專利名稱：一種攜載基因和/或藥物的醫(yī)療器械及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)療器械領(lǐng)域，具體的說，涉及一種攜載基因和/或 藥物的醫(yī)療器械及其制備方法。
背景技術(shù)：
1987年，希格沃特(Sigwart)等首次將血管內(nèi)金屬支架用于冠狀 動脈以來，為治療血管堵塞性疾病提供了良好的途徑。然而血管支架 內(nèi)再狹窄一直是影響經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(PCI)療效的主要原因。 隨著2004年強生Cypher雷帕霉素藥物支架和2005年波士頓科學公司 的Taxus紫杉醇藥物支架的上巿，藥物洗脫支架將支架內(nèi)再狹窄率從 金屬裸支架時代的30 %降低到10 %以下。
然而隨著藥物支架研究的深入和應用范圍的不斷擴大以及積累 病例的逐步增加，人們對其使用應更趨理性，對其目前存在的問題也 有了清醒的認識。在藥物洗脫支架的動物實驗中，藥物洗脫支架植入 后3個月藥物完全釋放后，出現(xiàn)局部纖維蛋白和炎性細胞聚集和內(nèi)皮 修復不完全，此時內(nèi)膜增殖的程度和金屬裸支架相似，即所謂晚期再 狹窄。此外，第一代藥物洗脫支架所攜帶的藥物，雷帕霉素、紫杉醇 以及它們的類似物在抑制血管平滑肌細胞增殖降低支架內(nèi)再狹窄的 同時，也抑制了血管內(nèi)皮細胞的增殖，因此延遲了支架表面的內(nèi)皮化, 從而增加了支架血栓的發(fā)生。同時第一代藥物洗脫支架攜載藥物的聚 合物基質(zhì)的長期存在可能導致過敏和炎癥反應。
伴隨著分子生物學的發(fā)展，許多疾病的發(fā)病機理在基因水平上得 以闡明，這使得從基因水平診斷和根治疾病成為可能。在醫(yī)治心臟病、 腫瘤、糖尿病等方面利用基因轉(zhuǎn)移和調(diào)位的治療正在深入研究。例如 將抗血栓形成基因?qū)胄难軆?nèi)，使之在血管內(nèi)表達，從而達到抑制血栓形成，防止血管堵塞的目的。然而如何將基因向生物體內(nèi)靶向輸 送或局部定位，這一關(guān)鍵性的技術(shù)問題尚未得到解決。
治療基因應用于心血管疾病的安全性和有效性已經(jīng)得到證實。各 國學者嘗試將各種治療基因負載在支架上，通過介入治療將治療基因 輸送到病變部位，從而通過基因調(diào)控達到抑制支架內(nèi)再狹窄和血栓形 成。這些嘗試都表明這種方法切實可行。
臨床前研究表明能夠促進血管形成的基因和蛋白包括 一氧化氮
合酶(NOS)基因(iNOS, eNOS)、角蛋白8 (Keratin 8)基因、血 管內(nèi)皮生長因子(VEGF)基因、表皮生長因子(EGF)基因、PTEN 基因(一種同腫瘤抑制基因)、尿激酶前體(Pro-UK)基因或反義寡 核核苷酸，胎盤生長因子(PLGF)基因，成纖維細胞生長因子(FGF) 基因，血管生成素基因，肝細胞生長因子(HGF)基因，血小板衍化 生長因子(PDGF-BB)基因，血小板生長因子(PGF)基因，血栓調(diào) 節(jié)蛋白(TM)基因，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)基因， 胰島素樣生長因子(IGF)基因，單核細胞趨化蛋白-l(MCP-l)基因， 巨噬細胞炎性蛋白-l(MIP-l)基因，缺氧誘導因子(HIF)基因，早期 生長反應(Egr)基因，Prox-l基因，Del-l基因，Cyr61基因，PR39 基因，kallikrein基因，分泌性Frizzled相關(guān)蛋白(sFrp )基因。(Jiro Aoki， Rev Esp Cardiol. 2005 ;58(8): 962-73; MMGaffney, British Journal of Pharmacology. 2007;152:175-188 )
以往研究結(jié)果證明，應用于支架的治療基因能夠降低再狹窄率和 抗血栓形成，這已經(jīng)在臨床前研究階段和部分臨床研究中得到部分證 實。動物研究也證明支架攜帶基因能夠作為基因傳遞系統(tǒng)提供治療基 因，阻止支架內(nèi)再狹窄和潛在的血管疾病，因此使用支架作為基因載 體具有顯著的治療優(yōu)勢，并得到廣泛的關(guān)注。
