專利名稱：：從白扁豆中分離多糖的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物成分分離，特別是一種從白扁豆中分離多糖的制備方法。二
背景技術(shù)：
：白扁豆為豆科扁豆DolichoslablabL.的干燥成熟種子，是一味食藥兼用的中藥，具有健脾化濕,和中消暑的功效，用于脾胃虛弱，食欲不振，大便溏瀉，白帶過多，暑濕吐瀉，胸悶腹脹等。白扁豆含有脂肪油、蛋白質(zhì)、尼克酸、氨基酸、維生素、磷脂、糖類，以及微量元素及鈣、磷、鐵等。但有關(guān)白扁豆有效成分深入的化學(xué)研究及其藥理活性研究極少，尤其是其中多糖的提取分離工藝未見報道，白扁豆多糖具有很好的抗氧化和增強免疫的作用，由于白扁豆多糖來自純天然的食藥兼用藥材，因此，能夠以食品添加劑、顆粒沖劑、口服液、膠囊、滴丸、軟膠囊等形式制備成保健品或藥品，用于抗衰老和提高人體抗病能力，且白扁豆原料價廉易得，國內(nèi)種植廣泛，如能研制出有效分離白扁豆中多糖成分的方法，將造福廣大人民和社會。三
發(fā)明內(nèi)容針對上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，本發(fā)明之目的就是提供-一種從白扁豆中分離多糖的制備方法，可有效解決從白扁豆中分離多糖的問題，其解決的技術(shù)方案是，取白扁豆，粉碎后每次加白扁豆612倍重量體積的質(zhì)量濃度為30~50%乙醇，超聲提取2次，每次30min，或回流提取2次，每次2h4h，過濾，合并濾液，濾液減壓濃縮至無醇味，濃縮液加白扁豆1015倍重量體積的50-80。C蒸餾水?dāng)嚢?、溶解，得溶解液，溶解液?jīng)3000轉(zhuǎn)/分離心10min后，得上清液，上清液通過大孔吸附樹脂柱，收集流出液，樹脂柱再用白扁豆2~4倍重量體積的蒸餾水沖洗，沖洗液和流出液合并，減壓濃縮至白扁豆重量體積的2倍，得濃縮液，再邊攪拌邊加質(zhì)量濃度為95%乙醇，使?jié)饪s液中含醇量為7080%，靜置過夜(12小時)，濾取底部沉淀物，沉淀物用無水乙醇洗去沉淀物中的水分，用丙酮洗去沉淀物中的無水乙醇，用乙醚洗去沉淀物中的丙酮，上述依次洗滌后，置于玻璃真空干燥器內(nèi)，以五氧化二磷為干燥劑，20-3(TC進行干燥，即得白扁豆多糖；所說的重量體積是指固體(藥物)用g計，液體(乙醇和蒸餾水等)用ml計(以下同)。本發(fā)明方法簡單，操作方便，成本低，為白扁豆的深加工、提高產(chǎn)品附加值、增加農(nóng)民收入提供了經(jīng)濟實惠的方法。四圖1為本發(fā)明的白扁豆多糖對羥基自由基的清除作用的曲線圖。五具體實施方式以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的具體實施方式作詳細說明。由技術(shù)方案給出，本發(fā)明還可由以下方法進行提取分離實施例1取白扁豆50g，粉碎，置圓底燒瓶中，加質(zhì)量濃度為50%的乙醇回流提取2次，每次乙醇用量400ml，每次回流提取時間2h，合并2次提取液，減壓濃縮至無醇味，加55t的蒸餾水500ml攪拌、溶解，再經(jīng)3000轉(zhuǎn)/分離心10min，離心得的上清液通過D101型大孔吸附樹脂柱，收集流出液，樹脂柱以100ml蒸餾水沖洗，合并流出液和沖洗液，減壓濃縮至約100ml，邊攪拌邊加質(zhì)量濃度為95%乙醇，調(diào)含醇量為70%，靜置12小時，濾取底部沉淀物，沉淀物用無水乙醇洗去沉淀物中的水分，用丙酮洗去沉淀物中的無水乙醇，用乙醚洗去沉淀物中的丙酮，上述依次洗滌后，置于玻璃真空干燥器內(nèi)，以五氧化二磷為干燥劑，2(TC干燥，即得白扁豆多糖。