專利名稱：日本血吸蟲14-3-3蛋白基因、其編碼蛋白及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種日本血吸蟲蛋白，特別是涉及一種日本血吸蟲14-3-3蛋白基因、 其編碼蛋白及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
血吸蟲病由血吸蟲的感染引起，在世界上有76個國家，受感染者約1.5億。致病 的血吸蟲有3種，既日本血吸蟲(Schistosoma japonicum)，曼氏血吸蟲(S. mansoni)和埃 及血吸蟲(S. haematobium)。在我國流行的是日本血吸蟲。血吸蟲病的流行給人民身體健 康和經(jīng)濟發(fā)展都造成巨大的損失，因此，防治血吸蟲病、開發(fā)研制血吸蟲臨床診斷試劑和抗 血吸蟲的藥物具有巨大的社會和經(jīng)濟效益。日本血吸蟲作為寄生蟲能在人體和動物體內(nèi)存在很多年而不被宿主的免疫機制 殺死，與它的免疫逃避能力有關(guān)。其免疫逃避機制有抗原模擬、抗原偽裝和免疫調(diào)節(jié)。其中 免疫調(diào)節(jié)指的是血吸蟲的蛋白能夠調(diào)節(jié)、干擾(主要是抑制)宿主的免疫系統(tǒng)，使其不能發(fā) 揮正常的免疫攻擊效能，從而有利于血吸蟲的生存。血吸蟲的排泄/分泌抗原(Excretory/Secretory protein, ESP)就是一類可以 發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)。這些蛋白來自血吸蟲的表皮和腸道上皮，或者是特化的排泄 /分泌器官。血吸蟲各個蟲期都產(chǎn)生這類蛋白。ESP是潛在藥物靶點和疫苗分子，因為抑制 這些蛋白可以干擾血吸蟲的免疫逃避機制從而增強宿主的免疫殺滅功能；ESP是潛在的診 斷分子，因為這些蛋白游離于宿主的血液中，可以很方便地用現(xiàn)有手段檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種日本血吸蟲14-3-3蛋白基因、其編碼蛋白 及應(yīng)用，該蛋白可成為很好的診斷標(biāo)記分子。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的日本血吸蟲14-3-3蛋白的基因，包括具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。所述的SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列編碼具有SEQ ID N0. 2所示序列的蛋白。本發(fā)明的日本血吸蟲14-3-3蛋白，包括具有SEQ ID N0. 2所示氨基酸序列的蛋白、或由該蛋白發(fā)生一個或多個氨基酸的 置換、缺失或插入而形成的具有相同功能的蛋白，該蛋白是具有SEQ ID NO. 1序列編碼的蛋白。利用蛋白質(zhì)組學(xué)手段，通過直接分析感染動物(兔子)的血液，發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲 的14-3-3蛋白(Accession number :EZ000062. 1)在宿主血液中也存在，是其ESP的成分之 一，表明該蛋白可能在血吸蟲的免疫調(diào)節(jié)、免疫逃避方面發(fā)揮重要作用；這也使它成為很好 的診斷標(biāo)記分子。這是國際上首次發(fā)現(xiàn)14-3-3蛋白出現(xiàn)在日本血吸蟲的ESP中。本發(fā)明的日本血吸蟲14-3-3蛋白作為免疫原，在制備血吸蟲疫苗方面的應(yīng)用；作 為潛在的藥物作用靶點，在篩選化學(xué)和其他種類藥物方面的應(yīng)用；作為特異性血吸蟲抗原，在制備抗血吸蟲抗體方面的應(yīng)用；在血清學(xué)診斷方面的應(yīng)用；日本血吸蟲14-3-3蛋白的編 碼基因，在基因治療方面的應(yīng)用。
