專利名稱：一種治療過敏性疾病的藥物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種通過脫敏療法來治療木霉過敏 性疾病的藥物及其制備方法。
背景技術(shù)：
變態(tài)反應(yīng)性疾病被世界衛(wèi)生組織(WHO)認(rèn)為是當(dāng)前世界性的重大衛(wèi)生學(xué) 問題，世界各國(guó)變態(tài)反應(yīng)性疾病的總發(fā)病率約為10-20%,包括過敏性哮喘、 過敏性鼻炎、過敏性皮炎及過敏性眼結(jié)膜炎等，是臨床常見病、多發(fā)病。在 引起變態(tài)反應(yīng)性疾病眾多的變應(yīng)原中，大氣致敏真菌是導(dǎo)致變態(tài)反應(yīng)疾病最 重要的因素之一。
真菌孢子是戶外空氣中最多的氣傳生物微粒。雖然它們的體積比花粉小 得多，但在空氣中的總體積幾乎與花粉相等。正常人日常生活中，每天約要 與IOO種不同的真菌接觸。真菌孢子?？梢l(fā)變態(tài)反應(yīng)性疾病，其中包括季 節(jié)性發(fā)作的過敏性鼻炎和哮喘以及職業(yè)性哮喘。
自從JohnBostock(1889)首次提出花粉癥以來，國(guó)內(nèi)外有關(guān)學(xué)者在對(duì)各地 變應(yīng)原做了許多的調(diào)查、抗原分析、純化等工作。近年來，隨著變態(tài)反應(yīng)學(xué)、 分子生物學(xué)及免疫學(xué)飛速發(fā)展，研究者對(duì)真菌變應(yīng)原研究取得了很大iiJL
真菌變應(yīng)原致敏蛋白組分的研究是真菌變態(tài)反應(yīng)研究的基礎(chǔ)。自上個(gè)世 紀(jì)七十年代Reed、 Salvaggio率先開展真菌變應(yīng)原致敏蛋白組分的研究以來， 截至2006年2月20日，世界免疫學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)(IUIS)共命名了 3個(gè)亞門、9個(gè) 目、12個(gè)屬、21個(gè)種的真菌88個(gè)致敏蛋白組分。真菌變應(yīng)原之間存在交叉 反應(yīng)性。在臨床上真菌過敏患者往往不是僅對(duì)一種、而是同時(shí)對(duì)多種真菌過敏。國(guó)內(nèi)外有對(duì)鏈格孢變應(yīng)原、芽枝菌變應(yīng)原、根霉變應(yīng)原、頭孢霉變應(yīng)原、 匍柄霉變應(yīng)原的研究，但是木霉變應(yīng)原的制備鮮有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供一種治療過敏性疾病(支氣管哮喘、過敏性鼻炎
等)的藥物，即木霉(7Wc/w&rma)變應(yīng)原及其制劑。該藥物利用脫敏治療 的原理，通過注射由小至大劑量的變應(yīng)原，使病人逐步提高對(duì)外來變應(yīng)原耐 受性，從而達(dá)到減輕發(fā)作或控制發(fā)作的目的。本發(fā)明木霉變應(yīng)原及其制劑適 于治療速發(fā)型過敏性疾病。
本發(fā)明治療過敏性疾病藥物中的木霉是指康氏木霉(rnc/20Am2a r丄om"g/'),康氏木霉屬于真菌門、半知菌亞門、絲孢綱、叢梗孢目、木霉 屬的一種。康氏木霉菌落廣鋪、平伏；產(chǎn)孢區(qū)域黃綠色；邊緣不齊；背面淺 綠色；光學(xué)顯微鏡下，菌絲對(duì)生或互生，有束生、對(duì)生、互生或單生瓶形小 梗，分生孢子由小梗生出，橢圓形、卵形、倒卵形，近無色；大小為3.5*1.9-3.2(pm)。
