專利名稱：黃酮類化合物在保護肝臟中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)和醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體而言，涉及黃酮類活性物質(zhì)在疾病預防 和治療中的新用途。
背景技術(shù)：
本領(lǐng)域中已知多種與血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性增加相關(guān)的疾病，例如(但不限于)肝 損傷、肝內(nèi)膽汁淤積、膽道梗阻、胰腺疾病、甲狀腺功能亢進癥、急性心肌梗塞、心力衰竭或 多發(fā)性肌炎。其中，肝損傷是嚴重危害人類健康的重大疾病。在這些疾病中，肝炎是嚴重危害人類健康的重大疾病。肝炎特別是病毒性肝炎在 中國的發(fā)病率持續(xù)升高。就乙型肝炎來說，全世界20億人感染乙肝病毒，其中6. 9億在中 國，全球有乙肝病毒表面抗原(HBsAg)攜帶者3. 5億人，其中三分之一在中國；全世界每年 有75萬人死于乙肝病毒感染引起的疾病，其中28萬人來自中國。如此驚人的數(shù)據(jù)，促使我 們不得不尋找有效的藥物治療及預防疾病的發(fā)生。肝炎從病因看主要有病毒性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎等。但是研究發(fā) 現(xiàn)，不論其初始病因如何，炎癥和免疫介導的肝細胞和肝組織損傷是這些疾病發(fā)生的必經(jīng) 過程，并且，它是影響疾病嚴重程度與預后的主要原因。因此，探索降低血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性(尤其是肝炎)的新方法和藥物一直是醫(yī)藥 領(lǐng)域的研究熱點。ConA(為刀豆蛋白A，一種植物凝集素)誘導的肝炎模型(ConA inducedhepatitis, CIH)是一種國際上廣泛采用的、用以研究免疫介導的肝損傷的實驗模 型(TiegsG，Hentschel J,ffendel A. .1 Clin Invest 1992，90 :196-203)。在模型誘導后 8 到24小時，動物血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性急劇增加，病理學分析(如HE染色和TUNEL) 可以觀察到肝臟正常結(jié)構(gòu)被破壞，大量的肝實質(zhì)細胞凋亡。在CIH的誘導過程中，細胞因子 腫瘤壞死因子a (TNFa)、干擾素、(IFN Y )、白介素_12以及白介素_4對肝臟的損傷起了 關(guān)鍵作用。CIH為研究免疫介導的肝損傷的發(fā)病機理以及尋找有效藥物治療及預防免疫介 導的肝損傷提供了有利的動物模型。黃酮類(Flavonoids)化合物廣泛分布于植物界，到目前為止，已發(fā)現(xiàn)了 2000多 種。它們多數(shù)以苷的形式存在，少數(shù)以游離態(tài)存在，其生理作用和生物活性是多種多樣的。 由于黃酮類化合物結(jié)構(gòu)的共軛性，對紫外和可見光均顯示強吸收，并在可見和紫外區(qū)內(nèi)高 度穩(wěn)定。天然來源的黃酮類化合物具有抗菌、抗光敏、抗氧化、抗自由基、抗病毒等生物活性 與藥理作用。目前已產(chǎn)業(yè)化開發(fā)了諸多植物黃酮類提取物，如水飛薊素、銀杏提取物、茶多酚、 葡萄籽提取物、松樹皮提取物、甘草黃酮、大豆異黃酮、葛根異黃酮等。然而，在治療或預防對象中與血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性增加相關(guān)的疾病，尤其是免疫 介導的肝損傷中，仍然迫切需要開發(fā)出有效的藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一正是在于開發(fā)出某些黃酮類化合物在降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性 (尤其是預防和治療免疫介導的肝臟損傷相關(guān)疾病)中的新用途，。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種具有結(jié)構(gòu)式A的化合物、其藥學上可接受的鹽、 或它們的組合在制備用于治療或預防對象中與血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性增加相關(guān)的疾病的藥 物中的用途 式中R” R2、R3和R4各自獨立地為選自下組的基團-H、-Ch烷基、-OH、-C^烷氧 基、-SH、-NH2、氟、氯、溴或碘。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述禮、R2、R3和R4各自獨立地為-H或-0H。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述化合物具有選自下組的結(jié)構(gòu)式 在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述與血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性增加相關(guān)的疾病包 括肝損傷、肝內(nèi)膽汁淤積、膽道梗阻、胰腺疾病、甲狀腺功能亢進癥、急性心肌梗塞、心力衰 竭或多發(fā)性肌炎。在一個優(yōu)選例中，所述肝損傷為病毒性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝 炎、藥物性肝炎、脂肪肝所致的肝損傷。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述肝損傷為免疫介導的肝損傷。在一個優(yōu)選例中，所述免疫介導的肝損傷選自病毒性肝炎、酒精性肝炎和自身免 疫性肝炎。在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物還降低對象中血清細胞因子的表達。在另一 個優(yōu)選例中，所述血清細胞因子是腫瘤壞死因子-a和/或干擾素。在另一個實施方式中，所述對象是哺乳動物。在一個優(yōu)選例中，所述哺乳動物是
