專利名稱：一種半抗原與含氨基載體的結(jié)合物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬藥物制劑領(lǐng)域，涉及一種半抗原與含氨基載體的結(jié)合物及其制備方法和 用途。
背景技術(shù)：
已知半抗原為不完全性單一性抗原，機(jī)體皮膚外搽，或動(dòng)物口服后可結(jié)合蛋白，約 在7-10天后在生物體內(nèi)誘導(dǎo)強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫反應(yīng)，半抗原如二硝基氟苯及二硝基氟苯均 在生物體內(nèi)不會(huì)自然生成，在自然界所有生物中，蛋白質(zhì)的氨基酸殘基中也不含二硝基苯 結(jié)構(gòu)，除非有人為標(biāo)記。有研究公開了通過Sanger’ s反應(yīng)，即DNFB或DNCB的二硝基苯置 換氨基上的氫，在微堿性條件下，蛋白質(zhì)與DNFB混合達(dá)到結(jié)合。該方法為大量共價(jià)結(jié)合標(biāo) 記到檢測用的抗體或檢測用的抗原上，利用針對(duì)二硝基苯單克隆抗體，產(chǎn)生免疫測定的信 號(hào)放大作用，以及與靶向載體結(jié)合后，在機(jī)體內(nèi)誘導(dǎo)，帶動(dòng)，強(qiáng)化免疫提供了化學(xué)基礎(chǔ)。目 前，針對(duì)單一抗原決定簇的單克隆抗體已廣泛用微量抗原性物質(zhì)的測定，雖然目前使用單 抗或抗體的免疫測定方法已可達(dá)到納克級(jí)，但仍然不能滿足臨床及科學(xué)研究的需要，尋求 更為敏感和特異的方法一直是研究人員孜孜不倦的追求。近十年來，有研究用單抗的靶向 作用對(duì)腫瘤作為輔助治療，如抗HER-2單抗赫賽丁(Herceptin)治療乳房癌，頭面部癌癥， 抗⑶22單抗美羅華(Rituximab)治療B細(xì)胞淋巴瘤，且已證實(shí)具有一定的療效。但實(shí)踐顯 示，總體上單純使用單抗所誘導(dǎo)的靶向免疫作用有限，遠(yuǎn)不能達(dá)到防治慢性感染，尤其是防 治惡性腫瘤。尋求一種在病灶部位可發(fā)揮更大免疫作用，防治效果好，能滿足預(yù)防及治療需 要的藥物一直是本領(lǐng)域研究人員的關(guān)注熱點(diǎn)。與本發(fā)明相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)有下述參考文獻(xiàn)參考文獻(xiàn)[1],楊國亮王俠生主編現(xiàn)代皮膚病學(xué)1996年5月第1版第1次印刷[2]. Maja Aleksic, Camilla K, David A Basketter et al. Investigating protein haptenation mechanisms of skin sensitisers using human serum albumin as a modal protein. Toxicology in vitro. 2007,21,723-73[3] . Bernard Metz , Gideon F. A. Kerstent, Peter Hoogerhout et al. Identification of formaldehyde-induced modifications of protein. The journal of biological chemistry. 2003,279(8) :6235_6243[4].吳仁蔚胡思順肖 運(yùn)力等檢測禽流感病毒抗體的重組核抗原間接ELISA 方法的建立畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)2006，37 (10) 1067-72[5],王弦謝小強(qiáng)曹亮等HER_2_neU基因在乳腺癌中的研究進(jìn)展生物學(xué)雜志 2008,25(1) 5-8[6],孫婷婷徐江平劉輝貝伐單抗對(duì)耐藥鼻咽癌細(xì)胞凋亡的影響解放軍醫(yī)學(xué)雜 志 2008,33(12) 1438-1440[7],王磊武士華王松俊單克隆抗體相關(guān)專利申請(qǐng)分析中國預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志2006,7(6) 569-570[8].劉端棋戰(zhàn)淑君分子靶向治療藥物的研究進(jìn)展中國腫瘤2008,17(11): 942

