專利名稱：蜈蚣有效部位及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥制藥領(lǐng)域，具體地，具體涉及蜈蚣有效部位及其提取方法和 應(yīng)用。
背景技術(shù)：
^k^k^M^^M-U^k Scolopendra subspinipes mutilans L. Koch 白勺〒 體。主產(chǎn)于江蘇、浙江、湖北、湖南、河南、陜西等地。春、夏二季捕捉，用竹片插入頭尾，繃直， 干燥。功效為息風(fēng)鎮(zhèn)痙，攻毒散結(jié)，通絡(luò)止痛。蜈蚣的主要功能主治熄風(fēng)鎮(zhèn)痙，攻毒散結(jié)，通 絡(luò)止痛。用于小兒驚風(fēng)，抽搐痙攣，中風(fēng)口堝，半身不遂，破傷風(fēng)，風(fēng)濕頑痹，瘡瘍瘰痢，毒蛇 咬傷中國(guó)藥典2005年版一部。傳統(tǒng)中藥以蜈蚣全蟲入藥，研究表明不同提取物所含活性物質(zhì)不同，藥效有明顯 差異。在體外抑菌方面，發(fā)現(xiàn)蜈蚣的酸性提取液對(duì)致病性真菌均有較強(qiáng)的抑制作用，而堿提 液和水提液效果不佳。不同提取液對(duì)致病性真菌和細(xì)菌的作用，3%醋酸提取液能強(qiáng)烈抑制 真菌生長(zhǎng)，但各提取物對(duì)細(xì)菌均無作用。蜈蚣水提取物表現(xiàn)出廣譜抗菌活性。在抗驚厥方 面，干燥蜈蚣水煎液對(duì)小鼠具有明顯中樞抑制作用。干燥蜈蚣醇提物、水提物對(duì)士的寧所致 驚厥均有不同程度的拮抗作用時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥2008年第19卷第11期.蜈蚣醇提取物和水 提取物部分藥理作用比較.周麗麗、黃迎春、仁超?，F(xiàn)有技術(shù)中提取蜈蚣一般為將蜈蚣粗粉經(jīng)醇提脫脂，所得殘?jiān)?_8°C水提，再減 壓濃縮后凍干得水提物凍干粉；所述凍干粉經(jīng)柱層析，蒸餾水洗脫，收集色帶D，將D部分減 壓濃縮后凍干；將D部分的凍干粉經(jīng)活性碳脫色后，得脫色凍干粉，再經(jīng)柱層析，蒸餾水洗 脫，UV220檢測(cè)，收集第二峰(主峰)，30-40°C旋轉(zhuǎn)濃縮、凍干，即得抑癌有效部分D-1。該方 法簡(jiǎn)便易行，有利于以蜈蚣為主藥的抗癌制劑的研究和開始。(中國(guó)專利zl01100288. 3)或以少棘蜈蚣為原料母體，清洗，干燥；研磨干燥后的原料母體得蜈蚣細(xì)粉；將蜈 蚣細(xì)粉經(jīng)水提、過濾得殘?jiān)僦貜?fù)水提，離心后取上清；減壓濃縮上清，經(jīng)醇提后得沉淀； 將沉淀經(jīng)硫酸銨分段鹽析后收集60%飽和度的沉淀物；將沉淀物經(jīng)DEAE-50纖維素離子交 換層析柱、洗脫、脫鹽后濃縮；將所得濃縮液經(jīng)S印hadex G-200柱純化，得蜈蚣多糖蛋白復(fù) 合物純品。制備方法易行，操作簡(jiǎn)便，原料來源廣泛，且應(yīng)用在制備抗腫瘤藥物中能有效殺 傷腫瘤細(xì)胞和提高機(jī)體免疫力，療效顯著。該多糖蛋白復(fù)合物在制備治療或預(yù)防腫瘤的藥 物中的應(yīng)用。(中國(guó)專利200710053587. 2)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種蜈蚣有效部位及其應(yīng)用。鑒于動(dòng)物類蛋白質(zhì)、粘多糖等大分子 物質(zhì)只有到達(dá)胃腸道后受消化酶、酸、堿等作用，方可被酶解或水解成小分子的肽、低聚糖 和其他小分子物質(zhì)，吸收入血而發(fā)揮藥效，故本實(shí)驗(yàn)?zāi)M胃和小腸的環(huán)境及消化過程，用胃 蛋白酶和胰蛋白酶仿生提取蜈蚣，使藥材中的大分子蛋白水解為小分子肽類以利于人體吸 收。APTT法、纖維蛋白原平板法為較常用的體外抗凝，溶纖試驗(yàn)方法，本實(shí)驗(yàn)以其為考察指標(biāo)，證明酶解工藝的可行性。