在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述藥物組合物中的具有結(jié)構(gòu)式A的化合物、其 藥學上可接受的鹽、或它們的組合占藥物組合物總重量的0. 001-99. 9wt%。在一個優(yōu)選例中，所述藥物組合物中的具有結(jié)構(gòu)式A的化合物、其藥學上可接受 的鹽、或它們的組合占藥物組合物總重量的l_95wt%，優(yōu)選5-90wt%，更優(yōu)選10-80wt%。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述藥物組合物的劑型包括片劑、粉末劑、注射 劑、顆粒劑、糖漿、膠囊、溶液劑、栓劑或藥膏。在一個優(yōu)選例中，所述藥物組合物為單位劑型或多劑型，其中具有結(jié)構(gòu)式A的化 合物、其藥學上可接受的鹽、或它們的組合的含量為l_4000mg/劑，優(yōu)選100-2000mg/劑。在另一優(yōu)選例中，以0. 01-200mg/kg體重，較佳地0. l_150mg/kg體重，優(yōu)選 0. 5-120mg/kg體重，更優(yōu)選l-70mg/kg體重，更優(yōu)選2_50mg/kg體重，最優(yōu)選2. 5-20mg/kg 體重給予所述藥物組合物。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述藥物組合物還包含緩解或治療肝臟損傷的其 它藥物。在一個優(yōu)選例中，所述緩解或治療肝臟損傷的其它藥物選自丹參酮II A、甘草酸 制劑、綠茶多酚、水飛薊素或粉防己堿。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種藥物組合物，其含有(1)有效量的具有結(jié)構(gòu)式A的化合物、其藥學上可接受的鹽、或它們的組合；(2)選自下組的一種或多種物質(zhì)丹參酮II A、甘草酸制劑、綠茶多酚、水飛薊素、 粉防己堿或它們的組合；和(3)藥學上可接受的載體。在一個優(yōu)選例中，所述具有結(jié)構(gòu)式A的化合物、其藥學上可接受的鹽、或它們 的組合占組合物總重量的0. 001-99. 9wt%，優(yōu)選l_95wt%，較優(yōu)選為5_90wt%，更優(yōu)選 10-80wt%。在另一優(yōu)選例中，所述化合物選自結(jié)構(gòu)式B的化合物(即芹黃素)、結(jié)構(gòu)式C的 化合物(即木樨草素)、或結(jié)構(gòu)式D的化合物(即黃芩素)或它們的組合。在另一優(yōu)選例中，組分(1)和組分(2)的重量比為0.01 100 100 0.01，優(yōu) 選 1 95 95 1。在本發(fā)明的第三方面，提供了治療或預防疾病的方法。在一個優(yōu)選例中，本發(fā)明提供了一種治療或預防對象與血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性增加 相關(guān)的疾病的方法，所述方法包括給予需要的對象有效量的具有結(jié)構(gòu)式A的化合物、其藥 學上可接受的鹽、或它們的組合， 式中
R” R2、R3和R4各自獨立地為選自下組的基團-H、-Ch烷基、-0H、烷氧 基、-SH、-NH2、氟、氯、溴或碘。在另一個優(yōu)選例中，所述化合物選自如上文所示的結(jié)構(gòu)式B的化合物(即芹黃 素)、如上文所示的結(jié)構(gòu)式C的化合物(即木樨草素)、或如上文所示的結(jié)構(gòu)式D的化合物 (即黃芩素)或它們的組合。在一個實施方式中，所述與血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性增加相關(guān)的疾病包括肝損傷、肝 內(nèi)膽汁淤積、膽道梗阻、胰腺疾病、甲狀腺功能亢進癥、急性心肌梗塞、心力衰竭或多發(fā)性肌 炎。在一個優(yōu)選例中，所述肝損傷為病毒性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、藥物 性肝炎、脂肪肝所致的肝損傷。在另一個優(yōu)選例中，所述肝損傷為免疫介導的肝損傷，優(yōu)選病毒性肝炎、酒精性 肝炎和自身免疫性肝炎。在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明提供了一種降低血清細胞因子表達的方法，所述方法包 括給予需要的對象有效量的具有結(jié)構(gòu)式A的化合物、其藥學上可接受的鹽、或它們的組
口 o在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明提供了一種治療或預防與血清細胞因子表達過度相關(guān)的 疾病的方法，所述方法包括給予需要的對象有效量的具有結(jié)構(gòu)式A的化合物、其藥學上可 接受的鹽、或它們的組合。在本發(fā)明的一個實施方式中，以0. 01_200mg/kg體重，較佳地0. l_150mg/kg體 重，優(yōu)選0. 5-120mg/kg體重，更優(yōu)選l-70mg/kg體重，更優(yōu)選2_50mg/kg體重，最優(yōu)選 2. 5-20mg/kg體重給予具有結(jié)構(gòu)式A的化合物、其藥學上可接受的鹽、或它們的組合。在本發(fā)明的另一個實施方式中，以片劑、粉末劑、注射劑、顆粒劑、糖漿、膠囊、溶液 劑、栓劑或藥膏的形式給予具有結(jié)構(gòu)式A的化合物、其藥學上可接受的鹽、或它們的組合。在本發(fā)明的另一個實施方式中，與其它緩解或治療肝臟損傷的藥物一起或先后給 予具有結(jié)構(gòu)式A的化合物、其藥學上可接受的鹽、或它們的組合。在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述緩解或治療肝臟損傷的其它藥物選自丹參酮 IIA、甘草酸制劑、綠茶多酚、水飛薊素、粉防己堿或它們的組合。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。


圖1 對CIH小鼠實施芹黃素(Api)、木樨草素(Lut)和黃芩素(Bai)治療的實驗 流程示意圖。圖2 芹黃素(Api)對CIH小鼠血清中ALT水平的影響。圖中，“***”代表與對 照相比，P<0. 001。圖3 經(jīng)芹黃素(Api)治療的CIH小鼠肝臟組織的H&E染色和TUNEL染色。其中，圖 3A為對照組小鼠肝臟組織切片H&E染色結(jié)果；圖3B為Api處理組小鼠H&E染色結(jié)果；圖3C 為對照組小鼠TUNEL染色結(jié)果；圖3D為Api處理組小鼠TUNEL染色結(jié)果。放大倍數(shù)X 100。圖4 芹黃素(Api)對炎性細胞因子(圖4A :TNF_a ；圖4B :IFN-y)的影響。圖中，“ ** ”代表與對照相比，P < 0. 01，“ _ ”代表與對照相比，P < 0. 001。圖5 木樨草素(Lut)對CIH小鼠血清中ALT水平的影響。圖中，“***”代表與 對照相比，P<0. 001。圖6 經(jīng)木樨草素(Lut)治療的CIH小鼠肝臟組織的H&E染色和TUNEL染色。其 中，圖6A為對照組小鼠肝臟組織切片H&E染色結(jié)果；圖6B為Lut處理組小鼠H&E染色結(jié) 果；圖6C為對照組小鼠TUNEL染色結(jié)果；圖6D為Lut處理組小鼠TUNEL染色結(jié)果。放大倍 數(shù) X100。圖7 木樨草素(Lut)對炎性細胞因子(圖7A :TNF_ a ；圖7B :IFN- y )的影響。圖 中，“ *，，代表與對照相比，P < 0. 05，“ ** ”代表與對照相比，P < 0. 01。圖8 黃芩素(Bai)對CIH小鼠血清中ALT水平的影響。圖中，“***”代表與對 照相比，P<0. 001。圖9 經(jīng)黃芩素(Bai)治療的CIH小鼠肝臟組織的H&E染色和TUNEL染色。其中，圖 9A為對照組小鼠肝臟組織切片H&E染色結(jié)果；圖9B為Bai處理組小鼠H&E染色結(jié)果；圖9C 為對照組小鼠TUNEL染色結(jié)果；圖9D為Bai處理組小鼠TUNEL染色結(jié)果。放大倍數(shù)X 100。圖10 黃芩素(Bai)對炎性細胞因子(圖10A :TNF_a ；圖10B :IFN-y)的影響。 圖中，“*”代表與對照相比，P < 0. 05，“#”代表與對照相比，P < 0. 01。
