專利名稱：一種靶向Survivin基因的siRNA分子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種靶向Survivin基因的siRNA分子及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
Survivin(存活素)是凋亡抑制蛋白(Inhibitorofapoptosis，IAP)家族的新成 員，是目前發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的凋亡抑制因子。Survivin功能復(fù)雜，具有抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn) 化并且參與細(xì)胞的有絲分裂、血管的生成和腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生等作用。Survivin基因 是Ambrosini等(Nature Med, 1997, 3 (8) :917_921)在人類基因組文庫(kù)中篩選克隆到的， 該基因全長(zhǎng)15KB，定位于17q25，含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，Survivin基因編碼產(chǎn)物是由 142個(gè)氨基酸組成的蛋白，分子量16. 2KD。研究顯示，Survivin的高表達(dá)能抑制多種因子如 p53,caspases等誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。經(jīng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)證實(shí)Survivin抑制凋亡的機(jī)制與IAP家 族其它成員一樣，可直接作用于細(xì)胞色素C從線粒體向胞質(zhì)釋放的過(guò)程的末期?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)， Survivin基因在胚胎組織及惡性腫瘤中普遍表達(dá)，如乳腺癌、胃癌、腎癌、黑色素癌、腸癌、 神經(jīng)母細(xì)胞癌和卵巢癌等；但在分化成熟的組織(除胎盤、增殖期子宮內(nèi)膜、分泌期子宮內(nèi) 膜有微量表達(dá)外)及癌旁正常組織中無(wú)表達(dá)。它的這一特性，使得靶向Survivin的免疫治 療和基因治療能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，抑制其增殖，正常組織卻能不受損傷和影響。RNA干擾技術(shù)是近幾年來(lái)興起的生物技術(shù)，該項(xiàng)技術(shù)的發(fā)現(xiàn)為疾病治療尤其是癌 癥的治療開(kāi)辟了全新的途徑，為科研工作者提供了一個(gè)全新的基因治療理念。用siRNA干 擾特定基因的表達(dá)是基因治療的重要組成部分。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是由 雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制。其原理是RNase III 核酶家族的Dicer，與雙鏈RNA結(jié)合，將其剪切成21_23nt及3 ‘端突出的小干擾RNA (small interfering RNA, siRNA)，隨后 siRNA 與 RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex,RISC)結(jié)合，解旋成單鏈，活化的RISC受已成單鏈的siRNA引導(dǎo)，序列特異性地結(jié) 合在靶mRNA上并將其切斷，引發(fā)靶mRNA的特異性分解，從而阻斷相應(yīng)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后基 因沉默機(jī)制。RNAi已作為一種簡(jiǎn)單有效的基因敲除的技術(shù)，廣泛地應(yīng)用于功能基因組學(xué)研 究以及抗病毒、抗腫瘤治療的研究中。目前針對(duì)Survivin的RNA干擾研究進(jìn)展迅速，體外實(shí)驗(yàn)顯示了良好的效果。有 很多文獻(xiàn)報(bào)道，用RNA干擾的技術(shù)來(lái)抑制Survivin基因的表達(dá)，Carvalho等用小分子干擾 RNA(small interfering RNA，siRNA)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，60h后蛋白印跡結(jié)果顯示治療組中 已檢測(cè)不到Survivin的表達(dá)，細(xì)胞增殖明顯受抑，部分細(xì)胞有絲分裂受到阻滯，出現(xiàn)凋亡 (J Cell Sci,2003,116(14) =2987-2998) 應(yīng)用 RNA 干擾技術(shù)，用靶向至 Survivin 基因的 