本發(fā)明中治療由木霉引起的過敏性疾病的藥物，可以是康氏木霉浸提液 變應(yīng)原、康氏木霉與其它空氣真菌組合浸提液變應(yīng)原、康氏木霉浸提液與藥 物上可接受載體組合變應(yīng)原、或者康氏木霉與其它空氣真菌浸提液以及藥物 上可接受載體組合變應(yīng)原。其它空氣真菌包括鏈格孢菌04temar/a or/fe/7wtf")、 ^^氏霉(//6/附/"欲0 / 6>;^// soroh"朋w附)、沖支孑包芽才支菌(C7a(icw;7on'Mw c/at/os/^on'oicfes)、 大抱斗支孑包菌(C7acfcw/ oh"附/wacrocar/ww)、 襄孑包甸柄$ 60^7ayM附)、彎孑包菌(Cwrvw/ar/a /w"oto)、 匍枝才艮霉(朋/zo/ zw Wo/owi/^r)、 總狀共頭霉(S;/wce/ /2a/a對(duì)n/加race附osw附)、總狀毛霉(Mwcor rarcemow加)、產(chǎn)黃青霉(尸em'c/〃/wm c/^o^oge"w/w)、，累、曲霉(As/7reg/〃MS w/ger)、 分枝犁頭霉046w力a ramosa)、宛氏擬青霉(Paec!7owyces vanof()、叢梗孢霉(Mom7/a 57'fc/ A/z'")、 4豆帚霉(Scopw/an'o/W7'51 6rev/caw//51)、 禾谷鐮刀菌(Ftwan'w附 grar附/wean/附)、粗壯了員套審(/4crof/2ec/M附ro6"5TM附)、3求,繁、孑包菌(A^gros/ orar sp/ a^7'ca)、專紅輪枝孑包菌(reW/c/〃/Mm /a&h"'ww)、頂孢頭孢霉(Ce7 /^/os/70〃.ww c/2^A oge"w/M)、 5求形阜孢菌(尸a/^/ah" ^/2aemspenMawM附)、疾蠕孑包菌 (//e&A"os/ oriw附a〃h)、 i求形單頭孢霉(Mowofoy/ orar ^ST /2aeA"Oce/ /2a/a)、玉米黑、灃分 菌([/勸7ago wo^fo)、麥散黑4分菌([/幼7"go wM^af)、面包酵母(&7cc/wra附;/cey cerev^s/ae)、 灰葡萄孑包菌(Bo^yto e/"erea)、 黃球瘤孑包菌(Se/^dow/ww c/ o^o^erww附)、黑附球霉(五/ /coco/附"/grw附)等；藥物上可才矣受的栽體包括 但不限于溶媒、氫氧化鋁凝膠、甘油、磷酸鹽緩沖液。
本發(fā)明康氏木霉變應(yīng)原制劑可以是任何適于將康氏木霉變應(yīng)原給予患者 治療過敏性疾病的劑型，包括注射劑、片劑、膠嚢、舌下含服劑、口服液、 氣霧劑、鼻腔劑、貼劑、滴丸劑或噴霧等。
本發(fā)明另一目的是提供了上述空氣真菌變應(yīng)原及其制劑的制備方法。 本發(fā)明公開的木霉變應(yīng)原及其制劑通過下述技術(shù)方案來獲得 木霉變應(yīng)原原材料一般可通過收集、培養(yǎng)、篩選、分離培養(yǎng)、收獲、去脂、 粉碎等步驟制備。
l)收集通常采用的方案是空氣一。優(yōu)選的方案是在四周沒有建筑物 阻擋的樓頂，離地面15 18米高，裝有固體培養(yǎng)基的培P放置空氣中1~ 3分鐘，然后帶回培養(yǎng)。培養(yǎng)基可選自蛋白胨-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)、察式培養(yǎng)基、豆粉-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、葡萄糖天門冬素培 養(yǎng)基。優(yōu)選培養(yǎng)基為蛋白胨-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，其組成為蛋白胨10g，葡萄 糖40g，瓊脂25g，水1000ml。先將瓊脂加入1000ml水中混勻加熱溶解后加 入蛋白胨和葡萄糖，充分混合均勻后趁熱分裝在100ml的管內(nèi)，12rC、30min 滅菌后，在超凈臺(tái)中倒入培養(yǎng)亞中，每個(gè)培養(yǎng)亞20 ~ 30ml,蓋好亞蓋，待培 養(yǎng)基冷卻凝固后即可用于空氣中曝皿。按上述同樣方法趁熱取5ml培養(yǎng)基加