具體實施例方式本發(fā)明人通過長期而深入的研究發(fā)現(xiàn)具有結(jié)構(gòu)式A的黃酮類化合物(如芹黃素、 木樨草素、黃芩素)可降低血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性，且對免疫介導的肝損傷具有保護作用。 本發(fā)明人進一步發(fā)現(xiàn)此類黃酮類化合物可下調(diào)與炎癥密切相關(guān)的細胞因子——IFN-y和 TNF-a，從而明確了其保護作用可能的機理。在此基礎(chǔ)上，發(fā)明人完成了本發(fā)明。具體而言，本發(fā)明利用具有結(jié)構(gòu)式A的黃酮類化合物(例如芹黃素、木樨草素、 黃芩素)，在CIH模型上證實了它們對免疫介導的肝損傷的保護作用。這些黃酮類化合物 均可顯著地抑制誘導CIH后小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的活性，使得ALT的水平降低到 1000U/L左右(CIH小鼠ALT平均值在8000U/L以上)。肝臟的病理分析顯示，在這些黃酮 類化合物分別處理后的小鼠的肝臟中，幾乎看不到明顯的肝臟正常結(jié)構(gòu)的破壞、炎性浸潤 以及肝細胞凋亡。進一步的研究表明，這些黃酮類化合物通過下調(diào)與炎癥密切相關(guān)的細胞 因子——IFN-y和TNF-a，而抑制免疫介導肝損傷。本發(fā)明提供了具有結(jié)構(gòu)式A的黃酮類化合物在預防和治療免疫介導的肝損傷中 的新用途，為降低開發(fā)成本和積極有效地治療肝臟疾病提供了一種新的途徑。具有結(jié)構(gòu)式A的黃酮類活件物質(zhì)如本發(fā)明所用，術(shù)語“具有結(jié)構(gòu)式A的黃酮類活性物質(zhì)”和“具有結(jié)構(gòu)式A的黃酮 類化合物”可互換使用，是指具有結(jié)構(gòu)式A的黃酮結(jié)構(gòu)活性成分、其藥學上可接受的鹽、或它 們的混合物，
結(jié)構(gòu)式A_式中禮、R2、R3和R4各自獨立地為選自下組的基團-H、烷基、-0H、烷氧 基、-SH、-NH2、氟、氯、溴或碘。優(yōu)選所述活性物質(zhì)具有為如下所詳細描述的芹黃素(結(jié)構(gòu) 式B)、木樨草素(結(jié)構(gòu)式C)和/或黃芩素(結(jié)構(gòu)式D)。在本發(fā)明中，對于制備黃酮類活性物質(zhì)的方法沒有特別的限制，比如其可提取自 天然植物(例如中藥材)，或可以采用化學合成、或半化學合成的方法來制備。本發(fā)明中所 使用的黃酮類活性物質(zhì)可通過市售途徑獲得，例如可購自上海食品藥品檢定所、Sigma等。代表性的具有結(jié)構(gòu)式A的黃酮類活性物質(zhì)如下(但不限于)A.芹黃素芹黃素(apigenin)，是一種黃酮類化合物，又稱芹菜素或洋芹素，廣泛分布于溫熱 帶的蔬菜和水果中，尤以芹菜中含量為高。在一些藥用植物如車前子、絡(luò)石藤等中也有很 高的含量，植物源性飲料如茶、酒以及一些調(diào)味品中也有分布。芹菜素的化學結(jié)構(gòu)為5，7， 4'-三羥基黃酮(如上文的式B所示)，相對分子質(zhì)量為270。芹菜素不溶于水，易溶于乙醇、二甲基亞砜(DMS0)。芹黃素現(xiàn)已可人工合成，是一 種來源充足、作用廣泛、具有廣闊開發(fā)前景的天然植物成分。早在20世紀70年代，國外科研工作者就對芹黃素及其相關(guān)化合物進行了研究。然 而，這些研究主要集中在芹黃素抗腫瘤及化療增敏作用、對內(nèi)分泌功能的影響、抗菌、抗病 毒作用等方面，而并未涉及其對與血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性增加相關(guān)的疾病(尤其是免疫介導 的肝損傷)的預防和/或治療作用。本發(fā)明中證明了芹黃素對與血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性增加相關(guān)的疾病，尤其是免疫介 導的肝損傷具有預防和治療作用，低劑量的芹黃素即可極為顯著地抑制誘導CIH后小鼠血 清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的活性。并且，肝臟的病理分析顯示，在芹黃素處理后的小鼠的肝臟 中，幾乎看不到明顯的肝臟正常結(jié)構(gòu)的破壞、炎性浸潤以及肝細胞凋亡。進一步的研究表 明，芹黃素通過下調(diào)與炎癥密切相關(guān)的細胞因子——IFN-y和TNF-a，而抑制免疫介導肝 損傷?？捎糜诒景l(fā)明中的芹黃素包括但不限于提取自天然植物(例如芹菜、車前子、絡(luò) 石藤等)的芹黃素，化學或半化學合成的芹黃素，或市售的芹黃素(例如可購自上海食品藥 品檢定所、Sigma等)。制成藥物組合物時，芹黃素可以是中性形式或鹽形式。這些鹽包括酸加成鹽，與無 機酸，例如鹽酸、磺酸或磷酸，或與有機酸，例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的鹽。合 適的堿加成鹽包括但不限于基于堿金屬或堿土金屬的陽離子，包括鋰、鈉、鉀、鈣、鎂和招 鹽；非毒性季銨和胺陽離子，包括銨、四甲銨、四乙銨、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、二乙胺 和乙胺。用于形成堿加成鹽的其它代表性有機胺包括乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶和哌 嗪等。
B.木樨草素木樨草素(luteolin)是一種天然黃酮類化合物，存在于多種植物中，其結(jié)構(gòu)如上 文的結(jié)構(gòu)式C所示。該化合物具有多種藥理活性，如消炎、抗過敏、抗腫瘤、抗菌、抗病毒等，臨床主要 用于止咳、祛痰、消炎、治療心血管疾病、治療“肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥”、SARS等。然而， 本領(lǐng)域并未涉及木樨草素對與血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性增加相關(guān)的疾病(尤其是免疫介導的 肝損傷)的預防和/或治療作用。本發(fā)明中證明了木樨草素對免疫介導的肝損傷具有保護作用，低劑量的芹黃素即 可極為顯著地抑制誘導CIH后小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的活性。并且，肝臟的病理分 析顯示，在木樨草素處理后的小鼠的肝臟中，幾乎看不到明顯的肝臟正常結(jié)構(gòu)的破壞、炎性 浸潤以及肝細胞凋亡。進一步的研究表明，木樨草素通過下調(diào)與炎癥密切相關(guān)的細胞因 子——IFN- y和TNF- a，而抑制免疫介導肝損傷?？捎糜诒景l(fā)明中的木樨草素包括但不限于提取自天然植物(例如木樨草 (ResedaodorataL.)的葉、莖和枝、金銀花、菊花、荊芥、白毛夏枯草等)的木樨草素，化學或 半化學合成的木樨草素，或市售的木樨草素(例如可購自上海食品藥品檢定所、Sigma等)。