專利名稱：牛蛙凝集素基因及其編碼的凝集素與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種牛蛙凝集素基因及其編碼的凝集素與應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
凝集素是動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞都能夠合成和分泌的、能與糖結(jié)合的蛋白質(zhì)， 在細(xì)胞識(shí)別和粘著反應(yīng)中起重要作用，主要是促進(jìn)細(xì)胞間的粘著。凝集素最大的 特點(diǎn)是能識(shí)別糖蛋白和糖脂中，特別是細(xì)胞膜中復(fù)雜的碳水化合物結(jié)構(gòu)，即細(xì)胞 膜表面的糖基。凝集素具有一個(gè)以上同糖結(jié)合的位點(diǎn)，因此能夠參與細(xì)胞的識(shí)別 和粘著，將不同的細(xì)胞聯(lián)系起來。凝集素在無(wú)脊椎動(dòng)物血液中具有多種生物活性， 可以選擇凝集各種細(xì)胞，對(duì)腫瘤細(xì)胞有特異性凝集作用等，是免疫防御的重要體 液因子之一。其功能涉及細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、發(fā)育和免疫等，特別是在凝集外來細(xì)胞， 參與吞噬、包囊、凝固、止血及創(chuàng)傷修復(fù)等方面發(fā)揮著重要的作用。
藥物靶向輸送和定位是世界研究的熱點(diǎn)。定向輸送藥物到特定的發(fā)病部位將 極大地提高藥物利用效率和減少副作用。凝集素具有專一的糖基結(jié)合特性，生物 體不同的器官與組織含有不同的糖基，因此凝集素可以專一地與不同的器官或組 織相結(jié)合。由于這個(gè)特點(diǎn)，它們一直被認(rèn)為是最好的藥物靶向輸送和定位載體而 受到藥物學(xué)家的青睞。幾十年來，科研人員一直在尋找合適的凝集素藥物輸送載 體分子，但目前絕大部分已知的凝集素分子量都大于10000，大分子量凝集素作
為藥物靶向輸送和定位載體將可能導(dǎo)致毒性和免疫原性等嚴(yán)重副作用，小分子量 凝集素將克服這些缺陷而作為理想的藥物輸送載體分子。
發(fā)明人將本發(fā)明的牛蛙凝集素編碼基因經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)，未發(fā)現(xiàn)有任何相 同基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開一種牛蛙凝集素基因。
本發(fā)明還提供了根據(jù)上述基因得到牛蛙凝集素，為一種新的凝集素。本發(fā)明的牛蛙凝集素基因，其特征在于cDNA由330個(gè)核苷酸組成，其自5'端 至3'端序列為
atgttcaccatgaagaaatccctgttactccttttcttccttgggaccatcaacttatct 60 ctttgtgagggacgacagsgagatgtcgatcaagaagt嵌igeiaigagatgatccaggtgaa 120 aggaatgttcaaaaaaaaaaacgatttttsacatttcctggaatgactttcggtaaattg 180 ttgggMaeitaaccagaaatgttg^eictttgaaaatggaattggaeLatceitctgatgtg 240 gBatattatttggctaaatgctcaacagatgtcttataaaaataaataaatatgttgcat 300
330 。
本發(fā)明的牛蛙凝集素，其特征在于分子量為1471.8道爾頓，等電點(diǎn)為8.75;編 碼牛蛙凝集素的為145-183位核苷酸，其氨基酸序列為
Phe Leu Thr Phe Pro Gly Met Thr Phe Gly Lys Leu Leu—AMIDATION 。
本發(fā)明的牛蛙凝集素，用于制備抗菌的飼料添加劑。
