專利名稱：：西沙海綿中一種環(huán)八肽類化合物及其用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術領域：
，是產(chǎn)自西沙群島附近海域的海洋動物棕色扁海綿戶;^fe//^/w"a中的一種具有抗腫瘤活性的新的環(huán)八肽類化合物。
背景技術：
：海綿是一種低等的多細胞動物，其分布廣泛，但常含有很多結(jié)構(gòu)罕見的具有抗癌活性的次生代謝產(chǎn)物，因此一直是海洋天然產(chǎn)物化學家首選海洋生物研究對象。本發(fā)明的藥源材料P/za^//^海綿屬尋常綱(Demospongiae)軟海綿目(Halichondrida)小軸海綿科(Axinellidae)海綿。2002年，曾從我國南海西沙永興島上采集的Py&ca海綿中發(fā)現(xiàn)了1個新的環(huán)肽phakelliastatin12并已申請專利(申請?zhí)?1113389.9)。之前的所有Phakellistatins類環(huán)肽化合物均是由美國亞利桑那州立大學Pettit小組從尸/zflfe//^屬海綿中發(fā)現(xiàn)的，但至今未見有關具有抗腫瘤活性的新的環(huán)八肽類化合物的報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種從中國西沙群島附近海域的棕色扁海綿中分離到的具有抗腫瘤活性的新的環(huán)八肽類化合物，包括兩個化合物，經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振等光譜技術檢測分析，其化學結(jié)構(gòu)通式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中，基團R1表示，或R2表示CH(CH3)2或CHCH3(CH2CH3)，R3表示CH2CH(CH3)2或CH2CH(CH3)2，R4表示CHCH3(CH2CH3)或CHOH(CH3)，R5表示CHCH3(CH2CH3)或CH2CH(CH3)2，本發(fā)明化合物Rl~R5的基團搭配如下化合物i.乂/、HNRl.化合物2.、HN.R2R3R4R5CH(CH3)2CH2CH(CH3)2CHCH3(CH2CH3)CHCH3(CH2CH3)CHCH3(CH2CH3)CH2CH(CH3)2CH〇H(CH3)CH2CH(CH3)2本發(fā)明化合物的制備方法如下1.提取，制備總提物將干燥的棕色扁海綿(P/wca)粉碎后，按常規(guī)用95%乙醇冷浸提取，得提取液，將提取液濃縮得浸膏，加入50%的乙酸乙酯水溶液進行提取，得乙酸乙酯總提物；2.分離純化1)制備粗提物將乙酸乙酯總提物用卯％甲醇混懸，按常規(guī)經(jīng)石油醚脫脂后，加水將混懸液的甲醇濃度調(diào)至60%，用二氯甲垸萃収，濃縮萃取液，得粗提物；2)分離純化環(huán)肽類化合物將上述粗提物過SephadexLH-20凝膠柱，用體積比CH2Cl2-MeOH:l:1的洗脫液洗脫，根據(jù)薄層層析檢識的結(jié)果，收集含有環(huán)肽類化合物的洗脫液部分，再進行反相硅膠柱色譜，以體積比為l:1-1:0的甲醇冰混合溶劑梯度洗脫，再以反相高效液相(55%甲醇/水，流速1.5ml/min，檢測波長為280nm)，分別得到化合物1和化合物2。體外活性試驗證明其對P388、BEL-7402、SPC-A-1、HAC和Colo-26等多種不同的腫瘤細胞均有明顯的抑制活性。因此可用于制備抗腫瘤藥物。本發(fā)明化合物制備方法簡單，抗腫瘤活性顯著。本發(fā)明為研究和開發(fā)新的抗腫瘤藥物提供了新的先導化合物，為開發(fā)利用我國海洋藥用資源提供了科學依據(jù)。具體實施例方式現(xiàn)結(jié)合實施例對本發(fā)明做詳細描述。實施例l.制備本發(fā)明化合物取干燥粉碎后的棕色扁海綿15kg，分別用95%乙醇50L冷浸提取8次，每次一周，合并提取液，提取液經(jīng)減壓濃縮得浸膏，用50%乙酸乙酯水溶液進行提取，得乙酸乙酯總提物，將乙酸乙酯總提物用卯％甲醇混懸，用石油醚脫脂后，加水將混懸液的甲醇濃度調(diào)至60%，用二氯甲垸萃取3次，濃縮萃取液，得粗提物55g;將上述粗提物55g過SephadexLH-20凝膠柱，用CH2Cl2-MeOH=1:1洗脫，根據(jù)薄層層析檢識結(jié)果，收集含有環(huán)肽類化合物的洗脫液，再進行反相硅膠柱色譜，以體積比為l:1-1:0的甲醇/水混合溶劑梯度洗脫，再以反相高效液相(55%甲醇/水，流速1.5ml/min,檢測波長為280nm)，分別得到化合物1和化合物2?