實施例2取白扁豆50g，粉碎，置圓底燒瓶中，加質(zhì)量濃度為30%的乙醇回流提取2次，每次乙醇用量500ml，每次回流提取時間3h，合并2次提取液，減壓濃縮至無醇味，加70。C的蒸餾水700ml攪拌、溶解，再經(jīng)3000轉(zhuǎn)/分離心10min，離心得的上清液通過AB-8型大孔吸附樹脂柱，收集流出液，樹脂柱以150ml蒸餾水沖洗，合并流出液和沖洗液，減壓濃縮至約100ml，邊攪拌邊加質(zhì)量濃度為95%乙醇，調(diào)含醇量為80%，靜置12小時，濾取底部沉淀物，沉淀物用無水乙醇洗去沉淀物中的水分，用丙酮洗去沉淀物中的無水乙醇，用乙醚洗去沉淀物中的丙酮，上述依次洗滌后，置于玻璃真空干燥器內(nèi)，以五氧化二磷為干燥劑，25匸干燥，即得白扁豆多糖。實施例3取白扁豆50g，粉碎，置三角燒瓶中，加質(zhì)量濃度為40%的乙醇超聲提取2次，每次乙醇用量300ml，每次超聲提取時間每次30min,合并2次提取液，減壓濃縮至無醇味，加6(TC的蒸餾水600ml攪拌、溶解，再經(jīng)3000轉(zhuǎn)/分速度離心10min，離心得的上清液通過AB-8型大孔吸附樹脂柱，收集流出液，樹脂柱以200ml蒸餾水沖洗，合并流出液和沖洗液，減壓濃縮至約iOOml，邊攪拌邊加質(zhì)量濃度為95%乙醇，調(diào)含醇量為75%，靜置12小時，濾取底部沉淀物，沉淀物用無水乙醇洗去沉淀物中的水分，用丙酮洗去沉淀物中的無水乙醇，用乙醚洗去沉淀物中的丙酮，上述依次洗滌后，置于玻璃真空干燥器內(nèi)，以五氧化二磷為干燥劑，3(TC干燥，即得白扁豆多糖。實施例4:取白扁豆50g，粉碎，置圓底燒瓶中，加質(zhì)量濃度為35%的乙醇回流提取2次，每次乙醇用量350ml，每次回流提取時間2.5h，合并2次提取液，減壓濃縮至無醇味，加65。C的蒸餾水550ml攪拌、溶解，再經(jīng)3000轉(zhuǎn)/分離心10min，離心得的上清液通過D101型大孔吸附樹脂柱，收集流出液，樹脂柱以125ml蒸餾水沖洗，合并流出液和沖洗液，減壓濃縮至約100m，邊攪拌邊加質(zhì)量濃度為95%乙醇，調(diào)含醇量為73%，靜置12小時，濾取底部沉淀物，沉淀物用無水乙醇洗去沉淀物中的水分，用丙酮洗去沉淀物中的無水乙醇，用乙醚洗去沉淀物中的丙酮，上述依次洗滌后，置于玻璃真空干燥器內(nèi)，以五氧化二磷為干燥劑，23。C干燥，即得白扁豆多糖。實施例5:取白扁豆50g，粉碎，置圓底燒瓶中，加質(zhì)量濃度為35%的乙醇回流提取2次，每次乙醇用量450ml，每次回流提取時間3.5h,合并2次提取液，減壓濃縮至無醇味，加75。C的蒸餾水650ml攪拌、溶解，再經(jīng)3000轉(zhuǎn)/分離心10min，離心得的上清液通過DIOI型大孔吸附樹脂柱，收集流出液，樹脂柱以175ml蒸餾7水沖洗，合并流出液和沖洗液，減壓濃縮至約100ml，邊攪拌邊加質(zhì)量濃度為95%乙醇，調(diào)含醇量為78%，靜置12小時，濾取底部沉淀物，沉淀物用無水乙醇洗去沉淀物中的水分，用丙酮洗去沉淀物中的無水乙醇，用乙醚洗去沉淀物中的丙酮，上述依次洗滌后，置于玻璃真空干燥器內(nèi)，以五氧化二磷為干燥劑，28°。