具體實施例方式一、方法1、感染動物，制備感染血清在血吸蟲流行區(qū)中收集自然感染的陽性湖北釘螺(Oncomelania hupensis hupensis)，將釘螺浸入水中，加以光照，收集浮在水面上的尾蚴。新西蘭大白兔剃去腹部的 毛，露出皮膚；取日本血吸蟲1000條尾蚴，經(jīng)裸露的兔子皮膚感染兔子。收集感染后第42 天的動物血液，制備血清。2、感染動物血清蛋白的提取用6倍體積的冷丙酮加入到血清中，沉淀血清中的蛋白，離心收集蛋白沉淀 (5000rpm, 5 分鐘)，溶解沉淀用 50mM Tris-HCl (pH 8. 3), 5mM EDTA, ImM phenylmethyl sulfonylfluoride (PMSF), 0. 5% sodium dodecyl sulfate (SDS), 0. 5mM二硫蘇糖醇(DTT)，
0.5% SDS，利用超聲波促進蛋白溶解。3、血清蛋白的酶解過程血清蛋白混合物加入終濃度IOmM DTT,室溫反應(yīng)30分鐘，再加入終濃度55mM的碘 乙酰氨置暗處反應(yīng)15分鐘，用去離子水稀釋5-10倍，按1 50的體積比例加入修飾的測 序級牛胰酶，37°C酶解過夜。4、血清蛋白酶解肽段混合物用強陽離子交換柱(Strong Cation Exchange, SCX) 進行分級SCX柱的平衡和清潔SCX柱在每次使用前，先用高鹽溶液(500mM/25% ACN, pH 3.0)過柱，然后用(H20/25% ACN，pH 3.0)平衡。清洗柱則用高鹽溶液。酶解后的肽段樣品用SCX平衡溶液(水、30%乙腈pH3.0)稀釋，預(yù)先配制好不同 濃度的NH4HCO3鹽溶液(IOmM 500mM)，用注射器將樣品推過SCX色譜柱4. OmmX 150mm P0R0S 50HS column (Sciex-Applied Biosystems)，再依次用配好的鹽溶液，按照濃度從 低到高的順序，洗脫SCX柱上結(jié)合的肽段，分別收集各個洗脫的組分，用真空濃縮儀將溶液 體積抽減20-30 μ 1左右。5、質(zhì)譜鑒定每個組分的肽混合物上樣到一個反相捕獲柱(C18，5 μ m, 300 A，300 μ m
1.dX5mm, LC Packings)，在20 μ 1/min的流速下脫鹽。然后這個捕獲柱和一個分析用的 75 μ mX 150mm C18柱(LC Packings)相連接，肽混合物就在200nl/min的流速下，從這個 柱子上洗脫進入裝有Protana NanoES的電噴霧離子源的QSTAR pulser i中。Agilent 1100毛細液相系統(tǒng)(Agilent Technologies)用來提供流動相A(0. 5%乙酸/水)和流動 相B(0. 5%乙酸/乙腈)，線性梯度是60分鐘內(nèi)5% B到50% B, 30分鐘內(nèi)50% B到90% B，然后是在90% B停留15分鐘。在分析柱后通過一個不銹鋼的兩通(Valco Instrument) 連接一個10 μ m直徑的PicoTip納噴霧頭(New Objective)，加上2500-3000伏的噴霧電 壓，以獲得穩(wěn)定的噴霧。MS/MS串聯(lián)質(zhì)譜譜圖通過信息依賴的采集(IDA)和任務(wù)-循環(huán)增強來記錄。在每
4個測定掃描中，選取3-6個信號最強、帶2到3個電荷的離子，用滾動碰撞能量打碎，以獲 得串聯(lián)質(zhì)譜的信息。噴霧電壓=3000, DP = 50，F(xiàn)P = 220，MS掃描范圍為m/z 450-1400， MSMS掃描范圍為m/z 50-1800，GSl = 20，簾氣為10，所用離子源為Protana NanoES電噴 霧離子源。6、質(zhì)譜數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)處理及日本血吸蟲排泌蛋白的鑒定質(zhì)譜搜索用的數(shù)據(jù)庫，包括從11717個從公共數(shù)據(jù)庫NCBI下載的日本血吸蟲蛋白 質(zhì)序列(時間是 2008 年 10 月 16 日)。搜索軟件是 MASCOT (http://www. matrixscience. com/, Matrix Science)。搜索參數(shù)為最大漏切點，3個；monoisotopic ；肽電荷數(shù)， +1/+2/+3 ；修飾，半胱氨酸carbamoylmethylation和methionine氧化。搜索結(jié)果合并后， 用下列標(biāo)準(zhǔn)進行過濾篩選1)對每一個串聯(lián)質(zhì)譜譜圖的搜索結(jié)果列表，只提取排位在第一個的結(jié)果，其他的 則丟棄；2)搜索得到的肽段中如果有KR，KK, RK, RR等序列，則這個肽段丟棄；3)搜索得到的肽段，長度在8個氨基酸以上的保留，小于8個氨基酸的丟棄；4)重復(fù)打到的肽段，只計算其中分值最高的，把這些肽段分值加起來，做為蛋白的 得分；5)蛋白的得分超過60，就認(rèn)為是可信的結(jié)果。