專利名稱：一種樹形聚合物靶向造影劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥及納米醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種樹形聚合物靶向造
影劑及其制備方法，特別用于肺癌高敏感性MRI成像的造影劑。
背景技術(shù)：
癌癥正在成為一個(gè)日益嚴(yán)重的全球問題，目前每年幾乎有700萬人死于 癌癥，主要癌癥種類為肺癌(約130萬死亡/年)、胃癌(約100萬死亡/ 年)、肝癌(約66萬死亡/年)、結(jié)腸癌(約66死亡/年)以及乳房癌(約50 萬死亡/年)，肺癌比任何其他癌癥造成更多人死亡。肺癌是一種源于支氣管 黏膜或腺體的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率在惡性腫瘤中位居首位并且呈逐年 上升趨勢(shì)。
肺癌的早期診斷和準(zhǔn)確的臨床分析直接關(guān)系到治療方案的選擇及預(yù)后評(píng) 估o自1973年Lauterbur首次將核磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging, MRI)應(yīng)用于人體診斷以來，這一技術(shù)在生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域己得到迅速發(fā)展和 廣泛應(yīng)用。MRI造影劑可以克服普通成像序列的限制，改變質(zhì)子所產(chǎn)生的信 號(hào)強(qiáng)度，從而提高正常和病變組織的對(duì)比度。作為應(yīng)用于人體的MRI造影劑， 除了滿足生物適應(yīng)性強(qiáng)、水溶性好和穩(wěn)定性等藥物基本要求外，還應(yīng)具有較 好的馳豫率、耙向性和適當(dāng)?shù)捏w內(nèi)存留時(shí)間。順磁性金屬離子Fe2+、 Fe"、 Mn2+、 Dy》和GcT能與配體絡(luò)合后形成水溶性順磁造影劑。
樹形聚合物(Dendrimers)是一種人工合成的納米分子，其直徑范圍從 G0代到G10代分別為1 13nm左右，最早由美國化學(xué)家D. A. Tomalia博士發(fā) 明并成功合成。與線型高分子藥物載體比較而言，樹形聚合物呈球形，而不 像線型高分子那樣隨機(jī)盤繞成團(tuán)。分子量大小可精細(xì)調(diào)控(單分散性好)，藥代動(dòng)力學(xué)行為具有可重復(fù)性。在其合成過程中，可以人為控制聚合物的體積、 形態(tài)以及末端基團(tuán)的種類。樹形聚合物具有溶解性高、粘附性低、高反應(yīng)性 以及可與其他物質(zhì)混溶等特點(diǎn)，可以作為單分子納米微粒運(yùn)載藥物或基因。
10多年來，樹形聚合物從材料科學(xué)到生物醫(yī)學(xué)等諸多領(lǐng)域都受到了日益廣泛
的關(guān)注。更重要的是樹形聚合物無免疫原性，不會(huì)引起機(jī)體的免疫反應(yīng)，無 遺傳毒性與細(xì)胞毒性，不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的轉(zhuǎn)化與細(xì)胞死亡。如樹形聚合物表面
引入羧基，則可以構(gòu)建理想的GcT配體。