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種半抗原與含氨基載體的結(jié)合 物。本發(fā)明所述的半抗原與含氨基載體的結(jié)合物具有式(I)的結(jié)構(gòu)。所述結(jié)構(gòu)包括其同分異構(gòu)體；所述的半抗原為二硝基氟苯(DNFB)或二硝基氯苯(DNCB)；所述的含氨基載體，可以是單抗或抗體或抗原或免疫表位或特異結(jié)合免疫球蛋白 的物質(zhì)，如葡萄球菌蛋白A(即SPA)，以及其他具有靶向結(jié)合的物質(zhì)，如對(duì)肝癌具有較高親 和力的、人工結(jié)合了氨基乙醇(作為連接橋)的碘化油酯等。所述的半抗原與含氨基載體的結(jié)合物把半抗原二硝基苯結(jié)構(gòu)結(jié)合到慢性感染病 原體的免疫抗原上，從而達(dá)到誘導(dǎo)，強(qiáng)化免疫防治腫瘤，慢性感染目的。 本發(fā)明中，所述的半抗原DNFB或DNCB與所述的載體的結(jié)合通過載體上的氨基， DNFB在微堿性條件下，二硝基苯部分置換氨基上的氫，與氨基共價(jià)結(jié)合。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供所述半抗原與含氨基載體的結(jié)合物的制備方法。本發(fā)明經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明，在一定范圍內(nèi)，DNFB的結(jié)合對(duì)HBIG的抗體效價(jià)沒有影響，免 疫球蛋白(抗體)抗體可以作為半抗原二硝基氟苯免疫靶向治療的有效載體。本發(fā)明采用 Sanger' s反應(yīng)，其中的半抗原DNFB或DNCB通過載體上的氨基，DNFB在微堿性條件下，二 硝基苯部分置換氨基上的氫，與氨基共價(jià)結(jié)合制得到半抗原與含氨基載體的結(jié)合物。本發(fā)明所述的載體可以是用于免疫測定的抗體或抗原，結(jié)合利用針對(duì)單一抗原 (如DNFB)的單抗，可使測定信號(hào)放大；重復(fù)間隔循環(huán)使用，可使測定信號(hào)擴(kuò)增；銜接有關(guān)的 量化顯示方法，可使檢測微量靶向載體的靶向物(如抗原性，抗體性物質(zhì))的敏感性提高。本發(fā)明中，每個(gè)載體結(jié)合半抗原分子數(shù)由載體所含有的游離氨基數(shù)決定，載體在 最大量結(jié)合半抗原分子的同時(shí)，必須不影響載體的靶向結(jié)合功能，該最大有效結(jié)合數(shù)是決 定免疫信號(hào)擴(kuò)增的最大因素。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供所述以上物質(zhì)在微量檢測以及防治腫瘤，慢性感染方 面的用途。本發(fā)明利用半抗原在一定范圍內(nèi)，在一個(gè)蛋白、抗原或抗體中結(jié)合2-200半抗原 DNFB分子后其免疫性不變的特性，并以抗DNFB的單抗測定可提高測定信號(hào)的方法，提供一種對(duì)免疫測定(如ELISA)明顯提高靈敏度1-200倍的方法及診斷用試劑。本發(fā)明中，半抗原二硝基苯結(jié)構(gòu)共價(jià)結(jié)合到靶向抗體、抗原或單抗，或腫瘤抗原，或腫瘤抗原表位，或感染病原體的抗原，或病原體抗原表位，或特異結(jié)合免疫球蛋白的物 質(zhì)，如葡萄球菌蛋白A(SPA)，腫瘤高親和力蛋白或短肽，及其他具有導(dǎo)向或靶向作用的結(jié)構(gòu) 中含氨基的物質(zhì)中產(chǎn)生偶聯(lián)體，能發(fā)揮半抗原免疫的靶向治療作用，可作為治療劑，或防治 用疫苗，可誘導(dǎo)，帶動(dòng)，強(qiáng)化特異免疫，對(duì)防治腫瘤，慢性感染性疾病實(shí)施免疫預(yù)防或治療。所述的慢性感染疾病可以是慢性乙型肝炎，慢性丙型肝炎等。