目前，所有將治療基因負載到支架進行的動物試驗都存在以下幾 個問題(1)由于支架置入過程中會遇到高速血流的沖擊，因此如何將治療基因牢固吸附在支架表面輸送到病變部位成為這種方法應用 于臨床的關(guān)鍵障礙。以前的研究文獻、專利等基本都釆用了在金屬裸 支架表面涂覆一層高分子載體或者蛋白涂層，然后利用這層高分子載 體或者蛋白涂層攜帶基因。這樣就存在高分子載體涂層或者蛋白涂層 本身與金屬基體的結(jié)合力在高速血流沖擊下容易與金屬基體分離，尤 其是那些極易溶于水的膠原、多聚賴氨酸等涂層，這樣負載在涂層上 的治療基因會隨著血流沖擊而大量流失，到達靶病變部位的基因量有 限；同時引入的高分子載體或蛋白涂層作為體內(nèi)異物會引起基體的應 激和免疫反應，尤其是蛋白涂層會引起的免疫排斥作用會大大削弱基 因治療的效果。(2)所有已經(jīng)負載到支架上的單基因研究都只能在一 定程度下減少血管內(nèi)再狹窄或者血栓發(fā)生率，并沒有一種獨特的基因 能夠同時以內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞為靶點，在修復內(nèi)皮的同時也抑制 平滑肌細胞的增生。另外，通過吸附方法將基因負載到血管支架上存 在基因與支架結(jié)合不牢固而易被血流沖走的不足。
因此將基因支架成功應用于臨床需要解決的問題是(1)能夠在 支架表面牢固攜載基因耐受支架植入過程中冠脈血流的沖擊；(2)尋 找更加特異性的能夠同時以內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞為靶點的基因，在 修復內(nèi)皮的同時也抑制平滑肌細胞的增生。

發(fā)明內(nèi)容
基于以上缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種攜載基因和/或藥物的 醫(yī)療器械及其制備方法。
一種攜載基因和/或藥物的醫(yī)療器械，包括醫(yī)療器械本體、醫(yī)療 器械本體表面的藥物和/或基因，其中，藥物和/或基因通過靜電吸附 和/或微孔物理吸附在醫(yī)療器械表面。
為了聯(lián)合發(fā)揮多種藥物和/或多種治療基因的協(xié)同效應，所述涂 敷和/或固定可將至少一種藥物和/或至少一種基因混合涂覆在醫(yī)療器 械本體的表面。參照專利《多藥涂層血管支架》(專利號ZL200620148126.4 )和專利《生物多肽血管支架》(專利號ZL 200620166479.7 )，可以在同 一表面涂覆多種藥物和多種治療基因；
可以首先在表面涂覆抗平滑肌增生藥物(如雷帕霉素)，然后再在雷 帕霉素表面涂覆治療基因(如一氧化氮合酶基因)，也可以同時在同 一表面涂覆抗平滑肌增生藥物和治療基因的混合涂層。
所述涂敷和/或固定液可以是將至少一種藥物和/或至少一種基因 分別涂覆在醫(yī)療器械的血流一側(cè)和血管壁一側(cè)，更進一步的明確和有 效正確發(fā)揮治療藥物和治療基因的特定作用，可以在支架血管壁側(cè)涂 覆抗平滑肌增生藥物和/或治療基因，在血流側(cè)涂覆抗血栓形成、抗 血小板粘附和促進內(nèi)皮化藥物和/或治療基因或者涂覆多種藥物和多 種治療基因。
本發(fā)明所述的攜載基因和/或藥物的醫(yī)療器械可以通過在支架表 面致孔或者釆用適當?shù)姆椒ㄊ怪Ъ鼙砻鎺д娦?，利用孔洞效應? 或靜電效應在支架表面涂覆和/或固定藥物和/或治療基因的組合。
本發(fā)明所述的攜載基因和/或藥物的醫(yī)療器械也可以包括負載基 因和/或藥物的負載基質(zhì)，所述負載基質(zhì)是不可降解生物載體、可降 解生物載體和蛋白活性材料中的一種或多種。
其中所述不可降解生物載體材料為聚甲基丙烯酸丁酯，乙烯醋酸 -乙烯酯，聚丙烯/聚丙烯腈共聚物，聚s己內(nèi)酯中的一種或多種；所 述可降解生物載體材料為乙交酯，丙交酯，s-己內(nèi)酯的均聚物或共 聚物中的一種及其與多官能團氨基酸的共聚物，聚乳酸，甲殼質(zhì)，殼 聚糖中的一種或多種；所述蛋白活性材料為明膠、膠原蛋白和白蛋白 等活性蛋白中的一種或多種。