干燥，即得白扁豆多糖。白扁豆多糖的抗氧化及免疫增強實驗1.白扁豆多糖的體外抗氧化作用-對羥自由基(-OH)的抑制作用，試驗情況是采用鄰二氮菲-金屬鐵離子-HA體系，通過Fenton反應(yīng)生成羥自由基，促使鄰二氮菲-Fe2+被氧化為鄰二氮菲-Fe3+，造成其水溶液在波長510nm處最大吸收消失，來測算其清除率。試劑pH7.4、0.2mol/L的磷酸緩沖液；7.5咖ol/L鄰二氮菲(以蒸餾水將50mmol/L鄰二氮菲無水乙醇溶液稀釋)；體積分?jǐn)?shù)為0.1%的HA溶液；7.5咖ol/LFeSCU容液；白扁豆多糖的濃度依次為20(mg/ml，400l^g/ml,600Hg/ml，800^g/ml，1000Pg/ral。操作方法取試管，按照按表l的順序和體積向試管中加各種試劑和樣品，搖勻，并置于恒溫水槽中，37。C保溫60min，置于波長510nm處，測吸光度(A)，按下式計算羥自由基清除率，結(jié)果見圖L表1鄰二氮菲-Fe2'-HA體系加樣表單位(ml)試劑空白管未損傷管損傷管樣品管磷酸鹽緩沖液2222鄰二氮菲溶液一0.50.50.5蒸餾水5.54.54.03.0FeS04溶液一0.50.50.5不同濃度多糖一一一1.0HA溶液一一0.50.5總體積7.57.57.57.5清除率=["2—A,)/(A?！狝|)]X]00%;A。為未損傷管的吸光值；Ai為損傷管的吸光值；A2為樣品管的吸光值。由此得出，白扁豆多糖對-0H自由基具有明顯的清除作用，并且隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，清除能力增強，表明白扁豆多糖對-OH自由基的清除能力與多糖濃度有明顯的量效關(guān)系，其中白扁豆多糖濃度約為70(^g/ml時，羥基自由基的清除率是50%。2.白扁豆多糖體內(nèi)抗氧化試驗情況如下取體重18-22g的昆明種小鼠40只，適應(yīng)件飼養(yǎng)1周后，隨機分成4組，每組10只。分別為空白對照組，多糖低劑量組(200mgkg—》，多糖中劑量組(300mgkg—1)，多糖高劑量組(400mgkg—D。每天灌胃給藥一次(0.2ml/10g)，連續(xù)15天口服給藥(空白對照組給等量蒸餾水)。末次給藥后24h，眼球取血，離心得小鼠血清，按照SOD、GSH-Px試劑盒的操作過程，測定白扁豆多糖對小鼠血清中的SOD及GSH-Px的影響，結(jié)果見表2。表2白扁豆多糖對小鼠血清中SOD、GSH-Px的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>*表示與空白組相比P〈0.05，林,與空白組比P〈0.01從表2中可以看出，與空白組相比，白扁豆多糖可顯著地提高小鼠血清中SOD和GSH-Px活力，中劑量和大劑量組的作用具有極顯著性(P〈0.01)，顯示出白扁豆多糖具有較好的抗氧化作用。3.白扁豆多糖對正常小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響的試驗如下取小鼠50只，體重1822g，雌雄各半，隨機均勻分為5組。分別灌服大、中、小劑量的白扁豆水溶液(200mg'kg-l，300mg'kg-l，400mg'kg-l;0.2ml/10g)，香站多糖混懸液(200mg*kg-l;0.2ml/10g)及同體積的生理鹽水。每天給藥1次，連續(xù)給藥10天。