專利名稱：β,β-二甲基丙烯酰阿卡寧及在制備抑制耐藥細(xì)菌藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥學(xué)領(lǐng)域，涉及抑制外泵型多藥耐藥細(xì)菌的天然萘醌化合物，尤其涉及 化合物p,P-二甲基丙烯酰阿卡寧及其在制備抑制多藥耐藥細(xì)菌藥物中的用途背景技術(shù)二十世紀(jì)初抗生素的發(fā)現(xiàn)使麻風(fēng)、傷寒、霍亂、結(jié)核等若干原本難以治療的感染性 疾病不再成為絕癥。但是，隨著抗菌藥物的不斷問世及其在全球范圍內(nèi)的廣泛大量應(yīng)用， 細(xì)菌對抗生素的耐藥性日益突出，至80年代末己發(fā)展成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。據(jù)報 道，耐甲氧西林金黃葡萄球菌(Methicillin-Resistant Sto; A[y/ococcM51 flwwM， MRSA)，目前 己經(jīng)成為醫(yī)院內(nèi)的一種常見嚴(yán)重的傳染性致病菌。MRSA除對甲氧西林耐藥外，對其它所有與甲氧西林相同結(jié)構(gòu)的e-內(nèi)酰胺類和頭孢類抗生素均耐藥。MRSA還可通過改變抗生素作用靶位，產(chǎn)生修飾酶，降低膜通透性等不同機(jī)制，對氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、 四環(huán)素類、氟喹喏酮類、磺胺類、利福平均產(chǎn)生不同程度的耐藥。過去認(rèn)為，萬古霉素 是抗擊MRSA的最后一道防線，但2002年在美國已經(jīng)出現(xiàn)耐萬古霉素的MRSA菌株。 最新的抗MRSA唑啉酮類藥物L(fēng)inezoid (Zyvox TM)以及鏈陽菌素類藥物 quinupristin/dalfostin合劑2001年剛剛投放入市場，但已經(jīng)出現(xiàn)了 Linezoid耐藥型 MRSA。 MRSA的這種多藥耐藥性，使得治療由它引起的感染和控制其傳播與流行十分 困難。臨床實踐顯示，除了采取措施通過限制濫用抗生素以減緩耐藥MRSA增長的速度， 同時必須研究開發(fā)新的抗多藥耐藥MRSA藥物，即新的化學(xué)結(jié)構(gòu)類型，新的作用方式 的抗多藥耐藥金黃葡萄球菌藥物作為后備，以防當(dāng)現(xiàn)有的抗菌藥物無法起作用之后，細(xì) 菌的大規(guī)模爆發(fā)。現(xiàn)有技術(shù)公開了細(xì)菌耐藥有多種機(jī)制。其中，減少藥物攝入細(xì)胞是細(xì)菌幾種重要的 耐藥機(jī)制中的一種。減少藥物攝入細(xì)胞又存在下述幾種方式細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的改變；細(xì)胞 膜蛋白的變異；藥物從細(xì)胞中被主動外排(外泵efflux)。目前普遍接受的細(xì)胞對藥物降低 通透性的機(jī)制是主動外泵機(jī)制。轉(zhuǎn)染了對抗生素和其他毒素的外泵系統(tǒng)從細(xì)菌到哺乳動 物器官中都發(fā)現(xiàn)存在。根據(jù)世界衛(wèi)生組織報告，具有多藥耐藥外泵蛋白機(jī)制的感染占了醫(yī)院感染的60%。因此，選擇含有NorA基因的MRSA細(xì)菌株作為一個篩選靶標(biāo)是尋找抑制耐藥細(xì)菌藥物的一條重要途徑。與本發(fā)明相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)有 [1] CDC. Staphylococcus areus resistant to vancomycin-United states. Mw6W^;朋dMwto/辦股e詠鄉(xiāng)oWs， 2002， 51: 565-567. [2] PublicHealth Dispatch. Vancomycin-resistan Staphylococcus arueus-Pennsylvannia.Mw編'(y aw/她加/砂恥e/tfy及，他，2002, 51: 902-903. [3] Tsiodras S, Gold HS, Sakoulas G., Eliopoulos GM, Wennersten C， Venkataraman L，Moellering RC, Ferraro MJ. Linezolid resistance in a clinical isolate of Staphylococcusaureus. 