本發(fā)明所述的醫(yī)療器械包括支架、人造血管、心臟瓣膜、導管、 管修補篩、起搏器、起搏器導子、除纖顫器、PFO隔膜封閉器械、血 管夾、動脈血管瘤閉鎖器、血液透析移植物、血液透析導管、房室吻 合分流、大動脈血管瘤移植物器械、靜脈瓣、血管接合夾、留置式動脈導管、血管護鞘等中的一種或多種器械的組合。所述醫(yī)療器械優(yōu)選 表面具有載藥孔洞的醫(yī)療器械。
所述醫(yī)療器械優(yōu)選支架，更優(yōu)選表面具有載藥孔洞的支架。
所述基因包括下述一種或多種 一氧化氮合酶(NOS)基因 (iNOS ， eNOS )、角蛋白8( Keratin 8)基因、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF ) 基因、表皮生長因子(EGF)基因、PTEN基因(一種同腫瘤抑制基 因)、尿激酶前體(Pro-UK)基因或反義寡核核苷酸，胎盤生長因子 (PLGF)基因，成纖維細胞生長因子(FGF)基因，血管生成素基 因，肝細胞生長因子(HGF)基因，血小板衍化生長因子(PDGF-BB) 基因，血小板生長因子(PGF)基因，血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)基因，粒細 胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)基因，胰島素樣生長因子(IGF) 基因，單核細胞趨化蛋白-l(MCP-l)基因，巨噬細胞炎性蛋白-l(MIP-l) 基因，缺氧誘導因子(HIF)基因，早期生長反應(Egr)基因，Prox-l 基因，Del-l基因，Cyr6l基因，PR39基因，kallikrein基因，分泌性Frizzled 相關(guān)蛋白(sFrp)基因。載體治療基因的真核表達載體為腺病毒、質(zhì) 粒、細胞、高分子中的一種。上述基因或其片段可釆用多個真核表達 載體負載，復合在同一或不同基質(zhì)上涂敷在醫(yī)療器械表面，或直接涂 敷在醫(yī)療器械表面；也可以在同一真核表達載體負載，復合在同一或 不同基質(zhì)上涂敷在醫(yī)療器械表面，或直接涂敷在醫(yī)療器械表面，但不 限于此。
本發(fā)明所述的藥物包括下述一種或多種他克莫司，艾羅莫司， 免疫抑制劑ABT-578，地塞米松，咪唑立賓，雷帕霉素，紫杉醇及其 衍生物，放線菌素，長春新堿及其衍生物，他汀類藥物，2-氯去氧腺苷， 核酶，巴馬司他，溴氯哌喹酮，C-蛋白酶抑制劑，普羅布可，雌二醇 類，肝素，抗血小板膜糖蛋白(GPIIb/IIIa)受體拮抗劑，阿昔單抗(抗 血小板凝聚單克隆抗體)， 一氧化氮合酶(NOS),精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)多肽，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，成纖維細胞生長因子(FGF)，堿性成纖維細胞生長因子，血小板誘導性因子， 轉(zhuǎn)化生長因子P1，酸性成纖維細胞生長因子，骨粘連蛋白，促血管 生成素，胰島素樣生長因子，粒細胞巨噬細胞集落刺激因子，血小板 衍生生長因子，內(nèi)皮細胞PAS蛋白1，血小板反應蛋白，增殖蛋白，
肝配蛋白-Al， E-選擇蛋白，肥胖蛋白，白介素8，甲狀腺素以及神 經(jīng)鞘氨醇l-磷酸酯，角蛋白8 (Keratin 8)，尿激酶前體(Pro-UK)， 反義寡核核苷酸，抗CD2、 CD3、 CD4、 CD8、 CD3R、 CD1、 CD5、 CD6、 CD7、 CD9、 CDIO、 CDll、 CD18、 CD19、 CD20、 CD21、 CD22、 CD23、 CD24、 CD37、 CD33、 CD34、 CD35、 CD64、 CD65、 CDw65、 CD66、 CD31、 CD 133、 CD89、 CDw90、 CD56、 CD57、 CD94、 CD40、 CD72、 CD77、 CD16、 CD32、 CD63、 CD36、 CD41、 CD42a、 CD42b、 CDllb、 CDllc、 CD29、 CD44、 CD48、 CD49a、 CD49b、 CD49c、 CD49e、 CD49f、 CD50、 CD51、 CD54、 CD58、 CD61、 CD62E、 CD62L、 CD62p、 CD103、 CD105、 CD26、 CD71、 CD95、 CD122、 CDwl24、 CD126、 CD127、 CD117白細胞分化抗原抗體及其片段，抗血管內(nèi)皮 生長因子l(VEGF-l)抗體及其片段，抗血管內(nèi)皮生長因子2(VEGF-2) 抗體及其片段，抗CD146 (Muc-18)抗體及其片段，抗干細胞抗原