具體為以水解度為指標(biāo)，單因素考察了仿生酶解法提取蜈蚣的 工藝條件；以APTT法、纖維蛋白原平板法為考察指標(biāo)，對(duì)仿生酶解法提取蜈蚣的工藝進(jìn)行 驗(yàn)證。結(jié)果證實(shí)，仿生酶解法凝血時(shí)間長(zhǎng)，抗血栓效果明顯。具體方法和結(jié)果通過以下實(shí)驗(yàn)證實(shí)1 材料1. 1藥材蜈蚣(由河北以嶺醫(yī)藥研究院有限公司提供)1.2試劑牛血清白蛋白(Sigma A7906，購(gòu)自北京環(huán)亞泰克生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公 司)；牛纖維蛋白原(Sigma F8630，購(gòu)自北京環(huán)亞泰克生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司)；胰蛋白 酶1 250(AmreSCO0458，購(gòu)自北京華美轉(zhuǎn)導(dǎo)科技有限公司)；胃蛋白酶1 10000(Sigma P7000，購(gòu)自北京環(huán)亞泰克生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司)；醫(yī)用注射性尿激酶(購(gòu)自北京市望 京醫(yī)院)；凝血酶(Sigma T4648，購(gòu)自北京環(huán)亞泰克生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司)；APTT試劑 10*1. 5ml (購(gòu)自上海太陽(yáng)生物試劑公司)；Protein Assay Dye Rgnt (Bio-red 5000006，北 京澤平科技有限責(zé)任公司)；三氯乙酸(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；乙醇(分析 純)；屈臣氏純凈水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。生理鹽水(稱取氯化鈉9g，加蒸餾水定容至1000ml，搖勻，即得)；人工胃液(取 鹽酸9ml，加蒸餾水稀釋成1000ml，即得)；人工腸液(取0. 2mol/L磷酸二氫鉀溶液250ml， 加0. 2mol/L氫氧化鈉溶液118ml，用水稀釋至1000ml，搖勻，即得)。1. 3儀器UV-2000型分光光度計(jì)；800B型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；ES-120 型電子分析天平(長(zhǎng)沙湘平科技發(fā)展有限公司)；恒溫水浴鍋(余姚市東方電工儀器廠)； DZ-1BC型真空干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)。1. 4動(dòng)物健康日本大耳白兔(雄性)，體重約2Kg(均由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技 術(shù)有限公司提供)，符合國(guó)家健康一級(jí)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)。2方法與結(jié)果2. 1以水解度為指標(biāo)，考察仿生酶解工藝工藝步驟如下將lg蜈蚣細(xì)粉置于50ml具塞圓底燒瓶中，加入20ml人工胃液，密 閉，于37°C水浴恒溫作用30min，分別加入一定量胃蛋白酶酶解一定時(shí)間，將酶解液置85°C 恒溫水浴作用15min，流水冷卻至室溫后，以4200r/min離心15min，取上清液，即得，殘?jiān)?60°C真空干燥稱重，得干燥殘?jiān)?。稱定胃蛋白酶解后的殘?jiān)?. 0g，置50ml具塞圓底燒瓶中，加入20ml人工腸液，密 閉于37°C水浴恒溫作用30min，分別加入一定量胰蛋白酶酶解一定時(shí)間，將酶解液置85°C 恒溫水浴作用15min，流水冷卻至室溫后，以4200r/min離心15min，取上清液，即得。以水解度為指標(biāo)，進(jìn)一步確定酶底比和酶解時(shí)間。