專利名稱：：一種雙重靶向脂質(zhì)體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種雙重靶向脂質(zhì)體及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：原發(fā)性腦瘤已成為癌癥的十大死因之一。100,000人中就有5到10人患惡性腦膠質(zhì)瘤[WrenschM，MinnY，ChewT，BondyM，BergerMS.Epidemiologyofprimarybraintumorscurrentconceptsandreviewoftheliterature.NeuroOncol.2002Oct；4(4)278-99.BehinA，Hoang-XuanK，CarpentierAF，DelattreJY.Primarybraintumoursinadults.Lancet.2003Jan25；361(9354)323-31.]。侵入性腦膠質(zhì)瘤細胞能夠快速地浸潤和破壞正常腦組織結(jié)構(gòu)，因而不可能通過手術(shù)完全切除腫瘤。盡管使用手術(shù)切除、放療和化療聯(lián)合治療，惡性腦膠質(zhì)瘤病人的平均生存時間不超過一年[AstnerST，PihuschR，NiederC，RachingerW，LohnerH，TonnJC，MollsM，GrosuAL.Extensivelocalandsystemictherapyinextraneuralmetastasizedglioblastomamultiforme.AnticancerRes.2006Nov-Dec；26(6C)4917-20.NiederC，GrosuAL，AstnerS，MollsM.Treatmentofunresectableglioblastomamultiforme.AnticancerRes.2005Nov-Dec；25(6C)4605-10.]?；煼椒ㄊ〉闹饕蚴强拱┧幫ㄟ^靜脈給藥后不能到達腦實質(zhì)。血腦屏障由內(nèi)皮單層細胞、星形膠質(zhì)細胞和周皮細胞組成，它將腦實質(zhì)與血液分開，并阻止藥物向中樞神經(jīng)系統(tǒng)滲透。血腦屏障阻止大分子和98％以上的小分子藥物的攝取[PardridgeWM.BBB-Genomicscreatingnewopeningsforbrain-drugtargeting.DrugDiscovToday.2001Apr1；6(8)381-383]?；煹牧硪粋€的障礙就是使化療藥在腫瘤部位維持高濃度而不擴散到正常組織[MinchintonAI，TannockIF.Drugpenetrationinsolidtumours.NatRevCancer.2006Aug；6(8)583-92.OhlfestJR，DemorestZL，MotookaY，VengcoI，OhS，ChenE，ScappaticciFA，SaplisRJ，EkkerSC，LowWC，F(xiàn)reeseAB，LargaespadaDA.Combinatorialantiangiogenicgenetherapybynonviralgenetransferusingthesleepingbeautytransposoncausestumorregressionandimprovessurvivalinmicebearingintracranialhumanglioblastoma.MolTher.2005Nov；12(5)778-88]。因此，對科研工作者來說，研究一種新的給藥系統(tǒng)既能使藥物透過血腦屏障又能靶向腦膠質(zhì)瘤成為一項緊迫的任務(wù)。腦膠質(zhì)瘤根據(jù)細胞的類型分成以下幾類(腦室)室管膜細胞瘤(室管膜細胞)，成膠質(zhì)細胞瘤(星形膠質(zhì)細胞)，少突神經(jīng)膠質(zhì)(細胞)瘤(少突膠質(zhì)細胞)，混合性神經(jīng)膠質(zhì)瘤(不同類型的神經(jīng)膠質(zhì))。低度的腦膠質(zhì)瘤分化良好(細胞不能回復(fù)較原始狀態(tài))并且是良性的，能被很好的診斷。重度膠質(zhì)瘤不分化(細胞回復(fù)較原始狀態(tài)的)并且是惡性的，很難被很好的診斷。根據(jù)WHO對膠質(zhì)瘤的分級系統(tǒng)，4級膠質(zhì)瘤的診斷最困難，患者的平均存活時間僅為12個月。從總體看，幾乎沒有病人存活能超過3年。通過手術(shù)和/或放射治療幾乎不能治愈惡性膠質(zhì)瘤(神經(jīng)膠質(zhì)瘤)。主要是以下兩大原因限制了化療所能起到的作用抗腫瘤藥不能透過血腦屏障及其在透過血腦屏障后對腫瘤組織的滲透能力很差。在腦腫瘤部位能維持高的治療濃度已成為化療的一大挑戰(zhàn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種雙重靶向脂質(zhì)體及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供的雙重靶向脂質(zhì)體，由脂質(zhì)體和其表面的修飾物組成，其特征在于所述脂質(zhì)體表面的修飾物為p-aminophenyl-α-D-manno-pyranoside(對硝基苯-α-D-吡喃甘露糖苷，MAN)和轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin，TF)。