(Sca-1)抗體及其片段，抗干細胞因子l ( SCF/c-Kti配體)抗體及其 片段，抗酪氨酸激酶Tie-2抗體及其片段和抗HAD-DR細胞表面抗原抗 體及其抗體片段。
特別的，本發(fā)明所述的在同一支架平臺涂覆和/或固定藥物和治 療基因的組合優(yōu)先選擇雷帕霉素和一氧化氮合酶基因，艾羅莫司和一 氧化氮合酶基因，雷帕霉素和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)基因，艾 羅莫司和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)基因這四種組合?？梢允紫仍?支架血管壁側(cè)涂覆和/或固定雷帕霉素和/或艾羅莫司藥物，然后在支 架血流側(cè)涂覆和/或固定一氧化氮合酶基因和/或血管內(nèi)皮生長因子
(VEGF)基因。也可以首先在支架表面涂覆和/或固定雷帕霉素和/或艾羅莫司藥物，再在藥物涂層表面涂覆和/或固定一氧化氮合酶基
因和/或血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)基因。
本發(fā)明所述的基因支架，所述基因優(yōu)選一氧化氮合酶(NOS)基
因和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)基因的基因組合，從而在同一支架
平臺上引入分別作用于抑制平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞的基因，聯(lián)合各基
因的優(yōu)勢從根本上解決支架再狹窄和內(nèi)皮化延遲的缺點。
本發(fā)明還提供上述攜載基因和/藥物醫(yī)療器械的制備方法。 本發(fā)明所述的攜載基因和,/或藥物的醫(yī)療器械的制備方法分為
(1) 在醫(yī)療器械表面攜載基因的方法，包括
1) 采用電化學拋光、腐蝕、陽極氧化、微弧氧化、微弧氮化和 陽極極化中的一種或多種，使醫(yī)療器械本體表面帶正電；
2) 將基因與瓊脂糖DNA電泳緩沖液、水、磷酸鹽緩沖液、二甲 基亞砜、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺中的一種，配置濃度為0.001-100 mg/ml的溶液，或?qū)⒒蚺c負載基質(zhì)混合成濃度為0.001-100 mg/ml，所述負載基質(zhì)是不可降解生物載體、可降解生物載體和蛋白 活性材料中的一種或多種，
3) 釆用靜電噴涂、蘸涂、浸涂、霧化噴涂中的一種或多種涂敷 基因溶液來涂覆和/或固定基因。
(2) 在醫(yī)療器械表面攜載藥物的方法，包括
1) 將治療藥物直接溶解有機溶劑中有機溶劑(如四氫呋喃、丙 酮、甲醇、乙醇)或者溶解在水溶性的介質(zhì)(如水、轔酸鹽緩沖液、 碳酸鹽緩沖液)中(溶解介質(zhì)根據(jù)藥物的極性進行選擇)，濃度 0.001mg~ 100 mg/ml范圍，也可將治療藥物與負載基質(zhì)混合成濃度為 0.001 ~ 100 mg/ml，所述負載基質(zhì)是不可降解生物載體、可降解生物 載體和蛋白活性材料中的一種或多種。
2) 釆用靜電噴涂、蘸涂、浸涂、霧化噴涂中的一種或多種涂覆 和/或固定治療藥物。本發(fā)明可以釆用(1)在醫(yī)療器械表面攜載藥物的方法和(2)在 醫(yī)療器械表面攜載藥物的方法的結(jié)合制備基因載藥支架，也可直接釆 用(1)或者(2)制備多藥或者多基因支架。
本發(fā)明優(yōu)選具有載藥孔洞的醫(yī)療器械制備攜載基因和/或藥物的