耙向性造影劑可以提高其在耙器官或組織內(nèi)的濃度并減少背景組織對(duì)造 影劑的吸收量，從而提高成像的敏感度。研究表明腫瘤細(xì)胞表面上的葉酸受 體數(shù)量一般比正常細(xì)胞上的更多，活性更強(qiáng)，把葉酸鍵連到造影劑上，可提 高造影劑對(duì)腫瘤細(xì)胞的主動(dòng)靶向性。從被動(dòng)靶向性來說，正常組織的血管上 的內(nèi)皮細(xì)胞排列緊密，間隙較小， 一般小于8nm，而癌變組織中血管壁的間 隙要大得多，在100 800 nm之間。因此可以利用特定納米尺寸效應(yīng)實(shí)現(xiàn)在 血液流通過程中的納米藥物的被動(dòng)靶向性。研究表明，靜脈注射粒徑700 3000mn的微粒，可被肺部毛細(xì)血管床機(jī)械過濾阻留，并停留相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間， 最終被單核巨噬細(xì)胞攝取進(jìn)入肺組織或肺泡。為避免造影劑納米粒子因肺部 毛細(xì)血管床機(jī)械過濾截留而引起栓塞甚至導(dǎo)致錯(cuò)誤的成像診斷結(jié)果，造影劑 顆粒不能過大。葉酸受體也廣泛存在于正常腎臟近曲小管上，但通常當(dāng)顆粒 粒徑大于10 nm時(shí)即不能通過腎小球過濾進(jìn)入腎臟。
盡管在過去的二十幾年中，醫(yī)學(xué)成像技術(shù)有了不少進(jìn)步，但我們對(duì)如何 在早期階段發(fā)現(xiàn)腫瘤的能力仍然有限。葉酸殘基通過生物兼容性大分子鍵聯(lián) 到樹形聚合物表面合成具有特定納米尺度大小的粒子，利用被動(dòng)靶向和主動(dòng) 靶向相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)肺癌高靶向性而敏感造影的體系國內(nèi)外尚未見報(bào)道?；诩{米尺度效應(yīng)的具有極高的生物兼容性的納米復(fù)合粒子的設(shè)計(jì)與合成，可 望克服目前肺癌臨床診斷不及時(shí)而錯(cuò)過最佳治療時(shí)機(jī)的情況，減輕肺癌這一 癌癥殺手中致死亡率最高的疾病帶給人類的危害，具有重要的學(xué)術(shù)研究?jī)r(jià)值 和應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種生物相容性好，靶向性好，對(duì)肺癌早期檢測(cè)
起作用的MRI大分子造影劑。
本發(fā)明的又一目的在于提供一種對(duì)肺癌細(xì)胞具有靶向性的新一代樹形納 米聚合物造影劑的制備方法和用途。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的
一種樹形聚合物靶向造影劑，特點(diǎn)是該造影劑為納米粒子，具有以下結(jié)
構(gòu)
處于最外端的靶向基團(tuán)；作為連接臂的親水性聚乙二醇鏈；位于中心核 的樹形聚合物PAMAM;體內(nèi)成像的順磁性金屬X;
其通式為PAMAM-PEG (n廣T/X;其中X為順磁性金屬離子Fe2+、 Fe3+、 Mn2+、 Dy"或Gd3+; PEG為分子量為1000 10000Da的聚乙二醇；T為耙向基團(tuán)； PAMAM為樹形聚合物；耙向基團(tuán)為葉酸、半乳糖或多肽。
上述造影劑的制備方法是將順磁性金屬離子配成溶液并用濃度為0. 1M 的鹽酸調(diào)節(jié)至pH值為5. 8 6. 2，然后將樹形大分子配體PAMAM-PEG (n) -T用 水稀釋后滴加到經(jīng)調(diào)節(jié)的順磁性金屬離子溶液中，避光、滴加時(shí)間控制在 30min 45min，室溫下反應(yīng)60 72小時(shí)后過凝膠柱，收集液濃縮后凍干得到 造影劑PAMAM-PEG (n) -TA，避光保存；其順磁性金屬離子與樹形大分子配 體PAMAM-PEG oo -T的摩爾量比為10:1 5:1;順磁性金屬離子溶液的濃度為1 2M;樹形大分子配體PAMAM-PEG (n) -T溶液的濃度為0. 5 lmg/ml; 所述樹形大分子配體PAMAM-PEG (n) -T的制備包括以下步驟
a) 通過MA的邁克爾加成聚合反應(yīng)制備整數(shù)代的PAMAM大分子；
b) PAMAM與丁二酸酐反應(yīng)形成端基為羧基的PAMAM-C00H;