siRNA作為靶向藥物，在基因的轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行干擾，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的 有絲分裂，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移時(shí)的血管形成和降低腫瘤細(xì)胞放化療的耐受性，對(duì)腫瘤進(jìn)行抑制， 在不久的將來(lái)可能成為一種新的腫瘤治療方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種通過(guò)SiRNA分子庫(kù)技術(shù)篩選出的高效靶向Survivin 基因的雙鏈siRNA分子，其下述正義鏈和反義鏈組成正義鏈5，-GACUUGGCCCA⑶⑶UUCUNn-3，(SEQID NO 2)反義鏈5，-AGAAACACUGGGCCAAGUCNn-3，(SEQID NO 3)其中，N是4種DNA堿基及其脫氧形式中的任何一種，即胞嘧啶C、鳥(niǎo)嘌呤G、腺嘌呤 A、胸腺嘧啶T、脫氧胞嘧啶dC、脫氧鳥(niǎo)嘌呤dG、脫氧腺嘌呤dA或脫氧胸腺嘧啶dT ;n是0 2的整數(shù)。換句話說(shuō)，該雙鏈siRNA分子的主干序列為正義鏈5，-GACUUGGCCCA⑶⑶UUCU-3，(SEQID NO 4)反義鏈5，-AGAAACACUGGGCCAA⑶C-3，(SEQID NO 5)在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，上述序列中3’端的“Nn”是兩個(gè)脫氧胸腺嘧啶dTdT。本發(fā)明的另一目的在于提供上述siRNA分子在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。體外實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的siRNA分子的反義鏈可特異性地與Survivin基因的mRNA 結(jié)合，降解mRNA，從而干擾轉(zhuǎn)錄后翻譯過(guò)程，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞分裂、抑制腫 瘤血管的生成，達(dá)到治療腫瘤的目的。


圖1是合成的Survivin基因開(kāi)放閱讀框瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖，制備得到的DNA 片段大小為429bp。右側(cè)條帶是Marker (標(biāo)準(zhǔn)參照)。圖2是siRNA分子庫(kù)構(gòu)建流程示意圖。圖3是TO-siRNA轉(zhuǎn)錄模板-Hl表達(dá)框結(jié)構(gòu)示意圖。圖4是PCR制備的TO-siRNA轉(zhuǎn)錄模板-Hl表達(dá)框純化后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖。 圖中，最左側(cè)條帶是Marker (標(biāo)準(zhǔn)參照)；siRNAl是本發(fā)明的19bp的siRNA ；而siRNA2、 siRNA3分別是從siRNA分子庫(kù)中篩選得到長(zhǎng)度為22bp和23bp的另外兩個(gè)siRNA。圖5是表達(dá)框轉(zhuǎn)染細(xì)胞后實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Survivin mRNA表達(dá)量柱形圖， 縱坐標(biāo)表示Survivin相對(duì)于GAPDH的mRNA表達(dá)水平；橫坐標(biāo)表示各處理實(shí)驗(yàn)組，其中 siRNAl-siRNA8為siRNA轉(zhuǎn)染的8個(gè)實(shí)驗(yàn)組，“未轉(zhuǎn)染”為正常細(xì)胞未轉(zhuǎn)染組。圖6是化學(xué)合成的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Survivin mRNA表達(dá)量柱 形圖，縱坐標(biāo)表示Survivin相對(duì)于GAPDH的mRNA表達(dá)水平；橫坐標(biāo)表示兩個(gè)處理實(shí)驗(yàn)組， 其中siRNAl為本發(fā)明siRNA的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組，“未轉(zhuǎn)染”為正常細(xì)胞未轉(zhuǎn)染組。