醫(yī)療器械，其制備方法包括
1) 釆用腐蝕、陽極氧化、微弧氧化、微弧氮化方法或其結(jié)合在 支架表面制備孔洞，利用支架表面的孔洞涂覆和固定藥物和/或治療
基因；
2) 釆用電化學拋光、腐蝕、陽極氧化、微弧氧化、微弧氮化方
法或這些方法結(jié)合，使支架表面帶上較多的正電，利用基因在溶液中 帶負電的特性，通過靜電吸附效應在支架表面涂覆或者固定藥物和/
或治療基因；
3) 釆用靜電噴涂技術(shù)，在支架表面噴涂和固定藥物和/或治療基 因時，通過外加電場使支架表面帶上更多的正電、藥物和/或治療基 因帶上更多的負電，通過靜電噴涂工藝增加基因在支架表面涂覆和固
定的量；
4) 利用上述1)、 2)、 3)三種方法的兩兩組合或者同時利用這三 種方法在支架表面涂覆和/或固定藥物和/或基因。
本發(fā)明的孔洞制備按照本公司的專利公開號CN 101161299A,
公開日為2008.4.16，名稱為"孔洞及聚合物共載的藥物釋放結(jié)構(gòu)及其 制備方法"中提出的工藝步驟，釆用腐蝕、陽極氧化、微弧氧化、 微弧氣化方法或這些方法結(jié)合在支架表面，如316L不銹鋼金屬裸支架 表面制備形成多孔表面，表面孔洞大小均一，呈多晶相結(jié)構(gòu)，孔洞的 大小為lnm 500 ju m。
本發(fā)明使用的靜電噴涂技術(shù)可釆用該領(lǐng)域公知技術(shù)，在支架和噴 嘴之間設置靜電發(fā)生器，使從噴嘴中噴出的藥物和/或治療基因電性 更負，從而利用靜電吸附的原理在支架表面涂覆和/或固定更多的藥物和/或治療基因。
不同的藥物和/或治療基因(包括載體治療基因)在支架表面涂 覆和/或固定的量要求不同，如果單純釆用孔洞物理吸附、靜電吸附 效應和靜電噴涂技術(shù)中的一種即可滿足，則基因載藥支架的制備只需 要釆用其中的一種方式，反之，則可同時聯(lián)合這三種方法，以增加藥 物和/或治療基因在支架表面的涂覆和/或固定量，保證藥物和/或治療 基因支架的有效性。
本發(fā)明利用靜電吸附和/或微孔吸附的原理將治療基因和/或藥物 涂敷在醫(yī)療器械本體的表面，制備方法簡單，基因和/或藥物與醫(yī)療 器械表面的結(jié)合緊密。
本發(fā)明所述的攜載基因和/或藥物的醫(yī)療器械具有以下優(yōu)點1) 將各種治療性基因(和各種藥物)聯(lián)合應用，提高了治療效果，降低 了再狹窄發(fā)生率，促進內(nèi)皮化；2)治療基因和/或藥物也可直接負載 在支架表面，無需任何中間基質(zhì)，避免了在基因和/或藥物與支架本
體支架設置中間層基質(zhì)可能帶來的炎癥及其副作用；3)釆用微孔或
者靜電吸附方式固定的治療基因和/或藥物相對牢固，能夠耐受支架 植入過程中高速冠脈血流的沖擊，從而能夠使治療有效量的治療基因 和/或藥物達到血管病變位置，達到靶向輸送或局部定位的目的。
與現(xiàn)有藥物洗脫支架相比，本發(fā)明通過加入促進內(nèi)皮化的治療基 因，不僅能夠降低支架內(nèi)再狹窄發(fā)生率，還可以促進支架表面內(nèi)皮化。 因此，本發(fā)明既能夠保持現(xiàn)有藥物洗脫支架降低再狹窄的優(yōu)勢，同時
還促進支架表面內(nèi)皮化；更進一步，多種效用的基因協(xié)同作用，對于 解決現(xiàn)有藥物洗脫支架降低支架內(nèi)再狹窄卻延遲內(nèi)皮修復的問題具 有重要的臨床意義。


圖l帶有微孔的金屬支架本體電鏡掃描照片。
圖2為涂敷藥物和基因的支架的掃描電鏡照片，其中左側(cè)為完整預留出支架血流側(cè)表面的雷帕霉素洗脫支架的掃描電鏡照片；右側(cè)為 表面攜載大量基因質(zhì)粒的支架血流側(cè)表面的掃描電鏡照片。
圖3支架植入后動物管腔的冠狀動脈造影圖，其中圖3a為裸支 架，圖3b為攜載基因和藥物的支架，圖3c攜載雷帕霉素藥物的支架。
圖4支架植入后動物管腔的內(nèi)皮電鏡照片，其中圖4a為裸支架， 圖4b為攜載基因和藥物的支架，圖4c攜載雷帕霉素藥物的支架。
具體實施例方式
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。如無 特別指明，實施例中使用的基因來源于美國Irwitrogen公司。
