專利名稱：N-[4-(n-{5-[(2,3-二氫-1h-茚-5-基氧)甲基]-2-呋喃基}乙酰肼基)苯基]環(huán)戊烷甲酰胺 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化工領(lǐng)域及醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
親環(huán)素Cycliphilins(CyPs)是普遍分布的細胞內(nèi)蛋白，在植物、細菌和哺乳動物中均存在，具有高度保守性，最初是作為環(huán)孢素A的細胞受體被發(fā)現(xiàn)的。環(huán)孢素 A(CyclosporinA,CsA)是從真菌代謝產(chǎn)物中分離得到的含11個氨基酸的環(huán)狀多肽，是一種 用于器官移植和自身免疫性疾病的免疫抑制劑，已被廣泛用于臨床，年銷售額在50億美元 以上。由于CsA用于臨床以來表現(xiàn)出各種毒副作用，對患者及移植物存活率的影響越來越 引起人們的重視，許多科學(xué)研究者正在努力尋找與CsA作用類似的、毒副作用低的替代物。 目前CsA也已經(jīng)開始用于腫瘤治療當(dāng)中，并且主要是與其它抗癌藥物如紫杉醇、阿霉素、長 春新堿等搭配使用，增強這些藥物的抗腫瘤活性(Clin Cancer Res. 11，2320-2326)。因為 環(huán)孢菌素A同時也是極為有效的免疫抑制劑，因此用于這些疾病的治療時不可避免會帶來 免疫抑制的副作用?？朔庖咭种频姆椒ㄖ饕獌煞N，一是對環(huán)孢菌素A的免疫抑制基團進 行修飾，或者從真菌中提取非免疫抑制的環(huán)孢菌素衍生物；另一種方法是根據(jù)CYP蛋白的 結(jié)構(gòu)，篩選或設(shè)計新的非肽類小分子抑制劑。CyPJ是CyP家族的新成員，CYP-J cDNA長1. 25Kb，編碼161個氨基酸，已從人的 胎腦cDNA文庫中分離并鑒定(Cytogenet. Cell Genet. 92，231-236)。在氨基酸序列上與線 蟲(C. elegans.) CYPlO具有72%的同源性。其具體核苷酸和氨基酸序列詳見NCBI網(wǎng)站上 基因登陸號為AF146799的基因報告。CYPJ蛋白能促進肝癌細胞的克隆形成率，可以促進肝 癌細胞物質(zhì)的復(fù)制增殖，并且能促進肝癌腫瘤細胞生長，因此，可以作為篩選抗肝癌藥劑的 靶標(biāo)。惡性腫瘤已成為人類致死的最重要原因之一，但是目前市售的抗腫瘤藥物均有各 種不良反應(yīng)，因此，尋找新型的低副作用抗腫瘤藥物成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域的一大熱點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供N-[4-(N-{5-[(2，3-二氫-IH-茚-5-基氧)甲基]_2_呋喃 基}乙酰胼基)苯基]環(huán)戊烷甲酰胺在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了 N-[4-(N-{5-[(2，3-二氫-IH-茚-5-基氧)甲基]_2_呋喃基} 乙酰胼基)苯基]環(huán)戊烷甲酰胺(即 N- [4- (N- {5- [ (2, 3-dihydro-lH-inden-5-yloxy) methyl]-2-furoyl}ethanehydra zonoyl)phenyl]cyclopentanecarboxamide),也可禾爾 為 5_[(2，3-dihydro-lH-inden-5-yloxy)methyl]-N，-[(IZ)-I-(4-cyclopentanecarb oxamide)-phenylethyIidene]-2-furohydrazide,5-[(2,3- 二 氧-IH-弗-5-氧)甲 基]-N- [ (IZ)-1-(4-環(huán)戊烷甲酰胺基)-苯基亞乙基]-2-呋喃酰胼，其分子量為524. 62，在本發(fā)明中簡稱為FD068，其結(jié)構(gòu)式為 先前對于本發(fā)明的FD068的研究主要集中在其是一種CypJ抑制劑，BIAcore分子 互作儀驗證其能與CypJ結(jié)合，其平衡一解離常數(shù)KD(M) 7. 05士0. 13X10_6，Chi2 = 0. 263。 其中，Chi2是BIAcore統(tǒng)計軟件中用于檢測實驗誤差的一個數(shù)據(jù)。其次，通過α-胰凝乳蛋 白酶活性測定法(a-chymotrypsin-coupled enzymic assay)測得本發(fā)明的 1_[2-(3_ 乙 氧苯基)喹啉-4-基]-2-{[4-甲氧基-3-(嗎啉甲基)苯基]二氮烯}乙酮，其酶活抑制 IC5tl值(μΜ)為14.17 士 0.53。本發(fā)明中，酶活抑制IC5tl值是指抑制酶活性50%時所需的 藥物濃度。我們以不加小分子抑制劑的反應(yīng)作為對照反應(yīng)，測定小分子配體在不同濃度下對 酶活反應(yīng)的抑制率，從而計算出小分子配體的酶活抑制IC5tl值。