具體實(shí)施例方式為方便起見(jiàn)，在下文中，術(shù)語(yǔ)“siRNA”、“siRNA序列”或“siRNA分子”可以互換，它 們表示的意思和范圍相同。其中，siRNA序列可以是單鏈結(jié)構(gòu)，也可以是雙鏈結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的siRNA分子來(lái)源于針對(duì)Survivin基因開(kāi)放閱讀框的功能保守區(qū)而制備 的siRNA分子庫(kù)，本發(fā)明所用siRNA分子庫(kù)技術(shù)是百奧邁科生物技術(shù)有限公司的專利技術(shù) (中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)枮?200710024217. 6，專利名稱PCR高通量構(gòu)建siRNA全位點(diǎn)分子庫(kù)制備方法)，其優(yōu)點(diǎn)在于所制備得到的siRNA隨機(jī)分布于Survivin開(kāi)放閱讀框區(qū)段，長(zhǎng)度 可控性分布于19-23bp，可以提高有效靶位點(diǎn)的命中率。siRNA的制備可采用多種方法，比如化學(xué)合成法、體外轉(zhuǎn)錄、酶切長(zhǎng)鏈dsRNA、載 體表達(dá)siRNA、PCR合成siRNA表達(dá)元件等，這些方法的出現(xiàn)為研究者提供了可選擇的空間， 可以更好地獲得基因沉默效率。本發(fā)明的siRNA分子可以作為抗腫瘤藥物的有效成分。腫瘤疾病包括肝癌、肺癌、 白血病、胃癌、宮頸癌、多發(fā)性骨髓瘤、皮膚鱗癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤、膀胱癌、骨肉瘤。本發(fā)明 的藥物對(duì)肝癌的抑制作用尤其明顯。作為該siRNA分子的另一種表達(dá)形式，可將其制備成DNA表達(dá)框形式，比如:U6啟 動(dòng)子-siRNA轉(zhuǎn)錄模板-Hl啟動(dòng)子。為簡(jiǎn)要起見(jiàn)，在下文中將“TO啟動(dòng)子-siRNA轉(zhuǎn)錄模板-Hl啟動(dòng)子”簡(jiǎn)寫(xiě)為 "U6-siRNA轉(zhuǎn)錄模板-Hl，，或“U6-siRNA_Hl，，，它們表示的意思和范圍相同。出于應(yīng)用目的，可將siRNA分子、表達(dá)siRNA分子的DNA表達(dá)框、或者包含siRNA 分子表達(dá)框的質(zhì)粒作為藥物直接給藥于受藥者身上特定部位，比如腫瘤組織。本發(fā)明的藥物的劑型可以為多種形式，只要適合于相應(yīng)疾病的給藥、并且恰當(dāng)?shù)?保持siRNA分子的活性。比如，對(duì)于注射用給藥系統(tǒng)，劑型可以是凍干粉。任選地，上述藥物劑型中可以包含任何藥學(xué)可接受的輔助劑，只要其適合于相應(yīng) 的給藥體系、并且恰當(dāng)?shù)乇３謘iRNA分子的活性。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的設(shè)計(jì)思想并驗(yàn)證篩選得到的siRNA的抗腫瘤效果，設(shè)計(jì)了如下 實(shí)驗(yàn)方案(1)構(gòu)建凋亡抑制因子Survivin基因開(kāi)放閱讀框的siRNA分子庫(kù)，該分子庫(kù)中包 含靶向至Survivin基因的siRNA效應(yīng)分子，長(zhǎng)度分布于19_23bp。(2)制備具有相應(yīng)效應(yīng)的siRNA表達(dá)框，其結(jié)構(gòu)為U6啟動(dòng)子-siRNA轉(zhuǎn)錄模板-Hl 啟動(dòng)子，使其更易于體外篩選。(3)運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，檢測(cè)上述siRNA表達(dá)框在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄出的效應(yīng)siRNA 分子對(duì)Survivin基因的抑制作用。(4)化學(xué)合成上述方法篩選得到的最優(yōu)靶點(diǎn)siRNA，在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步運(yùn) 用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)Survivin基因的mRNA表達(dá)水平。下述實(shí)施例僅用于闡明本發(fā)明，并非是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。需要說(shuō)明的是，如無(wú)特別注明，下述實(shí)施例中的百分比含量皆為重量百分含量
Wt %。實(shí)施例1siRNA分子庫(kù)的制備1.主要儀器、試劑和材料1. 1 儀器=PCR 儀(ABI 公司)；電轉(zhuǎn)儀(BIO-RAD，MicroPulser)；離心機(jī) (Eppendorf)，長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外燈等。