實施例l基因載藥支架的制備
(1) 將316L不銹鋼裸支架經(jīng)切割、去渣、拋光，放置在濃度為 75%的醫(yī)用酒精中，在頻率30khz的超聲波清洗15分鐘，溫度設定在 40°C，干燥60分鐘后取出。然后將支架放置在~38%的鹽酸腐蝕12 小時后，將支架本體作為陽極與脈沖電源的正極連接，鈦金屬片作為 陰極與脈沖電源的負極連接，將支架本體與陰極金屬片同時置于為28 %的鹽酸中，電流設定為20A，頻率為2000赫茲，時間為5分鐘，在 316L金屬裸支架本體表面制備孔洞(圖l)。
(2) 將0.2g雷帕霉素加入10ml四氫呋喃溶液中，用球囊保護帶 有孔洞的支架本體的血流側(cè)表面，并將配制好的雷帕霉素藥物在室溫 條件下分散均勻，然后噴涂于支架本體的血管側(cè)表面，空氣中固化 60min;使支架的雷帕霉素載藥量達到2.2 ja g/mm2 ，制備出預留出血 流側(cè)表面的雷帕霉素藥物洗脫支架(圖2)。
(3) 將pcDNA3.1-iNOS基因質(zhì)粒制備成100mg/ml的緩沖液，然 后將(2)制備的預留出血流側(cè)表面的雷帕霉素藥物支架放入配制好 的緩沖液中，溫育12小時后取出，4'C長期保存。掃描電鏡下可見支 架內(nèi)表面吸附了大量iNOS基因質(zhì)粒(圖3)。實施例2基因載藥支架的制備植入豬冠狀動脈的實驗研究
將如實施例l所述制備好的基因載藥支架手術(shù)隨機植入豬冠狀動 脈的前降支(LAD)、回旋支(LCX)和右冠狀動脈(RCA)，并以金 屬裸支架和雷帕霉素藥物支架作為對照。在植入后的7天、14天和28 天對各組動物分別行冠狀動脈造影(QCA)，并處死相應動物進行組 織形態(tài)學觀察和電鏡觀察。
QCA和組織形態(tài)學結(jié)果表明，手術(shù)后28天，植入基因載藥支架(圖 3b)的動物管腔丟失和新生內(nèi)膜面積相比裸支架(圖3a)顯著減少， 其效果與雷帕霉素藥物支架(圖3c)大致相當。
電鏡觀察結(jié)果表明，基因載藥支架(圖4b)相比藥物支架(圖4c)、 裸支架(圖4a)內(nèi)皮化速度更快，植入手術(shù)后7天基因載藥支架組動 物內(nèi)皮化即已完全。
通過上述實驗證明，基因載藥支架抑制動物冠狀動脈再狹窄能力 與雷帕霉素藥物支架相當，但是其內(nèi)皮化速度更快，從而能降低支架 植入晚期血栓的發(fā)生率。
實施例3載雙基因(NOS和VEGF)支架的制備
(1) 按照實施例l的方法制備帶有孔洞的純鈦裸支架。
(2) 制備一氧化氮合酶(NOS)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) 基因質(zhì)粒
目的基因VEGF釆用逆轉(zhuǎn)錄法從人白血病細胞HL-60中獲得，目 的基因NOS從人臍靜脈內(nèi)皮細胞基因組DNA中獲得，并以質(zhì)粒載體 pcDNA3.1分別構(gòu)建VEGF和NOS的載體治療基因。轉(zhuǎn)染進大腸桿菌 DH5a， -70°0保存。最后使用Qiagene公司的去內(nèi)毒素質(zhì)粒純化試劑 盒及方法提純質(zhì)粒。
(3 )將pcDNA3.1-iNOS基因質(zhì)粒和pcDNA3.1-VEGF基因質(zhì)粒同時 溶解在TAE緩沖液，濃度均為1 mg/ml，然后將按照(1)制備的帶 有孔洞的支架放入配制好的緩沖液中，溫育30分鐘 1天后取出，4'C長期保存。即得載一氧化氮合酶(NOS)和血管內(nèi)皮生長因子
(VEGF)基因的支架。
實施例4載雙基因(VEGF和EGF)支架的制備
1.帶有孔洞的裸支架的制備
將巿售鎳鈦合金支架裸支架放置在濃度為99.5%的丙酮中，在頻 率100khz的超聲波清洗5分鐘，然后置于干燥箱中，溫度設定在30'C， 干燥30分鐘取出。
然后將支架放置在~ 38 %的鹽酸腐蝕l小時~ 24小時后，將支架 本體作為陽極與脈沖電源的正極連接，鈦金屬片作為陰極與脈沖電源 的負極連接，將支架本體與陰極金屬片同時置于為1~38%的鹽酸電 流設定為O.Ol ~ 30A,頻率為25 ~ 3000赫茲，時間為1 ~ 20分鐘，在316L 金屬裸支架本體表面制備孔洞，并使支架表面帶上正電。