2001， 358: 207-208.[4〗Potoski BA， Mangino JE, Goff DA. Clinical Filures of Linezolid and Implications for theClinical Microbiology Laboratory, CDC.五merg/"g /"^fecz/owj1 Zfeeoyey， 2002， 8 (12):1519-1520.[5] Yu, JL， et al. 2002, NorA Functions as a Multidrug Efflux Protein in both Cytoplasmic Membrane Vesicles and Reconstituted Proteoliposomes， / 5a"erio/ogy， 184 (5): 1370—1377.[6] Kaatz G.AV, Seo SM， Ruble CA. Efflux-mediated fluoroquinolone resistance in Staphylococcus aureus.爿wri附/cro6/a"ge她am/C72e附o^ e，乂 1993， 37: 1086~1094.[7] Gibbons S, Udo EE. The effect of reserpine, a modulator of multidrug efflux pumps, on the in vitro activity of tetracycline against clinical isolates of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) possessing the tet (K) determinant. P/y;to^ era/3_y ^eMtwr/i, 2000,14: 139—140.[8] Richardson JF， Reith S. Characterization of a strain of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (EMRSA-15) by conventional and molecular methods. Jiwwa/ o/ i /ec"o", 1993, 25: 45—52.發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的的目的是提供一種抑制外泵型多藥耐藥細(xì)菌的天然萘醌化合物，具體涉及 天然萘醌化合物(3,(3-二甲基丙烯酰阿卡寧(l3,P-dimethylacrylalkannin)，尤其涉及化合物P，卩-二甲基丙烯酰阿卡寧及其在制備抑制多藥耐藥細(xì)菌藥物中的用途。本發(fā)明中，多藥耐藥細(xì)菌是對甲氧西林類抗生素藥物具有耐藥性，同時對氟喹諾酮 類抗生素藥物具有耐藥性的金黃葡萄球菌。本發(fā)明中，所述的金黃葡萄球菌含有將氟喹諾酮類抗生素排出的外泵耐藥基因 norAo本發(fā)明提供了可用于抑制耐氟諾喹酮類耐甲氧西林金黃葡萄球菌(multidrug resistant MRSA)天然抑制劑AE02-7-2。所述的化合物，化學(xué)名為(3, (3-二甲基丙烯?；?5,8-二羥基-l，4-萘醌。本發(fā)明提供的化合物AE02-7-2，其分子式為。21112206，比旋光度[ot]D227- 143 。(c 0.01: 丙酮)具有式(I)的結(jié)構(gòu)。OH 0 5. 6. P，P-dimethylacrylalkannin(I)本發(fā)明中，所述的化合物具有5,8-二羥基萘醌母核骨架，萘醌的2-位碳上具有一個 酰氧基取代的甲基戊烯側(cè)鏈。本發(fā)明中，所述的酰氧基為甲基丁烯酰氧基，l'-位為S構(gòu)型。本發(fā)明的化合物AE02-7-2通過下述方法制備，采用紫草科(Boraginaceae)紫草屬04n7eWa)植物新疆紫草04 77eWfl ewc^o附")的根， 粉碎，95%乙醇45攝氏度以下浸泡提取，合并提取液減壓濃縮至乙醇全部揮發(fā)完畢， 加水至浸膏混懸，用乙酸乙酯萃取。