1.2 材料和試劑lkb plus DNA Ladder (invitrogen) ；DNase I (Roche)； MnCl2(BBI)；磷酸接頭(Sigma-aldrich) ；ATP (BBI) ；BSA (NEB) ；BmsbI (NEB) ；T4 DNA連接酶 (NEB) ；Tag DNA聚合酶(百奧邁科生物技術(shù)有限公司)；瓊脂糖(BBI) ；dNTP(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)；酚氯仿抽提試劑(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)；低分 子量DNA Ladder (NEB) ；EcoPl5I (NEB) ；T4 DNA聚合酶(NEB) ；FokI 酶(NEB) ；SfiI 酶(NEB)； 感受態(tài)細(xì)胞(invitrogen) ；pTOHl-GFP表達(dá)載體(NT Oimcs，USA)。凝膠抽提試劑盒QIAEX II Gel Extration Kit(QIAGEN)；質(zhì)粒抽提試劑盒(百奧邁科生物技術(shù)有限公司)。其他 生化試劑均購(gòu)于Sigma-aldrich。2. siRNA分子庫(kù)的構(gòu)建2. lSurvivin基因開(kāi)放閱讀框的獲得由百奧邁科生物技術(shù)有限公司全基因合 成 Survivin (GenBankAccessionnumber :NM_001168)開(kāi)放閱讀框(ORF)，基因長(zhǎng)度為
429bp (圖 1),3
122atgggtgccccgacgttgccccctgcctggcagccctttctcaaggaccaccgcatctc
181tacattcaagaactggcccttcttggagggctgcgcctgcaccccggagcggatggccga
241ggctggcttcatccactgccccactgagaacgagccagacttRRCCCaRtRtttcttctR
301cttcaaggagctggaaggctgggagccagatgacgaccccatagaggaacataaaaagca
361ttcgtccggttgcgctttcctttctgtcaagaagcagtttgaagaattaacccttggtga
421atttttgaaactggacagagaaagagccaagaacaaaattgcaaaggaaaC C 3.3. C 3.3. 3.3.
481gaagaaagaatttgaggaaactgcggagaaagtgcgccgtgccatcgagcagctggctgc
541catggattga(SEQ ID NO 1)
2. 2siRNA分子庫(kù)構(gòu)建用百奧邁科生物技術(shù)有限公司的專利技術(shù)構(gòu)建siRNA分子
庫(kù)(專利申請(qǐng)?zhí)枮?00710024217.6，專利名稱PCR高通量構(gòu)建siRNA全位點(diǎn)分子庫(kù)制備 方法)，構(gòu)建流程見(jiàn)圖2。成功構(gòu)建Survivin開(kāi)放閱讀框的siRNA分子庫(kù)，隨機(jī)挑取克隆進(jìn)行測(cè)序，其序列 長(zhǎng)度可控性分布在19-23bp之間，顯示出位點(diǎn)及長(zhǎng)度的多樣性。實(shí)施例2siRNA表達(dá)框的制備與靶位點(diǎn)篩選1.主要儀器、試劑和材料1. 1儀器PCR儀(ABI)；實(shí)時(shí)定量PCR儀(Bio-Rad)；凝膠電泳設(shè)備(北京六一儀 器廠)；長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外燈；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)等。I·2 材料和試劑Ikb plus DNA Ladder (invitrogen) ； Pfu DNA 聚合酶(百奧邁 科生物技術(shù)有限公司)；Agar0se(BBI) ；dNTP(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)；瓊 脂糖凝膠純化試劑盒(百奧邁科生物技術(shù)有限公司)，Lipofectamin 2000 (invitrogen), DMEM 培養(yǎng)基(Gibco)，TurboCapture mRNA kit (QIAGEN), SensiMix One-Step Kit(Quantace)等。其他生化試劑均購(gòu)于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。1. 3PCR引物(百奧邁科生物技術(shù)有限公司合成)5，U6 啟動(dòng)子引物5，-AAGGTCGGGCAGGAAGAGGGC-3，3，Hl 啟動(dòng)子引物5，-TATTTGCATGTCGCTATGTGTTCT-3，Survivin 正向引物5，-CGACGTTGCCCCCTGCCTG-3，Survivin 反向引物5，-AAGGAAAGCGCAACCGGACGA-3，GAPDH 正向引物5，-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3，GAPDH 反向引物5，-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3，
6
