專利名稱：苯甲酰胺衍生物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化工領(lǐng)域及醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及N-[3-(苯甲酰胺)-5-(4-氧代-4H-3， 1-苯并惡嗪-2-基)苯基]苯甲酰胺在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
親環(huán)素CycliphilinS(CyPS)是普遍分布的細胞內(nèi)蛋白，在植物、細菌和哺乳 動物中均存在，具有高度保守性，最初是作為環(huán)孢素A的細胞受體被發(fā)現(xiàn)的。環(huán)孢素 A(CyclosporinA,CsA)是從真菌代謝產(chǎn)物中分離得到的含11個氨基酸的環(huán)狀多肽，是一種 用于器官移植和自身免疫性疾病的免疫抑制劑，已被廣泛用于臨床，年銷售額在50億美元 以上。由于CsA用于臨床以來表現(xiàn)出各種毒副作用，對患者及移植物存活率的影響越來越 引起人們的重視，許多科學(xué)研究者正在努力尋找與CsA作用類似的、毒副作用低的替代物。 目前CsA也已經(jīng)開始用于腫瘤治療當中，并且主要是與其它抗癌藥物如紫杉醇、阿霉素、長 春新堿等搭配使用，增強這些藥物的抗腫瘤活性(Clin Cancer Res. 11，2320-2326)。因為 環(huán)孢菌素A同時也是極為有效的免疫抑制劑，因此用于這些疾病的治療時不可避免會帶來 免疫抑制的副作用?？朔庖咭种频姆椒ㄖ饕獌煞N，一是對環(huán)孢菌素A的免疫抑制基團進 行修飾，或者從真菌中提取非免疫抑制的環(huán)孢菌素衍生物；另一種方法是根據(jù)CYP蛋白的 結(jié)構(gòu)，篩選或設(shè)計新的非肽類小分子抑制劑。CyPs廣泛分布于從微生物到哺乳動物的各類物種中。Cyclophilin A(CyPA)是首 先從牛的胸腺細胞中發(fā)現(xiàn)的CyP家族中第一個成員，并驗證它具有PPIase活性(Science， 226,544-547 ；Nature 337,473-478)。重組人 T 細胞的 cyclophilinA(hCyPA)的三維 結(jié)構(gòu)及它與CsA、四肽及一些二肽形成的復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)已有報道(Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A. 88,9483-9487 ；J. Mol. Biol. 228,539-550 ；J. Mol. Biol. 234，1119-1130.； Nature,353,276-279 ；Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88,3324-3328 ；Biochemistry,35, 7362-7368)。CyPA與HIV相關(guān)蛋白質(zhì)的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)也已報道(Cell，87，1285-1294 ； Structure 5，139-146)。CyP家族的其他成員與CyPA具有序列同源性及三維結(jié)構(gòu)類似 的特性(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90，11850-11854 ；Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91， 5183-5186 J. Mol. Biol. 331，45-56)。CyPJ是CyP家族的新成員，CYP-J cDNA長1. 25Kb，編碼161個氨基酸，已從人的 胎腦cDNA文庫中分離并鑒定(Cytogenet. Cell Genet. 92，231-236)。在氨基酸序列上與線 蟲(C. elegans.)CYP10具有72%的同源性。其具體核苷酸和氨基酸序列詳見NCBI網(wǎng)站上 基因登陸號為AF146799的基因報告。CYPJ蛋白能促進肝癌細胞的克隆形成率，可以促進肝 癌細胞物質(zhì)的復(fù)制增殖，并且能促進肝癌腫瘤細胞生長，因此，可以作為篩選抗肝癌藥劑的 靶標。惡性腫瘤已成為人類致死的最重要原因之一，但是目前市售的抗腫瘤藥物均有各 種不良反應(yīng)，因此，尋找新型的低副作用抗腫瘤藥物成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域的一大熱點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供N-[3_(苯甲酰胺)-5-(4_氧代-4H-3，1_苯并惡嗪_2_基) 苯基]苯甲酰胺的新的藥物用途。