所述p-aminophenyl-α-D-manno-pyranoside可連接于所述脂質(zhì)體的氨基上；所述轉(zhuǎn)鐵蛋白可連接于所述脂質(zhì)體的羧基上。所述脂質(zhì)體的氨基可由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH2(DSPE-PEG-NH2)提供；所述脂質(zhì)體的羧基可由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-COOH(DSPE-PEG-COOH)提供。具體來說所述脂質(zhì)體制備時，可在原料中加入二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH2和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-COOH，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH2和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-COOH結(jié)合到脂質(zhì)體表面，提供用于連接p-aminophenyl-α-D-manno-pyranoside和轉(zhuǎn)鐵蛋白的氨基和羧基。所述脂質(zhì)體具體可用卵磷脂、膽固醇、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚二醇-NH2(DSPE-PEG-NH2)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-COOH(DSPE-PEG-COOH)作為原料制備得到。卵磷脂、膽固醇、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH2、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-COOH的質(zhì)量比可為(104.5-105.5)∶(44.5-45.5)∶(28-28.5)∶(3.4-3.6)∶(3.4-3.6)。卵磷脂、膽固醇、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH2、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-COOH的具體摩爾比可為52∶43∶4∶0.5∶0.5。所述靶向脂質(zhì)體中，所述轉(zhuǎn)鐵蛋白與所述脂質(zhì)體的質(zhì)量比為(4-5)∶15，所述p-aminophenyl-α-D-manno-pyranoside與所述脂質(zhì)體的質(zhì)量比為(1.5-2)∶15。所述靶向脂質(zhì)體中，所述轉(zhuǎn)鐵蛋白與卵磷脂的比可為300-400μg轉(zhuǎn)鐵蛋白/μmol磷脂。所述靶向脂質(zhì)體中，所述p-aminophenyl-α-D-manno-pyranoside與所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH2的摩爾比可為(3-10)∶1。所述聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺具體可為DSPE-PEG2000。所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH2具體可為DSPE-PEG2000-NH2。所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-COOH具體可為DSPE-PEG2000-COOH。本發(fā)明還提供了一種靶向脂質(zhì)體的制備方法，包括如下步驟1)以卵磷脂、膽固醇、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH2、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-COOH為原料制備表面具有氨基和羧基的脂質(zhì)體；2)將p-aminophenyl-α-D-manno-pyranoside與脂質(zhì)體的氨基連接；將轉(zhuǎn)鐵蛋白與脂質(zhì)體的羧基連接；得到靶向脂質(zhì)體。所述步驟1)中，制備脂質(zhì)體的方法具體可為硫酸銨梯度法。所述步驟2)中，可用戊二醛作連接劑，將p-aminophenyl-α-D-manno-pyranoside與脂質(zhì)體的氨基(由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH2提供)的氨基連接。所述步驟2)中，可用EDCI作連接劑，將轉(zhuǎn)鐵蛋白與脂質(zhì)體的羧基(由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-COOH提供)連接。