于10天早上各組小鼠均腹腔注射5%雞紅細胞生理鹽水混懸液0.5ml，于第10天灌胃給藥后2h，給雞紅細胞后4h，脫頸椎處死小鼠。腹腔注入漢氏液2.5ml，輕揉小鼠腹部，然后剪開小鼠腹部皮膚，在腹膜h剪一小孔，用吸管吸取腹腔液2ml置于試管中，混勻，吸取少許腹腔液滴于載玻片上，37。C孵育30min，生理鹽水沖去附著的細胞，瑞氏染液染色，顯微鏡下觀察小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬情況，并計算吞噬百分率和吞噬指數(shù)，結(jié)果見表3。4.白扁豆多糖對止常小鼠溶血素形成的影響試驗如下取小鼠50只，體重1822g，雌雄各半，隨機均勻分為5組。分別灌服大、中、小劑量的白扁豆多糖水溶液(200mg'kg-I，300mg'kg-l，400mg'kg-l;0.2ml/10g)、香燕多糖混懸液(200mg*kg-l，0.2ml/10g)及同體積的生理鹽水(0.2ml/10g)。每天給藥1次，連續(xù)給藥12天。于給藥第1天各組小鼠均腹腔注射5。/。雞紅細胞生理鹽水混懸液0.2ml/只,進行免疫，于最后1次給藥后2h，小鼠眼眶取血，離心，分離血清。用生理鹽水1:IOO稀釋后，取lm稀釋液與5%雞紅細胞混懸液0.5ml、10。/o補體0.5ml(豚鼠血清，用雞紅細胞預(yù)先飽和6h)混勻，37。C孵育30min，冰水中終止反應(yīng)。另設(shè)不加補體的空白管作對照，吸取各管上清液于UV-2000型分光光度計540nm處比色，測定各組溶血素形成情況，結(jié)果見表3。表3白扁豆多糖對正常小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能和小鼠血清溶血素形成的影響組別吞噬百分率(％)吞噬指數(shù)溶血素的形成(OD)宇白組0.2231±0.0510.2600士0.08240.0448±0.0048香菇多糖紹0.3639±0.047林0.4869±0.0745林0.0537±0.0056**小劑量組0.4938±0.IIO林0.7506±0.2幼6林0.0568±0.0056**中劑量組0.5025±0.049林0.7608±0.1307林0.0652±0.0077**大劑量組0.5547±0.085林0.8917±0.1636林0.0605±0.0070林林^與空白組比P〈0.01從表3可以看出，與空白對照組比，大、中、小劑量組能顯著提高小鼠腹腔巨噬細胞對雞紅細胞的吞噬百分率(PO.Ol)，可顯著提高腹腔巨噬細胞的吞噬指數(shù)(PO.Ol)，以大劑量組作用為強。從表3還可以看出，與空白對照組比，白扁豆多糖大、中、小劑量組溶血素OD值均顯著升高(PO.Ol)，其中以中劑量組作用為最優(yōu)。由此得出，白扁豆多糖可顯著提高腹腔巨噬細胞的吞噬指數(shù)和吞噬百分率(P<0.01)，可顯著促進溶血素的形成，具有較好的增強免疫的作用。10本發(fā)明適用于對任何量的白扁豆進行多糖的分離，以稀乙醇為提取溶劑，減少淀粉、蛋白質(zhì)類雜質(zhì)的溶出，并采用大孔吸附樹脂脫色，有效解決了從白扁豆中多糖的提取分離技術(shù)難題，本發(fā)明操作簡單，方法簡單，成本較低，為制備抗衰老和提高免疫功能從而增強人體抗病力的保健品或藥品提供了原料，是中藥提取物卜.的一大創(chuàng)造，經(jīng)濟和社會效益巨大。