低分的蛋白，手工檢查后保留或者 丟棄。匹配到宿主或者牛胰酶、角蛋白的肽段，則丟棄。同時進行反向蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫的搜索。反向蛋白庫是將日本血吸蟲蛋白質(zhì)序列 反轉(zhuǎn)，保持長度、組成不變。根據(jù)正向庫和反向庫搜索得到的結(jié)果，確定假陽性率。計算方 法假陽性=2*(反向庫肽段數(shù))/(正向庫肽段數(shù)+反向庫肽段數(shù))。假陽性控制在0%。二、結(jié)果1)從被感染的動物血清中直接鑒定日本血吸蟲的排泌蛋白在國際上首次從被感染的動物血清中直接鑒定日本血吸蟲的排泌蛋白。鑒定到日 本血吸蟲14-3-3蛋白的3個肽段(表1)，證明了日本血吸蟲14-3-3蛋白的確存在于宿主 動物的血清中，可以被檢測到，因而可以成為血吸蟲臨床診斷的靶標(biāo)分子。表1日本血吸蟲14-3-3在被感染的動物血清中被發(fā)現(xiàn)和鑒定 2)日本血吸蟲14-3-3蛋白的序列保守性
鑒定到的日本血吸蟲14-3-3蛋白的肽段，都經(jīng)過與宿主動物即兔子的序列的比 較，發(fā)現(xiàn)這些肽段都是血吸蟲特異的、不同于宿主。3)日本血吸蟲14-3-3蛋白的功能日本血吸蟲14-3-3蛋白發(fā)揮多種重要的生物學(xué)功能。本實施例中的結(jié)果表明日 本血吸蟲14-3-3蛋白可以分泌到宿主的血液中，和宿主的免疫系統(tǒng)直接接觸，推測可能發(fā) 揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用。因此，可以通過在感染動物或人體血液中檢測血吸蟲14-3-3蛋白 的存在，從而判斷是否感染血吸蟲，或者判斷藥物治療后的驅(qū)蟲效果。
權(quán)利要求
一種日本血吸蟲14 3 3蛋白的基因，其特征在于包括具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的日本血吸蟲14-3-3蛋白的基因，其特征在于所述的SEQID NO. 1所示的核苷酸序列編碼具有SEQ ID NO. 2所示序列的蛋白。
3.一種日本血吸蟲14-3-3蛋白，其特征在于包括具有SEQ ID NO. 2所示氨基酸序 列的蛋白、或由該蛋白發(fā)生一個或多個氨基酸的置換、缺失或插入而形成的具有相同功能 的蛋白。
4. 一種日本血吸蟲14--3--3蛋白在制備血吸蟲疫苗方面的應(yīng)用。
5. 一種日本血吸蟲14--3--3蛋白在篩選藥物方面的應(yīng)用。
6. 一種日本血吸蟲14--3--3蛋白在制備抗血吸蟲抗體方面的應(yīng)用。
7. 一種日本血吸蟲14--3--3蛋白在血清學(xué)診斷方面的應(yīng)用。
8. 一種日本血吸蟲14--3--3蛋白的編碼基因在基因治療方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種日本血吸蟲14-3-3蛋白基因、其編碼蛋白及應(yīng)用，該基因包括具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；日本血吸蟲14-3-3蛋白，包括具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白、或由該蛋白發(fā)生一個或多個氨基酸的置換、缺失或插入而形成的具有相同功能的蛋白，該蛋白是具有SEQ ID NO.1序列編碼的蛋白。本發(fā)明的日本血吸蟲14-3-3蛋白作為免疫原，在制備血吸蟲疫苗方面的應(yīng)用；作為潛在的藥物作用靶點，在篩選藥物方面的應(yīng)用；作為特異性血吸蟲抗原，在制備抗血吸蟲抗體方面的應(yīng)用；在血清學(xué)診斷方面的應(yīng)用；日本血吸蟲14-3-3蛋白的編碼基因，在基因治療方面的應(yīng)用。
文檔編號A61P33/12GK101921768SQ200910057438
公開日2010年12月22日 申請日期2009年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月17日
發(fā)明者馮正, 劉鋒, 胡薇, 韓澤廣 申請人:上海人類基因組研究中心