所述步驟1)中，卵磷脂、膽固醇、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH2、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-COOH的質(zhì)量比可為(104.5-105.5)∶(44.5-45.5)∶(28-28.5)∶(3.4-3.6)∶(3.4-3.6)。卵磷脂、膽固醇、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH2、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-COOH的具體摩爾比可為52∶43∶4∶0.5∶0.5。所述聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺具體可為DSPE-PEG2000。所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH2具體可為DSPE-PEG2000-NH2。所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-COOH具體可為DSPE-PEG2000-COOH。所述的靶向脂質(zhì)體可應(yīng)用于制備藥物載體。本發(fā)明還保護一種藥物載體，它的活性成分為所述的靶向脂質(zhì)體。本發(fā)明還保護一種載藥脂質(zhì)體，是用所述的靶向脂質(zhì)體包載藥物得到的。所述藥物具體可為柔紅霉素。本發(fā)明還保護一種治療腦腫瘤的藥物，它的活性成分是包載柔紅霉素的載藥脂質(zhì)體。所述腦腫瘤可為腦膠質(zhì)瘤，具體可為C6膠質(zhì)瘤。所述包載柔紅霉素的載藥脂質(zhì)體可應(yīng)用于制備治療腦腫瘤的藥物。所述腦腫瘤可為腦膠質(zhì)瘤，具體可為C6膠質(zhì)瘤。脂質(zhì)體經(jīng)MAN修飾后，能夠被血腦屏障上的GLUT1(葡萄糖轉(zhuǎn)運體1)識別，使脂質(zhì)體跨膜轉(zhuǎn)運通過血腦屏障；脂質(zhì)體經(jīng)TF修飾后，在跨血腦屏障后可通過轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)主動識別腦膠質(zhì)瘤細胞，從而提高腫瘤部位的藥物濃度，增加抗癌藥物的細胞內(nèi)傳遞效率；因此發(fā)揮雙重靶向作用。機制可能與下面兩個方面有關(guān)血腦屏障上有TfR表達，腫瘤細胞表面上有GLUT1表達；大多數(shù)的腦腫瘤都是實體瘤，實體瘤的無血管部分成為有效控制腫瘤生長的主要障礙。甘露糖衍生物和轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的柔紅霉素脂質(zhì)體制備及其二級靶向作用的梗概圖見圖1葡萄糖轉(zhuǎn)運體(GLUT1，一級靶向)介導(dǎo)跨血腦屏障，然后轉(zhuǎn)鐵蛋白(二級靶向)介導(dǎo)靶向C6膠質(zhì)瘤細胞。脂質(zhì)體的粒徑可以顯著性的影響脂質(zhì)體的體內(nèi)藥物動力學(xué)性質(zhì)、毒性及其抗腫瘤活性。就粒徑本身而言，平均粒徑在100nm左右的脂質(zhì)體擁有最長的血漿半衰期。本發(fā)明得到的包載柔紅霉素的脂質(zhì)體的平均粒徑在120nm附近，多分散系數(shù)在0.13-0.25左右，是一個粒徑大小合適、分布均勻的分散體系，在血液中的循環(huán)時間長，使脂質(zhì)體囊泡有更多的機會通過腫瘤部位新生毛細血管內(nèi)皮組織上的“孔隙”而向腫瘤組織富集，從而實現(xiàn)更好的抗腫瘤活性。Zeta電位是衡量脂質(zhì)體或脂質(zhì)納米粒等分散體系的物理穩(wěn)定性的參數(shù)之一。本發(fā)明得到的包載柔紅霉素的脂質(zhì)體的zeta電位略顯負性，說明脂質(zhì)體囊泡之間具有適量的靜電排斥力，脂質(zhì)體貯存穩(wěn)定性更好，不易發(fā)生聚沉。本發(fā)明得到的柔紅霉素脂質(zhì)體對C6膠質(zhì)瘤細胞具有明顯的抑制作用。本發(fā)明將MAN與脂質(zhì)體表面DSPE-PEG-NH2連接得以增加跨血腦屏障能力，將轉(zhuǎn)鐵蛋白與脂質(zhì)體表面的DSPE-PEG-COOH連接以靶向腦膠質(zhì)瘤，得到了雙重靶向脂質(zhì)體。將抗腫瘤藥柔紅霉素包封于脂質(zhì)體中，得到了一種全新的抗惡性腦膠質(zhì)瘤雙重靶向脂質(zhì)體，能夠使藥物在跨過血腦屏障后靶向到腦膠質(zhì)瘤部位，從而腫瘤部位的藥物濃度大大增加，提高化療的效果。本發(fā)明為腦膠質(zhì)瘤化療提供了一個新的對策，并有助于對腦膠質(zhì)瘤的非侵入性治療的研究，具有重要的理論意義與臨床意義。圖1為雙重靶向脂質(zhì)體制備及雙重靶向作用梗概圖。圖2為BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖3為載藥脂質(zhì)體A1和載藥脂質(zhì)體C1的形態(tài)。圖4為HRP標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖5為HRP不同時間的通透率。圖6為透過血腦屏障能力測定中柔紅霉素的跨體外血腦屏障轉(zhuǎn)運率。圖7為MAN競爭實驗中柔紅霉素的跨體外血腦屏障轉(zhuǎn)運率。圖8為48小時后，載藥脂質(zhì)體對C6膠質(zhì)瘤細胞的抗增殖作用。