具體涉及N-[3-(苯甲酰胺)-5-(4_氧代-4H-3，1-苯并 惡嗪-2-基)苯基]苯甲酰胺在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。所述的抗腫瘤藥物為針劑或者片劑。所述的抗腫瘤藥物是抗肝癌藥物或者抗結(jié)腸 癌藥物。本發(fā)明還提供了一種抑制腫瘤細胞增殖的方法，即將N-[3_(苯甲酰胺)-5-(4_氧 代-4H-3，1-苯并惡嗪-2-基)苯基]苯甲酰胺加入腫瘤細胞的培養(yǎng)液中。所述的腫瘤細胞可以是肝癌細胞或者結(jié)腸癌細胞等。具體的說，所述的腫瘤細胞 是例如QGY細胞或者SMMC-7721細胞的肝癌細胞，或者例如sw620細胞的結(jié)腸癌細胞。加 入FD4的具體方法可以采用實施例4中所采用的方法，或者其它常規(guī)的操作。本發(fā)明的N-[3-(苯甲酰胺)-5-(4-氧代-4H-3，1-苯并惡嗪-2-基)苯基]苯甲酰 胺(即 N-[3-(benzoylamino)-5-(4-oxo-4H-3,l-benzoxazin-2-yl)phenyl]benzamide), 在本發(fā)明中簡稱為FD4。本發(fā)明的N-[3-(苯甲酰胺)-5-(4_氧代-4H-3，1-苯并惡嗪-2-基)苯基]苯甲 酰胺，其分子量為461. 48，結(jié)構(gòu)式為 其相關(guān)信息如下化合物Id :AG-690/34685040,MDL 號MFCD00315649，分子式C28H19N304。先前對于本發(fā)明的FD4的研究主要集中在其是一種CypJ抑制劑，BIAcore分子互 作儀驗證其能與CypJ結(jié)合，其平衡-解離常數(shù)KD(M) 1. 17X10_5。其次，通過a-胰凝乳蛋 白酶活性測定法(a -chymotrypsin-coupled enzymic assay)測得本發(fā)明的N_[3_(苯甲 酰胺)-5_(4-氧代-4H-3，1-苯并惡嗪-2-基)苯基]苯甲酰胺，其酶活抑制IC5Q值(yM) 為 26. 34 士 2. 11。進一步的研究表明，本發(fā)明的CypJ小分子抑制劑FD4對腫瘤細胞生長有抑制作用。本發(fā)明測定了 FD4對肝癌細胞的殺傷情況，結(jié)果顯示，F(xiàn)D4對腫瘤細胞QGY和 sw620細胞有一定程度的殺傷力。此外，F(xiàn)D4還能夠有效降低SMMC-7721細胞的克隆形成率。
因此，本發(fā)明的FD4能夠抑制CYPJ的活性或者表達量，對于CYPJ表達量高的腫瘤 細胞殺傷效果更好。本發(fā)明的小分子化合物可以采用各種常規(guī)的制備方法制備。例如，采用人工化學(xué) 合成的方法。利用本發(fā)明小分子化合物，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與FD4發(fā)生相互作 用的物質(zhì)，如受體、抑制劑或拮抗劑等。本發(fā)明及其抑制劑、拮抗劑等，當在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效 果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH 通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而 有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)肌 內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。以本發(fā)明的FD4為例，可以將其與合適的藥學(xué)上可接受的載體聯(lián)用。這類藥物組 合物含有治療有效量的化合物和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限 于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā) 明的人FD4可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過 常規(guī)方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進行制備。藥物 組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量， 例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的FD4還可與其他治 療劑一起使用。