制成藥物組合物時，木樨草素可以是中性形式或鹽形式。這些鹽包括酸加成鹽，與 無機酸，例如鹽酸、磺酸或磷酸，或與有機酸，例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的鹽。 合適的堿加成鹽包括但不限于基于堿金屬或堿土金屬的陽離子，包括鋰、鈉、鉀、鈣、鎂和 鋁鹽；非毒性季銨和胺陽離子，包括銨、四甲銨、四乙銨、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、二乙 胺和乙胺。用于形成堿加成鹽的其它代表性有機胺包括乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶和 哌嗪等。C.黃芩素黃芩素(Baicalein)是一種天然黃酮類化合物，存在于多種植物中，其結(jié)構(gòu)如上 文的結(jié)構(gòu)式D所示。研究表明黃芩素具有降低腦血管阻力，改善腦血循環(huán)、增加腦血流量及抗血小板 凝集的作用，臨床用于腦血管病后癱瘓的治療等。然而，本領(lǐng)域并未涉及黃芩素對與血清谷 丙轉(zhuǎn)氨酶活性增加相關(guān)的疾病(尤其是免疫介導的肝損傷)的預防和/或治療作用。本發(fā)明中證明了黃芩素對免疫介導的肝損傷具有保護作用，低劑量的黃芩素即可 極為顯著地抑制誘導CIH后小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的活性。并且，肝臟的病理分析 顯示，在黃芩素處理后的小鼠的肝臟中，幾乎看不到明顯的肝臟正常結(jié)構(gòu)的破壞、炎性浸 潤以及肝細胞凋亡。進一步的研究表明，黃芩素通過下調(diào)與炎癥密切相關(guān)的細胞因子—— IFN-y和TNF-a，而抑制免疫介導肝損傷。可用于本發(fā)明中的黃芩素包括但不限于提取自天然植物(例如唇形科植物高 黃芩(Scutellaria altissimaL.)的葉、并頭草(S. galericulataL.)的葉和根、紫葳科 植物木蝴蝶(Oroxylum indicum(L.)Vent.)的種子和莖皮、車前科植物大車前(Plantago majorL.)的葉等)的黃芩素，化學或半化學合成的黃芩素，或市售的黃芩素(例如可購自上 海食品藥品檢定所、Sigma等)。制成藥物組合物時，黃芩素可以是中性形式或鹽形式。這些鹽包括酸加成鹽，與無 機酸，例如鹽酸、磺酸或磷酸，或與有機酸，例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的鹽。合適的堿加成鹽包括但不限于基于堿金屬或堿土金屬的陽離子，包括鋰、鈉、鉀、鈣、鎂和鋁 鹽；非毒性季銨和胺陽離子，包括銨、四甲銨、四乙銨、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、二乙胺 和乙胺。用于形成堿加成鹽的其它代表性有機胺包括乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶和哌嗪等。具有結(jié)構(gòu)式A的黃酮類活件物質(zhì)的新用涂黃酮類活性物質(zhì)在以往研究和臨床應用中已用于心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌 系統(tǒng)、腫瘤等疾病。本發(fā)明人利用本領(lǐng)域廣泛接受的T細胞介導的肝炎模型“ConA誘導的肝炎模 型”(CIH)，證實了具有結(jié)構(gòu)式A的黃酮類化合物具有對免疫介導的肝損傷有顯著的保護作 用，具有結(jié)構(gòu)式A的黃酮類化合物可以使CIH小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的活性顯著降低。 肝臟的病理分析也顯示，在黃酮類化合物處理組小鼠肝臟正常結(jié)構(gòu)的破壞和TUNEL陽性的 凋亡細胞與對照組相比均明顯減少。發(fā)明人深入的工作進一步表明具有結(jié)構(gòu)式A的黃酮類化合物對免疫介導的肝損 傷的保護作用的機理是其導致介導肝損傷的炎性細胞因子，包括干擾素和腫瘤壞死因 子a表達的顯著下降，從而保護肝臟免受損傷。如本文所用，術(shù)語“免疫介導的肝損傷”是所有由免疫介導的肝臟損傷的統(tǒng)稱，在 許多肝炎的發(fā)病過程中都起了重要作用。免疫介導的肝損傷包括但不限于病毒性肝炎、酒 精性肝炎、自身免疫性肝炎等肝臟損傷疾病。肝損傷、肝纖維化和肝癌是肝臟損傷的不同病 理階段，免疫介導的肝損傷一般出現(xiàn)在急性期或慢性期的早期，如果由急性期轉(zhuǎn)入慢性期 多會導致肝臟的纖維化，而如果肝細胞自我修復系統(tǒng)紊亂，細胞大量的惡性增殖就轉(zhuǎn)變?yōu)?肝癌。本發(fā)明中提供了具有結(jié)構(gòu)式A的黃酮類活性物質(zhì)的新用途，其可用于治療或預防 對象的與血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性增加相關(guān)的疾病，包括治療或預防對象的肝損傷(尤其是 免疫介導的肝損傷)、或降低血清細胞因子(例如腫瘤壞死因子_a和/或干擾素)的 表達。所述與血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性增加相關(guān)的疾病包括(但不限于)肝損傷、肝內(nèi)膽汁淤 積、膽道梗阻、胰腺疾病、甲狀腺功能亢進癥、急性心肌梗塞、心力衰竭或多發(fā)性肌炎。其中， 肝損傷包括(但不限于)病毒性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、藥物性肝炎、脂肪肝 所致的肝損傷。在一個優(yōu)選例中，所述肝損傷為免疫介導的肝損傷，優(yōu)選為病毒性肝炎、酒精性肝 炎和自身免疫性肝炎。相應地，本發(fā)明中還提供了具有結(jié)構(gòu)式A的黃酮類活性物質(zhì)在制備用于治療或預 防上述疾病的藥物組合物中的用途，以及利用具有結(jié)構(gòu)式A的黃酮類活性物質(zhì)或其藥物組 合物來治療或預防上述疾病的方法。應理解，本發(fā)明中所用術(shù)語“緩解”是指使得疾病或失調(diào)的征狀得到改善，甚至該 疾病或失調(diào)消失或痊愈。藥物組合物本發(fā)明還提供了一種藥物組合物在治療或預防對象與血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性增加 相關(guān)的疾病(尤其是肝損傷)中的用途，所述的藥物組合物含有有效量的具有結(jié)構(gòu)式A的 黃酮類活性物質(zhì)以及藥學上可接受的載體，或任選含有其它本領(lǐng)域已知的對上述疾病具有治療或預防作用的其它活性成分。如本文所用，術(shù)語“含有”或“包括”包括了“包含”、“基本上由……構(gòu)成”、和 “由……構(gòu)成”。如本文所用，術(shù)語“藥學上可接受的”的成分是適用于人和/或動物而無過度不良 副反應(如毒性、刺激和變態(tài)反應)的，即有合理的效益/風險比的物質(zhì)。如本文所用，術(shù)語“有效量”是指可對人和/或動物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和 /或動物所接受的量。