6入18"50mm中，121°C、 30min滅菌后取出做成斜面?zhèn)溆谩?br> 2 )培養(yǎng)培養(yǎng)溫度18 ~ 30°C ，培養(yǎng)時(shí)間72 ~ 108h。優(yōu)選培養(yǎng)溫度20 ~ 25 °C,培養(yǎng)時(shí)間72~96h。
3) 篩選對(duì)生長(zhǎng)成熟真菌的菌落外觀鑒定和在顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)鑒定， 找出所需的菌種康氏木霉。首先對(duì)菌落的生長(zhǎng)速度、顏色、表面、形態(tài)、質(zhì) 地、邊緣進(jìn)行觀察，康氏木霉在例如馬玲薯-葡萄糖瓊脂的培養(yǎng)基上，于25。C 在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，菌落直徑為3.4cm;菌落廣鋪、平伏；產(chǎn)孢區(qū)域黃綠色； 邊緣不齊；背面淺綠色。對(duì)有其外觀形態(tài)的菌落在光學(xué)顯微鏡下觀察，菌絲 對(duì)生或互生，有束生、對(duì)生、互生或單生瓶形小梗，分生孢子由小梗生出， 橢圓形、卵形、倒卵形，近無色；大小為3.5*1.9 ~3.2(拜)。
4) 分離培養(yǎng)把康氏木霉接種到斜面內(nèi)18 25。C進(jìn)行培養(yǎng)48 72h，菌 體成熟后光學(xué)顯微鏡下鑒定不含其它微生物后，接種到液體培養(yǎng)基，在18~ 30。C培養(yǎng)45 80天，光學(xué)顯微鏡下鑒定以不含其它微生物為合格。培養(yǎng)的優(yōu) 選條件為20 25。C培養(yǎng)45-60天。液體培養(yǎng)基可選自蛋白胨-葡萄糖液 體培養(yǎng)基或馬鈴薯-葡萄糖液體培養(yǎng)基、察式培養(yǎng)基、豆粉-葡萄糖液體培養(yǎng)基、 葡萄糖天門冬素培養(yǎng)基。優(yōu)選培養(yǎng)基為馬鈴薯-葡萄糖液體培養(yǎng)基，其組成為 馬鈴薯2000g，葡萄糖120g，水5000ml;先將馬鈴薯去皮切碎，加水煮沸20min， 用多層紗布過濾，用水加至原量，再加入葡萄糖，充分溶解后分裝于三角燒 瓶?jī)?nèi)，121°C、 30min滅菌后，冷卻至室溫，在超凈臺(tái)中4秦種康氏木霉進(jìn)行培 養(yǎng)。
5 )收獲對(duì)長(zhǎng)成的真菌進(jìn)行菌體收集，收集的菌體用1 ~ 3倍體積的70 ~ 75%乙醇?xì)⑺谰w，2-8。C自然風(fēng)干；優(yōu)選方案為收集的菌體用2倍體積 的70~75%乙醇?xì)⑺谰w，4 6。C自然風(fēng)干。
6)去脂加入2-3倍體積的有機(jī)溶劑進(jìn)行去脂；有機(jī)溶劑包括乙醚、 石油醚、苯、二甲苯、甲苯、丙酮、無水乙醇、甲醇等，最佳方案為丙酮、曱醇、石油醚。傾倒出上層有機(jī)溶劑，保留下層固體，反復(fù)幾次。在2 8。C 自然風(fēng)千，沒有刺激性氣味為止。
7)粉碎用高速萬能粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，優(yōu)選粉碎后過180目分樣篩。