權(quán)利要求1、一種從白扁豆中分離多糖的制備方法，其特征在于，取白扁豆，粉碎后每次加白扁豆6～12倍重量體積的質(zhì)量濃度為30～50％乙醇，超聲提取2次，每次30min，或回流提取2次，每次2h～4h，過濾，合并濾液，濾液減壓濃縮至無醇味，濃縮液加白扁豆10～15倍重量體積的50-80℃蒸餾水?dāng)嚢?、溶解，得溶解液，溶解液?jīng)3000轉(zhuǎn)/分離心10min后，得上清液，上清液通過大孔吸附樹脂柱，收集流出液，樹脂柱再用白扁豆2～4倍重量體積的蒸餾水沖洗，沖洗液和流出液合并，減壓濃縮至白扁豆重量體積的2倍，得濃縮液，再邊攪拌邊加質(zhì)量濃度為95％乙醇，使?jié)饪s液中含醇量為70～80％，靜置過夜，濾取底部沉淀物，沉淀物用無水乙醇洗去沉淀物中的水分，用丙酮洗去沉淀物中的無水乙醇，用乙醚洗去沉淀物中的丙酮，上述依次洗滌后，置于玻璃真空干燥器內(nèi)，以五氧化二磷為干燥劑，20-30℃下進行干燥，即得白扁豆多糖；所說的重量體積是指固體用g計，液體用ml計。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的從白扁豆中分離多糖的制備方法，其特征在于，取白扁豆50g，粉碎，置圓底燒瓶中，加質(zhì)量濃度為50%的乙醇回流提取2次，每次乙醇用量400ml，每次回流提取時間2h，合并2次提取液，減壓濃縮至無醇味，力B55。C的蒸餾水500ml攪拌、溶解，再經(jīng)3000轉(zhuǎn)/分離心10min，離心得的上清液通過DIOI型大孔吸附樹脂柱，收集流出液，樹脂柱以100ml蒸餾水沖洗，合并流出液和沖洗液，減壓濃縮至約100ml，邊攪拌邊加質(zhì)量濃度為95%乙醇，調(diào)含醇量為70%，靜置12小時，濾取底部沉淀物，沉淀物用無水乙醇洗去沉淀物中的水分，用丙酮洗去沉淀物中的無水乙醇，用乙醚洗去沉淀物中的丙酮，上述依次洗滌后，置于玻璃真空干燥器內(nèi)，以五氧化二磷為干燥劑，20匯干燥，即得白扁豆多糖。3、根據(jù)權(quán)利要求l所述的從白扁豆中分離多糖的制備方法，其特征在于，取白扁豆50g，粉碎，置圓底燒瓶中，加質(zhì)量濃度為30%的乙醇回流提取2次，每次乙醇用量500ml，每次回流提取時間3h，合并2次提取液，減壓濃縮至無醇味，加70。C的蒸餾水700ml攪拌、溶解，再經(jīng)3000轉(zhuǎn)/分離心10min，離心得的上清液通過AB-8型大孔吸附樹脂柱，收集流出液，樹脂柱以150ml蒸餾水沖洗，合并流出液和沖洗液，減壓濃縮至約100ml，邊攪拌邊加質(zhì)量濃度為95%乙醇，調(diào)含醇量為80%，靜置12小時，濾取底部沉淀物，沉淀物用無水乙醇洗去沉淀物中的水分，用丙酮洗去沉淀物中的無水乙醇，用乙醚洗去沉淀物中的丙酮，上述依次洗滌后，置于玻璃真空干燥器內(nèi)，以五氧化二磷為干燥劑，25'C干燥，即得白扁豆多糖。4、根據(jù)權(quán)利要求l所述的從白扁豆中分離多糖的制備方法，其特征在于，取白扁豆50g，粉碎，置三角燒瓶中，加質(zhì)量濃度為40。/。