2. 1.1水解度測(cè)定方法2. 1. 1. 1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備染色液的配制準(zhǔn)確量取Bio-Rad Protein Assay 50ml，加入蒸餾水稀釋定容至 250ml，濾去不溶性物質(zhì)即得，置室溫下可保存6個(gè)月。牛血清白蛋白(BSA) lmg/ml的配制準(zhǔn)確稱取10mg BSA，蒸餾水定容于10ml，其濃 度為lmg/ml (1000mg/L)，置冰箱保存。精密吸取BSA溶液0.02、0.06、0.08、0. lml分別置于10ml試管中，依次用蒸餾水補(bǔ)至0. 1ml，加入5ml考馬斯亮藍(lán)染色液，漩渦混合器震蕩混勻。以蒸餾水為空白對(duì)照，于 595nm處測(cè)定吸光度。以牛血清白蛋白濃度(mg/ml)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo) 準(zhǔn)曲線，得線性方程:y = 0. 9947x+0. 0238 (r = 0. 9986)結(jié)果表明，BSA在0 lmg/ml范 圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。見表1。表1測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 2. 1. 1.2水解度測(cè)定法水解度計(jì)算公式DH= xioo%式中N2為藥材酶解液加入20% TCA后測(cè)得的可溶性蛋白量(g/L)，即樣品2及樣 品4 為藥材酶解前加入20% TCA測(cè)得的可溶性蛋白量(g/L)-Ig藥材細(xì)粉加入10ml20% TCA，過濾，所得上清液；NO為不同酶解工藝提取總蛋白量(g/L)，即樣品1或樣品3。胃蛋白酶酶解工藝篩選2. 1.2. 1酶底比考察結(jié)果見表2表2胃蛋白酶酶解酶底比考察結(jié)果 結(jié)論隨著酶底比增大，吸光度基本呈上升趨勢(shì)；4%、5%、％酶底比的吸光度較 高但差別不大，從節(jié)約成本考慮，確定酶底比為4%。2. 1. 2. 2酶解時(shí)間考察結(jié)果見表3表3胃蛋白酶酶解的酶解時(shí)間考察結(jié)果 結(jié)論隨著酶水解時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度呈上升趨勢(shì)；但考慮到酶解時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)影響到下 一步的操作，及會(huì)發(fā)生變質(zhì)等問題，故酶解時(shí)間確定為4h。2. 1.3胰蛋白酶酶解工藝篩選2. 1. 3. 1蜈蚣胰蛋白酶酶底比考察結(jié)果見表4
表4胰蛋白酶酶解的酶底比考察結(jié)果
酶解時(shí)間(h)~~ NOfIN2值水解度(％)
3.00
0. 6570.6073.99
4.00
0. 6520.6098.66
5.00
0.6330.61225.22
6.00
0.6420.61527. 18
7. 00
0. 6190.60928. 98結(jié)論隨著酶底比增大，吸光度呈上升趨勢(shì)；酶底比在5.0%、6.0%、7.0%時(shí)吸光 度增加趨勢(shì)平緩。為節(jié)約成本選擇酶底比為5. 0%較為合適。2. 1. 3. 2酶解時(shí)間考察結(jié)果見表5表5胰蛋白酶酶解的酶解時(shí)間考察 隨著酶水解時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度呈上升趨勢(shì)；但考慮到酶解時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)影響到下 一步的操作，及會(huì)發(fā)生變質(zhì)等問題，故酶解時(shí)間確定為4h。