c) 聚乙二醇二胺(NH2-PEG(n)-NH2)與T等摩爾比反應(yīng)，以l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDOHCl)、 4-二甲氨基吡啶(DMAP) 為縮合劑和催化劑在二甲基亞砜溶劑中反應(yīng)，得到NH2-PEG (n) -T;
d) NH2-PEG(n)-T與PAMAM-COOH反應(yīng)，其摩爾比為32 : 1，反應(yīng)液用截 留分子量為3500-15000的透析袋，在H20中透析60 72 h ，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃 縮，冷凍機(jī)干燥，得樹形大分子配體PAMAM-PEG (n)-T。
上述造影劑應(yīng)用于肺癌早期影像診斷。 本發(fā)明的造影劑具有以下特點(diǎn)
① 、具有極高的生物兼容性，無免疫原性和細(xì)胞毒性；
② 、核心結(jié)構(gòu)大小精細(xì)可調(diào)，表面羧基數(shù)量可控；
◎、樹形聚合物表面羧基密集，可絡(luò)合多個(gè)順磁性金屬離子，從而通過 提高造影劑的馳豫率而增強(qiáng)造影的敏感性；
④ 、主動(dòng)靶向和被動(dòng)耙向相結(jié)合而對(duì)肺癌細(xì)胞具有高靶向性能進(jìn)一步提 高成像的靈敏性，實(shí)現(xiàn)對(duì)肺癌的早期檢測(cè)，有利于肺癌的早發(fā)現(xiàn)、早治療；
⑤ 、親水高分子表面修飾能夠延長(zhǎng)納米復(fù)合粒子的血液循環(huán)時(shí)間，增強(qiáng) 含軋樹形聚合物的水溶性而增強(qiáng)其在血液中的穩(wěn)定性；
◎、與線性高分子聚合物盤繞成團(tuán)形成納米粒子比較而言，樹形聚合物 配體形成的納米粒子在血液流通過程中不會(huì)因解離而釋放出金屬離子從而造 成對(duì)機(jī)體有害。


圖1為本發(fā)明造影劑結(jié)構(gòu)示意圖，圖中 一 靶向基團(tuán)；—W連接臂;
樹形高聚物PAMAM; 順磁性金屬離子。
圖2為本發(fā)明造影劑PAMAM-PEG ( )-FA/Gd紅外譜圖 圖3為本發(fā)明造影劑PAMAM-PEG 。。。。)-FA/Gd形成的粒徑在80nm納米的 SEM圖
圖4為本發(fā)明造影劑PAMAM-PEGe)-FA/Gd形成的粒徑在lOOnm納米的 SEM圖
圖5為本發(fā)明造影劑PAMAM-PEG (n) -FA/Gd形成不同粒徑的TEM圖
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述
實(shí)施例1
1. PAMAM的合成
a) 0. 5G PAMAM-Me的合成
取9g乙二胺和30g甲醇，于三口燒瓶中，邊攪拌邊滴加103. 2g丙烯酸 甲酯，滴加速度為每秒一滴，在25°C、攪拌24h。然后將產(chǎn)物在-5匸、133. 3Pa 的條件下減壓蒸餾3小時(shí)，得到淡黃色液體。
b) l.OG PAMAM-朋2的合成
取20. 2g 0.5代AMAM于三口燒瓶中，加入60g甲醇，攪拌、滴加72g 乙二胺，滴加速度為ld/s，在25。C、攪拌24h。然后產(chǎn)物在-5°C、 266. 6Pa 的條件下減壓蒸餾3小時(shí)，得到淡黃色粘稠狀液體，即l.OG PAMAM-NH2。
c) 重復(fù)a) ， b)步驟，直到得到純凈的4. OG PAMAM
2. PAMAM-COOH的合成取0. 2mmo1的PAMAM (4. 0代)溶于無水DMS0中，&保護(hù)，加入0. 02mmo1 催化劑DMAP和12. 8腿o1的丁二酸酐，在40°C、攪拌48小時(shí)，將溶劑DMS0 透析除去，濾除不溶物、冷凍干燥得到PAMAM-C00H。
3. NH廠PEG (1000) -FA的合成
