專(zhuān)利名稱(chēng)：：西沙海綿中一種環(huán)九肽類(lèi)化合物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，是產(chǎn)自西沙群島附近海域的海洋動(dòng)物棕色扁海綿中的一種具有抗腫瘤活性的新的環(huán)九肽類(lèi)化合物。
背景技術(shù)：
：海綿是一種低等的多細(xì)胞動(dòng)物，其分布廣泛但常含有很多結(jié)構(gòu)罕見(jiàn)的具有抗癌活性的次生代謝產(chǎn)物，因此一直是海洋天然產(chǎn)物化學(xué)家首選海洋生物研究對(duì)象。本發(fā)明的藥源材料P/z"fe肌"海綿屬尋常綱(Demospongiae)軟海綿目(Halichondrida)小軸海綿科(Axindlidae)海綿。2002年，曾從我國(guó)南海西沙永興島上采集的戶(hù)/"""海綿中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)新的環(huán)肽phakemastatin12并已申請(qǐng)專(zhuān)利(申請(qǐng)?zhí)?1113389.9)。之前的所有Phakellistatins類(lèi)環(huán)肽化合物均是由美國(guó)亞利桑那州立大學(xué)Pettit小組從尸/wfe/""屬海綿中發(fā)現(xiàn)的，但至今未見(jiàn)有關(guān)具有抗腫瘤活性的新的環(huán)九肽類(lèi)化合物的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種從中國(guó)西沙群島附近海域的棕色扁海綿中分離到新的環(huán)九肽類(lèi)化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下本發(fā)明化合物的制備方法如下:1.提取，制備總提物將千燥的棕色扁海綿(P./W")粉碎后，按常規(guī)用95%乙醇冷浸提取，得提取液，將提取液濃縮得浸膏，加入50%的乙酸乙酯水溶液進(jìn)行提取，得乙酸乙酯總提物。2.分離純化1)制備粗提物將乙酸乙酯總提物用90%甲醇混懸，按常規(guī)經(jīng)石油醚脫脂后，將甲醇水層用正丁醇萃取，得粗提物；2)分離純化環(huán)肽類(lèi)化合物將粗提物上SephadexLH-20凝膠柱色譜，以純甲醇為洗脫劑，根據(jù)薄層層析檢識(shí)結(jié)果，收集含有環(huán)肽類(lèi)化合物的洗脫液部分，再進(jìn)行反相硅膠柱色譜，以體積比為l:1-1:0的甲醇/水混合溶劑梯度洗脫，再以反相高效液相(55%甲醇/水，流速1.5ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm)制備，得本發(fā)明化合物G48H68Ni20|4°體外活性試驗(yàn)證明，本發(fā)明化合物對(duì)P388、BEL-7402、SPC-A-1、HAC和Colo-26等多種不同的腫瘤細(xì)胞均有一定的抑制活性。因此可用于制備抗腫瘤藥物。本發(fā)明化合物制備方法簡(jiǎn)單，抗腫瘤活性顯著。本發(fā)明為研究和開(kāi)發(fā)新的抗腫瘤藥物提供了新的先導(dǎo)化合物，為開(kāi)發(fā)利用我國(guó)海洋藥用資源提供了科學(xué)依據(jù)。具體實(shí)施例方式現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述。實(shí)施例l.制備本發(fā)明化合物取干燥粉碎后的棕色扁海綿15kg，分別用95%乙醇50L冷浸提取8次，每次一周，合并提取液，提取液經(jīng)減壓濃縮得浸膏，浸膏用50%的乙酸乙酯水溶液進(jìn)行提取，得乙酸乙酯總提物，乙酸乙酯總提物用卯％甲醇混懸，用石油醚脫脂；將醇水層用正丁醇萃取，得粗提物50g;將上述粗提物50g進(jìn)行SephadexLH-20凝膠柱色譜，以純甲醇為洗脫劑，根據(jù)薄層層析檢識(shí)結(jié)果，收集含有環(huán)肽類(lèi)化合物的洗脫液部分，再進(jìn)行反相硅膠柱色譜，以體積比為l:1-1:0的甲醇/水混合溶劑梯度洗脫，再以反相高效液相(55%甲醇/水，流速1.5ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm)制備，得化合物C48H68N12014，其理化性質(zhì)和核磁共振譜數(shù)據(jù)如下化合物<:48^168:^12014:白色玻璃狀粉末。ESI-MS中顯示有[M+Hr峰1037.54、[M+Na]+峰1059.55,確定其分子量為1036。核磁共振譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表l。表1化合物C48H68N12014的核磁共振譜數(shù)據(jù)(DMSO-d6,600MHz/150MHz)Positions13cS'H(mult.J)PositionS'3CS'H(mult.J)Pro4-CH223.441.58(m)卜CO174.21.55Cm)2-CH60.644.00Cm)5-CH240.573.14(m)3-CH228.74a:1.77(m)2.94(m)b:1.26(m)NH9.36(br.s)4-CH224.21a:1.66On)34-C157.42b:1.53(m)=NH5-CH247.13a:3.63(m)-NH2b:3.19(m)C陽(yáng)NH8.76(d,7.2)PheAla1-CO169.241-CO172.252-CH54.444.22(m)2-CH47.584.44(qui,7,0)3-CH234.87a:3.33(m)3-CH318.871.28(d，7.0)b:2.90(m)NH7.58(d,7.0)4-C138.56Val5/5'-CH128.887.08(d，7.S)1-CO171.316/6'-CH128.17.23(t,7.5)2-CH59.963.98(t，7.0)7-CH126.197.16(t，7.5)3-