圖9為應(yīng)用不同的載藥脂質(zhì)體，C6膠質(zhì)瘤細胞攝取柔紅霉素的情況。圖10為TF受體競爭實驗中，不同處理中，C6膠質(zhì)瘤細胞攝取柔紅霉素的情況。圖11為激光共聚焦法檢測細胞對不同載藥脂質(zhì)體的攝取及其在細胞內(nèi)的分布。圖12為BMVEC/C6共培養(yǎng)實驗中不同載藥脂質(zhì)體在跨體外血腦屏障后對C6膠質(zhì)瘤的抑制率。圖13為膠質(zhì)瘤細胞球?qū)嶒灥牟煌幚碇心[瘤球體積率。圖14為不同載藥脂質(zhì)體處理的C6膠質(zhì)瘤大鼠的腦膠質(zhì)腫瘤體積抑制率。圖15為不同載藥脂質(zhì)體處理的C6膠質(zhì)瘤大鼠的卡普蘭-邁耶存活曲線。具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。實施例1、脂質(zhì)體的制備卵磷脂(EPC)和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(polyethyleneglycol-distearoylphosphatidylethanolamine，PEG2000-DSPE)購自日本油脂株式會社(日本NOF公司)；膽固醇(cholesterol)購自北京市海淀區(qū)微生物培養(yǎng)基制品廠(北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠)；DSPE-PEG2000-COOH、DSPE-PEG2000-NH2、p-aminophenyl-α-D-manno-pyranoside(MAN)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(分子量為80,000道)(holo-transferrin，TF)購自Sigma-AldrichCorporation，Beijinglocalagent，China；shephedexG-100、trinitrobenzenesulphonicacid(TNBS)購自Sigma-Aldrich公司，Beijinglocalagent，China；1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidehydrochloride(EDCI)購自ShanghaiMedpepCo.，Ltd.，China；N-hydroxysuccinimide(NHS)購自BeijingSanshengTengdaTechnologyCo.，Ltd.，China；BCA試劑盒購自PierceCorporation，Beijinglocalagent，China；聚碳酯過濾器(孔徑400、200nm)購自Millipore(Bedford，MA，USA)；柔紅霉素鹽酸鹽購自南京天尊澤眾化學(xué)試劑公司。HP1100型高效液相色譜儀(Agilent，美國)。NanoSeriesZen4003ZetaSizer(Malverninstruments，英國)。SPI3800NseriesSPA-400型原子力顯微鏡(日本)。一、空白脂質(zhì)體的制備1、空白脂質(zhì)體的制備將卵磷脂、膽固醇、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-COOH、DSPE-PEG2000-NH2按摩爾比52∶43∶4∶0.5∶0.5溶解在氯仿中；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿，在茄形瓶中40℃、40rpm旋蒸形成薄膜；加入10ml250mM硫酸銨，先在水浴中超聲5min，然后轉(zhuǎn)移到血清瓶中在JY92-2D型超聲波細胞粉碎機中進一步超聲(超聲工作時間為10s，間歇時間為10s，全程時間為10min，保護溫度為35℃)。得到脂質(zhì)體A。2、空白MAN修飾的脂質(zhì)體的制備通過戊二醛作連接劑，將MAN化學(xué)連接到脂質(zhì)體A上DSPE-PEG2000-NH2的氨基上，具體步驟為將8ml脂質(zhì)體A(7.5mg/ml)與2mgMAN混合；然后緩慢加入戊二醛，使戊二醛終濃度為15mM；室溫下孵育5min；在PBS(pH7.4)中透析去除未連接的MAN和戊二醛。得到脂質(zhì)體B。3、空白MAN和TF修飾的脂質(zhì)體的制備通過EDCI作連接劑，將轉(zhuǎn)鐵蛋白的氨基與脂質(zhì)體B上DSPE-PEG-COOH的羧基連接，具體步驟為取2ml脂質(zhì)體B(7.5mg/ml)，加入1.0mgEDCI和1.44mgNHS(DSPE-PEG-COOH∶EDCI∶NHS＝0.063∶2.5∶6.3；摩爾比)，混勻后加入5mg轉(zhuǎn)鐵蛋白，緩慢攪拌并室溫孵育3h。過ShephedexG-100柱(用pH7.4的PBS平衡)，去除游離轉(zhuǎn)鐵蛋白，得到脂質(zhì)體C。4、空白TF修飾的脂質(zhì)體的制備通過EDCI作連接劑，將轉(zhuǎn)鐵蛋白的氨基與脂質(zhì)體A上DSPE-PEG-COOH的羧基連接，步驟同步驟3。得到脂質(zhì)體D。二、載藥脂質(zhì)體的制備和包封率的測定藥脂比＝柔紅霉素鹽酸鹽的質(zhì)量脂質(zhì)體中卵磷脂和膽固醇的質(zhì)量之和。