；衔?禾n2的理化性質(zhì)和核磁共振譜數(shù)據(jù)如下化合物1:白色玻璃狀粉末。ESI-MS中顯示有[M+Na]+峰938.35、[M+K]+峰954.32，確定其分子量為915，核磁共振譜數(shù)據(jù)見表l。其化學結(jié)構(gòu)式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>表l.本發(fā)明化合物1的核磁共振譜數(shù)據(jù)(DMSO-d6，600MHz/150MHz)Position15S13CS'H(mult.y)Position13S,3CS'H—It—Pro'5-CH247.29a:3.87(m)1-CO170.9b:3.59On)2-CH60.923.88(m)Leu3-CH228.83a:1.94(m)1-CO170.11b:1.78(m)2-CH54.094.50(m)4-CH224.73a:1.76(m)3-CH237.29a:2.14Cm)b:1.73(m)b:1.60(m)5-CH247.05a:3.59(m)4-CH24.461.47(m)b:3.49(m)5-CH320.650.85(d，6.8)丁rp6-CH323.230.87(d，6.8)1-CO跳75NH8.25(d，6.8)2-CH56.463.75(m)lie13-CH223.51a:3.62(m)卜CO171.5b:3.40(dd，3.1，14.5)2-CH53.934.65(m)4-C111.433-CH37.961.74(m)5-CH123.496.98(br.s)4-CH223.16a:1.31(m)NH10.73(br.s)b:1.15(m)6-C136.115-CH310.940.75(t,7.6)7-CH111.237.32(d，8.0)6-CH314.830.85(d，6.6)8-CH120.717.05(t，8.0)NH7.55(d,8.0)9-CH117.986.96(t，8.0)Pro310-CH118.077.47(d，8.0)1-CO169.85ll-C127.012-CH59.414.54(m)NH8.20(d,6.8)3-CH228.83a:2.12(m)Valb:1.71(m)卜CO169.364-CH224.81a:1.83(m)2-CH55.814.52(t，10.0)b:1.73(m)3-CH29.852.11(m)5-CH247.35a:3.50(m)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>化合物2:白色玻璃狀粉末，ESI-MS顯示有[M-H]—峰916.63、[M+Na]+峰940.63，確定其分子量為917。核磁共振譜數(shù)據(jù)見表2。其化學結(jié)構(gòu)式為表2化合物2的核磁共振譜數(shù)據(jù)(DMSO-d6，600MHz/150MHz)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>3-CH224.58a:3.47(m)NH8.76(d，6.8)b:3.36(dd,3.8，14.4)Thr4-C110.96l-CO168.775-CH123.386.97(br.s)2-CH56.124.87(dd，3.5,9.5)NH]0.76(br.s)3-CH67.654.13(m;)5-C136.054-CH318.991.03(d,6.3)6-CH111.37.32(d，8.0)OH5.22(d,12.8)7-CH120.767.05(t,8.0)NH7.49(d，9.4)8-CH118.16.97(t.8.0)Pro39-CH117.937.46(d，8.0)l-CO170.9310-C127.062-CH59.074.46(dd,4.4，8.7)NH7.91(d，7.1)3-CH228.31a:2.06(m)lieb:1.92(m)l-CO170.114-CH224.54a:1.83(m)2-CH54.194.67(t，10.5)b:1.72(m)3-CH33.012.02(m)5-CH246.92a:3.68(m)4-CH223.31a:1.36(m)b:3.54(m)b:1.03(m)Lsu25-CH39.520.76(t,7.4)l-CO171.36-CH315.070.78(d，6.6)2-CH48.144.44Cm)NH7.40(d，9.8)3-CH238.02a:1.70(m)Pro2b:1.05(m)l-CO170.554-CH24.361.54(m)2-CH60.324.10(t，7.9)5-CH320.860.81(d,6.6)3-CH229.61a:2.15(m)6-CH323.020.86(d，6.6)b:1.71(m)NH8.13(d,8.6)體外抗腫瘤活性實驗實驗使用的腫瘤細胞株為上海天甲公司提供的P388(小鼠白血病細胞株)、BEL-7402(人肝癌細胞株)、SPC-A-1(人肺癌細胞株)、HAC(小鼠肝癌腹水瘤細胞株)、Colo-26(小鼠結(jié)腸癌細胞株)。