2. siRNA表達(dá)框的制備2. IPCR擴(kuò)增制備U6-siRNA轉(zhuǎn)錄模板-Hl表達(dá)框選取8例Survivin siRNA陽(yáng)性 克隆質(zhì)粒為模板，用高保真酶Pfu DNA聚合酶通過(guò)PCR的方法擴(kuò)增制備TO-siRNA轉(zhuǎn)錄模 板-Hl表達(dá)框(圖3為表達(dá)框示意圖)。各PCR反應(yīng)體系為50 μ 1反應(yīng)體系0. 5 μ 1模板DNA(10_50ng)，1 μ 1 5，U6啟動(dòng) 子引物(ΙΟμΜ),Ιμ 13，Hl 啟動(dòng)子引物(ΙΟμΜ),Ιμ IdNTP (IOmM), 0. 5 μ IPfu DNA 聚合酶， 用ddH20補(bǔ)足到50μ 1。反應(yīng)條件為:95°C Imin預(yù)變性，95°C 15sec變性，58°C 30sec退火， 72°C 30sec延伸，20個(gè)循環(huán)。1 %瓊脂凝膠電泳檢測(cè)，PCR產(chǎn)物條帶單一，片段大小符合實(shí)驗(yàn) 要求。2. 2表達(dá)框PCR產(chǎn)物純化1. 0%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴(kuò)增得到的表達(dá)框，并 用瓊脂糖凝膠純化試劑盒純化凝膠產(chǎn)物。純化后的DNA再次進(jìn)行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢 測(cè)，純化后的TO-siRNA轉(zhuǎn)錄模板-Hl表達(dá)框純度和濃度符合要求，如圖4所示。同時(shí)用紫 外分光光度計(jì)測(cè)得制備后的表達(dá)框濃度為200-420ng/y 1。3.靶位點(diǎn)篩選3. 1細(xì)胞培養(yǎng)肝癌細(xì)胞S匪C-7721在含10% 85的01^] 培養(yǎng)基中，371、5%0)2 培養(yǎng)才直培養(yǎng)。3. 2細(xì)胞鋪板并轉(zhuǎn)染將細(xì)胞按IX IO5/孔接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在無(wú)抗含 10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。轉(zhuǎn)染按照LipofectaminTM2000的說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染，U6_siRNA轉(zhuǎn)錄模板-Hl表達(dá)框DNA 量按0.2 μ g/孔加入。3. 3實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Survivin基因mRNA水平用mRNA提取純化試劑盒 TurboCapture mRNA kit提取純化細(xì)胞RNA，操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用80 μ 1無(wú)RNase 水/孔溶解RNA，取4 μ IRNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。用基因特異性引物檢測(cè)樣本中Survivin mRNA表達(dá)水平，同時(shí)擴(kuò)增看家基因 GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照。每個(gè)反應(yīng)做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。建立如下25 μ 1的反應(yīng)體系4 μ 1模板 RNA, 12. 5 μ 12 X SensiMix One-Step, 1 μ 15，正向引物(6 μ Μ)，1 μ 13，反向引物(6 μ Μ)， 0. 5μ 1 50 X SYBR GreenI，用無(wú)RNase水補(bǔ)足體系至25 μ 1。反應(yīng)條件40°C反轉(zhuǎn)錄30min， 95°C預(yù)變性 7min，95°C變性 20sec，60°C退火 30sec，72°C延伸 30sec，循環(huán) 45 次。3. 4結(jié)果分析用實(shí)時(shí)定量PCR2_AAet法分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并作出柱狀圖，如圖5所 示，結(jié)果顯示對(duì)應(yīng)于Survivin多個(gè)位點(diǎn)的siRNA均呈現(xiàn)較好的沉默效果，尤其是siRNAl，相 對(duì)于未轉(zhuǎn)染組，其對(duì)Survivin基因的沉默效果達(dá)到85%。尤其須需要說(shuō)明的是，siRNAl正義鏈序列與Survivin基因開(kāi)放閱讀框中的第 278-296 位(下劃線部分 gacttggcccagtgtttct)相對(duì)應(yīng)。實(shí)施例3化學(xué)合成siRNA驗(yàn)證沉默效果1.主要儀器、試劑和材料1. 1儀器核酸合成儀(GE公司)、PCR儀(ABI公司)；實(shí)時(shí)定量PCR儀(Bio-Rad)； 細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)等。