將0, 2mo1的FA溶于DMS0中、攪拌、&保護(hù)，加入EDC/NHS活化2h， 然后投入等摩爾比的聚乙二醇二胺(NH2-PEGu。。co-NH2)，室溫、避光、攪拌 24小時(shí)，將產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到截留分子量為1000的透析袋中，透析72h、濃縮、過 硅膠柱分離提純，冷凍干燥，得到NH2-PEG(,。。。)-FA，避光低溫保存。
4. FA-PEG",-PAMAM的合成
取0. 05mmo1的PAMAM-C00H溶于DMS0中，加入催化劑量的EDC/NHS活化 羧基，反應(yīng)兩小時(shí)后投入0.32鵬o1的單取代的NH2-PEG(隱廣FA， &保護(hù)、室 溫、攪拌72h得FA- PEG ", -PAMAM (PP畫F)。截留分子量為5000的透析 袋中透析，透析純化，產(chǎn)物濃縮、冷凍干燥，得到大分子配體FA-PEG(,) -PAMAM。用動(dòng)態(tài)光散射測(cè)的粒徑和Zeta電位，用凝膠滲透色譜測(cè)定其分散性。
5. FA-PEG (畫)-PAMAM/Gd的制備
稱取3. 75g (10,1) GdCl3.6H20溶于10mL水中，用0. 01mol/L的稀鹽 酸調(diào)節(jié)pH值至6左右，再緩慢滴加10ml的PP。。。。)F的水溶液1 Omg/( lmmol)， 室溫?cái)嚢?2小時(shí)，過S印hadex-G25凝膠柱，濃縮、冷凍干燥，得最終產(chǎn)物 造影劑FA-PEG (1圃-PAMAM/Gd 。 實(shí)施例2
1. PAMAM的合成
a) 0. 5G PAMAM-Me的合成
取9g乙二胺和30g甲醇，于三口燒瓶中，邊攪拌邊滴加103. 2g丙烯酸甲酯，滴加速度為每秒一滴，在25°C、攪拌24h。然后將產(chǎn)物在-5°C、 133. 3Pa 的條件下減壓蒸餾3小時(shí)，得到淡黃色液體，即為0.5G PAMAM-Me。
b) 1.0G PAMAM-NH2的合成
取20. 2g 0. 5代AMAM于三口燒瓶中，加入60g甲醇，攪拌、滴加72g 乙二胺，滴加速度為ld/s，在25。C、攪拌24h。然后產(chǎn)物在-5。C、 266.6Pa 的條件下減壓蒸餾3小時(shí)，得到淡黃色粘稠狀液體，即1.0G PAMAM-NH2。
c) 重復(fù)a) ,b)步驟，直到得到純凈的4.0G PAMAM
2. NH2—PEG (2000〉 -FA的合成
將0. 2mo1的FA溶于DMSO、攪拌、N"呆護(hù)，加入EDC/NHS活化2h，后投 入等摩爾比的聚乙二醇二胺(NH2-PEG(2。。。)-NH2)，室溫、避光、攪拌24小時(shí)， 截留分子量為2000的透析袋中透析72小時(shí)、濃縮、冷凍干燥，過硅膠柱分 離提純，得到產(chǎn)物單取代NH2—PEG(2,)-FA，避光低溫保存。
3. COOH-PEG(2。。。)-FA的合成
取2Ommo1的NH2—PEG (2。。?！?-FA溶于無水DMSO中，&保護(hù)，加入 0. 02mmolDMAP催化劑和40mmo1的丁二酸酐，40°C、攪拌48h，截留分子量為 2000的透析袋中透析，透析純化，冷凍干燥，得到COOH-PEG (2。。。)-FA
4. FA-PEG (2, -PAMAM的合成
取0. 05腿o1的PAMAM-NH2溶于DMSO中，待全部溶解后投入0. 32mmo1的 COOH-PEG(2。。。)-FA， N"呆護(hù)、室溫?cái)嚢?2h，截留分子量為10000的透析袋中 透析，透析純化，產(chǎn)物濃縮、冷凍干燥。用動(dòng)態(tài)光散射測(cè)PP(2。。。)F的粒徑和 Zeta電位，用凝膠滲透色譜測(cè)定其分散性。
5. FA-PEG (2000) -PAMAM/Gd的制備
稱取3. 75g (IO畫I) GdCl3. 6H20溶于lOmL水中，用0. Olmol/L的稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6左右，再緩慢滴加10ml的PP(麵)F的水溶液1 0mg/( lmmol), 室溫?cái)嚢璺磻?yīng)60h，過S印hadex-G25凝膠柱，收集物濃縮、冷凍干燥得最終 產(chǎn)物造影劑FA-PEG (調(diào))-PAMAM/Gd。 實(shí)施例3