本發(fā)明的結(jié)合物還用于微量定性定量分析檢測，組織組化染色。本發(fā)明中，含半抗原二硝基苯結(jié)構(gòu)在體內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞免疫作為殺傷作用彈頭，結(jié)合 具有靶向作用的載體，對(duì)癌瘤，慢性感染具有特異識(shí)別力，在靶向病灶部位，利用其強(qiáng)有力 的半抗原細(xì)胞免疫，在局部誘導(dǎo)多種免疫活化因子，改善局部免疫微環(huán)境，實(shí)現(xiàn)施強(qiáng)化免疫 治療癌瘤或感染。本發(fā)明經(jīng)實(shí)驗(yàn)顯示，所述的半抗原二硝基氟苯在體外沒有免疫系統(tǒng)參與的情況 下，可直接抑制肝癌細(xì)胞，以MTT法測定其IC50為32. 22 μ Μ, IC90為49. 53 μ Μ，雖然同時(shí) 測定的5氟尿嘧啶(5-FU)的IC50雖較DNFB明顯為小，為3. 62 μ Μ,但I(xiàn)C90卻> 200 μ Μ, 提示半抗原二硝基苯結(jié)構(gòu)可作為前藥(prodrug)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)藥物，表明二硝基苯結(jié)構(gòu)共價(jià)結(jié) 合后的化合物具有直接抗癌作用。本發(fā)明的半抗原DNFB或DNCB與含氨基載體的結(jié)合物可 進(jìn)一步制備防治腫瘤的藥物。與現(xiàn)有抗癌藥相比，本發(fā)明可明顯有激活，誘導(dǎo)，強(qiáng)化特異免疫發(fā)揮作用，通過注 射或血管介入治療，適用于肝癌、直腸癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌和肺癌及淋巴瘤，局 部浸潤性型白血病等的治療，也可直接或與其他藥物混合用于局部治療，腹腔，胸腔等腔隙 治療等。


圖1是小鼠肝癌瘤內(nèi)注射抑瘤效果，其中顯示，DNFB瘤內(nèi)注射小鼠皮下移植瘤結(jié)果，D溶液為DNFB Img溶0. Iml磷酸 緩沖液(PBS)，無水乙醇(ETH)為0. 1ml，對(duì)照組為0. Iml的PBS溶液。D溶液及ETH組抑瘤 率分別為74. 43%, 59. 2%，兩者與對(duì)照組相比均有顯著差異(ρ分別< 0. 01及< 0. 05)。圖2是吸光度變化，其中顯示了，在500ul磷酸氫鈉(PBS)緩沖溶液體系中，2mg，4mg，Omg (即對(duì)照組) DNFB與13mg高效價(jià)乙肝免疫球蛋白(HBIG)結(jié)合后對(duì)半系列稀釋測定的效價(jià)比較，經(jīng)雙因 素方差分析無差異(P < 0. 05)，以紫外分光光度法測定，結(jié)合內(nèi)標(biāo)定量，2mg，4mg結(jié)合體系 中，分別有6. 12%,7. 86%的氨基酸殘基實(shí)現(xiàn)了與HBIG的結(jié)合。
具體實(shí)施例方式下述通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不能限制本發(fā)明的內(nèi)容。實(shí)施例1以半抗原二硝基氟苯和抗乙型肝炎表面抗原的單克隆抗體為反應(yīng)原料，在弱堿性 條件下，通過Sanger’ s反應(yīng)，氟脫落結(jié)合單抗中氨基上的氫，把二硝基苯部分置換共價(jià)結(jié)合到氨基上，獲得目標(biāo)產(chǎn)物二硝基苯共價(jià)結(jié)合的乙肝表面抗原單抗，其中一個(gè)目標(biāo)產(chǎn)物中， 結(jié)合率為二硝基苯有1-200個(gè)，該結(jié)合量不影響單抗的特異識(shí)別功能。上述半抗原也可采用二硝基氯苯，二硝基溴苯，或二硝基碘苯。經(jīng)免疫測定(如ELISA)，結(jié)果顯示，免疫反應(yīng)測定信號(hào)放大高達(dá)200倍，明顯提高 免疫測定的靈敏度。