當本發(fā)明的FD4被用作藥物時，可將治療有效劑量的FD4施用于哺乳動物，其中該 治療有效劑量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克 體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當然，具體劑量還應(yīng) 考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。本發(fā)明提供了小分子化合物N- [3-(苯甲酰胺)-5- (4-氧代_4H_3，1 -苯并惡 嗪-2-基)苯基]苯甲酰胺在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。該化合物能夠明顯抑制腫瘤細胞 的增殖。FD4是針對細胞靶點CYPJ設(shè)計的藥物，不易形成耐藥性，而且，對于高表達CYPJ蛋 白的腫瘤細胞效果特別明顯。因此，本發(fā)明的小分子化合物作為新的抗腫瘤藥物進行開發(fā)， 抑瘤效果明顯，特異性好。因此，本發(fā)明的FD4可以作為新的抗腫瘤藥物進行開發(fā)，為治療 和治愈腫瘤提供了一種新的途徑和手段。
具體實施例方式實施例ICypJ小分子抑制劑的虛擬篩選在PDB蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中，檢索到了人類CYPA蛋白的X光衍射晶體結(jié)構(gòu)(PDB代 碼1CWA)。這個結(jié)構(gòu)是CYPA與其天然抑制劑環(huán)孢菌素A(CsA)的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)。從這 個結(jié)構(gòu)中，確定了 CYPA的活性位點，并且確定了活性位點中，能夠被CsA所抑制的若干關(guān) 鍵氨基酸位點。根據(jù)CYPJ與CYPA高度同源的序列，我們與中國科學(xué)院上海藥物所合作， 建立了 3D結(jié)構(gòu)模型，并且在此后的蛋白結(jié)晶及結(jié)構(gòu)解析時也得到了證實(CYPJ PDB代碼 1XYH)。針對CypJ活性位點，對若干小分子數(shù)據(jù)庫進行了篩選。用于篩選的小分子數(shù)據(jù)庫 主要包括SPECS和CNPD。最后篩選到了本發(fā)明的FD4。整個計算過程是在中科院上海藥物所64CPU-SGI 0RIGN3800計算機和上海超算中心392CPU-神威I超級計算機上進行的。實施例2利用BIAcore分子互作儀驗證虛擬篩選結(jié)果BIAcore分子互作儀是基于表面等離子共振技術(shù)來實現(xiàn)跟蹤生物分子間的相互 作用，無需任何標記物，因此最大限度的保證了實驗結(jié)果的真實性。實驗時，將目的生物分 子(CypJ蛋白)固定在傳感芯片表面，然后將小分子化合物溶于溶劑并且流過芯片表面。 監(jiān)測器能實時跟蹤檢測溶液中的分子與芯片表面目的生物分子結(jié)合、解離整個過程的變 化。通過BIAcore的結(jié)合數(shù)據(jù)，本發(fā)明的N_[3_(苯甲酰胺)-5_(4_氧代-4H-3，1-苯并惡 嗪-2-基)苯基]苯甲酰胺與CypJ結(jié)合的平衡-解離常數(shù)KD(M) :1. 17X10_5。實施例3利用酶活實驗證明小分子化合物對CypJ酶活抑制的能力測定CyP活性的方法很多，但以a _胰凝乳蛋白酶活性測定法 (a-chymotrypsin-coupled enzymic assay)最常用。其原理是含脯氨酸的寡肽底物，如 N-琥拍酰-Ala-Ala-Pro-Phe 對硝基苯胺(N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Ph印-nitroanilide) 在溶液中其順式、反式結(jié)構(gòu)處于平衡，CyP能催化該底物發(fā)生順反異構(gòu)作用，即催化脯氨酸 由順式變?yōu)榉词?；當其處于反式結(jié)構(gòu)時，C端p-nitroanilide被a-胰凝乳蛋白酶裂解，釋 放出色素基團對硝基苯胺，在390nm連續(xù)測定吸光值的變化即可得知CyP的PPIase活性。我們以不加小分子抑制劑的反應(yīng)作為對照反應(yīng)，測定小分子配體在不同濃度 下對酶活反應(yīng)的抑制率，從而計算出小分子配體的IC5(I值。本發(fā)明的N-[3-(苯甲酰 胺)-5_(4-氧代-4H-3，1-苯并惡嗪-2-基)苯基]苯甲酰胺(Interchim公司)其酶活抑 制 IC5Q 值(PM)為 26. 34士 2. 11。