的乙醇超聲提取2次，每次乙醇用量300ml，每次超聲提取時間每次30min，合并2次提取液，減壓濃縮至無醇味，加60°C的蒸餾水600ml攪拌、溶解，再經(jīng)3000轉(zhuǎn)/分速度離心10min，離心得的上清液通過AB-8型大孔吸附樹脂柱，收集流出液，樹脂柱以200ml蒸餾水沖洗，合并流出液和沖洗液，減壓濃縮至約100ml，邊攪拌邊加質(zhì)量濃度為95%乙醇，調(diào)含醇量為75%，靜置12小時，濾取底部沉淀物，沉淀物用無水乙醇洗去沉淀物中的水分，用丙酮洗去沉淀物中的無水乙醇，用乙醚洗去沉淀物中的丙酮，上述依次洗滌后，置于玻璃真空干燥器內(nèi)，以五氧化二磷為干燥劑，3(TC干燥，即得白扁豆多糖。5、根據(jù)權(quán)利要求l所述的從白扁豆中分離多糖的制備方法，其特征在于，取白扁豆50g，粉碎，置圓底燒瓶中，加質(zhì)量濃度為35%的乙醇回流提取2次，每次乙醇用量350ml，每次回流提取時間2.5h，合并2次提取液，減壓濃縮至無醇味，加65。C的蒸餾水550ml攪拌、溶解，再經(jīng)3000轉(zhuǎn)/分離心10min，離心得的上清液通過DIOI型大孔吸附樹脂柱，收集流出液，樹脂柱以125ml蒸餾水沖洗，合并流出液和沖洗液，減壓濃縮至約100ml，邊攪拌邊加質(zhì)量濃度為95%乙醇，調(diào)含醇量為73%，靜置12小時，濾取底部沉淀物，沉淀物用無水乙醇洗去沉淀物中的水分，用丙酮洗去沉淀物中的無水乙醇，用乙醚洗去沉淀物中的丙酮，上述依次洗滌后，置于玻璃真空干燥器內(nèi)，以五氧化二磷為干燥劑，23。C千燥，即得白扁豆多糖。6、根據(jù)權(quán)利要求l所述的從白扁豆中分離多糖的制備方法，其特征在于，取白扁豆50g，粉碎，置圓底燒瓶中，加質(zhì)量濃度為35%的乙醇回流提取2次，每次乙醇用量450ml，每次回流提取時間3.5h，合并2次提取液，減壓濃縮至無醇味，加75。C的蒸餾水650ml攪拌、溶解，再經(jīng)3000轉(zhuǎn)/分離心10min，離心得的上清液通過D101型大孔吸附樹脂柱，收集流出液，樹脂柱以175ml蒸餾水沖洗，合并流出液和沖洗液，減壓濃縮至約100ml，邊攪拌邊加質(zhì)量濃度為95%乙醇，調(diào)含醇量為78%，靜置12小時，濾取底部沉淀物，沉淀物用無水乙醇洗去沉淀物中的水分，用丙酮洗去沉淀物中的無水乙醇，用乙醚洗去沉淀物中的丙酮，上述依次洗滌后，置于玻璃真空干燥器內(nèi)，以五氧化二磷為干燥劑，28。c干燥，即得白扁豆多糖。全文摘要本發(fā)明涉及從白扁豆中分離多糖的制備方法，有效解決從白扁豆中分離多糖的問題，其方法是，取白扁豆，粉碎后每次加白扁豆6～12倍重量體積的質(zhì)量濃度為30～50％乙醇，超聲提取2次，或回流提取2次，過濾，合并濾液，減壓濃縮至無醇味，濃縮液加白扁豆10～15倍重量體積的蒸餾水?dāng)嚢?、溶解，溶解液?jīng)3000轉(zhuǎn)/分離心10min后，上清液通過大孔吸附樹脂柱，收集流出液，樹脂柱再用白扁豆2～4倍重量體積的蒸餾水沖洗，沖洗液和流出液合并，減壓濃縮至白扁豆重量體積的2倍，再邊攪拌邊加質(zhì)量濃度為95％乙醇，使?jié)饪s液中含醇量為70～80％，靜置過夜，濾取底部沉淀物，用無水乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌后，置玻璃真空干燥器內(nèi)，以五氧化二磷為干燥劑，干燥即得白扁豆多糖。文檔編號A61P37/04GK101575383SQ20091006475公開日2009年11月11日申請日期2009年4月29日優(yōu)先權(quán)日2009年4月29日發(fā)明者馮衛(wèi)生,張寒娟,云楊,許小華申請人:河南中醫(yī)學(xué)院