然后進行后處理先使用濃度為99.5%的丙酮，再使用蒸餾水， 利用頻率為60khz超聲波清洗本體材料各1 Omin,然后置于干燥箱中， 溫度設定在50。C，干燥25分鐘取出。
2. VEGF和EGF雙基因支架的制備
將血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和表皮生長因子(EGF)基因加 入高純水中，制備濃度均為O. 1 mg/ml的溶液，裝入噴涂機中，在支 架和噴嘴之間設置靜電發(fā)生器，電壓設置為20KV，電流設定為 0.2mA，使從噴嘴中噴出的基因帶更多負電，利用靜電吸附的原理在 支架表面涂覆和/或固定更多的基因。反復噴涂5遍，4'C長期保存。
權(quán)利要求
1、一種攜載基因和/或藥物的醫(yī)療器械，包括醫(yī)療器械本體、醫(yī)療器械本體表面的藥物和/或基因，其特征在于，藥物和/或基因通過靜電吸附和/或微孔物理吸附涂敷和/或固定在醫(yī)療器械表面。
2、 如權(quán)利要求l所述的醫(yī)療器械，其特征在于，所述基因包括下 述一種或多種 一氧化氮合酶基因、角蛋白8基因、血管內(nèi)皮生長因 子基因、表皮生長因子基因、PTEN基因、尿激酶前體基因或反義寡 核核苷酸，胎盤生長因子基因，成纖維細胞生長因子基因，血管生成 素基因，肝細胞生長因子基因，血小板衍化生長因子基因，血小板生 長因子基因，血栓調(diào)節(jié)蛋白基因，粒細胞-巨P藍細胞集落刺激因子 基因，胰島素樣生長因子基因，單核細胞趨化蛋白-l基因，巨噬細胞 炎性蛋白-l基因，缺氧誘導因子基因，早期生長反應基因，Prox-l基 因，Del-l基因，Cyr61基因，PR39基因，kallikrein基因，分泌性Frizzled 相關(guān)蛋白基因；所述基因的真核表達載體為腺病毒、質(zhì)粒、細胞、高 分子中的一種。
3、 如權(quán)利要求1所述的醫(yī)療器械，其特征在于，本發(fā)明所述的 藥物包括下述一種或多種他克莫司，艾羅莫司，免疫抑制劑 ABT-578,地塞米松，咪唑立賓，雷帕霉素，紫杉醇及其衍生物，放 線菌素，長春新堿及其衍生物,他汀類藥物，2-氯去氧腺苷，核酶，巴 馬司他，溴氯哌喹酮，C-蛋白酶抑制劑，普羅布可，雌二醇類，肝素， 抗血小板膜糖蛋白受體拮抗劑，阿昔單抗， 一氧化氮合酶，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽，血管內(nèi)皮生長因子，成纖維細胞生長因子， 堿性成纖維細胞生長因子，血小板誘導性因子，轉(zhuǎn)化生長因子P1， 酸性成纖維細胞生長因子，骨粘連蛋白，促血管生成素，胰島素樣生 長因子，粒細胞巨噬細胞集落刺激因子，血小板衍生生長因子，內(nèi)皮 細胞PAS蛋白1,血小板反應蛋白，增殖蛋白，肝配蛋白-Al， E-選 擇蛋白，肥胖蛋白，白介素8，甲狀腺素以及神經(jīng)鞘氨醇l-磷酸酯，角蛋白8，尿激酶前體，反義寡核核苷酸，抗CD2、 CD3、 CD4、 CD8、 CD3R、 CD1、 CD5、 CD6、 CD7、 CD9、 CDIO、 CDll、 CD18、 CD19、 CD20、 CD21、 CD22、 CD23、 CD24、 CD37、 CD33、 CD34、 CD35、 CD64、 CD65、 CDw65、 CD66、 CD31、 CD 133、 CD89、 CDw90、 CD56、 CD57、 CD94、 CD40、 CD72、 CD77、 CD16、 CD32、 CD63、 CD36、 CD41、 CD42a、 CD42b、 CDllb、 CDllc、 CD29、 CD44、 CD48、 CD49a、 CD49b、 CD49c、 CD49e、 CD49f、 CD50、 CD51、 CD54、 CD58、 CD61、 CD62E、 CD62L、 CD62p、 CD 103、 CD 105、 CD26、 CD71、 CD95、 CD122、 CDwl24、 CD126、 CD127、 CD117白細胞分 化抗原抗體及其片段，抗血管內(nèi)皮生長因子l抗體及其片段，抗血管 內(nèi)皮生長因子2抗體及其片段，抗CD146抗體及其片段，抗干細胞 抗原抗體及其片段，抗干細胞因子1抗體及其片段，抗酪氨酸激酶 Tie-2抗體及其片段和抗HAD-DR細胞表面抗原抗體及其抗體片段。