1. 2 材料和試劑:Lipofectamin 2000 (invitrogen)，DMEM 培養(yǎng)基(Gibco)，TurboCapture mRNA kit (QIAGEN)，SensiMix One-Step Kit(Quantace)等。其他生化試 劑均購(gòu)于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。1. 3PCR引物(百奧邁科生物技術(shù)有限公司合成)Survivin 正向引物5，-CGACGTTGCCCCCTGCCTG-3，Survivin 反向引物5，-AAGGAAAGCGCAACCGGACGA-3，GAPDH 正向引物5，-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3，GAPDH 反向引物5，-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3，2.化學(xué)合成制備siRNA利用百奧邁科生物技術(shù)有限公司擁有的核酸合成儀(美國(guó)GE公司)分別合成 siRNAl的正義鏈(sense strand)和反義鏈(antisense strand)的RNA。并進(jìn)行純化，將 正義鏈和對(duì)應(yīng)的反義鏈退火成siRNA雙鏈(duplex)，分裝IOD/管，最后冷凍干燥，轉(zhuǎn)染前用 無(wú)RNase水溶解至20 μ Μ。3.沉默效率驗(yàn)證3. 1細(xì)胞培養(yǎng)肝癌細(xì)胞S匪C-7721在含10% 85的01^] 培養(yǎng)基中，371、5%0)2 培養(yǎng)才直培養(yǎng)。3. 2細(xì)胞鋪板并轉(zhuǎn)染將細(xì)胞按IX IO5/孔接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在無(wú)抗含 10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。轉(zhuǎn)染按照LipOfeCtaminTM2000的說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染，RNA按IOnM/孔加入。3. 3實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Survivin基因mRNA水平用mRNA提取純化試劑盒 TurboCapture mRNA kit提取純化細(xì)胞RNA，操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用80 μ 1無(wú)RNase 水/孔溶解RNA，取4 μ IRNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。用基因特異性引物檢測(cè)樣本中Survivin mRNA表達(dá)水平，同時(shí)擴(kuò)增看家基因 GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照。每個(gè)反應(yīng)做3個(gè)平行。建立如下25μ1反應(yīng)體系4μ1模板RNA， 12. 5μ 1 2 X SensiMix One-Step, 1 μ 1 5，正向引物(6 μ Μ)，1 μ 1 3，反向引物(6μΜ)， 0. 5μ 1 50 X SYBR Green I，用無(wú)RNase水補(bǔ)足體系至25 μ 1。反應(yīng)條件40°C反轉(zhuǎn)錄30min， 95°C預(yù)變性 7min，95°C變性 20sec，60°C退火 30sec，72°C延伸 30sec，循環(huán) 45 次。3.4結(jié)果分析用實(shí)時(shí)定量？0 2-八Act法分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并作出柱狀圖，如圖6 所示，結(jié)果顯示靶向至Survivin基因的siRNAl的沉默效果達(dá)到96%。序列表<110>百奧邁科生物技術(shù)有限公司<120> 一種靶向Survivin基因的siRNA分子及其應(yīng)用<130>PCNBB0901065S<141>2009-07-03<160>5<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>429<212>DNA<213>GenBank Accession number :NM_001168cgacgttgccccctgcctgg cagccctttctcaaggaccaccgcatctct60actggcccttcttggagggc tgcgcctgcaccccggagcggatggccgag120tccactgccccactgagaac gagccagacttggcccagtgtttcttctgc180tggaaggctgggagccagat gacgaccccatagaggaacataaaaagcat240gcgctttcctttctgtcaag aagcagtttgaagaattaacccttggtgaa300tggacagagaaagagccaag aacaaaattgcaaaggaaaccaacaataag360ttgaggaaactgcggagaaa gtgcgccgtgccatcgagcagctggctgcc420 429
