter試劑，BH試劑)溶解在 500 μ 1重蒸餾苯中，取5 μ g BH試劑苯溶液于小反應(yīng)管內(nèi)，氮?dú)獯蹈珊?，依次加? μ 1分 析純的N，N 二甲基甲酰胺(DMF)和1.5μ1 Na125I溶液(60MBq)，然后加入5 μ 1 (20 μ g) 氯胺T (Ch-T)溶液，室溫下反應(yīng)Imin后馬上加入5 μ 1 (60 μ g)的偏重亞硫酸鈉，和 50 μ 1 (200 μ g)的碘化鉀溶液(0. 05mol/L pH7. 4的磷酸緩沖液新鮮配制)，混勻終止反應(yīng)。 在上述反應(yīng)液中加入5μ1 N，N 二甲基甲酰胺(DMF)，250 μ 1重蒸餾苯提取125I-BH試劑，再 小心吸出苯溶液于小反應(yīng)管中，并氮?dú)獯蹈桑吹?25I-BH標(biāo)記物。(3) 125I-BH標(biāo)記物與氨基 化的羥基磷灰石納米顆粒連接
將上述步驟(2)中裝有125I-BH標(biāo)記物的小反應(yīng)管置于冰浴中，加入50 μ 1上述步 驟(1)中制得的硅氨基化的羥基磷灰石納米顆粒溶液(含量為100 μ g，在0. 05mol/L pH 8. 4的硼酸緩沖液，并通過(guò)40KHz超聲振蕩15min)，冰浴中攪拌反應(yīng)30min，再加入150 μ 1 0. 2mol/L的甘氨酸溶液(用0. 05mol/L pH 8. 4的硼酸緩沖液配制)，室溫下繼續(xù)攪拌反應(yīng) 15min,以除去過(guò)量的125I-BH標(biāo)記物。將上述小反應(yīng)管中取出反應(yīng)液到5ml的離心管中，加入2ml 50%乙醇水溶液，超 聲振蕩20min后，4°C，3000rpm離心lOmin，吸去上清液，沉淀物即為標(biāo)記產(chǎn)物。用4ml 50% 乙醇水溶液分二次離心洗滌沉淀物，再用2ml乙醇離心洗滌沉淀物后，加入Iml乙醇，超聲 振蕩20min，凍干備用。(4)標(biāo)記產(chǎn)物的鑒定
采用硅膠薄層紙層析法(ITLC/SG法)進(jìn)行鑒定。以快速硅膠薄層層析紙(ITLC/ SG)為載體，用2. 5% BSA(W/W)的0. Olmol/L pH7. 4的PBS緩沖液展開(kāi)，然后將每條層析紙 剪成Icm等距離的小紙條，放入放射性測(cè)量試管中進(jìn)行測(cè)定。125I-BH標(biāo)記物、125I-甘氨酸和 125F Rf值都在0. 80 1. 00范圍，而已標(biāo)記的羥基磷灰石納米顆粒Rf值是0. 00，在紙層析 條原點(diǎn)不動(dòng)，與未標(biāo)記的羥基磷灰石納米顆粒在紙層析條中展開(kāi)行為相同。經(jīng)以上方法鑒 定所制得的標(biāo)記產(chǎn)物放射性化學(xué)純度> 95% (見(jiàn)附圖1)。(5)標(biāo)記產(chǎn)物的穩(wěn)定性檢測(cè)將標(biāo)記產(chǎn)物分散于0. Olmol/LpH值為7. 4的PBS溶液中，室溫保存，定期采用硅膠 薄層紙層析法(ITLC/SG法)檢測(cè)溶液中放射性物質(zhì)的性質(zhì)，根據(jù)紙層析條帶原點(diǎn)位置上的 放射性計(jì)數(shù)與整個(gè)紙層析條帶放射性計(jì)數(shù)的比值計(jì)算未解離的標(biāo)記產(chǎn)物的百分率，從而評(píng) 價(jià)標(biāo)記產(chǎn)物的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，室溫放置32天后，標(biāo)記產(chǎn)物的穩(wěn)定性良好(見(jiàn)附圖2)。(6)標(biāo)記產(chǎn)物的表征采用X射線衍射(XRD)和透射電鏡(TEM)檢測(cè)所得到的羥基磷灰石納米顆粒標(biāo)記 產(chǎn)物的組成相及粒徑變化情況，其結(jié)果請(qǐng)見(jiàn)圖3、圖4a及圖4b所示，所得到的標(biāo)記產(chǎn)物為羥 基磷灰石組成相，其幾何尺寸在標(biāo)記前后基本未變化，仍屬于納米顆粒的范疇。
權(quán)利要求
一種羥基磷灰石納米顆粒放射性核素標(biāo)記產(chǎn)物，其特征在于，所述放射性核素是125I。
2.權(quán)利要求1所述標(biāo)記產(chǎn)物的制備方法，該方法包括以下步驟a.硅烷偶聯(lián)劑稀釋溶液處理羥基磷灰石納米顆粒，使其硅烷氨基化；b.125I_BH標(biāo)記物的制備；c.125I-BH標(biāo)記物與氨基化的羥基磷灰石納米顆粒連接。
3.按照權(quán)利要求2所述的制備方法，其中步驟a中所述的硅烷偶聯(lián)劑為氨基丙基三乙 氧基硅烷(分子式為(CH3CH20)3SiCH2CH2CH2NH2)。
4.按照權(quán)利要求3所述的制備方法，其中所述的氨基丙基三乙氧基硅烷的稀釋溶液配 比為偶聯(lián)劑乙醇=1 5V/V。
5.按照權(quán)利要求2或4所述的制備方法，其稀釋溶液的PH值為8。
6.按照權(quán)利要求2所述的制備方法，其中步驟c中的氨基化的羥基磷灰石納米顆粒經(jīng) 過(guò)以下處理在0. 05mol/L pH 8. 4的硼酸緩沖液中，并通過(guò)40KHz超聲振蕩15min。
7.按照權(quán)利要求2所述的制備方法，其中步驟c中的連接在以下條件下進(jìn)行冰浴中 攪拌反應(yīng)30min，再加入0. 2mol/L的甘氨酸溶液，所述甘氨酸溶液用0. 05mol/L pH 8. 4的 硼酸緩沖液配制。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種羥基磷灰石納米顆粒放射性核素標(biāo)記產(chǎn)物及其制備方法，所述的羥基磷灰石納米顆粒標(biāo)記產(chǎn)物可由下述方法制備獲得，其步驟為(a)硅烷偶聯(lián)劑對(duì)羥基磷灰石納米顆粒進(jìn)行氨基化表面改性；(b)125I-BH標(biāo)記物的制備；(c)125I-BH標(biāo)記物與改性的羥基磷灰石納米顆粒連接。本發(fā)明選用化學(xué)活潑性高的放射性核素125I，它具有合適的半衰期，為60天。通過(guò)這種標(biāo)記方法所得到的125I標(biāo)記產(chǎn)物穩(wěn)定，可以用于羥基磷灰石納米顆粒的體內(nèi)顯像和分布學(xué)研究。
文檔編號(hào)A61K101/02GK101829341SQ200910047550
公開(kāi)日2010年9月15日 申請(qǐng)日期2009年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月13日
發(fā)明者丁婷婷, 孫皎, 謝廣平, 鐘高仁 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院