進一步的研究表明，本發(fā)明的CypJ小分子抑制劑FD068對腫瘤細胞(肝癌細胞 HepG2細胞、SK-Hepl細胞、7721細胞等)生長有抑制作用。本發(fā)明測定了 FD068對SK-Ifepl細胞的殺傷情況，結(jié)果顯示，F(xiàn)D068對肝癌細胞有 一定程度的殺傷力。此外，F(xiàn)D068還能夠有效降低SK-H印1細胞的克隆形成率。從而認為 本發(fā)明的FD068有抑制肝癌細胞增長的作用。因此，本發(fā)明的FD068能夠抑制CYPJ的活性或者表達量，既可以用于制備抗肝癌 藥物。本發(fā)明的小分子化合物可以采用各種常規(guī)的制備方法制備。例如，采用人工化學(xué) 合成的方法。利用本發(fā)明小分子化合物，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與FD068發(fā)生相互 作用的物質(zhì)，如受體、抑制劑或拮抗劑等。本發(fā)明及其抑制劑、拮抗劑等，當(dāng)在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效 果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH 通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而 有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)肌 內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。以本發(fā)明的FD068為例，可以將其與合適的藥學(xué)上可接受的載體聯(lián)用。這類藥物 組合物含有治療有效量的化合物和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不 限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本 發(fā)明的FD068可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通 過常規(guī)方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量， 例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的FD068還可與其他 治療劑一起使用。本發(fā)明的FD068在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用中，可以是針劑或者片劑。當(dāng)本發(fā)明的FD068被用作藥物時，可將治療有效劑量的該多肽施用于哺乳動物， 其中該治療有效劑量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克 /千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量 還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。 更好的，本發(fā)明的FD068可以應(yīng)用于制備抗肝癌藥物。本發(fā)明還提供了一種殺傷腫瘤細胞的方法，即將FD068加入腫瘤細胞的培養(yǎng)液 中。具體的方法可以采用實施例2中所采用的方法，或者其它常規(guī)的操作。本發(fā)明中，所述的腫瘤細胞可以是H印G2細胞、SK-H印1細胞或者7721細胞。結(jié) 果表明，本發(fā)明的FD068對于腫瘤細胞，尤其是如H印G2細胞、SK-Ifepl細胞或者7721細胞 等的肝癌細胞殺傷效果非常明顯。本發(fā)明提供了小分子化合物N- [4- (N- {5- [ (2，3- 二氫-IH-茚-5-基氧)甲 基]-2-呋喃基}乙酰胼基)苯基]環(huán)戊烷甲酰胺在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。該化合物 能夠明顯抑制腫瘤細胞的增殖。FD068是針對細胞靶點CYPJ設(shè)計的藥物，不易形成耐藥性， 而且，對于高表達CYPJ蛋白的腫瘤細胞效果特別明顯。因此，本發(fā)明的小分子化合物作為 新的抗腫瘤藥物進行開發(fā)，抑瘤效果明顯，特異性好。因此，本發(fā)明的FD068可以作為新的 抗腫瘤藥物進行開發(fā)，為治療和治愈腫瘤提供了一種新的途徑和手段。