1. PAMAM的合成
a) 0. 5G PAMAM-Me的合成
取9g乙二胺和30g甲醇，于三口燒瓶中，邊攪拌邊滴加103. 2g丙烯酸 甲酯，滴加速度為每秒一滴，在25°C、攪拌24h。然后將產(chǎn)物在-5r、 133. 3Pa 的條件下減壓蒸餾3小時(shí)，得到淡黃色液體。
b) l.OG PAMAM-朋2的合成
取20. 2g 0. 5代AMAM于三口燒瓶中，加入60g甲醇，攪拌、滴加72g 乙二胺，滴加速度為ld/s，在25'C、攪拌24h。然后產(chǎn)物在-5°C、 266. 6Pa 的條件下減壓蒸餾3小時(shí)，得到淡黃色粘稠狀液體，即1.0G PAMAM-NH2。
c) 重復(fù)a) ,b)步驟，直到得到純凈的4.0G PAMAM
2. NH2-PEG (4000) -FA的合成
將0. 2mo1的FA溶于DMSO、攪拌、N^呆護(hù)，加入EDC/NHS活化2h，后投 入等摩爾比的聚乙二醇二胺(NH2-PEG(4。。。)-NH2)，室溫、避光、攪拌24小時(shí)， 截留分子量為4000的透析袋中透析72小時(shí)、濃縮、冷凍干燥，過硅膠柱分 離提純，得到產(chǎn)物單取代NH2—PEG(柳。)-FA，避光低溫保存。
3. COOH-PEG (柳。)-FA的合成
取20mmo1的朋2—PEG(翻廣FA溶于無水DMSO中，&保護(hù)，加入0. 02mmo1 催化劑DMAP和40mmo1的丁二酸酐，4CTC、攪拌48h，截留分子量為4000的 透析袋中透析，透析除去溶劑DMSO，濾除不溶物，冷凍干燥，得到C00H-PEG
ii(4000) 一FA
4. FA-PEG (漏)-PAMAM的合成
取0. 05mmol的PAMAM-朋2溶于DMS0中，待全部溶解后投入0. 32腿o1的 COOH-PEG -FA， N2保護(hù)下室溫?cái)嚢?2h。截留分子量為20000的透析袋中 透析，除去溶劑和未反應(yīng)物。產(chǎn)物濃縮、冷凍干燥。用動(dòng)態(tài)光散射測(cè)PP，。) F的粒徑和Zeta電位，用凝膠滲透色譜測(cè)定其分散性。
5. FA-PEG ", -PAMAM/Gd的制備
稱取3. 75g (lO咖ol) GdCl3. 6H20溶于10mL水中，用0. Olmol/L的稀鹽 酸調(diào)節(jié)pH值至6左右，再緩慢滴加10ml的PP(濯)F的水溶液1 Omg/( lmmol )， 室溫?cái)嚢?4h，，過S印hadex-G25凝膠柱，收集物濃縮、冷凍干燥,得最終產(chǎn) 物，大分子造影劑FA-PEG (働> -PAMAM/Gd 。 實(shí)施例4-6
除分別用FeCl3、 FeCl2、 MnCl2替代GdCl3外，其它同實(shí)施例1。 實(shí)施例7-9
除分別用FeCl3、 FeCl2、 MnCl2替代GdCh外，其它同實(shí)施例2。 實(shí)施例10-12
除分別用FeCl3、 FeCl2、 MnCl2替代GdCl3外，其它同實(shí)施例3。 實(shí)施例13-15
除用半乳糖替代葉酸(FA)外，其它分別同實(shí)施例l、 2、 3。 實(shí)施例16-18
除用多肽替代葉酸(FA)夕卜，其它分別同實(shí)施例1、 2、 3。 在上述實(shí)施例中，制得了粒徑小于100nm，基于樹形聚合物的肺癌或肝
癌靶向造影劑。上述實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明但并不局限于此，應(yīng)該理解在
不脫離本發(fā)明的范圍內(nèi)還可有多種變通或替換方案。
權(quán)利要求