如本文所用，術(shù)語“藥學上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種 賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用 后沒有過分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在《雷明頓藥物科學》 (Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Pub. Co. ,N. J. 1991)中可找到關(guān)于藥學上 可接受的賦形劑的充分討論。在組合物中藥學上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些 載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如填充劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑、泡騰劑、潤濕劑或乳 化劑、矯味劑、PH緩沖物質(zhì)等。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受 的水性載體介質(zhì)中，其中PH通常約為5-8，較佳地，pH約為6-8。本發(fā)明的藥物組合物中可含有作為有效成分的具有結(jié)構(gòu)式A的黃酮類化合物、 其藥學上可接受的鹽、或它們的混合物。本發(fā)明的組合物中具有結(jié)構(gòu)式A的黃酮類活性物質(zhì)有效成分占組合物總重 量的0. 001-99. 9wt% ；優(yōu)選為組合物總重量的l_95wt%，較優(yōu)選為5_90wt%，更優(yōu)選 10-80wt%。余量為藥學上可接受的載體以及其它添加劑等物質(zhì)。如本文所用，術(shù)語“單位劑型”是指為了服用方便，將本發(fā)明的組合物制備成單次 服用所需的劑型，包括但不限于各種固體劑(如片劑)、液體劑、膠囊劑、緩釋劑。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，所述組合物為單位劑型或多劑型，且其中具有 結(jié)構(gòu)式A的黃酮類活性物質(zhì)的含量為l-4000mg/劑，優(yōu)選100-2000mg/劑。在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述組合物中含有低劑量的具有結(jié)構(gòu)式A的黃酮類活 性物質(zhì)，例如l-10mg/劑，更優(yōu)選2-8mg/劑，進一步優(yōu)選含有3_6mg/劑。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選例中，所述組合物中含有中劑量的具有結(jié)構(gòu)式A的黃酮類 活性物質(zhì)，例如其含量為10-1000mg/劑；更優(yōu)選20-800mg/劑，進一步優(yōu)選50_600mg/齊lj， 更優(yōu)選75-500mg/劑。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選例中，所述組合物中含有高劑量的具有結(jié)構(gòu)式A的黃 酮類活性物質(zhì)，例如其含量為1000-3500mg/劑；更優(yōu)選1100-3200mg/劑，進一步優(yōu)選 1200-3000mg/ 劑，更優(yōu)選 1500_2000mg/ 齊[J。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選例中，每天施用1-6劑本發(fā)明的組合物，優(yōu)選施用1-3劑； 在高劑量時優(yōu)選每天服用1齊U。本發(fā)明的組合物，可以為固態(tài)(如顆粒、片劑、凍干粉、栓劑、膠囊、舌下含片)或液 態(tài)(如口服液、注射液)或其它合適的形式。應理解，所用黃酮類活性物質(zhì)的有效劑量可隨待施用或治療的對象的嚴重程度而 變化。具體情況根據(jù)對象的個體情況(例如對象體重、年齡、身體狀況、所需達到的效果)
12來決定，這在熟練醫(yī)師或營養(yǎng)師可以判斷的范圍內(nèi)。施用方式本發(fā)明的組合物可以通過常規(guī)途徑施用，其中包括(但并不限于)口服、肌注、皮 下注射等。優(yōu)選口服施用。組合物形式應與施用方式相匹配。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)需要確定具有結(jié)構(gòu)式A的黃酮類活性物質(zhì)的服用量。通常 本發(fā)明組合物的施用量，按活性物質(zhì)重量計，通常為每天約0. 01-200mg活性物質(zhì)/kg體重， 較佳地約0. l-150mg活性物質(zhì)/kg體重，優(yōu)選0. 5-120mg活性物質(zhì)/kg體重，更優(yōu)選l_70mg/ kg體重，更優(yōu)選2-50mg活性物質(zhì)/kg體重，最優(yōu)選2. 5_20mg活性物質(zhì)/kg體重。在一個實施方式中，本發(fā)明組合物含有作為活性物質(zhì)的芹黃素，按芹黃素重量計， 通常為每天約0. 5-120mg芹黃素/kg體重，更優(yōu)選1-70芹黃素mg/kg體重，更優(yōu)選2_50mg 芹黃素/kg體重，最優(yōu)選2. 5-20mg芹黃素/kg體重施用藥物。在一個實施方式中，本發(fā)明組合物含有作為活性物質(zhì)的木樨草素，按木樨草素重 量計，通常為每天約l-200mg木樨草素/kg體重，更優(yōu)選2-140木樨草素mg/kg體重，更優(yōu) 選4-100mg木樨草素/kg體重，最優(yōu)選5-40mg木樨草素/kg體重施用藥物。在一個實施方式中，本發(fā)明組合物含有作為活性物質(zhì)的黃芩素，按黃芩素重量計， 通常為每天約0. 5-120mg黃芩素/kg體重，更優(yōu)選1-70黃芩素mg/kg體重，更優(yōu)選2_50mg 黃芩素/kg體重，最優(yōu)選2. 5-20mg黃芩素/kg體重施用藥物。本發(fā)明的組合物可直接使用，也可與其它治療劑或輔劑聯(lián)合使用。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的組合物還可與有效量(如0. 0005-0. 1克/ kg體重/天；優(yōu)選的，為0. 001-0. 05克/kg體重/天)的選自下組的一種或多種物質(zhì)聯(lián)合 施用丹參酮II A、甘草酸制劑、水飛薊素、綠茶多酚或粉防己堿等。當兩種或兩種以上的藥物聯(lián)合給藥時，一般具有優(yōu)于兩種藥物分別單獨給藥的效 果。優(yōu)選地，聯(lián)合施用的藥物或其它制劑不干擾本發(fā)明黃酮類活性物質(zhì)有效成分的治療活 性。本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明揭示了具有結(jié)構(gòu)式A的黃酮類活性物質(zhì)在治療或預防肝臟損傷中的新用 途，具有以下優(yōu)點1.