有機(jī)相減壓蒸干后用硅膠和RP-18正反相柱層析多 次分離得到紫紅色固體化合物AE02-7-2。所述化合物AE02-7-2的物理性質(zhì)和波譜學(xué)性質(zhì)為° (c, 0.01,丙酮)；分子式為C21H22O6(370); EI-MS m/z (%) 302, 288 (2.71)， 270 (100), 255 (45.91)， 229 (6.99), 220 (15.87)， 100 (2.60)， 83 (72.88)， 69 (11.81); IR(KBr)vmax :3446， 3408， 2959， 2920， 2843, 1726, 1605， 1457 cm";本發(fā)明采用最低抑菌濃度測定了化合物AE02-7-2的抑制耐藥菌活性 穆勒-亨頓肉湯(Mueller-Hinton broth, MHB; Oxoid)調(diào)至每升含20毫克鈣離子和鎂 離子。通過比較McFarland標(biāo)準(zhǔn)，將細(xì)菌培養(yǎng)物配制成5xl05 cfii/ml密度的接種物。本發(fā)明的化合物AE02-7-2進(jìn)行了藥理實驗。采用對甲氧西林類抗生素藥物具有耐藥性的金黃葡萄球菌(Methicillin-Resistant Sto/ /2j/ococow ot/wm， MRSA)進(jìn)行抑菌實驗，結(jié)果顯示，本發(fā)明化合物具有藥理活性。 盡管對于標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌株ATCC25943，化合物AE02-7-2的抑菌活性(最低抑制濃 度MIC 10.8 ^M)低于抗生素諾氟沙星(noflorxacin),最低抑制濃度MIC 1.6 ^M,但它對 具有NorA外泵蛋白，已經(jīng)耐受氟諾喹酮類抗生素藥物的多藥耐藥金葡菌菌株SA1199B 表現(xiàn)出良好的抑制作用(MIC 2.7 (iM)，抑菌效力是陽性對照藥物諾氟沙星(MIC 50 pM) 的13倍。同時，所述的化合物AE02-7-2對具有TetK四環(huán)素外泵蛋白的耐四環(huán)素金葡 菌菌株Xu212和具有MsrA大環(huán)內(nèi)酯外泵蛋白的耐大環(huán)內(nèi)酯金葡菌菌株RN4220均擁有 抑制作用，最低抑菌濃度為10.8 nM。本發(fā)明化合物AE02-7-2可用于制備抑制多藥耐藥細(xì)菌的藥物，其特征是含有有效 抑菌量的該化合物。所述的藥物可制成抗菌注射劑，或外用藥物制劑。 本發(fā)明采用的儀器和實驗材料均為市購，其中紅外光譜儀Avatar 360 E.S.P. , Thermo Nicolet Corporation;核磁共振儀Varian Mercury Plus 400MHz超導(dǎo)核磁共振波譜儀，CDC13, DMSO, Acetone;質(zhì)譜EI-MS: Agilent 5973N MSD型質(zhì)譜儀；旋光Polarimeter P-1020, JASCO Corporation層析硅膠(煙臺市芝罘黃務(wù)硅膠開發(fā)試驗廠；青島海洋化工廠分廠)；硅膠H (60 型)10 40nm (青島海洋化工廠分廠)；TCL板(煙臺市芝罘黃務(wù)硅膠開發(fā)試驗廠)； 反相硅膠:C-18 (Fluka公司)。
具體實施方式
實施例1制備化合物AE02-7-2植物新疆紫草(^77eWaeMc/^owa)的根l.O千克，粉碎，95%乙醇45 攝氏度以下浸泡提取，合并提取液減壓濃縮至乙醇全部揮發(fā)完畢，用氯仿固相萃取。剩 余部分用硅膠和RP-18正反相柱層析多次分離得到紫紅色固體化合物AE02-7-2。樣品 2.0克與100-200目硅膠拌樣，揮發(fā)除去殘余溶劑。取用200-300目硅膠250克裝入直徑 2.0厘米玻璃柱，加入上述已拌好硅膠并揮干的樣品，加入流動相進(jìn)行分離。硅膠柱色 譜流動相為氯仿-石油醚(l:l);合并相同流分，減壓蒸發(fā)除出溶劑。用薄層色譜方法檢測 所得樣品純度，Rf值為0.6 (氯仿-石油醚3:7);重復(fù)上述流程對樣品進(jìn)行純化用同樣方 法進(jìn)行反相硅層析，反相色譜的流動相為甲醇-水(9:l)。AE02-7-2的物理性質(zhì)和波譜學(xué)性質(zhì)為紫紅色固體，[a]D227- 143 。