4、 如權(quán)利要求l-3任一所述的醫(yī)療器械，其特征在于，所述涂敷 和/或固定是將至少一種藥物和/或至少一種基因混合涂覆在醫(yī)療器械 本體的表面。
5、 如權(quán)利要求l-3任一所述的醫(yī)療器械，其特征在于，所述涂敷和/或固定是將至少一種藥物和/或至少一種基因分別涂覆在醫(yī)療器械 的血流一側(cè)和血管壁一側(cè)。
6、 如權(quán)利要求l-5任一所述的醫(yī)療器械，其特征在于，所述的藥 物和基因是雷帕霉素和一氧化氮合酶基因，艾羅莫司和一氧化氮合酶 基因，雷帕霉素和血管內(nèi)皮生長因子基因，艾羅莫司和血管內(nèi)皮生長 因子基因這四種組合中的一種或兩種；其涂覆和/或固定的方式是在 血管壁側(cè)涂覆雷帕霉素和/或艾羅莫司藥物，在血流側(cè)涂覆一氧化氮 合酶基因和/或血管內(nèi)皮生長因子基因；或在本體表面涂覆和/或固定 雷帕霉素和/或艾羅莫司藥物，再在藥物涂層表面涂覆一氧化氮合酶 基因和/或血管內(nèi)皮生長因子基因。
7、 如權(quán)利要求l-5任一所述的醫(yī)療器械，其特征在于，所述基因 是一氧化氣合酶基因和血管內(nèi)皮生長因子基因的基因組合。
8、 如權(quán)利要求l-7任一所述的醫(yī)療器械，其特征在于，所述醫(yī)療器械包括支架、人造血管、心臟瓣膜、導管、管修補篩、起搏器、起搏器導子、除纖顫器、PFO隔膜封閉器械、血管夾、動脈血管瘤閉鎖器、血液透析移植物、血液透析導管、房室吻合分流、大動脈血管瘤 移植物器械、靜脈瓣、血管接合夾、留置式動脈導管、血管護鞘等中 的一種或多種器械的組合，優(yōu)選表面具有載藥孔洞的醫(yī)療器械，優(yōu)選 支架，更優(yōu)選表面具有載藥孔洞的支架。
9、 如權(quán)利要求1和2所述的醫(yī)療器械，其特征在于，所述醫(yī)療器 械還包括負載基因和/或藥物的負載基質(zhì)，所述負載基質(zhì)是不可降解 生物載體、可降解生物載體和蛋白活性材料中的一種或多種。
10、 如權(quán)利要求l-9所述的醫(yī)療器械的制備方法，包括1) 釆用腐蝕、陽極氧化、微弧氧化、微弧氮化方法或其結(jié)合在 支架表面制備孔洞，利用支架表面的孔洞涂覆和固定藥物和/或治療 基因；2) 釆用電化學拋光、腐蝕、陽極氧化、微弧氧化、微弧氮化方 法或這些方法結(jié)合，使支架表面帶上較多的正電，利用基因在溶液中 帶負電的特性，通過靜電吸附效應在支架表面涂覆或者固定藥物和/ 或治療基因；3) 釆用靜電噴涂技術(shù)，在支架表面噴涂和固定藥物和/或治療基 因時，通過外加電場使支架表面帶上更多的正電、藥物和/或治療基 因帶上更多的負電，通過靜電噴涂工藝增加基因在支架表面涂覆和固定的量；4) 利用上述1)、 2)、 3)三種方法的兩兩組合或者同時利用這三 種方法在支架表面涂覆和/或固定基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種攜載基因和/或藥物的醫(yī)療裝置及其制備方法。該醫(yī)療裝置利用靜電吸附和/或微孔物理吸附原理，在其本體表面直接涂覆和/或固定活性藥物和/或治療基因，其優(yōu)點在于在同一平臺上復合多種治療基因和藥物，聯(lián)合多個治療基因和藥物的優(yōu)勢，從根本上解決再狹窄和內(nèi)皮化延遲的問題。本發(fā)明的攜載基因和/或藥物的醫(yī)療裝置的制備方法簡單，基因和藥物的固定效果好，可不引入負載藥物和基因的基質(zhì)載體，降低了植入引發(fā)的再狹窄和炎癥反應風險，治療效果優(yōu)于現(xiàn)有植入性醫(yī)療器械。
文檔編號A61L27/00GK101502696SQ200910078128
公開日2009年8月12日 申請日期2009年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月17日
發(fā)明者余占江, 冉玉鳳, 萌 張, 張正才, 王長青, 邱笑違, 陳永強 申請人:樂普(北京)醫(yī)療器械股份有限公司