專(zhuān)利名稱(chēng)：：總合草苔蟲(chóng)中一種甾體類(lèi)化合物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，是從海洋動(dòng)物總合草苔蟲(chóng)中提取的一種新的甾體類(lèi)化合物及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：總合草苔蟲(chóng)&wnYz>^是一種真體腔動(dòng)物，在世界水域分布廣泛，我國(guó)沿海從渤海到南海的西沙群島的多鹽水域都有。該群體呈紅褐色或紫褐色，呈草叢狀，高40150mm，每支有個(gè)蟲(chóng)兩列，交互排列。其群體常附著在海帶、石花菜、貝類(lèi)以及船底、碼頭、航標(biāo)等水下設(shè)施上，影響海洋養(yǎng)殖和國(guó)防、海洋交通，是海洋主要污損生物之一。本申請(qǐng)人曾經(jīng)從此種草苔蟲(chóng)中分離到一種具有抗腫瘤活性的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)化合物并已申請(qǐng)專(zhuān)利(專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?7106686.8)。但至今未見(jiàn)從中提取具有抗腫瘤活性的甾體類(lèi)化合物的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種從海洋動(dòng)物總合草苔蟲(chóng)^^w/fl^nY/"a中提取的具有抗腫瘤活性的新的甾體類(lèi)化合物，為兩個(gè)新的甾體化合物，采用質(zhì)譜和核磁共振等光譜技術(shù)，確定了化合物的結(jié)構(gòu)，分別為(1)3^24(5>二羥基-5，25-二稀-7-甾酮，(2)3/5，25-二羥基-5,23-二稀-7-甾酮，其化學(xué)結(jié)構(gòu)通式如下.當(dāng)R為26日寸，化合物為3^24(5>二羥基-5，25-一稀-7-甾酮，OH當(dāng)R為I時(shí)，化合物為3p,25-二羥基-5,23-二稀-7-甾酮。本發(fā)明化合物的制備方法如下l.提取，制備總提物將干燥總合草苔蟲(chóng)粉碎后，按常規(guī)用95%乙醇冷浸提取，得提取液，將提取液濃縮得浸膏，加入50%的乙酸乙酯水溶液進(jìn)行提取，得乙酸乙酯總提物；2.分離純化1)制備粗提物將乙酸乙酯總提物用90%甲醇混懸，按常規(guī)經(jīng)石油醚脫脂后，調(diào)節(jié)甲醇濃度至60%，用二氯甲烷萃取，得粗提物；2)分離甾體化合物將上述粗提物過(guò)SephadexLH-20凝膠柱，用體積比為1:1的CH;zCl2-MeOH洗脫，根據(jù)薄層層析檢識(shí)的結(jié)果，收集含有甾體類(lèi)化合物的洗脫液部分，過(guò)200300目的正相硅膠柱，以體積比為5:10:1的石油醚/乙酸乙酯混合溶劑梯度洗脫，根據(jù)薄層層析檢識(shí)的結(jié)果，收集含有甾體類(lèi)化合物的洗脫液部分，再按常規(guī)經(jīng)反相硅膠柱色譜分離，以體積比為1:11:0的甲醇/水混合溶劑梯度洗脫，然后經(jīng)反相高效液相色譜(83%甲醇/水，流速1.5mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為239nm)分離，分別得到化合物(1)3",24(5)-二羥基-5，25-二稀-7-甾酮和化合物(2)3^25-二羥基-5，23-二稀-7-甾酮。經(jīng)體外活性試驗(yàn)證明，上述甾體類(lèi)化合物對(duì)HepG2、HT-29和NCI-H460三種不同的腫瘤細(xì)胞均有一定的抗腫瘤活性，ICs。值為22.58)ig/ml至53.41pg/ml，接近甚至優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥長(zhǎng)春新堿，因此可用于制備抗腫瘤藥物。本發(fā)明化合物制備方法簡(jiǎn)單，抗腫瘤活性顯著。本發(fā)明為研究和開(kāi)發(fā)新的抗腫瘤藥物提供了新的先導(dǎo)化合物，為開(kāi)發(fā)利用我國(guó)海洋藥用資源提供了科學(xué)依據(jù)。具體實(shí)施方式現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述。實(shí)施例1.制備本發(fā)明甾體化合物取干燥粉碎后的總合草苔蟲(chóng)50kg，分別用95%乙醇50L冷浸提取5次，每次一周，合并浸提液，浸提液經(jīng)減壓濃縮后得浸膏，浸膏按常規(guī)用50%的乙酸乙酯水溶液進(jìn)行提取，得乙酸乙酯總提物，乙酸乙酯總提物用卯°/。