本發(fā)明揭示了具有結(jié)構(gòu)式A的黃酮類活性物質(zhì)在治療或預防對象的與血清谷 丙轉(zhuǎn)氨酶活性增加相關(guān)的疾病(尤其是治療或預防肝臟損傷)的作用及其作用機理，從而 為相關(guān)疾病的治療和預防提供了新的途徑；2.本發(fā)明中采用的具有結(jié)構(gòu)式A的黃酮類活性物質(zhì)多為已知的藥物，本領(lǐng)域已熟 知其藥物代謝動力學、毒理學等，因此降低了研發(fā)成本；且本領(lǐng)域中已知其生產(chǎn)制備工藝， 可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)條件來制備該藥物，因此降低了生產(chǎn)成本。實施例下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實驗材料和動物動物C57BL/6品系小鼠，7_8周，雄性，體重24_25g，購自上海斯萊克實驗動物有 限責任公司，隨機分組；ConA 購自 Vector Laboratory Inc.，溶于 PBS (pH 7. 2-7. 4)，濃度為 2. 25mg/ml。芹黃素(Api):購自上海市食品藥品檢定所，先用DMS0溶解(濃度為0. 17mg/ yl)，于 _20°C 保存，臨用前以 PBS (pH 7. 2-7. 4)稀釋(濃度為 3. 125mg/ml 或 6. 25mg/ml)。木樨草素(Lut):購自上海市食品藥品檢定所，先用DMS0溶解(濃度為0. 17mg/ yl)，于 _20°C 保存，臨用前以 PBS (pH 7. 2-7. 4)稀釋(濃度為 6. 25mg/ml 或 12. 5mg/ml)。黃芩素(Bai):購自上海市食品藥品檢定所，先用DMS0溶解(濃度為0. 17mg/ yl)，于 _20°C 保存，臨用前以 PBS (pH 7. 2-7. 4)稀釋(濃度為 3. 125mg/ml 或 6. 25mg/ml)。對照溶液含有DMS0的PBS溶液(DMS0濃度為7. 5%，PBS的pH為7. 2-7. 4)。試驗方法黃酮類化合物芹黃素(Api)、木樨草素(Lut)和黃芩素(Bai)的治療實驗流程如圖 1所示(1)將小鼠隨機分組，經(jīng)腹腔注射給予對照溶液(200iU，對照組)或者一定濃度 的黃酮類化合物(給藥組)；(2)給藥2小時后，各小鼠接受同樣的給藥處理；(3)隨后，立即給所有的小鼠由尾靜脈注射劑量為15mg/kg體重的ConA，以誘導 CIH ；(4a)于注射ConA 2小時后，處死小鼠，獲取血清，檢測血清中TNF_ a的水平；(4b)于注射ConA 8小時后，處死小鼠，獲取血清和肝臟，檢測血清中ALT和 IFN-y的水平，并進行肝臟的組織病理學分析。實施例1芹黃素(ADi)對CIH小鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活件的降低作用(A)試驗根據(jù)上文“試驗方法”部分的記載進行芹黃素(Api)治療實驗，所用Api劑量分別 為:25mg/kg(低劑量Api組)和50mg/kg(高劑量Api組)。給予ConA 8小時后，處死小 鼠，取血清檢測ALT的水平。(B)谷丙轉(zhuǎn)氨酶酶活的測定測量步驟采用上海伊華醫(yī)學科技有限公司生產(chǎn)的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性測定試劑 盒，按照說明書操作。簡要步驟如下血清適當稀釋后，取25微升加至96孔板，加入100微升酶工作液， 37°C孵育15分鐘，加入150微升終止液，酶標儀492nm讀數(shù)，根據(jù)試劑盒提供的標準血清和 稀釋倍數(shù)計算谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性數(shù)值。(C)試驗結(jié)果及分析Api治療對ALT活性影響的結(jié)果分別如圖2A和2B所示。數(shù)據(jù)以平均數(shù)士標準差 的形式表示，代表了 3次試驗的結(jié)果(***P < 0. 001)。低濃度Api組和高濃度Api組結(jié)果均顯示Api可極顯著地降低CIH小鼠血清中 谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性。其中，高劑量Api對ALT活性的降低效果更優(yōu)于低劑量Api。
由此可知Api可以有效地抑制誘導CIH的小鼠血清中ALT的水平。實施例2經(jīng)芹昔素(ApD處理后的CIH小鼠肝_的H&E染色和TUNEL染色觀察(A)試驗根據(jù)上文“試驗方法”部分的記載進行芹黃素(Api)治療實驗，所用Api劑量為 50mg/kg。給予ConA 8小時后，處死小鼠，取肝臟組織進行切片，進行組織病理學分析。(B)H&E 染色對小鼠肝臟組織的切片進行H&E染色。染色過程如下1.小鼠麻醉后，經(jīng)PBS心臟灌注后除去殘留血液后，取肝臟，放入裝有4%的多聚 甲醛的管子中后固定；2.脫水將固定后的組織切成合適大小后依次經(jīng)過如下步驟2. 1. 70%酒精，30min，2. 2. 95%酒精，lh 30min，重復一次，2. 3. 100%酒精，lh 30min，重復一次;3.透明將脫水好的組織放入二甲苯中，15-20min，重復一次；4.浸蠟將透明好的組織放入融化的石蠟中(60°C )，lh，重復一次；5.包埋；6.切片將包埋好的組織塊切成5 u m厚的薄片；7.展片將5 ym的組織片鋪在40°C的水面上，讓組織充分展平；8.撈片將展平的組織片撈在多聚賴氨酸處理好的玻片上；9.將玻片放在37°C的烘臺上烘干；10.脫蠟水合將烘干的帶有組織的玻片經(jīng)過如下步驟進行脫蠟水合10. 1. 二 甲苯，5min，重復一次，10. 2. 100%酒精，5min，重復一次，10. 3. 95%酒精，5min，重復一次，10. 470%酒精，5min，10. 5 7jC,5min ；11.蘇木素中染色7min ；12.流水沖洗；13.水中反色 5min;14.伊紅中染色 0. 5min ；15.脫水透明化，封片15. 1. 70%酒精，2min，重復一次，15. 2. 95%酒精，2min，重復一次，15. 3. 100%酒精，2min，重復一次，15.4. 二 甲苯，5min，重復一次，15.5.中性樹膠封片。(C)TUNEL 染色對小鼠肝臟組織的切片進行TUNEL染色。TUNEL染色過程如下1.小鼠麻醉后，經(jīng)PBS心臟灌注除去殘留血液，取肝臟，放入裝有4%的多聚甲醛