具體實施例方式實施例1利用酶活實驗證明小分子化合物對CypA酶活抑制的能力測定CyP活性的方法很多，但以α _胰凝乳蛋白酶活性測定法 (α -chymotrypsin-coupled enzymic assay)最常用。我們以不加小分子抑制劑的反應(yīng)作為對照反應(yīng)，測定各個小分子配體在不同濃度 下對酶活反應(yīng)的抑制率，從而計算出各個小分子配體的IC5tl值。本發(fā)明的N-[4-(N-{5-[(2， 3-二氫-IH-茚-5-基氧)甲基]-2-呋喃基}乙酰胼基)苯基]環(huán)戊烷甲酰胺(CHEMCATS Order Number :AK_968/15604391)。其酶活抑制 IC5tl 值(μ Μ)為 18. 67士 1. 74。實施例2MTS法測定FD068對SK-Ifepl細胞的生長抑制作用人肝癌細胞株SK-Ifepl細胞(ATCC公司)2 5Χ103/孔接種至96孔板，培養(yǎng) 24小時使之貼壁后加入FD068 (Interchim公司，ΑΚ-968/15603640)，設(shè)6個濃度梯度，每 個濃度設(shè)3個復(fù)孔。細胞在37°C，5% CO2條件下培養(yǎng)72小時后，倒掉培養(yǎng)液，用MTS試 劑盒(Promega公司)測定細胞存活率，測試方法為將細胞用無血清培養(yǎng)基洗一遍，按照 100 μ 1/well的量加入預(yù)先配制好的MTS顯色溶液(IOml無血清培養(yǎng)基中加入2ml溶液1 和100 μ 1溶液2，充分混勻)。將一個沒有細胞的孔設(shè)為本底孔，用以校正溶液的背景光吸 收。把細胞放入細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 4小時，然后用酶標(biāo)儀讀取光吸收值(參考波 長630-700nm，測定波長490nm)，計算細胞存活率，以測定孔光吸收值/對照孔光吸收值作 為細胞存活率的數(shù)值。
結(jié)果N-[4-(N-{5-[(2，3-二氫-IH-茚-5-基氧)甲基]_2_呋喃基}乙酰胼基) 苯基]環(huán)戊烷甲酰胺對SK-Ifepl細胞的半數(shù)抑制濃度IC5tl值為45ug/ml。其中，半數(shù)抑制濃度IC5tl值是指抑制細胞生長50%時所需的藥物濃度。實施例3FD068對克隆形成率的影響 SK-H印1細胞(ATCC公司)1000個/皿接種于60mm細胞培養(yǎng)皿，一組加入FD068， 另一組加入DMSO作為對照。連續(xù)培養(yǎng)15-20天時間，中間酌情換液。用室溫IXPBS洗一次， 加2ml預(yù)冷的甲醇4°C固定lOmin。棄去固定用的甲醇，用預(yù)冷的1 XPBS洗一次，加GIMESA 染色劑，室溫染色lOmin，清水洗3遍，去浮色，拍照、計數(shù)。根據(jù)細胞數(shù)目確定克隆大小，大于200個細胞的稱為大克隆，100-200個細胞之間 的稱為中克隆，50-100個細胞之間的稱為小克隆。比較大中克隆之間的差異，重復(fù)2次每次 三皿取平均值，加入FD068后SK-H印1細胞所形成的克隆數(shù)顯著少于加入DMSO后所形成的 克隆數(shù)，尤其是大克隆比對照少了近30%。這些結(jié)果提示，F(xiàn)D068能抑制細胞克隆形成。
權(quán)利要求
N-[4-(N-{5-[(2，3-二氫-1H-茚-5-基氧)甲基]-2-呋喃基}乙酰肼基)苯基]環(huán)戊烷甲酰胺在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，該抗腫瘤藥物為針劑或者片劑。
3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的抗腫瘤藥物是抗肝癌藥物。
4.一種抑制腫瘤細胞增殖的方法，其特征在于，將N-[4-(N-{5-[(2，3- 二 氫-IH-茚-5-基氧)甲基]-2-呋喃基}乙酰胼基)苯基]環(huán)戊烷甲酰胺加入腫瘤細胞的 培養(yǎng)液中。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的腫瘤細胞是H印G2細胞、SK-Hepl細 胞或者7721細胞。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程和化學(xué)領(lǐng)域，涉及N-[4-(N-{5-[(2，3-二氫-1H-茚-5-基氧)甲基]-2-呋喃基}乙酰肼基)苯基]環(huán)戊烷甲酰胺在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。尋找新型的低副作用抗腫瘤藥物是生物醫(yī)藥領(lǐng)域的一大熱點。N-[4-(N-{5-[(2，3-二氫-1H-茚-5-基氧)甲基]-2-呋喃基}乙酰肼基)苯基]環(huán)戊烷甲酰胺能夠明顯抑制腫瘤細胞的增殖，并且，該化合物是針對細胞靶點CYPJ蛋白結(jié)構(gòu)設(shè)計的，對于高表達CYPJ蛋白的腫瘤細胞效果特別明顯。因此，本發(fā)明的小分子化合物作為新的抗腫瘤藥物進行開發(fā)，抑瘤效果明顯，特異性好。
文檔編號A61K31/341GK101843611SQ200910048259
公開日2010年9月29日 申請日期2009年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月26日
發(fā)明者余龍, 張明君 申請人:復(fù)旦大學(xué)