甲醇混懸，按常規(guī)用石油醚脫脂；調(diào)節(jié)甲醇濃度至60%，用二氯甲烷萃取，得粗提物40g;將上述粗提物40g過(guò)SephadexLH-20凝膠柱，用CH2Cl2-MeOH=1:1洗脫，根據(jù)薄層層析檢識(shí)的結(jié)果，收集含有甾體類(lèi)化合物的洗脫液部分，過(guò)200300目正相硅膠柱，以體積比為5:10:1石油醚/乙酸乙酯混合溶劑梯度洗脫，根據(jù)薄層層析檢識(shí)的結(jié)果，收集含有甾體類(lèi)化合物的洗脫液部分，再經(jīng)反相硅膠柱色譜分離，以體積比為l:11:0的甲醇/水混合溶劑梯度洗脫，然后經(jīng)反相高效液相色譜(83%甲醇/水，流速1.5mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為239nm)分離，分別得到化合物(1)3^24(5>二羥基-5，25-二稀-7-甾酮和化合物(2)3尿25-二羥基-5,23-二稀-7-甾酮，其理化性質(zhì)和核磁共振譜數(shù)據(jù)如下(/)3々,24(5>二羥基-5,25-二稀-7-甾酮黃色固體;m.p.144畫(huà)145。C;UV(MeOH)Xmax(s)239(0.03)nm;[a]-63.38。(c0.5,MeOH);ESI-MS—):437.18[M+Na]+,851.37[2M+Na]+;459.19[M+COOH]—,873.51[2M+COOHr;和13C核磁共振譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表(2)3^25-二羥基-5，23-二稀-7-甾酮黃色固體；m.p.145-147°C;UV(MeOH)Xmax(s)239(0.04)nm;[a]))9-71.01o(c0.5，MeOH);IR(KBr)cm.1:3421,2937，2869，1670,1458，1383，1182，1061，970,629;ESI-MS(w/z):437.26[M+Na]+,851.55[2M+Na]+;459.19[M+COOH]-,873.49[2M+COOH]—;'H和l3C核磁共振譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。表1.本發(fā)明化合物1和2的核磁共振譜數(shù)據(jù)(CDC13,500MHz/125MHz)position化合物l化合物2'HS(irt.，mult"/inHz)13CSCmult.)11.94:1H,m)36.36CCH2)1.94(1H,m)36.37(CH2)1.20<:1H，m)1.20(1H,m)21.94<:1H，m)31.22(CH2)1.94(IH，m)31.21(CH2)1.63<:1H，m)1.61(lH,m)33.67(1H，m)70.55(CH)3.68(1H,m)70.53(CH)42.50(1H,m)41,83(CH2)2.51(lH，m)41.83(CH2)2.41(1H,m)2.40(H，m)5165.32(C)165.09(C)65.69(1H，s)126.14(CH)5.69(1H,s)126.13(CH)7202.15(C)202.18(C)82.23(1H,m)45.41(CH)2.24(1H,m)45.41(CH)91.50(IH，m)49.93(CH)1.50(1H,m)49.94(CH)1038.29(C)38.29(C)111.56(舊，m)21.23(CH2)1.57(IH，m)21.22(CH2)1.54(IH，m)1.52(IH，m)122.02〔IH,dt,14.03.6)38.71(CH2)2.02(1H，m)38.64(CH2)uo(1H,m)U3(lH,m)1343.13(C)43.15(C)141.34(IH，m)49.98(CH)1,34(1H，m)49.94(CH)152.42〔1H，trO26,30(CH2)2.42(1H，m)26.34(CH2)2.37〔IH,m)2.37(1H,m)161.89〔IH,m)28.49(CH2)1.92(IH，28.55(CH2)1.26〔IH,m)1.29(lH，m)171.08〔1H'm)54.56(CH)1.09(1H,m)54.47(CH)180.68〔3H,s)11.98(CH3)0.69(3H,s)12.04CCH3)191.20〔3H，s)18.90(CH3)1.20(3H,s)17.33(CH3)201.45〔IH,m)35.53CCH)1.47(IH，m)36.02(CH)210.97〔3H，d，7.2)18.32(CH3)0.92(3H，d，5.0)18.82CCH3)221.47(1H，m)31.72CCH2)2.16(1H,m)38.83(CH2)1.09(1H,m)1.77(1H,m)231.48(IH,m)31.22(CH2)5.59(1H,m)125.35(CH)1.41(1H，m)244.01(1H,t,6.4)76.74(CH)5.59(1H，m)139.54(CH)25147.54(C)70.75(C)264.93(1H，brs)111.40(CH2)1.31(3H,s)29.96(CH3)4.83(1H,brs)271.72(3H,s)17.23(CH3)1.31(3H,s)29.92(CH3)體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)使用的腫瘤細(xì)胞株為上海天甲生物有限公司提供的HepG2(人肝癌細(xì)胞株)、H460(人肺癌細(xì)胞株)和HT-29(人結(jié)腸癌細(xì)胞株)。