(c， 0.01，丙酮)；分子式為C21H2206(370); EI-MS m/z (%) 302， 288 (2.71)， 270 (100)， 255 (45.91), 229 (6.99)， 220 (15.87)， 100 (2.60)， 83 (72.88), 69 (11.81); IR (KBr) vmax:3446， 3408， 2959, 2920， 2843， 1726, 1605, 1457 cm"; !H NMR S (ppm, Jin Hz): 6.98 s (3-H), 12.43 ;y (5-OH), 7.18 s (2H, 6-H， 7-H), 12.59 s (8陽OH)， 6.01必, 4.7, 7.2 (l，-H), 2.60 w; 2.47 m; (2H， 2，-H) 5.12 Z ，7.3 (3，-H)， 1.68 s (5，-H), 1.57 & 6，-H; 5.85 s (2，，-H)， 2.15 (4"-H)， 1.94 ;y (5，，-H). 13C畫R S (ppm): 177.5 (C-l)， 149.0 (C-2), 131.6 (C-3), 179.0 (C-4)， 166.2 (C陽5), 132.6 (C-6)， 132.4 (C-7), 166.8 (C陽8), 111.8 (C-9), 111.6 (C-10), 68.6 (C-r), 32.9 (C-2，)， 118.0 (C-3，)， 135.9 (C-4，)， 25.8 (C-5，)， 18.0 (C-6，)， 165.3 (C-l")， 115.2 (C-2"), 159.0 (C-3，，)， 20.4 (C隱4"), 27.6 (C-5").實施例2化合物AE02-7-2對SA1199B的藥理活性實驗確定最低抑菌濃度諾氟沙星(norfloxacin)購于西格瑪公司(Sigma Chemical Co.)穆 勒-亨頓肉湯(Mueller-Hinton broth， MHB; Oxoid)調(diào)至每升含20毫克韓離子和鎂離子。通 過比較McFarland標(biāo)準(zhǔn)，將細(xì)菌培養(yǎng)物配制成5><105 cfli/ml密度的接種物。諾氟沙星與 化合物AE02-7-2溶解于二甲基亞砜溶劑并稀釋MHB中至512微克/毫升的起始濃度。 用Nunc型96微孔板，125微升MHB加入1-11號？L;將125微升化合物或諾氟沙星(對 照藥物)加入1號孔并連續(xù)稀釋，留下ll號孔不加化合物或藥物作為細(xì)菌生長對照。最 后的體積加入12號孔，該孔中不含肉湯作為無菌對照。最后，細(xì)菌接種物(125微升)分 別加入1-11號孔，并將該盤在37oC下培養(yǎng)18小時。最低抑菌濃度(MIC)是未見細(xì)菌生 長的最低濃度，所有最低抑菌濃度重復(fù)測定兩次。濃度為5毫克/毫升的3-[4， 5-二甲基 噻唑基-2]-2， 5-二苯基四唑藍(lán)溴化物(MTT; Lancaster)由顏色黃變藍(lán)，用于檢測細(xì)菌的生長。本發(fā)明采用的實驗細(xì)菌SA-1199B為含有過度表達(dá)NorA多藥耐藥外泵蛋白的金黃 葡萄球菌(Gibbons S， Udo EE. P/ 聲o及ewwc/j, 2000, 14: 139—140.),其對諾氟沙 星的耐藥為MIC 16微升/毫升或50 ^M。所述的NorA蛋白是金葡菌的主要藥物外排泵 (efflux pump)。結(jié)果顯示，對于耐藥菌株SA-1199B，在對照藥物諾氟沙星最低抑菌濃度為MIC 16 微克/毫升(50pM)時，化合物AE02-7-2的最低抑菌濃度為1微克/毫升(2.7 pM)，表明化 合物AE02-7-2的抑菌活性強(qiáng)于對照藥物諾氟沙星。實施例3化合物AE02-7-2對耐藥菌Xn212和的藥理活性試驗采用與實施例2中相同方法培養(yǎng)細(xì)菌，諾氟沙星為陽性對照藥物，重復(fù)實施例2的實驗步驟檢測AE02-7-2對耐藥菌株Xu212的最低抑制濃度。所述菌株Xu212為具有 TetK四環(huán)素外泵蛋白的耐四環(huán)素金葡菌菌株(Richardson JF, Re池S. Jo"mfl/ o/ /fos幽〃"/ec麵，1993,25: 45—52.)。結(jié)果顯示，化合物AE02-7-2對具有TetK四環(huán)素外泵蛋白的耐四環(huán)素金葡菌菌株 Xu212擁有抑制作用，最低抑菌濃度為4微克/毫升(10.8 ^M)，該強(qiáng)度與陽性對照藥物 諾氟沙星抑菌活性相當(dāng)，4微克/毫升(12.5piM)。