本發(fā)明的牛蛙凝集素，在制備藥物靶向輸送載體中的應(yīng)用。
本發(fā)明牛蛙凝集素的制備過程，包括以下步驟
1) 牛蛙凝集素基因的克隆
牛蛙皮膚總RNA的提取，mRNA的純化，cDNA第一鏈的合成及cDNA文庫(kù)構(gòu)建， 設(shè)計(jì)引物利用PCR方法篩選牛蛙凝集素基因。擴(kuò)增引物長(zhǎng)度為20個(gè)核苷酸，上游引物 為5' -ATGTTCACCWTGAAGAAATC -3'，下游引物為CLONTECH公司SMART cDNA Library Construction Kit中的3' PCR Primer引物，其序列為5' -ATTCTAGAGGC CGAGGCGGCC-3'。所獲陽(yáng)性克隆進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定。
編碼牛蛙成熟凝集素都為第145-183位核苷酸，其氨基酸序列為 Phe Leu Thr Phe Pro Gly Met Thr Phe Gly Lys Leu Leu—AMID ATION;
2) 牛蛙凝集素的合成
根據(jù)編碼牛蛙凝集素的基因推斷牛蛙凝集素的氨基酸序列，用自動(dòng)多肽合成儀 APEX396合成其全序列。通過HPLC反相C18柱層析脫鹽、純化。然后用高效液相色 譜HPLC方法鑒定其純度，分子量測(cè)定采用快原子轟擊質(zhì)譜法，等電聚焦電泳測(cè)定等 電點(diǎn)，用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
一、牛蛙凝集素對(duì)兔紅細(xì)胞的凝集活性檢測(cè)
取新鮮兔血加入阿氏液(Alsever)體積比為1:1，輕輕混勻防止血液凝固，于4'C在阿氏液中可保存兩周。洗滌紅細(xì)胞，加入TBS-Ca2+緩沖液1500~2000 rpm離心5 min~10 min棄去上清，直至上清液不再呈紅色為止。稀釋紅細(xì)胞，10nL洗滌好的紅細(xì)胞加入到 lmLTBS-Ca2+緩沖液中，于96孔板中加紅細(xì)胞懸液40 45pL，加入5 10pL溶解于生 理鹽水的樣品，37'C45min-lh后觀測(cè)結(jié)果。
結(jié)果合成的牛蛙凝集素具有很強(qiáng)的凝集兔紅細(xì)胞的作用，并測(cè)得其對(duì)兔紅細(xì)胞的 最小凝集濃度為31.25嗎/mL。
根據(jù)凝集素具有專一的糖基結(jié)合特性，生物體不同的器官與組織含有不同的糖 基，凝集素可以專一地與不同的器官或組織相結(jié)合，因此，本發(fā)明牛蛙凝集素能夠 應(yīng)用于制備藥物靶向輸送載體。
二、牛蛙凝集素抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用
抗菌活性檢測(cè)，測(cè)定最小抑菌濃度(MIC)時(shí)，采用二倍稀釋法進(jìn)行抗菌檢測(cè)。以 LB液體培養(yǎng)基作為培養(yǎng)介質(zhì)。將過夜培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)菌株用LB培養(yǎng)基稀釋菌落成每毫升 含105細(xì)菌的菌液，將菌液接種于LB液體培養(yǎng)基，細(xì)菌最終濃度為105。
在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上加入90pL LB培養(yǎng)基中，加入經(jīng)0.22pm孔徑膜過濾的溶解于
生理鹽水的本發(fā)明牛蛙凝集素樣品lO(iL作為第一孔,混勻后取5(VL加入第2管，依次
倍比稀釋，自第9孔吸出50pL棄去，第10管系對(duì)照管，每個(gè)樣品重復(fù)兩次。細(xì)菌菌株
均為吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院微生物與免疫實(shí)驗(yàn)室保存，結(jié)果如表1.