實(shí)驗(yàn)方法采用常規(guī)的四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法，臺(tái)盼蘭染色法。實(shí)驗(yàn)分4組空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和本發(fā)明化合物1組和化合物2組。陽(yáng)性對(duì)照藥為長(zhǎng)春新堿。將本發(fā)明化合物l、2和陽(yáng)性對(duì)照藥分別用DMSO溶解，配成IOO，50，25，12.5，6.25，3.125(微克/毫升)6種濃度，細(xì)胞先按常規(guī)以10%的小牛血清培養(yǎng)，傳代時(shí)貼壁細(xì)胞以0.2%的胰酶消化液消化，使細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，實(shí)驗(yàn)時(shí)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔接種180微升，細(xì)胞懸液濃度為5xl04個(gè)/毫升。置37"C的C02培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)過(guò)夜后，每孔加20微升藥物溶液，空白對(duì)照組加20微升DMSO，每種濃度重復(fù)5孔。藥物作用于細(xì)胞3天后進(jìn)行MTT法測(cè)定，于96孔培養(yǎng)板每孔加入濃度為5毫克/毫升的MTT工作液10微升，37'C孵育4小時(shí)，棄上清液，加100微升DMSO，在570納米波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。臺(tái)盼蘭排染法，加入臺(tái)盼蘭工作液，計(jì)數(shù)活細(xì)胞。按下列公式計(jì)算被測(cè)物對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率空白對(duì)照組細(xì)胞數(shù)一用藥組細(xì)胞數(shù)~~空白對(duì)照組細(xì)胞數(shù)~"00%半數(shù)有效抑制濃度IC5o值采用Logit法計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表2表2.本發(fā)明化合物1和2對(duì)腫瘤細(xì)胞的半數(shù)有效抑制濃度(pg/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由表2可見(jiàn)，本發(fā)明化合物1禾n2對(duì)HepG2和HT-29腫瘤細(xì)胞株的IC5o值均明顯小于陽(yáng)性對(duì)照藥長(zhǎng)春新堿，對(duì)NCI-H460腫瘤細(xì)胞株的IC50值相對(duì)接近于陽(yáng)性對(duì)照藥長(zhǎng)春新堿。說(shuō)明本發(fā)明化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制活性接近甚至優(yōu)于對(duì)照藥長(zhǎng)春新堿，因此可以用于制備抗腫瘤藥物。權(quán)利要求1.一種甾體類(lèi)化合物，其特征在于化學(xué)結(jié)構(gòu)通式如下其中，R基團(tuán)表示id="icf0002"file="A2009100489890002C2.tif"wi="109"he="29"top="103"left="60"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>全文摘要本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，是從海洋動(dòng)物總合草苔蟲(chóng)Bugulaneritina中提取的一種新的甾體類(lèi)化合物及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。其化學(xué)結(jié)構(gòu)通式如下體外活性試驗(yàn)證明，其對(duì)HepG2、HT-29和NCI-H460三種不同的腫瘤細(xì)胞均有顯著的抗腫瘤活性，IC₅₀值接近甚至優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥長(zhǎng)春新堿，因此可用于制備抗腫瘤藥物。文檔編號(hào)A61K31/575GK101514222SQ200910048989公開(kāi)日2009年8月26日申請(qǐng)日期2009年4月9日優(yōu)先權(quán)日2009年4月9日發(fā)明者劉香芳,張紅軍,帆楊,林厚文,陳萬(wàn)生,陳建濤申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)