綜上，以水解度為指標(biāo)，通過單因素考察，蜈蚣的仿生酶解工藝為蜈蚣藥材細(xì)粉 加入人工胃液(固液比1 20)，密閉，于37°C恒溫水浴作用30min后，加入4.0%胃蛋白酶 水解4h，將酶解液置于85°C恒溫水浴作用15min，冷卻至室溫，以4200r/min離心15min，取 上清液，干燥得蜈蚣胃蛋白酶酶解物；沉淀干燥，繼加入20倍量人工腸液，密閉，于37°C恒 溫水浴作用30min后，加入5%胰蛋白酶水解4h，將酶解液于85°C恒溫水浴作用15min，冷 卻至室溫，以4200r/min離心15min，取上清液，干燥得蜈蚣胰蛋白酶酶解物。2. 2復(fù)合酶解法按照上述仿生酶解法的條件，對(duì)蜈蚣進(jìn)行復(fù)合酶解作為仿生酶解法的對(duì)照。稱取2g蜈蚣藥材細(xì)粉于50ml圓底燒瓶，加入40ml人工胃液，密閉于37°C水浴鍋 30min后加入60mg胃蛋白酶水解，3h后用Imol/mlNaOH溶液調(diào)節(jié)酶解液的pH = 6. 8，加入 IOOmg胰蛋白酶酶解4h，于85°C水浴滅酶15min，4200r/min離心15min，取上清液，60°C真 空干燥稱重，得干燥復(fù)合酶解物。3藥效實(shí)驗(yàn)3. 1樣品制備稱取以上各種提取方法所得干燥物適量，加入生理鹽水制成每320μ 1生理鹽水 含有0. 25g原藥材的樣品。3. 2APTT 法3. 2. 1血漿的制備取大耳白兔耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉麻醉后，頸動(dòng)脈取血，3. 8 %枸櫞酸鈉抗凝 (1 9)，混勻后以3000r/min，離心15min，取上清液，分離出貧血小板血漿(PPP)。3. 2. IAPTT時(shí)間的測(cè)定取PPP100 μ 1于測(cè)試槽中，加樣品液10 μ 1 (預(yù)溫5min)和APTT試劑100 μ 1 (預(yù) 溫IOmin)，孵育5min后加入CaC12100 μ 1 (預(yù)溫15min)，同時(shí)計(jì)時(shí)，用針尖撥動(dòng)溶液，當(dāng)有 絲狀凝結(jié)物被針挑起時(shí)，記錄時(shí)間。以生理鹽水為陰性對(duì)照(每個(gè)樣品平行測(cè)定6份)，結(jié)果見表 表6蜈蚣酶解法APTT抗凝藥效考察(η = 6) 注與生理鹽水組相比P < 0. 05。結(jié)論各樣品都能顯著延長(zhǎng)APTT時(shí)間，其中仿生酶解組比復(fù)合酶解組抗凝下效果 更顯著，證明仿生酶解方案可行。3. 3纖維蛋白原平板法3. 3. 1試液的配制磷酸緩沖液(PBS)稱取3. 12g磷酸二氫鈉，加蒸餾水定容到100ml，即得A液； 稱取磷酸氫二鈉7. 1632g，加蒸餾水定容到100ml，即得B液；使用時(shí)，取A液760 μ 1、B液 3240 μ 1加入76ml生理鹽水，即得磷酸緩沖液。纖維蛋白原溶液稱取纖維蛋白原0. 3g加入60mlPBS，振搖，溶解，即得。3. 3. 2纖維蛋白平板的制備在平皿內(nèi)加入9ml 5g · L-I的纖維蛋白原溶液，再加入2 X 103 μ · L-I的凝血酶 溶液1ml，立即打旋混勻大約10s，即形成Imm厚的纖維蛋白凝塊，在平皿上蓋加濾紙，水平 處放置，凝固后形成纖維蛋白平板。3. 3. 3測(cè)定步驟將樣品液、尿激酶(6X105 μ · L-1)和生理鹽水各10 μ 1分別點(diǎn) 在纖維蛋白平板上，各點(diǎn)間距大于1. 5cm。置纖維蛋白平板于濕盒內(nèi)，放入37°C烘箱中，4h 后觀察有無溶解圈，并測(cè)量溶解圈的直徑，計(jì)算溶解圈面積，以溶解圈面積大小衡量纖溶活 性的大小。結(jié)果見表7。表7纖維蛋白平板溶栓實(shí)驗(yàn)結(jié)果