0109]<220>
0110]<221>Survivin基因開(kāi)放閱讀框
0111]<222>(1). . (429)
0112]<400>1
0113]atgggtgccc
0114]acattcaaga
0115]gctggcttca
0116]ttcaaggagc
0117]tcgtccggtt
0118]tttttgaaac
0119]aagaaagaat
0120]atggattga
0121]<210>2 0122]<211>20
0123]<212>RNA
0124]<213>人工序列
0125]<220>
0126]<221> 正義鏈
0127]<222>(1). . (20)
0128]<223>Nn
0129]<220>
0130]<221>misc_feature
0131]<222>(20). . (20)
0132]<223州是(、6、六、1\(1(、(16、(^或泔；η 是 0 2 的整數(shù)c
0133]<400>2
0134]gacuuggccc aguguuucuNn
0135]<210>3
0136]<211>20
0137]<212>RNA
0138]<213>人工序列
0139]<220>
0140]<221> 反義鏈
0141]<222>(1). . (20)
0142]<223>Nn
0143]<220>
0144]<221>misc_feature
0145]<222>(20). . (20)
0146]<223>N是C、G、A、T、dC、dG、dA或dT ；η 是 0
0147]<400>3
20
2的整數(shù)t0148]agaaacacug ggccaagucNn20
0149]<210>4
0150]<211>19
0151]<212>RNA
0152]<213>人工序列
0153]<220>
0154]<221> 正義鏈
0155]<222>(1). . (19)
0156]<400>4
0157]gacuuggccc aguguuucu19
0158]<210>5
0159]<211>19
0160]<212>RNA
0161]<213>人工序列
0162]<220>
0163]<221> 反義鏈
0164]<222>(1). . (19)
0165]<400>5
0166]agaaacacug ggccaaguc19
權(quán)利要求
一種雙鏈siRNA分子，其具有如下序列結(jié)構(gòu)正義鏈5’ GACUUGGCCCAGUGUUUCUNn 3’(SEQ ID NO2)反義鏈5’ AGAAACACUGGGCCAAGUCNn 3’(SEQ ID NO3)，其中，N是4種DNA堿基及其脫氧形式中的任何一種，即胞嘧啶C、鳥(niǎo)嘌呤G、腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、脫氧胞嘧啶dC、脫氧鳥(niǎo)嘌呤dG、脫氧腺嘌呤dA或脫氧胸腺嘧啶dT；n是0～2的整數(shù)。
2.如權(quán)利要求1所述的siRNA分子，其特征在于，所述N為dT，且n為2。
3.如權(quán)利要求1所述的siRNA分子，其特征在于，所述n為0。
4.如權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的siRNA分子在制備治療抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述腫瘤為肝癌、肺癌、白血病、胃癌、宮頸 癌、多發(fā)性骨髓瘤、皮膚鱗癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤、膀胱癌、骨肉瘤中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種靶向Survivin基因的雙鏈siRNA分子及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。該siRNA分子正義鏈為SEQ ID NO2，反義鏈為SEQ ID NO3，其中，反義鏈可特異性地與Survivin基因的mRNA結(jié)合，降解mRNA，從而干擾轉(zhuǎn)錄后翻譯過(guò)程，達(dá)到治療腫瘤的目的。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101935651SQ20091005439
公開(kāi)日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2009年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月3日
發(fā)明者孫云成, 朱遠(yuǎn)源, 李鐵軍, 陸毅祥 申請(qǐng)人:百奧邁科生物技術(shù)有限公司