15的管子中后固定；2.脫水將固定后的組織切成合適大小后依次經(jīng)過如下步驟2. 1. 70%酒精，30min，2. 2. 95%酒精，lh30min，重復一次，2. 3. 100%酒精，lh30min，重復一次；3.透明將脫水好的組織放入二甲苯中，15-20min，重復一次；4.浸蠟將透明好的組織放入融化的石蠟中(60°C )，lh，重復一次；5.石蠟包埋；6.切片將包埋好的組織塊切成5 u m厚的薄片；7.展片將組織片鋪在40°C的水面上，讓組織充分展平；8.撈片將展平的組織片撈在多聚賴氨酸處理好的玻片上；9.將玻片放在37°C的烘臺上烘干；10.脫蠟水合將烘干的帶有組織的玻片經(jīng)過如下步驟進行脫蠟水合10. 1. 二 甲苯，5min，10. 2. 100%酒精，5min，10. 3. 95%酒精，5min，10. 4. 90%酒精，5min，10. 5. 80%酒精，5min，10. 6. 70%酒精，5min，10. 7. 7jC，5min，10. 8. PBS，5min ；11.用濾紙小心吸去載玻片上組織周圍的多余液體，加入蛋白酶K溶液(20iig/ ml)，濕盒中37°C水解15min，去除組織蛋白。用PBS洗兩次，每次5min ；12.色缸中加入含6%過氧化氫的甲醇，于室溫反應5min。用PBS洗兩次，每次 5min ；13.用濾紙小心吸去載玻片上組織周圍的多余液體，每標本加入按試劑盒(TUNEL 凋亡檢測試劑盒，購自羅氏)說明書配制的TdT酶反應液(5iUTdT酶+45iU標記液每標 本，陰性對照只加標記液不加酶液)，蓋玻片覆蓋，濕盒中37°C反應lh，用PBS洗兩次，每次 5min ；14.用濾紙小心吸去載玻片上組織周圍的多余液體，每標本加入50 ill P0D，濕盒 中37°C反應30min。用PBS洗兩次，每次5min ；15.用濾紙小心吸去載玻片上組織周圍的多余液體，每標本加入100 iU新鮮配置 的DAB溶液，顯色3-10min ；16.脫水透明化，封片16. 1.水，2min 重復一次，16. 2. 70%酒精，2min，重復一次，16. 3. 95%酒精，2min，重復一次，16. 4. 100%酒精，2min，重復一次，16. 5. 二 甲苯，5min，重復一次，
16.6.中性樹膠封片。(D)實驗結(jié)果與討論Api治療后的肝臟組織切片H&E染色或者TUNEL染色結(jié)果分別如圖3A和3B所示。由圖可明顯觀察到經(jīng)過Api處理后的小鼠誘導CIH后，小鼠肝臟部位的炎性浸潤 和肝細胞壞死明顯低于對照組小鼠。以上結(jié)果表明Api可以有效地抑制誘導CIH后小鼠肝臟中的炎性浸潤和肝細胞 壞死。_仿丨丨3.(API)靜性麵附白■向(A)血清中腫瘤壞死因子_ a (TNF- a )的濃度檢測根據(jù)上文“試驗方法”部分的記載進行Api (劑量為50mg/kg)治療，在給予ConA 2 小時后，處死小鼠，取血清，按(C)中所述的ELISA方法，用廠商提供的ELISA試劑盒檢測血 清中TNF-a的濃度。(B)血清、_干擾素的濃度檢測根據(jù)上文“試驗方法”部分的記載進行Api (劑量為50mg/kg)治療，在給予ConA 8 小時后，處死小鼠，取血清，按(C)中所述的ELISA方法，用廠商提供的ELISA試劑盒檢測血 清中干擾素(IFN-y)的濃度。(C) ELISA試劑及方法使用Duoset ELISA試劑盒(R&D，MN，USA)，按照生產(chǎn)商提供的說明書操作，簡要步 驟如下取100微升一抗包板過夜，洗板后300微升封閉緩沖液封閉2小時，洗板后加入 100微升樣品和標準品，孵育2小時，洗板后加入二抗孵育2小時，洗板后加入酶標鏈親和 素，加入底物顯色，硫酸中止，酶標儀450nm讀數(shù)(參考波長為540nm)。根據(jù)標準曲線計算 樣品中各細胞因子的濃度。(D)實驗結(jié)果與討論小鼠血清中腫瘤壞死因子-a的濃度檢測實驗和干擾素的濃度檢測實驗 結(jié)果分別如圖4A和4B所示，其中的數(shù)據(jù)分別代表了 3次試驗的結(jié)果(#P < 0. 01，***P < 0. 0001)。結(jié)果顯示Api處理組小鼠血清中兩種炎性細胞因子的水平均極顯著低于對照 組，可有效抑制炎性細胞因子的表達。該結(jié)果表明Api對免疫介導的肝損傷的保護作用的機理之一是其導致了介導肝 損傷的炎性細胞因子，包括干擾素和腫瘤壞死因子a表達的顯著下降，從而保護肝臟 免受損傷。實施例4.木樨草素(Lut)對CIH小鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活件的降低作用(A)試驗根據(jù)上文“試驗方法”部分的記載進行木樨草素(Lut)治療實驗，所用Lut劑量分 別為:50mg/kg(低劑量Lut組)和100mg/kg(高劑量Lut組)。給予ConA 8小時后，處死 小鼠，取血清檢測ALT的水平。(B)谷丙轉(zhuǎn)氨酶酶活的測定采用實施例1⑶中所述的方法和試劑測定ALT活性。
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(C)試驗結(jié)果及分析Lut治療對ALT活性影響的結(jié)果分別如圖5A和5B所示。數(shù)據(jù)以平均數(shù)士標準差 的形式表示，代表了 3次試驗的結(jié)果(***P < 0. 001)。低濃度Lut組和高濃度Lut組結(jié)果均顯示Lut可極顯著地降低CIH小鼠血清中 谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性。其中，高劑量Lut對ALT活性的降低效果更優(yōu)于低劑量Lut。由此可知Lut可以有效地抑制誘導CIH的小鼠血清中ALT的水平。實施例5.經(jīng)木樨草素(Lut)處理的CIH小鼠肝臟的H&E染餼和TUNEL染餼觀察(A)試驗根據(jù)上文“試驗方法”部分的記載進行木樨草素(Lut)治療實驗，所用Lut劑量為 100mg/kg。給予ConA 8小時后，處死小鼠，取肝臟組織進行切片，進行組織病理學分析。(B) H&E 染色采用實施例2(B)中所述的方法和試劑對小鼠肝臟組織的切片進行H&E染色。(C) TUNEL 染色采用實施例2(C)中所述的方法和試劑對小鼠肝臟組織的切片進行TUNEL染色。(D)實驗結(jié)果與討論Lut治療后的肝臟組織切片H&E染色或者TUNEL染色結(jié)果分別如圖6A和6B所示。由圖可明顯觀察到經(jīng)過Lut處理后的小鼠誘導CIH后，小鼠肝臟部位的炎性浸潤 和肝細胞壞死明顯低于對照組小鼠。以上結(jié)果表明Lut可以有效地抑制誘導CIH后小鼠肝臟中的炎性浸潤和肝細胞 壞死。實施例6木樨草素(Lut)對炎性細胞因子的影響(A)血清中腫瘤壞死因子_ a (TNF- a )的濃度檢測根據(jù)上文“試驗方法”部分的記載進行Lut (劑量為100mg/kg)治療，在給予ConA 2小時后，處死小鼠，取血清，按(C)中所述的ELISA方法，采用廠商提供的ELISA試劑盒檢 測血清中TNF-a的濃度。(B)血清中干擾素的濃度檢測根據(jù)上文“試驗方法”部分的記載進行Lut (劑量為100mg/kg)治療，在給予ConA 8小時后，處死小鼠，取血清，按(C)中所述的ELISA方法，采用廠商提供的ELISA試劑盒檢 測血清中干擾素(IFN-y)的濃度。(C) ELISA試劑及方法采用實施例3 (C)中所述的ELISA方法對小鼠肝臟組織的切片進行TUNEL染色。(D)實驗結(jié)果與討論小鼠血清中腫瘤壞死因子-a的濃度檢測實驗和干擾素的濃度檢測實驗結(jié)果 分別如圖7A和7B所示，其中的數(shù)據(jù)分別代表了 3次試驗的結(jié)果(*P < 0. 05，< 0. 01)。結(jié)果顯示Lut處理組小鼠血清中兩種炎性細胞因子的水平顯著或極顯著低于對 照組，可有效抑制炎性細胞因子的表達。該結(jié)果表明Lut對免疫介導的肝損傷的保護作用的機理之一是其導致了介導肝 損傷的炎性細胞因子，包括干擾素和腫瘤壞死因子a表達的顯著下降，從而保護肝臟 免受損傷。