______ 表l,牛蛙凝集素的抑菌活性_
_____ 菌株 "~ 最小抑菌濃度(嗎/nTi^
牛蛙凝集素
金葡菌ATCC 25923 15.6
鏈球菌2型CVCC 606 7.8
大腸桿菌ATCC 25922 62.5
肺炎克雷伯菌ATCC 700603 31.25
結(jié)論本發(fā)明牛蛙凝集素具有抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用。
本發(fā)明可用于制備抗菌的詞料添加劑；
本發(fā)明也可用于制備抗菌藥物。
本發(fā)明的有益效果在于由牛蛙凝集素編碼基因推導(dǎo)其氨基酸序列，合成的牛蛙凝 集素具有顯著的凝集兔紅細(xì)胞以及抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用，該牛蛙凝集素具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、
5人工合成方便的有益特點(diǎn)，因此可以作為抗菌的飼料添加劑、抗菌藥物開發(fā)以及藥物耙 向輸送載體中起導(dǎo)向作用的功能性分子。
具體實(shí)施例方式
下面用實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
實(shí)施例1: 牛蛙凝集素基因克隆
I .牛蛙皮膚總RNA提取
A. 活體牛蛙用雙蒸水清洗干凈，滅菌針從牛蛙的延髓腔毀髓，取50 100 mg牛 蛙皮膚組織放入干烤過的研缽中，加入1 mL TRIZOL Reagent (Invitrogen公司產(chǎn)品)迅 速在冰水浴中研磨。
B. 充分混勻后，移入1. 5 mL離心管中(DEPC管)15 30 °C放置5 min，加入等 體積氯仿旋渦混勻15 s， 4 °C 12 000 xg離心15 min。
C. 取上清加入500nL異丙醇，15 30 。C放置5min ，旋渦15 s混勻，4 °C 12 000 xg離心10min。棄上清，加入1 mL75。/。乙醇漂洗沉淀，7 500 xg離心5 min ，重復(fù)1 次。超凈工作臺(tái)中干燥90s ，用30^L RNase-free water溶解，即得到牛蛙皮膚組織總 RNA。
II. 牛蛙皮膚mRNA的分離純化，采用操作步驟按照德國(guó)QIAGEN公司的Oligotex mRNA Mini Kit試劑盒說明書進(jìn)行。
III. 牛蛙皮膚cDNA文庫(kù)的構(gòu)建
采用CLONTECH公司的CreatorTM SMARTTM cDNA Library Construction Kit文庫(kù) 構(gòu)建試劑盒。
A. cDNA第一鏈合成(mRNA反轉(zhuǎn)錄)
以純化的mRNA為模板，利用cDNA構(gòu)建試劑盒提供的CDS III/ 3' Primer: 5' .ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG陽(yáng)d(T)30 N-1N-3' (N = A, C, G or T; N-l = A, G or C)禾口 SMARTTM IVoligonucleotide: 5' -AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GT GG CC ATTACG GCCGGG-3'，在PowerScript 逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成cDNA第一鏈。反 應(yīng)體系為10pL: lpL SMART IV Oligonucleotide ， l^LCDSIII引物混勻，72。C2min ， 冰浴2 min 。離心后分別加入以下試劑2單5X First-Stand Buffer、 1.0 DTT (20mM)、 1.0 dNTP Mix (10 mM)、 1.0 (iL PowerScript逆轉(zhuǎn)錄酶，反應(yīng)總體積為10.0pL。 42。C反應(yīng)60min，冰浴放置5 min，終止第一鏈合成。-2(TC保存。B. LD-PCR方法擴(kuò)增第二鏈
1. 95°C預(yù)熱PCR儀。
2. 以第一鏈cDNA為模板，向反應(yīng)管中依次加入以下試劑2pL cDNA第一鏈 合成產(chǎn)物、80|iL去離子水、IO^iL 10 *Advantage 2 PCR緩沖液、2pL 50*dNTP混合物、 2pL5' PCR引物、2^L CDS 111/3' PCR引物以及2pL 50* Advantage 2 Polymerase Mix,反應(yīng)體系為100pL。
3. 在PCR儀中按以下程序擴(kuò)增 95 °C 1分鐘；