8 )保存2 ~ 8'C密封避光保存。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，依據(jù)上述制備方法，結(jié)合本領(lǐng)域常用技術(shù) 和方法，增加、減少、替代、合并、拆分上述制備木霉變應(yīng)原原材料步驟， 或?qū)γ坎剿玫脑噭┗驐l件進(jìn)行一定的改變，也能實(shí)現(xiàn)制備木霉變應(yīng)原原材 料的目的，同樣屬于本發(fā)明范圍之內(nèi)。
其他空氣真菌變應(yīng)原原材料可采用與木霉變應(yīng)原原材料制備方法類似 方法制備。
康氏木霉變應(yīng)原浸提液可通過對(duì)康氏木霉變應(yīng)原原材料進(jìn)行提取、過濾 制備。
1) 提取康氏木霉變應(yīng)原原材料與無菌7jC按1: 10-30 (W/V)的比例 混合，提取48 ~ 80小時(shí)，提取過程中每天攪拌或振蕩不低于2小時(shí)，溫度2 ~ 8'C;或者把混合液經(jīng)超聲破碎或細(xì)胞破^PH義破碎后，浸提12~24小時(shí)。優(yōu) 選方案為康氏木霉變應(yīng)原原材料與無菌水按l: 25混合，提取60~72小時(shí)， 每天振蕩3~5小時(shí)，溫度4 6。C。
2) 粗濾采用濾紙去渣。
3) 除菌過濾0.22拜膜超濾膜正壓過濾或錯(cuò)流除菌過濾。最佳方案為 0.22nm膜+0.45拜紙板錯(cuò)流除菌過濾，得到變應(yīng)原浸提液。
測(cè)定其浸提液蛋白含量濃度，控制藥物的效價(jià)。浸提液蛋白含量可采用 Bradford法測(cè)定。
康氏木霉變應(yīng)原可以采用藥劑學(xué)常規(guī)制備方法制備成注射劑、片劑、膠 嚢、舌下^^服劑、口^^液、氣霧劑、鼻腔劑、貼劑、滴丸劑或噴霧劑等。 優(yōu)選康氏木霉變應(yīng)原制備成凍干粉針劑或者注射液?？凳夏久棺儜?yīng)原凍干粉針劑的制備變應(yīng)原浸提液在2 8。C下蒸發(fā)濃縮 到原體積的8 ~ 20%,濃縮液加入5 ~ 10%藥物可接受載體進(jìn)行冷凍干燥，得 到凍干粉針劑。藥物可接受載體選自甘露醇、葡萄糖、吐溫、丙二醇等糖 醇類物質(zhì)，得到凍千粉針劑。優(yōu)選方案為變應(yīng)原浸提液在4 6r下蒸發(fā)濃縮 到原體積的10%,濃縮液加入5%甘露醇，分裝成1/100w/v至1/1，000，000w/v 范圍內(nèi)多個(gè)濃度的制劑，對(duì)濃縮液進(jìn)行冷凍千燥，得到凍千粉針劑。
康氏木霉變應(yīng)原注射液的制備將上述將凍干粉針劑用浸提液等體積的 生理鹽水稀釋，按照所需濃度，稀釋成1/100至1/1,000，000范圍內(nèi)的多個(gè)濃 度的制劑，得注射劑。
康氏木霉變應(yīng)原制劑可由醫(yī)師根據(jù)患者種族、年齡、體重和大致疾病狀 況、給藥方式等因素確定對(duì)病人有益的劑量進(jìn)行施用。
本發(fā)明的再一發(fā)明目的是公開上述木霉變應(yīng)原及其制劑在治療過敏性病 癥中的應(yīng)用。
本發(fā)明可用于過敏性支氣管譯喘、過敏性鼻炎等的治療。治療時(shí)，對(duì)患 者先使用較低濃度木霉變應(yīng)原制劑進(jìn)行治療，然后逐步增加制劑濃度，最后 用較高的濃度制劑維持治療。由于不同濃度的藥物^A體吸收途徑不一樣， 所以治療時(shí)使用的初始濃度和維持濃度也不同。
用本發(fā)明木霉變應(yīng)原制劑對(duì)21例變態(tài)反應(yīng)性鼻炎和/或哞喘患者進(jìn)行注射 脫敏治療12 - 18個(gè)月，其癥狀明顯改善，總有效率為95.2%.