^WM 7. H^m (Bai)對CIH小鼠谷丙轉(zhuǎn)(ALT)活件的降低,作用(A)試驗根據(jù)上文“試驗方法”部分的記載進行黃芩素(Bai)治療實驗，所用Bai劑量分別 為:25mg/kg(低劑量Bai組)和50mg/kg(高劑量Bai組)。給予ConA 8小時后，處死小 鼠，取血清檢測ALT的水平。(B)谷丙轉(zhuǎn)氨酶酶活的測定采用實施例1⑶中所述的方法和試劑測定ALT活性。(C)試驗結(jié)果及分析Bai治療對ALT活性影響的結(jié)果分別如圖8A和8B所示。數(shù)據(jù)以平均數(shù)士標準差 的形式表示，代表了 3次試驗的結(jié)果(***P < 0. 001)。低濃度Bai組和高濃度Bai組結(jié)果均顯示Bai可極顯著地降低CIH小鼠血清中 谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性。由此可知Bai可以有效地抑制誘導CIH的小鼠血清中ALT的水平。實施例8.經(jīng)黃芩素(Bai)處理的CIH小鼠肝臟的H&E染餼和TUNEL染餼觀察(A)試驗根據(jù)上文“試驗方法”部分的記載進行黃芩素(Bai)治療實驗，所用Bai劑量為 50mg/kg。給予ConA 8小時后，處死小鼠，取肝臟組織進行切片，進行組織病理學分析。(B) H&E 染色采用實施例2(B)中所述的方法和試劑對小鼠肝臟組織的切片進行H&E染色。(C) TUNEL 染色采用實施例2(C)中所述的方法和試劑對小鼠肝臟組織的切片進行TUNEL染色。(D)實驗結(jié)果與討論Bai治療后的肝臟組織切片H&E染色或者TUNEL染色結(jié)果分別如圖9A和9B所示。由圖可明顯觀察到經(jīng)過Bai處理后的小鼠誘導CIH后，小鼠肝臟部位的炎性浸潤 和肝細胞壞死要明顯低于對照組。以上結(jié)果表明Bai可以有效地抑制誘導CIH后小鼠肝臟中的炎性浸潤和肝細胞 壞死。實施例9黃芩素(Bai)對炎性細胞因子的影響(A)血清中腫瘤壞死因子_ a (TNF- a )的濃度檢測根據(jù)上文“試驗方法”部分的記載進行Bai (劑量為50mg/kg)治療，在給予ConA 2 小時后，處死小鼠，取血清，按(C)中所述的ELISA方法，采用廠商提供的ELISA試劑盒檢測 血清中TNF-a的濃度。(B)血清中干擾素的濃度檢測根據(jù)上文“試驗方法”部分的記載進行Bai (劑量為50mg/kg)治療，在給予ConA 8 小時后，處死小鼠，取血清，按(C)中所述的ELISA方法，采用廠商提供的ELISA試劑盒檢測 血清中干擾素(IFN-y)的濃度(C) ELISA試劑及方法采用實施例3 (C)中所述的ELISA方法對小鼠肝臟組織的切片進行TUNEL染色。(D)實驗結(jié)果與討論
小鼠血清中腫瘤壞死因子-a的濃度檢測實驗和干擾素的濃度檢測實驗 結(jié)果分別如圖10A和10B所示，其中的數(shù)據(jù)分別代表了 3次試驗的結(jié)果(*P < 0. 05，**P < 0. 01)。結(jié)果顯示Bai處理組小鼠血清中兩種炎性細胞因子的水平顯著或極顯著低于對 照組，可有效抑制炎性細胞因子的表達。該結(jié)果表明Bai對免疫介導的肝損傷的保護作用的機理之一是其導致了介導肝 損傷的炎性細胞因子，包括干擾素和腫瘤壞死因子a表達的顯著下降，從而保護肝臟 免受損傷。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
一種具有結(jié)構(gòu)式A的化合物、其藥學上可接受的鹽、或它們的組合在制備用于治療或預防對象中與血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性增加相關(guān)的疾病的藥物中的用途式中R1、R2、R3和R4各自獨立地為選自下組的基團 H、 C1 6烷基、 OH、 C1 6烷氧基、 SH、 NH2、氟、氯、溴或碘。F2009100536041C0000011.tif
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述Ri、R2、R3和R4各自獨立地為-H或-0H。
3.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述化合物具有選自下組的結(jié)構(gòu)式
4.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述與血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性增加相關(guān)的疾 病包括肝損傷、肝內(nèi)膽汁淤積、膽道梗阻、胰腺疾病、甲狀腺功能亢進癥、急性心肌梗塞、心 力衰竭或多發(fā)性肌炎。
5.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述肝損傷為免疫介導的肝損傷。
6.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述對象是哺乳動物。
7.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述藥物組合物中的具有結(jié)構(gòu)式A的化合 物、其藥學上可接受的鹽、或它們的組合占藥物組合物總重量的0. 001-99. 9wt%。
8.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述藥物組合物的劑型包括片劑、粉末劑、 注射劑、顆粒劑、糖漿、膠囊、溶液劑、栓劑或藥膏。
9.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述藥物組合物還包含緩解或治療肝臟損 傷的其它藥物。
10.一種藥物組合物，其含有(1)有效量的具有結(jié)構(gòu)式A的化合物、其藥學上可接受的鹽、或它們的組合；(2)選自下組的一種或多種物質(zhì)丹參酮IIA、甘草酸制劑、綠茶多酚、水飛薊素、粉防 己堿或它們的組合；和(3)藥學上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一類具有保肝作用的中藥活性單體成分，即具有結(jié)構(gòu)式A的黃酮類活性物質(zhì)在治療肝臟炎癥相關(guān)疾病中的新用途，該結(jié)構(gòu)式中R1、R2、R3和R4各自獨立地為選自下組的基團-H、-C1-6烷基、-OH、-C1-6烷氧基、-SH、-NH2、氟、氯、溴或碘。具體而言，本發(fā)明涉及具有結(jié)構(gòu)式A的黃酮類化合物、其藥學上可接受的鹽、或它們的組合在制備用于治療或預防對象的與血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性增加相關(guān)的疾病(尤其是肝損傷)的藥物組合物中的用途。所述黃酮類化合物優(yōu)選為芹黃素、木樨草素和黃芩素。
文檔編號A61P1/18GK101926787SQ20091005360
公開日2010年12月29日 申請日期2009年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月23日
發(fā)明者徐凌云, 王瑩, 羅清瓊, 許艷 申請人:中國科學院上海生命科學研究院