實驗方法采用常規(guī)的四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法，臺盼蘭染色法。實驗分4組空白對照組、陽性對照組、本發(fā)明化合物l組和化合物2組。陽性對照藥為長春新堿。將本發(fā)明化合物1、2和陽性對照藥分別用:DMSO溶解，配成IOO，50，25，12.5，6.25，3.125(微克/毫升)6種濃度，細胞先按常規(guī)以10%的小牛血清培養(yǎng)，傳代吋貼壁細胞以0.2%的胰酶消化液消化，使細胞處于對數(shù)生長期，實驗吋細胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔接種180微升，濃度為5><104個/毫升的細胞懸液。置37"C的C02培養(yǎng)箱預培養(yǎng)過夜后，每孔加20微升藥物溶液，空白對照組加20微升DMSO，每種濃度重復5孔。藥物作用于細胞3天后進行MTT法測定，于96孔培養(yǎng)板每孔加入濃度為5毫克/毫升的MTT工作液IO微升，37。C孵育4小時，棄上清液，加100微升DMSO，在570納米波長下用酶標儀測定OD值。臺盼蘭排染法，加入臺盼蘭工作液，計數(shù)活細胞。按下列公式計算被測物對癌細胞生長的抑制率空白對照組細胞數(shù)一用藥組細胞數(shù)^空白對照組細胞數(shù)~xl00%半數(shù)有效抑制濃度ICs。值采用L0git法計算。結(jié)果見表3:表3.本發(fā)明化合物1和2對腫瘤細胞的半數(shù)有效抑制濃度(嗎/ml)ic50P388BEL-7402SPC-A曙1HACColo-26化合物l>50>50>50>50>50化合物27.830.4>50>5028.1長春新堿60.2113.4122.383.279.0由表3可見，本發(fā)明化合物1和2對多種不同的腫瘤細胞株均表明有一定的抑制作用，其中化合物2對小鼠P388的IC5o值僅為7.8pg/ml，且明顯優(yōu)于對照藥長春新堿，故可以用于制備抗腫瘤藥物。本發(fā)明為研制新的抗腫瘤藥提供了新的先導化合物。權(quán)利要求1.一種環(huán)八肽類化合物，其特征在于化學結(jié)構(gòu)通式如下其中基團R1表示R2表示CH(CH3)2或CHCH3(CH2CH3)，R3表示CH2CH(CH3)2，R4表示CHCH3(CH2CH3)或CHOH(CH3)，R5表示CHCH3(CH2CH3)或CH2CH(CH3)2；化合物基團搭配分別為化合物1R1為R2為CH(CH3)2、R3為CH2CH(CH3)2、R4為CHCH3(CH2CH3)、R5為CHCH3(CH2CH3)；化合物2R1為R2為CHCH3(CH2CH3)、R3為CH2CH(CH3)2、R4為CHOH(CH3)、R5為CH2CH(CH3)2。2.權(quán)利要求1所述環(huán)八肽類化合物在制備抗腫瘤藥物中的應用。全文摘要本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術領域：
，是產(chǎn)自西沙群島附近海域的海洋動物棕色扁海綿Phakelliafusca中的一種具有抗腫瘤活性的新的環(huán)八肽類化合物。其化學結(jié)構(gòu)通式如式(I)所示，其中基團R₁表示如式(II)所示，R₂表示CH(CH₃)₂或CHCH₃(CH₂CH₃)，R₃表示CH₂CH(CH₃)₂，R₄表示CHCH₃(CH₂CH₃)或CHOH(CH₃)，R₅表示CHCH₃(CH₂CH₃)或CH₂CH(CH₃)₂。體外活性試驗證明其對多種不同的腫瘤細胞均有一定的抑制活性，其中化合物2對小鼠P388的IC₅₀值僅為7.8μg/ml，且明顯優(yōu)于對照藥長春新堿，因此可用于制備抗腫瘤藥物。本發(fā)明為研制新的抗腫瘤藥提供了新的先導化合物。文檔編號A61P35/00GK101519436SQ200910048988公開日2009年9月2日申請日期2009年4月9日優(yōu)先權(quán)日2009年4月9日發(fā)明者張紅軍,樸淑娟,帆楊,林厚文,陳萬生申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學