實施例4MTS法測定FD4對腫瘤細胞的生長抑制作用人肝癌細胞株QGY細胞(ATCC公司)3 X 103/孔接種至96孔板，培養(yǎng)24小時使之 貼壁后加入FD4 (Interchim公司)，設(shè)6個濃度梯度，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔。細胞在37°C， 5% C02條件下培養(yǎng)72小時后，倒掉培養(yǎng)液，用MTS試劑盒(Promega公司)測定細胞存活 率，測試方法為將細胞用無血清培養(yǎng)基洗一遍，按照lOOiU/well的量加入預(yù)先配制好的 MTS顯色溶液(10ml無血清培養(yǎng)基中加入2ml溶液1和100 u 1溶液2，充分混勻)。將一個 沒有細胞的孔設(shè)為本底孔，用以校正溶液的背景光吸收。把細胞放入細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培 養(yǎng)2 4小時，然后用酶標儀讀取光吸收值(參考波長630-700nm，測定波長490nm)，計算 細胞存活率，以測定孔光吸收值/對照孔光吸收值作為細胞存活率的數(shù)值。結(jié)果加入了 N-[3_(苯甲酰胺)-5-(4_氧代-4H_3，1-苯并惡嗪-2-基)苯基] 苯甲酰胺后，QGY細胞的數(shù)量約為對照的67%。用同樣的方法處理sw620細胞(ATCC)，結(jié)果sw620細胞(ATCC)的數(shù)量約為對照的 75%。實施例5FD4對克隆形成率的影響SMMC-7721細胞(ATCC公司，肝癌細胞株)1000個/皿接種于60mm細胞培養(yǎng)皿，一 組加入FD4，另一組加入DMS0作為對照。連續(xù)培養(yǎng)15-20天時間，中間酌情換液。用室溫 1 X PBS洗一次，加2ml預(yù)冷的甲醇4°C固定lOmin。棄去固定用的甲醇，用預(yù)冷的1 X PBS洗 一次，加GIMESA染色劑，室溫染色lOmin，清水洗3遍，去浮色，拍照、計數(shù)。根據(jù)細胞數(shù)目確定克隆大小，大于200個細胞的稱為大克隆，100-200個細胞之間 的稱為中克隆，50-100個細胞之間的稱為小克隆。比較大中克隆之間的差異，重復(fù)2次每次
6三皿取平均值，加入FD4后7721細胞所形成的克隆數(shù)顯著少于加入DMS0后所形成的克隆 數(shù)。這些結(jié)果提示，F(xiàn)D4能抑制腫瘤細胞克隆形成。
權(quán)利要求
N [3 (苯甲酰胺) 5 (4 氧代 4H 3，1 苯并惡嗪 2 基)苯基]苯甲酰胺在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的抗腫瘤藥物是抗肝癌藥物。
3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的抗腫瘤藥物是抗結(jié)腸癌藥物。
4.如權(quán)利要求1或2或3所述的應(yīng)用，其特征在于，該抗腫瘤藥物為針劑或者片劑。
5.一種抑制腫瘤細胞增殖的方法，其特征在于，將N-[3-(苯甲酰胺)-5-(4_氧 代-4H-3，1-苯并惡嗪-2-基)苯基]苯甲酰胺加入腫瘤細胞的培養(yǎng)液中。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的腫瘤細胞是肝癌細胞或者結(jié)腸癌細胞。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的腫瘤細胞是QGY細胞或者SMMC-7721 細胞。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的腫瘤細胞是sw620細胞。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程和化學(xué)領(lǐng)域，涉及FD4N-[3-(苯甲酰胺)-5-(4-氧代-4H-3，1-苯并惡嗪-2-基)苯基]苯甲酰胺在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的FD4能夠明顯抑制腫瘤細胞的增殖。FD4是針對細胞靶點CYPJ設(shè)計的藥物，不易形成耐藥性，而且，對于高表達CYPJ蛋白的腫瘤細胞效果特別明顯。因此，本發(fā)明的小分子化合物作為新的抗腫瘤藥物進行開發(fā)，抑瘤效果明顯，特異性好。因此，本發(fā)明的FD4可以作為新的抗腫瘤藥物進行開發(fā)，為治療和治愈腫瘤提供了一種新的途徑和手段。
文檔編號A61P1/16GK101919862SQ20091005290
公開日2010年12月22日 申請日期2009年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月11日
發(fā)明者余龍, 張明君, 陳帥 申請人:復(fù)旦大學(xué)