本發(fā)明制劑制備方法工藝簡(jiǎn)單、原材料價(jià)廉易得，可大規(guī)才莫工業(yè)化生產(chǎn)。


圖1為Bradford法測(cè)空氣中康氏木霉真菌變應(yīng)原浸提液中蛋白含量的標(biāo)準(zhǔn)曲 線。
9具體實(shí)施方式
實(shí)施例l康氏木霉變應(yīng)原原材料的制備
1) 在四周沒有建筑物阻擋的樓頂，離地面17米高，裝有固體培養(yǎng)基的 培^m放置空氣中3分鐘后，帶回實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。蛋白胨-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 蛋白胨10g,葡萄糖40g，瓊脂25g，水1000ml。先將瓊脂加入1000ml水中 混勻加熱溶解后加入蛋白胨和葡萄糖，充分混合均勻后趁熱分裝在100ml 的管內(nèi)，121°C、 30min滅菌后，在超凈臺(tái)中倒入培^ja中，每個(gè)培^L20-30ml,蓋好皿蓋，待培養(yǎng)基冷卻凝固后即可用于空氣中^inr。按上述同樣方 法趁熱取5ml培養(yǎng)基加入18n50mm的試管中，121°C、 30min滅菌后取出做 成斜面?zhèn)溆谩?br> 2) 把空氣膝孤在25。C下培養(yǎng)72h。
3) 對(duì)生長(zhǎng)成熟的菌落外觀和在顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)鑒定，找出所需的菌 種康氏木霉。菌落直徑為3.4cm;菌落廣鋪、平伏；產(chǎn)孢區(qū)域黃綠色；邊緣 不齊；背面淺綠色。康氏木霉的菌絲對(duì)生或互生，有束生、對(duì)生、互生或單 生瓶形小梗，分生孢子由小梗生出，橢圓形、卵形、倒卵形，近無色；大小 為3.5*1.9 ~3.2(—。
4) 把篩選到的康氏木霉接種到斜面內(nèi)25。C進(jìn)行培養(yǎng)72h，菌體成熟后 光學(xué)顯微鏡下鑒定不含其它微生物為合格菌種，接種到馬鈴薯-葡萄糖液體 培養(yǎng)基，室溫培養(yǎng)60天，光學(xué)顯微鏡下鑒定以不含其它微生物為合格。馬 鈴薯-葡萄糖液體培養(yǎng)基配方馬鈴薯2000g,葡萄糖120g,水5000ml;先 將馬鈴薯去皮切碎，加水煮沸20min，用多層紗布過濾，將波浪加至原量， 再加入葡萄糖，充分溶解后分裝于三角燒瓶?jī)?nèi)，121°C、 30min滅菌后，冷 卻至室溫。
5) 對(duì)長(zhǎng)成的真菌進(jìn)行菌體收集，收集的的菌體用2倍體積的70~75% 乙醇?xì)⑺谰w，4。C自然風(fēng)千。
106)加入2倍體積的石油醚傾倒出上層有機(jī)溶劑，保留下層固體，2~8°C 自然風(fēng)干，殘留粉未中沒有刺激性氣味為止。
7 )粉碎粉碎后過180目分樣篩。
8 )保存2 ~ 8°C密封避光保存。
實(shí)施例2注射用木霉變應(yīng)原制劑的制備
1) 取康氏木霉變應(yīng)原原材料，與無菌水按照1: 25 (W/V)的比例混 合。提取72小時(shí)，提取過程中每天攪拌3小時(shí)，溫度4。C。
2) 濾紙去渣。
3) 0.22pm膜+0.45Mm紙板錯(cuò)流除菌過濾，得到變應(yīng)原浸提液。測(cè)定其 浸提液蛋白含量濃度，控制藥物的效價(jià)。(蛋白含量測(cè)定見實(shí)施例5 )
4 )4'C下蒸發(fā)濃縮到原體積的10°/。，濃縮液加入5。/。甘露醇進(jìn)^f于冷凍千燥， 得到凍干粉針劑。
實(shí)施例3 鏈格抱菌變應(yīng)原原材料的制備
1) 四周沒有建筑物阻擋的樓頂，離地面17米高，裝有蛋白胨一葡萄糖 瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿放置空氣中1分鐘，實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。
2) 把空氣曝i在25t:下培養(yǎng)72h。
3) 對(duì)生長(zhǎng)成熟的菌落外觀和在顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)鑒定，找出所須的菌 種鏈格孢菌。鏈格孢菌在馬玲薯一葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，于25。C在培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)72h，菌落直徑為2.9cm;有腐敗氣味；菌落細(xì)絨狀；褐色；邊緣整 齊；背面褐黑色。對(duì)有其特征的菌落在光學(xué)顯微鏡下觀察，對(duì)菌絲特征、孢 子特征進(jìn)行觀察，分生孢子梗短，不分支，有隔，褐綠色；分生孢子為倒棒 狀，表面有3~5橫隔和縱隔，壁磚樣結(jié)構(gòu)，孢子末端有一喙?fàn)钗?，褐色?大小不規(guī)則，大小為30~36*4~15(nm)。