實施例4化合物AE02-7-2對標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌株ATCC25943的藥理活性試驗采用與實施例2中相同方法培養(yǎng)細(xì)菌，諾氟沙星為陽性對照藥物，重復(fù)實施例2 的實驗步驟檢測AE02-7-2對標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌株ATCC25943的最低抑制濃度。實驗 結(jié)果表明，AE02-7-2 (MIC 2微克/毫升(5.4 nM))對標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌株ATCC25943 的抑制活性弱于陽性對照藥物諾氟沙星(MIC 0.5微克/毫刑1.6 nM))。實施例5化合物AE02-7-2對臨床耐藥菌株的藥理活性試驗采用與實施例2中相同方法培養(yǎng)細(xì)菌，諾氟沙星為陽性對照藥物，重復(fù)實施例2的實驗步驟檢測AE02-7-2對臨床常見的耐甲氧西林金葡菌株EMRSA16 ( Richardson JF, Re池S. Jo^""a/ 0//fo印"a/ /"/e"/o", 1993， 25: 45-52.)的最低抑制濃度。EMRSA16 EMRSA16為英國醫(yī)院中一種[8]。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，化合物AE02-7-2的抑菌活性(MIC 2 微克/毫升(5.4 nM))明顯強(qiáng)于陽性對照藥物諾氟沙星(MIC 128微克/毫升(400 ^M))。
權(quán)利要求
1、式(I)的化合物，其分子式為C21H22O6，分子量為370，比旋光度[α]D22.7-143°(c0.01，丙酮)，
2、 按權(quán)利要求1中所述的式(I )的化合物，其特征在于，所述的化合物具有5, 8-二羥基萘醌母核骨架，萘醌的2-位碳上具有一個酰氧基取代的甲基戊烯側(cè)鏈。
3、 按權(quán)利要求2所述的式(I )的化合物，其特征在于，所述的酰氧基為甲基丁烯酰氧基，r-位為s構(gòu)型。
4、 權(quán)利要求1所述的式(I )的化合物在制備抑制多藥耐藥細(xì)菌藥物中的用途。
5、 按權(quán)利要求4所述的用途，其特征是所述的多藥耐藥細(xì)菌是對甲氧西林類抗生素藥物具有耐藥性，同時對氟喹諾酮類抗生素藥物具有耐藥性的金黃葡萄球菌。
6、 按權(quán)利要求4所述的用途，其特征是所述的金黃葡萄球菌含有將氟喹諾酮類抗生素排出的外泵耐藥基因norA。
7、 一種抑制多藥耐藥細(xì)菌的藥物，其特征是含有有效抑制耐藥細(xì)菌量的權(quán)利要求1的化合物。
8、 按權(quán)利要求7所述的藥物，其特征是所述的耐藥細(xì)菌是對甲氧西林類抗生素藥物具有耐藥性，同時對氟喹諾酮類抗生素藥物具有耐藥性的金黃葡萄球菌。
9、 按權(quán)利要求7所述的抑制多藥耐藥細(xì)菌的藥物，其特征是所述的藥物是注射劑或外用藥物制劑。
全文摘要
本發(fā)明屬于藥學(xué)領(lǐng)域，涉及β，β-二甲基丙烯酰阿卡寧及在制備抑制耐藥細(xì)菌藥物中的用途。本發(fā)明提供了可用于抑制外泵型多藥耐藥耐甲氧西林金黃葡萄球菌的天然抑制劑。該化合物對具有NorA外泵蛋白的多藥耐藥金葡菌菌株具有出良好的抑制作用，抑菌效力是陽性對照藥物諾氟沙星的13倍。該化合物對具有TetK四環(huán)素外泵蛋白的耐四環(huán)素金葡菌菌株Xu212和具有MsrA大環(huán)內(nèi)酯外泵蛋白的耐大環(huán)內(nèi)酯金葡菌菌株RN4220均有抑制作用，最低抑菌濃度為10.8μM。本發(fā)明化合物可用于制備抑制多藥耐藥細(xì)菌的藥物，制成抗菌注射劑或外用藥物制劑。
文檔編號A61P31/04GK101597230SQ200910054418
公開日2009年12月9日 申請日期2009年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月3日
發(fā)明者佳 葉, 青 穆, 穆合蘇爾·熱合曼, 西蒙·吉本斯 申請人:復(fù)旦大學(xué)