結(jié)果表明仿生酶解法所得的胃酶酶解部分和胰酶酶解部分有明顯溶解圈，其中胃 酶酶解部分溶解圈最大，各個(gè)樣品在熱板上均無溶解圈，證明仿生酶解的工藝方案可行。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 稱取2g蜈蚣藥材細(xì)粉于50ml圓底燒瓶，加入40ml人工胃液，密閉于37°C水浴鍋 30min后加入60mg胃蛋白酶水解，3h后用Imol/mlNaOH溶液調(diào)節(jié)酶解液的pH = 6. 8，加入 IOOmg胰蛋白酶酶解4h，于85°C水浴滅酶15min，4200r/min離心15min，取上清液，60°C真 空干燥稱重，得干燥復(fù)合酶解物。結(jié)果纖維蛋白原平板實(shí)驗(yàn)結(jié)果是通過1000萬(wàn)長(zhǎng)焦數(shù)碼相機(jī)拍照，輔以作圖工具 ipwin32測(cè)量所得。減少誤差，提高精確度。試驗(yàn)結(jié)果表明蜈蚣仿生酶解法所得提取物均能顯著延長(zhǎng)APTT作用時(shí)間，纖維蛋 白原平板實(shí)驗(yàn)表明均有明顯溶解圈；其中仿生酶解法胃酶酶解部分溶解圈最大，APTT時(shí)間 最長(zhǎng)，證明仿生酶解工藝可行。由于目前動(dòng)物藥多以全粉入藥，存在著劑量大、易造成微生物污染、用藥劑量不當(dāng) 而引起敏反應(yīng)、急性肝腎功能損害、溶血反應(yīng)、中樞抑制和致畸等毒副作用。本發(fā)明提供了 蜈蚣進(jìn)行抗凝、抗血栓活性成分的分離純化方法，可以有效的解決以上問題。
權(quán)利要求
一種蜈蚣有效部位提取物，可通過以下方法制備蜈蚣用人工胃液加入胃蛋白酶酶解，殘?jiān)D(zhuǎn)入人工腸液，加入胰蛋白酶酶解，得到蜈蚣復(fù)合酶解物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蜈蚣有效部位提取物，該提取物的制備方法特征在于該方法 包括下列步驟a.蜈蚣凈選，粉碎成細(xì)粉；b.將蜈蚣細(xì)粉加入人工胃液，密閉，于37°C恒溫水浴30min，加入胃蛋白酶水解4小時(shí)， 將酶解液置于85°C恒溫水浴作用15min，冷卻至室溫，離心，取上清液，干燥得蜈蚣胃蛋白 酶酶解物；c.將步驟b)所得的蜈蚣胃蛋白酶酶解物沉淀干燥，加入人工腸液，密閉，于37°C恒溫 水浴作用30min后，加入胰蛋白酶水解，將酶解液于85°C恒溫水浴作用15min，冷卻至室溫， 離心15min，取上清液，干燥得蜈蚣胰蛋白酶酶解物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蜈蚣有效部位提取物，該提取物的制備方法特征在于該方法 包括下列步驟a.蜈蚣凈選，粉碎成細(xì)粉；b.將蜈蚣細(xì)粉加入重量體積比為1 20的人工胃液中，密閉，于37°C恒溫水浴30min， 加入4. 0%胃蛋白酶水解4小時(shí)，將酶解液置于85°C恒溫水浴作用15min，冷卻至室溫，以 4200r/min離心15min，取上清液，干燥得蜈蚣胃蛋白酶酶解物；c.將步驟b)所得的蜈蚣胃蛋白酶酶解物沉淀干燥，繼加入20倍量人工腸液，密閉， 于37°C恒溫水浴作用30min后，加入5%胰蛋白酶水解4h，將酶解液于85°C恒溫水浴作用 15min，冷卻至室溫，以4200r/min離心15min，取上清液，干燥得蜈蚣胰蛋白酶酶解物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蜈蚣有效部位提取物在制備抗凝血和溶栓的藥物中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于其中所述的藥物的劑型為膠囊劑、片劑、顆 粒劑、散劑、口服液或丸劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蜈蚣提取的有效部位，還公開了這種有效部位的制備方法，它是蜈蚣通過仿生酶解法制得。同時(shí)，公開了該有效部位在制備抗凝血和溶栓的藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K35/64GK101862349SQ20091007413
公開日2010年10月20日 申請(qǐng)日期2009年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月14日
發(fā)明者張玉杰, 王玉蓉, 許文博, 趙韶華, 黃能聽 申請(qǐng)人:河北以嶺醫(yī)藥研究院有限公司