4) 鏈格孢菌接種到斜面內(nèi)25。C進(jìn)行培養(yǎng)72h，菌體成熟后光學(xué)顯微鏡下鑒定不含其它微生物為合格菌種，接種到馬鈴薯-葡萄糖液體培養(yǎng)基，室
溫培養(yǎng)60天，光學(xué)顯微鏡下鑒定以不含其它微生物為合格。
5 )對(duì)長(zhǎng)成的真菌進(jìn)行菌體收集，收集的的菌體用2倍體積的70 ~ 75%
乙醇?xì)⑺谰w，4。C自然風(fēng)干。
6)加入2倍體積的丙酮傾倒出上層有機(jī)溶劑，保留下層固體，4'C自然
風(fēng)千，殘留粉未中沒有刺激性氣《 未為止。
7 )粉碎粉碎后過180目分樣篩。
8 )保存2 ~ 8°C密封避光保存。
實(shí)施例4 鏈^&菌變應(yīng)原制劑的制備
1)取鏈格孢菌變應(yīng)原原材料，與無菌7jc按照1: 25 (W/V)的比例混 合。提取72小時(shí)，提取過程中每天攪拌3小時(shí)，溫度4。C。 2 )濾紙去渣。
3) 0.22nm膜+0.45拜紙板錯(cuò)流除菌過濾，得到變應(yīng)原浸提液。測(cè)定其 浸提液蛋白含量濃度，控制藥物的效價(jià)。
4) 4。C下蒸發(fā)濃縮到原體積的10%,濃縮液加入5%甘露醇進(jìn)行冷凍干 燥，得到凍干粉針劑。
實(shí)施例5注射用組合變應(yīng)原制劑的制備
1) 取康氏木霉凍干粉針劑，與溶4某按照1: 25比例混合成制劑。
2) 取鏈格孢菌凍干粉針劑，與溶^^按照1: 25比例混合成制劑。
3) 分別取上述康氏木霉、鏈格孢菌溶媒混合制劑，按照1: 1: 1比例 混合，得到注射用組合變應(yīng)原制劑。
實(shí)施例6木霉浸提液中蛋白含量的測(cè)定(Bradford法)
1)染料工作液配制用蒸餾水將5xCoomassie濃縮液稀釋為400 ml lx染料工作液。稀釋的lx染料工作液用普通濾紙過濾除去沉淀。
2)標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液配制將標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白(BSA， 4mg/ml， -20。C)用 溶媒稀釋。稀釋BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液至500、 400、 300、 200、 100、 50、 10、 5 ng/ml 各稀釋度，充分混勻，放置2min。
3 )標(biāo)準(zhǔn)曲線制作取上述每一稀釋度標(biāo)準(zhǔn)BSA溶液各取15 pl，與285 ]ul染料工作液混合。反應(yīng)終體積300 ji1。用96孔微板，置酶標(biāo)儀中，在595 腿處測(cè)定吸光收值OD595。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)濃度(ng/ml)為橫座標(biāo)，用吸光度 值OD595為縱座標(biāo)作圖，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線。
4) 樣品測(cè)定與濃度計(jì)算樣品測(cè)定方法同上(標(biāo)準(zhǔn)曲線制作)。才艮據(jù) 標(biāo)準(zhǔn)曲線和測(cè)出的未知樣品的OD595值，得出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。此 濃度是與染料工作液混合之前的待測(cè)樣品中的蛋白濃度。如杲樣品在與染料 工作液混合之前經(jīng)過稀釋，最后估計(jì)樣品蛋白濃度時(shí)須乘以實(shí)際稀釋倍數(shù)。
5) 最佳方案1: 20 ( W/V)木霉變應(yīng)原浸提液的蛋白含量為0.1 ~ 0.3mg/ml。
實(shí)施例7注射用木霉變應(yīng)原用于治療過敏性疾病
1) 患者21例，男8例，女13例，年齡7~58歲，病程1 8年，平 均3.1年。在醫(yī)院作變應(yīng)原皮試21例均為木霉陽性。注射變應(yīng)原制劑12個(gè) 月。
2) 治療藥物如實(shí)施例2中所得的注射用木霉變應(yīng)原粉針劑。