CH29.382.07(m)NH7.23(br.s)4-CH318.380.87(d,6.8)Asp5-CH319.430.89(d,6.8)1-CO172.72NH8.08(d,6.3)2-CH50.284.71(br.t10.2)Thr3-CH241.96a:2.82(m)1-CO169.67b:2.17(m)2-CH58.833.98(m)4-CO175.783-CH65.584.15(m)OHOH5.03(br.s)NH7.00(d，8.8)4-CH320.630.98(d，6.4)SerNH7.63(d，7.5)1-CO169.89Tyr2-CH57.364.01(m)1-CO170.413-CH260.63a:3.78(m)2-CH51.154.81(q，7.4)b:3.68(br.d，7.8)3-CH236.57a:2.83(m)OH4.88(d,6.0)b:2.94(m)NH8.53(d,4.4)4-C126.92Arg5/5'-CH130.067.06(d,8.3)1-CO171.496/6'-CH1〗5.116.64(d，8.3)2-CH53.334.04(m)5-C155.93-CH227.81.79(m)OH61.72(m)NH7.01(d，8.2)體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)使用的腫瘤細(xì)胞株為上海天甲公司提供的P388(小鼠白血病)、BEL-7402(人肝癌)、SPC-A-1(人肺癌)、HAC(小鼠肝癌腹水瘤)、Colo-26(小鼠結(jié)腸癌)。實(shí)驗(yàn)方法采用常規(guī)的四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法，臺(tái)盼蘭染色法。實(shí)驗(yàn)分3組空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和本發(fā)明化合物組。陽(yáng)性對(duì)照藥為長(zhǎng)春新堿。將本發(fā)明化合物和陽(yáng)性對(duì)照藥分別用DMSO溶解，配成IOO，50，25，12.5，6.25，3.125(微克/毫升)6種濃度，細(xì)胞先按常規(guī)以10%的小牛血清培養(yǎng)，傳代時(shí)貼壁細(xì)胞以0.2%的胰酶消化液消化，使細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，實(shí)驗(yàn)時(shí)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔接種180微升，濃度為5><104個(gè)/毫升的細(xì)胞懸液。置37匸的C02培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)過(guò)夜后，每孔加20微升藥物溶液，空白對(duì)照組加20微升DMSO，每種濃度重復(fù)5孔。藥物作用于細(xì)胞3天后進(jìn)行MTT法測(cè)定，于96孔培養(yǎng)板每孔加入濃度為5毫克/毫升的MTT工作液10微升，37。C孵育4小時(shí)，棄上清液，加100微升DMSO，在570納米波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。臺(tái)盼蘭排染法，加入臺(tái)盼蘭工作液，計(jì)數(shù)活細(xì)胞。按下列公式計(jì)算被測(cè)物對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率空白對(duì)照組細(xì)胞數(shù)一用藥組細(xì)胞數(shù)~~空白對(duì)照組細(xì)胞數(shù)~~x100%半數(shù)有效抑制濃度IQJ直采用L0git法計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表2:表2化合物<:48^168^2014對(duì)腫瘤細(xì)胞的半數(shù)有效抑制濃度(ng/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由表2可見(jiàn)，化合物(:48&8^2014對(duì)多種不同的腫瘤細(xì)胞株均表明有一定的抑制作用，其中對(duì)小鼠P388的IC5。值僅為5.6pg/ml，且明顯優(yōu)于對(duì)照藥長(zhǎng)春新堿，故可以用于制備抗腫瘤藥物。本發(fā)明為研制新的抗腫瘤藥提供了新的先導(dǎo)化合物。權(quán)利要求1.一種環(huán)九肽類(lèi)化合物，其特征在于化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下2權(quán)利要求1所述九肽類(lèi)化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，是產(chǎn)自西沙群島附近海域的海洋動(dòng)物棕色扁海綿Phakelliafusca中的一種具有抗腫瘤活性的新的環(huán)九肽類(lèi)化合物。其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如右所示。體外活性試驗(yàn)證明，本發(fā)明化合物對(duì)多種不同的腫瘤細(xì)胞均有顯著的抑制活性，其中對(duì)小鼠P388的IC₅₀值僅為5.6μg/ml，且明顯優(yōu)于對(duì)照藥長(zhǎng)春新堿。因此可用于制備抗腫瘤藥物。本發(fā)明為研制新的抗腫瘤藥提供了新的先導(dǎo)化合物。文檔編號(hào)A61P35/00GK101519435SQ20091004898公開(kāi)日2009年9月2日申請(qǐng)日期2009年4月9日優(yōu)先權(quán)日2009年4月9日發(fā)明者張紅軍,曹桂東,帆楊,林厚文,濤董,陳萬(wàn)生申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)