常溫下把結(jié)合乙肝免疫球蛋白(HBIG(13mg/500ul PBS)水溶液分別與不同劑量 (2，4，8mg)的半抗原二硝基氟苯(DNFB)混合，分別組成二毫克管，四毫克管，八毫克管，混 勻過夜后離心，僅見八毫克管的HBIG水溶液出現(xiàn)沉淀，二毫克管，四毫克管及未加DNFB的 HBIG水溶液對(duì)照管，各取半量作對(duì)半稀釋后分別以HiTrap分子篩柱脫鹽，三個(gè)洗脫液再分 別作對(duì)半系列稀釋11次，使二毫克管，四毫克管及對(duì)照組分別各組成12個(gè)標(biāo)本，共36個(gè)標(biāo) 本。以ELISA法分別檢測乙肝表面抗體的效價(jià)。取二毫克 管，四毫克管的另一半分別予飽 和硫酸銨沉淀后取上清，分別以紫外光光度分析儀測定A34tl,與加入不同劑量DNFB的五個(gè) 系列濃度作內(nèi)標(biāo)的對(duì)照管上清相比較，推算二毫克管，四毫克管上清中DNFB的剩余含量， 從而計(jì)算相應(yīng)管中HBIG結(jié)合掉的DNFB量。結(jié)果顯示二毫克管，四毫克管及對(duì)照組，經(jīng)雙因素方差分析及q檢驗(yàn)，三組間同 稀釋度間吸光差值(OD45tl-OD63tl)無差異(ρ > 0.05)，而各稀釋度間則有非常顯著差異(ρ < 0. 01)。飽和硫酸銨沉淀結(jié)合分光光度法測定證實(shí)二毫克管，四毫克管中6. 5mg HBIG分 別了結(jié)合了 0. 67mg禾口 0. 86mg的DNFB，相當(dāng)于每mg的HBIG分別結(jié)合了 0. 104mg及0. 132mg 的DNFB，即每一個(gè)HBIG分子分別結(jié)合了 88. 72及113. 48個(gè)DNFB半抗原分子，約占HBIG氨 基酸殘基的6. 12%和7. 86%。實(shí)驗(yàn)證實(shí)在一定范圍內(nèi)，DNFB的結(jié)合對(duì)HBIG的抗體效價(jià) 沒有影響，免疫球蛋白(抗體)可作為半抗原DNFB免疫靶向治療慢性病毒感染或腫瘤的一 種有效載體。實(shí)施例2按實(shí)施例1的制備方法，采用二硝基苯共價(jià)結(jié)合的腫瘤或感染靶向制劑，制備由 半抗原誘導(dǎo)的免疫靶向治療腫瘤藥物，或/和由二硝基氟苯作為原藥直接具有的抗癌作 用。結(jié)果顯示，結(jié)合比率同實(shí)施例1 ；DNFB瘤內(nèi)注射小鼠皮下移植瘤抑瘤率良好。所述的腫瘤或感染靶向制劑可選自抗HER-2單抗赫賽丁或乙肝單抗。實(shí)施例3按實(shí)施例1的制備方法，采用二硝基苯共價(jià)結(jié)合的腫瘤或慢性感染病原體的免疫 抗原或抗原表位制備由半抗原誘導(dǎo)建立，或強(qiáng)化特異免疫的防治藥物。如DNFB結(jié)合乙肝表 面抗原，DNFB結(jié)合黑色素瘤腫瘤消退抗原表位等，可用于特異性預(yù)防或作為腫瘤治療性疫 苗等，結(jié)果顯示，其結(jié)合比率同實(shí)施例1。所述的靶向治療腫瘤或慢性感染藥物其特征是以 具有靶向作用的化合物作為結(jié)合腫瘤的導(dǎo)向部分，與半抗原決定簇部分以共價(jià)結(jié)合，實(shí)施 腫瘤或慢性感染的靶向治療。表1 體外對(duì)SMMC-7721肝癌細(xì)胞株48小時(shí)細(xì)胞存活率(MTT法，六孔值的均數(shù))。測試終濃度 二硝基氟苯(DNFB) 五氟尿嘧啶(5-FU)OuM1001002uM102. 9953. 03IOuM101. 3238. 08
50uM8. 9217. 82IOOuM1. 5416. 55 200uM1. 3413. 37估計(jì)IC5032. 22uM3. 62uM估計(jì)IC9049. 53uM> 200uM表2 =DNFB及5_FU分別對(duì)SMMC-7721肝癌細(xì)胞株48小時(shí)細(xì)胞存活率(在0，2， 10，50，100，200uM時(shí)，MTT法測定的六孔具體數(shù)值)DNFB 組1.062 1.072 1.066 1.124 1.213 1.2311. 107 1. 114 1. 176 1. 1451. 121 1. 2971. 126 1. 074 1. 210 1. 144 1. 135 1. 1640. 192 0. 148 0. 147 0. 1450. 142 0. 1400. 065 0. 079 0. 085 0. 0670. 074 0. 