1、一種樹形聚合物靶向造影劑，其特征在于該造影劑為納米粒子，具有以下結(jié)構(gòu)處于最外端的靶向基團(tuán)；作為連接臂的親水性聚乙二醇鏈；位于中心核的樹形聚合物PAMAM；體內(nèi)成像的順磁性金屬X；其通式為PAMAM-PEG(n)-T/X；其中X為順磁性金屬離子Fe2+、Fe3+、Mn2+、Dy3+或Gd3+；PEG為分子量為1000～10000Da的聚乙二醇；T為靶向基團(tuán)；PAMAM為樹形聚合物；靶向基團(tuán)為葉酸、半乳糖或多肽。
2、 一種權(quán)利要求1所述造影劑的制備方法，其特征在于該方法是將順 磁性金屬離子配成溶液并用濃度為0. 1M的鹽酸調(diào)節(jié)至pH值為5. 8 6. 2，然 后將樹形大分子配體PAMAM-PEG (n) -T用水稀釋后滴加到經(jīng)調(diào)節(jié)的順磁性金 屬離子溶液中，避光、滴加時(shí)間控制在30min 45min，室溫下反應(yīng)60 72 小時(shí)后過凝膠柱，收集液濃縮后凍干得到造影劑PAMAM-PEG (n) _T/X,避光 保存；其順磁性金屬離子與樹形大分子配體PAMAM-PEG (n) -T的摩爾量比為 10:1 5: l;順磁性金屬離子溶液的濃度為1 2M;樹形大分子配體PAMAM-PEG(n) -T溶液的濃度為0. 5 lmg/ml;所述樹形大分子配體PAMAM-PEG (n) -T的制備包括以下步驟a) 通過MA的邁克爾加成聚合反應(yīng)制備整數(shù)代的PAMAM大分子；b) PAMAM與丁二酸酐反應(yīng)形成端基為羧基的PAMAM-COOH;c) 聚乙二醇二胺(NH2-PEG(n)-NH2)與T等摩爾比反應(yīng)，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)、 4-二甲氨基吡啶(DMAP) 為縮合劑和催化劑在二甲基亞砜溶劑中反應(yīng)，得到NH2-PEG (n) -T;d) NH2-PEG (n) -T與PAMAM-C00H反應(yīng)，其摩爾比為32 : 1，反應(yīng)液用 截留分子量為3500-15000的透析袋，在H20中透析60 72 h ，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 濃縮，冷凍機(jī)干燥，得樹形大分子配體PAMAM-PEG (n) -T。
3、 一種權(quán)利要求1所述的造影劑，其特征在于該造影劑在肺癌早期影像 診斷中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種樹形聚合物靶向造影劑及其制備方法，其造影劑為納米粒子，其結(jié)構(gòu)為處于最外端的靶向基團(tuán)T；作為連接臂的親水性聚乙二醇鏈；位于中心核的樹形聚合物PAMAM；體內(nèi)成像的順磁性金屬X；其通式為PAMAM-PEG_(n)-T/X。其制備方法不同分子量的PEG和靶向基團(tuán)反應(yīng)得一端為靶向基團(tuán)，一端為氨基的NH₂-PEG_(n)-T；再將NH₂-PEG_(n)-T與PAMAM-COOH以32∶1的摩爾比反應(yīng)，即得大分子配體T-PEG_(n)-PAMAM；將此配體與順磁性金屬離子溶液螯和得PAMAM-PEG_(n)-T/X。本發(fā)明的制備方法操作簡(jiǎn)單，條件溫和安全，適于推廣應(yīng)用。且所得造影劑，細(xì)胞毒性小，馳豫率高，白鼠體內(nèi)體成像效果很好；荷瘤裸鼠，體內(nèi)成像時(shí)，靶向性明顯。
文檔編號(hào)A61K51/06GK101584870SQ200910053369
公開日2009年11月25日 申請(qǐng)日期2009年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月18日
發(fā)明者余家會(huì), 劉順英, 張偉祿, 娜 李, 梁重時(shí), 羅淑芳 申請(qǐng)人:華東師范大學(xué)