3) 治療方法皮下注射，每次注射0.1ml開始，每周2次，每次遞增 O.lml，增至lml為一療程。治療原則是先從低濃度開始，每進(jìn)入一個(gè)新的 療程，藥物濃度增大10倍，直到增至1/100后，則不再增大，開始用本濃 度藥液進(jìn)行維持治療。
4) 結(jié)果隨訪12-18個(gè)月，21例患者中顯效8例，有效12例，無效1 例，有效率為95.2%。 18例患者在一月之內(nèi)起效。
權(quán)利要求
1、一種治療過敏性病癥的藥物，該藥物含有康氏木霉變應(yīng)原。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的藥物，其特征在于，其中所述的康氏木霉變應(yīng)原是 將空氣中收集到的康氏木霉培養(yǎng)后，通過脫脂、無菌水浸出、濃縮、凍干 的方法而獲得的。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物，該藥物還含有其它空氣真菌變應(yīng)原和/或藥 學(xué)上可接受載體。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l-3中任一所述的藥物，其特征在于該藥物是注射劑、口服 液、片劑、膠嚢劑、舌下含服劑、氣霧劑、鼻腔劑或貼劑。
5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物，該藥物是康氏木霉變應(yīng)原凍千粉針劑或康氏 木霉變應(yīng)原注射液。
6、 康氏木霉變應(yīng)原原材料的制備方法，釆用下述步驟制備1) 空氣曝亞，實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行菌種的篩選、純種分離、鑒定?？凳夏久咕?廣鋪、平伏；產(chǎn)孢區(qū)域黃綠色；邊緣不齊；背面淺綠色；光學(xué)顯微鏡 下菌絲對(duì)策或互生，有束生、對(duì)策、互生或單生瓶形小梗，分生孢子 由小梗生出，橢圓形、卵形、倒卵形,近無色；大小為3.5*1.9 ~ 3.2(拜);2) 康氏木霉實(shí)驗(yàn)室20-25。C室溫培養(yǎng)45-60天，光學(xué)顯微鏡下鑒定以 不含其它微生物為合格；3)對(duì)長(zhǎng)成的真菌進(jìn)行菌體收集，1 ~ 2倍體積的70 ~ 75%乙醇?xì)⑺谰w， 2 8'C自然風(fēng)干；4) 加入2 ~ 3倍體積的丙酮或石油醚等有機(jī)溶劑進(jìn)行去脂；5) 傾倒出上層丙酮或石油醚等有機(jī)溶劑，保留下層固體，2 8。C自然風(fēng) 干，得到真菌變應(yīng)原原材料。
7、 康氏木霉變應(yīng)原浸提液的制備方法，采用下述步驟制備1)康氏木霉變應(yīng)原原材料與無菌水按1: 10~30 (W/V)的比例混合， 提取48~80小時(shí)，提取過程中每日振蕩或攪拌不低于2小時(shí)，溫度2~ 8°C;2)濾紙去渣；3) 0.22pm膜錯(cuò)流除菌過濾，得到變應(yīng)原浸提液。
8、 康氏木霉變應(yīng)原凍干粉針劑的制備方法，將康氏木霉變應(yīng)原浸提液2 8。C 下蒸發(fā)濃縮到原體積的10%,濃縮液進(jìn)行冷凍干燥，得到凍干粉針劑。
9、 康氏木霉變應(yīng)原注射液的制備方法，將康氏木霉變應(yīng)原凍干粉針劑用浸提 液等體積的生理鹽水稀釋，按照所需濃度，稀釋成1/100至1/1,000,000范圍 內(nèi)的多個(gè)濃度的制劑，得注射液。
10、 康氏木霉變應(yīng)原在制備治療由木霉過敏引起的過敏性疾病藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種治療由空氣中木霉(Trichoderma)引起的速發(fā)型過敏性疾病的藥物，該藥物為康氏木霉(Trichoderma T.koningi)變應(yīng)原。本發(fā)明還提供了該藥物從原材料到成品的制備方法以及該藥物用于特異性診斷和免疫治療過敏性病癥的用途。本發(fā)明的變應(yīng)原利用脫敏治療原理，藥物的劑量由小到大，病人吸收該藥物逐步提高對(duì)空氣中木霉變應(yīng)原的耐受性，從而達(dá)到減輕癥狀及治愈的目的，如木霉引起的支氣管哮喘、過敏性鼻炎等。
文檔編號(hào)A61K39/35GK101450210SQ200910076609
公開日2009年6月10日 申請(qǐng)日期2009年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月9日
發(fā)明者喬秉善 申請(qǐng)人:北京新華聯(lián)協(xié)和藥業(yè)有限責(zé)任公司