0700.063 0.067 0.076 0.0710.076 0.0745-FU 組1. 204 1. 190 1. 156 1. 2221. 282 1. 3910. 662 0. 675 0. 666 0. 6770. 726 0. 7020. 484 0. 507 0. 476 0. 4800. 520 0. 5790. 235 0. 250 0. 279 0. 2580. 279 0. 3060. 223 0. 244 0. 244 0. 2410. 270 0. 2950. 200 0. 214 0. 207 0. 2280. 222 0. 220無細(xì)胞對(duì)照組0. 054 0.057 0.060 0.0510. 054 0.065。
權(quán)利要求
一種半抗原與含氨基載體的結(jié)合物，其特征是所述的半抗原與含氨基載體的結(jié)合物所述結(jié)構(gòu)包括其同分異構(gòu)體，具有式(I)的結(jié)構(gòu)F2009100491746C0000011.tif
2.按權(quán)利要求1所述的半抗原與含氨基載體的結(jié)合物，其特征是所述的半抗原為二硝 基氟苯或二硝基氯苯。
3.按權(quán)利要求1所述的半抗原與含氨基載體的結(jié)合物，其特征是所述的含氨基載體， 選自單抗或抗體或抗原或免疫表位或特異結(jié)合免疫球蛋白的物質(zhì)，及其他具有靶向結(jié)合的 物質(zhì)。
4.按權(quán)利要求3所述的半抗原與含氨基載體的結(jié)合物，其特征是所述的特異結(jié)合免疫 球蛋白的物質(zhì)是葡萄球菌蛋白。
5.按權(quán)利要求3所述的半抗原與含氨基載體的結(jié)合物，其特征是所述的其他具有靶向 結(jié)合的物質(zhì)選自對(duì)肝癌具有較高親和力的或人工結(jié)合了氨基乙醇的碘化油酯。
6.權(quán)利要求1或2的半抗原與含氨基載體的結(jié)合物的制備方法，其特征是所述的半抗 原與載體的結(jié)合是通過載體上的氨基，在微堿性條件下，二硝基苯部分置換氨基上的氫，與 氨基共價(jià)結(jié)合反應(yīng)得到。
7.權(quán)利要求1的半抗原與含氨基載體的結(jié)合物在免疫微量測定中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1的半抗原與含氨基載體的結(jié)合物在制備防治腫瘤藥物中的用途。
9.權(quán)利要求1的半抗原與含氨基載體的結(jié)合物在制備防治慢性感染疾病藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬藥物合成領(lǐng)域，涉及一種半抗原與含氨基載體的結(jié)合偶聯(lián)物及其制備方法和用途。本發(fā)明通過Sanger’s反應(yīng)獲得半抗原與含氨基載體的結(jié)合偶聯(lián)物。利用半抗原的免疫性以及載體功能，結(jié)合使用針對(duì)半抗原的單抗，可在微量測定時(shí)放大信號(hào)，明顯提高測定的靈敏度。含半抗原二硝基苯結(jié)構(gòu)在體內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞免疫作為殺傷作用彈頭，結(jié)合具有靶向作用的載體，對(duì)癌瘤，慢性感染具有特異識(shí)別力，在靶向病灶部位，在局部誘導(dǎo)多種免疫活化因子，改善局部免疫微環(huán)境，實(shí)現(xiàn)施強(qiáng)化免疫治療癌瘤或感染。本發(fā)明的結(jié)合物可用于免疫微量測定，制備防治腫瘤的藥物。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101856497SQ20091004917
公開日2010年10月13日 申請(qǐng)日期2009年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月10日
發(fā)明者何曉俊, 儲(chǔ)艷秋, 匡春香, 戴兆云, 方明珠, 蔣公羽, 黃偉達(dá) 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院