②24個(gè)循環(huán)95 °C 15秒鐘，68 °C復(fù)性6分鐘。
4. 循環(huán)結(jié)束后，將離心管中合成的cDNA雙鏈進(jìn)行純化。
C. 大腸桿菌DH5ct感受態(tài)細(xì)胞的制備
1. 挑取大腸桿菌DH5(x單菌落劃線接種在新鮮LB瓊脂平板上，37'C過夜。挑取 單菌落接種到25mL的LB液體培養(yǎng)基中。
2. 以220-225rpm 37'C振搖過夜。取10mL過夜培養(yǎng)物接種到1L LB中。在37°C 劇烈振搖培養(yǎng)直到OD600達(dá)到0.5-0.7，冰浴lh。
3. 把菌液轉(zhuǎn)移到滅菌的預(yù)冷的離心瓶中。以4000rpm (2800xg) 4°C, 15min。去上 清液冰浴。輕輕地用1L冰預(yù)冷的10%甘油重懸沉淀。
4. 4000rpm (2800xg) 4°C， 15min，輕輕地用0.5L冰預(yù)冷的10%甘油重懸沉淀。
5. 4000rpm (2800xg) 4°C， 15min，輕輕地用250mL冰預(yù)冷的10%甘油重懸沉淀。
6. 4000rpm (2800xg) 4'C， 15min。用甘油重懸使最終體積達(dá)3.5mL。細(xì)菌密度大 約為3xl()w細(xì)胞/mL。等體積分裝為10(VL/份，迅速放于干冰中。在-80'C貯存感受態(tài)細(xì) 胞。
7. 用超螺旋載體如Pucl9進(jìn)行轉(zhuǎn)化驗(yàn)證感受態(tài)。應(yīng)產(chǎn)生至少0.5-lxlO'QcfuVg的細(xì)胞。
D. 連接以及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
1. 在微量離心管中加入0.3pLTaKaRapMD18-T載體、2.2^L牛蛙cDNA雙鏈溶 液、2.5^L4dH20，加入5pLSolutionl，全量為10 pL 。
2. 16'C連接過夜.
3. 全量(10pL)加入至100^LDH5a感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30分鐘。
5. 42'C熱擊90秒鐘后，冰浴2分鐘。6. 加入LB培養(yǎng)基800|aL,37°C緩慢振蕩培養(yǎng)(60-80轉(zhuǎn)/min) 45-60分鐘。
7. 取200 pL涂布于含有Amp+的LB培養(yǎng)基上37 °C培養(yǎng)16小時(shí)，形成單菌落。
8. 每個(gè)LB平皿用5mL LB液體培養(yǎng)基洗滌菌落，加30 %甘油凍存。構(gòu)建的 cDNA文庫(kù)大約含1 xlO 6個(gè)單獨(dú)克隆。
IV. 牛蛙凝集素基因克隆篩選
擴(kuò)增引物長(zhǎng)度為20個(gè)核苷酸，上游引物5' -ATGTTCACCWTGAAGAAATC-3 '， 下游引物為SMARTTM cDNA Library Construction Kit中的3' PCR Primer引物5' -ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCC-3 7 。
PCR反應(yīng)條件如下94'C30秒，5CTC30秒，72°C 2分鐘，共35循環(huán)，72°C 10 分鐘。
V. 牛蛙凝集素基因序列測(cè)定結(jié)果
提取質(zhì)粒并用M13+與M13-測(cè)序，儀器為ABI PRISM 3730全自動(dòng)核苷酸序列測(cè)定
儀，基因測(cè)序結(jié)果自5'端至3'端序列為
atgttcaccatgaagaaatccctgttactccttttcttccttgggaccatcaacttatct 60
ctttgtgagggacgacagagagatgtcgatcaagaagaaagaagagatgatccaggtgaa 120
aggaatgttcaaaaaaaaaaacgatttttaacatttcctggaatgactttcggtaaattg 180
ttgggaaaataaccagaaatgttgaaactttgaaaatggaattggaaatcstctgatgtg 240
gaatattatttggcta^atgctcaacagatgtcttataaaaataaataaatatgttgcat :〗00
330
牛蛙凝集素基因核苷酸序列為序列長(zhǎng)度為330個(gè)堿基，序列類型核酸，鏈數(shù) 單鏈，序列
種類CDNA ，來源牛蛙皮膚
編碼牛蛙凝集素的為第145-183位核苷酸，其氨基酸序列為
Phe Leu Thr Phe Pro Gly Met Thr Phe Gly Lys Leu Leu—AMIDATION
實(shí)施例2:
制備牛蛙凝集素
I、樣品的制備方法根據(jù)編碼牛蛙凝集素的基因推斷牛蛙凝集素的氨基酸序列，
用自動(dòng)多肽合成儀APEX396合成其全序列。通過HPLC反相C18柱層析脫鹽、純化。 II 、分子量測(cè)定采用電噴霧電離(electrospray ionization, ESI)，發(fā)射電壓為4.5Kv 。 III、純化的牛蛙凝集素用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度(流速L0mL/min;
8流動(dòng)相乙腈+水+TFA0.0P/。，梯度洗脫；色譜柱C18，檢測(cè)波長(zhǎng)220nm)，分子量測(cè)定采 用快原子轟擊質(zhì)譜法，等電聚焦電泳測(cè)定等電點(diǎn)，用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列 結(jié)構(gòu)。
牛蛙凝集素是由無(wú)尾兩棲類動(dòng)物牛蛙凝集素基因編碼的一種單鏈多肽，分子量為 1471.8道爾頓，等電點(diǎn)為8.75，多肽全序列一級(jí)結(jié)構(gòu)為苯丙氨酸一亮氨酸一蘇氨酸一 苯丙氨酸一脯氨酸一甘氨酸一蛋氨酸一蘇氨酸一苯丙氨酸一甘氨酸一賴氨酸一亮氨酸 一酰胺化(Phe Leu Thr Phe Pro Gly Met Thr Phe Gly Lys Leu Leu—AMID ATION)。
權(quán)利要求
1. 一種牛蛙凝集素基因，其特征在于cDNA由330個(gè)核苷酸組成，其自5′端至3′端序列為atgttcaccatgaagaaatccctgttactccttttcttccttgggaccatcaacttatct 60ctttgtgagggacgacagagagatgtcgatcaagaagaaagaagagatgatccaggtgaa 120aggaatgttcaaaaaaaaaaacgatttttaacatttcctggaatgactttcggtaaattg 180ttgggaaaataaccagaaatgttgaaactttgaaaatggaattggaaatcatctgatgtg 240gaatattatttggctaaatgctcaacagatgtcttataaaaataaataaatatgttgcat 300acaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa 330。
2、 一種牛蛙凝集素，其特征在于分子量為1471.8道爾頓，等電點(diǎn) 為8.75;編碼牛蛙凝集素的為145-183位核苷酸，其氨基酸序列為Phe Leu Thr Phe Pro Gly Met Thr Phe Gly Lys Leu Leu-AMIDATION 。
3、 權(quán)利要求2所述的牛蛙凝集素，用于制備抗菌詞料的添加劑。
4、 權(quán)利要求2所述的牛蛙凝集素，在藥物開發(fā)以及制備藥物靶向輸送 載體中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種牛蛙凝集素基因及其編碼的凝集素和在制藥中的應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的牛蛙凝集素基因是從構(gòu)建的牛蛙皮膚cDNA文庫(kù)中篩選到的，分子量為1471.8道爾頓，等電點(diǎn)為8.75，多肽全序列一級(jí)結(jié)構(gòu)為Phe Leu Thr Phe Pro Gly Met Thr Phe Gly Lys Leu Leu-AMIDATION，C-端為α-酰胺化修飾。編碼牛蛙凝集素的基因由330位核苷酸，其中編碼成熟肽的為第145-183位核苷酸。人工合成的牛蛙凝集素具有明顯的凝集兔紅細(xì)胞與抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用，由于分子量小、合成簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，利用本發(fā)明獲得的牛蛙凝集素能用于抗菌的飼料添加劑、藥物開發(fā)以及藥物靶向輸送載體中起導(dǎo)向作用的功能性分子。
文檔編號(hào)A61K38/10GK101508993SQ200910066648
公開日2009年8月19日 申請(qǐng)日期2009年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月18日
發(fā)明者新 馮, 孫長(zhǎng)江, 趙瑞利, 雷連成, 韓俊友, 韓文瑜 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)