1、載藥脂質(zhì)體的制備將柔紅霉素鹽酸鹽以1∶12的藥脂比與脂質(zhì)體A混合，40℃水浴中振搖20min，然后進行透析，除去游離的柔紅霉素鹽酸鹽，得到載藥脂質(zhì)體A1。將柔紅霉素鹽酸鹽以1∶12的藥脂比與脂質(zhì)體B混合，40℃水浴中振搖20min，然后進行透析，除去游離的柔紅霉素鹽酸鹽，得到載藥脂質(zhì)體B1。將柔紅霉素鹽酸鹽以1∶12的藥脂比與脂質(zhì)體C混合，40℃水浴中振搖20min，然后進行透析，除去游離的柔紅霉素鹽酸鹽，得到載藥脂質(zhì)體C1。將柔紅霉素鹽酸鹽以1∶12的藥脂比與脂質(zhì)體D混合，40℃水浴中振搖20min，然后進行透析，除去游離的柔紅霉素鹽酸鹽，得到載藥脂質(zhì)體D1。2、包封率的測定將載藥脂質(zhì)體置于10mL容量瓶中，用10倍量的甲醇破壞，并用流動相定容，HPLC法測定柔紅霉素含量。包封率(％)＝載藥脂質(zhì)體中柔紅霉素的含量/(載藥脂質(zhì)體中柔紅霉素的含量+游離柔紅霉素含量)×100％。表1不同載藥脂質(zhì)體的包封率在所制備的載藥脂質(zhì)體A1、B1、C1、D1中，柔紅霉素的包封率均大于90％。實施例2、脂質(zhì)體的性能測定一、轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾率測定(BCA法)1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備采用BCA試劑盒(PierceCorporation，Beijinglocalagent，China)，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)進行測定，用PBS配置0、25、125、250、500、750和1000μg/ml的BSA，加入工作液后37℃下孵育30min，冷卻至室溫于540nm測定吸光值。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。2、修飾率按BCA試劑盒說明書測定實施例1制備的脂質(zhì)體C和脂質(zhì)體D中的轉(zhuǎn)鐵蛋白含量，并計算修飾率(μgTF/μmol磷脂)(修飾率＝連接到脂質(zhì)體上的轉(zhuǎn)鐵蛋白質(zhì)量卵磷脂的物質(zhì)的量)，結(jié)果見表2。表2脂質(zhì)體中的轉(zhuǎn)鐵蛋白含量和轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾率(n＝3)二、MAN修飾率測定脂質(zhì)體上DSPE-PEG-NH2的氨基與三硝基苯硫酸反應(yīng)，分別檢測實施例1制備的脂質(zhì)體A、脂質(zhì)體B和脂質(zhì)體C上可與三硝基苯硫酸反應(yīng)的氨基數(shù)量。脂質(zhì)體B的MAN修飾率為(1-脂質(zhì)體B上可與三硝基苯硫酸反應(yīng)的氨基數(shù)量/脂質(zhì)體A上可與三硝基苯硫酸反應(yīng)的氨基數(shù)量)×100％。脂質(zhì)體C的MAN修飾率為(1-脂質(zhì)體C上可與三硝基苯硫酸反應(yīng)的氨基數(shù)量/脂質(zhì)體A上可與三硝基苯硫酸反應(yīng)的氨基數(shù)量)×100％。脂質(zhì)體上可與三硝基苯硫酸反應(yīng)的氨基數(shù)量的檢測方法為向1ml脂質(zhì)體溶液中加入1ml4％NaHCO3和1ml10％十二烷基硫酸鈉(sodiumdodecylsulphate，SDS)。混合后30℃下反應(yīng)20min，然后再加入1ml0.1％TNBS溶液，再在40℃下反應(yīng)2h，最后加入0.5ml1MHCl終止反應(yīng)，320nm下測定吸光度(MitraM，MandalAK，ChatterjeeTK，DasN.TargetingofmannosylatedliposomeincorporatedbenzylderivativeofPenicilliumnigricansderivedcompoundMT81toreticuloendothelialsystemsforthetreatmentofvisceralleishmaniasis.JDrugTarget.2005Jun；13(5)285-93)。表3脂質(zhì)體B和脂質(zhì)體C的MAN修飾率(n＝3)三、粒徑和電位測定使用NanoSeriesZen4003ZetaSizer(Malverninstruments，Ltd，UK)測定實施例1制備的載藥脂質(zhì)體A1、B1、C1、D1的粒徑、多分散系數(shù)和Zeta電位。不同載藥脂質(zhì)體的粒徑(particlesize)、多分散系數(shù)(polydispersityindex，PDI)和zeta電位(zetapotential)的測定結(jié)果見表4。表4不同載藥脂質(zhì)體的粒徑、多分散系數(shù)和zeta電位(n＝3)脂質(zhì)體粒徑分布均勻，粒徑在120nm左右。各載藥脂質(zhì)體都略帶負電，說明脂質(zhì)體囊泡之間具有適量的靜電排斥力，貯存穩(wěn)定性更好，不易發(fā)生聚沉。五、原子力顯微鏡(AFM)采用原子力顯微鏡對實施例1制備的載藥脂質(zhì)體A1和載藥脂質(zhì)體C1進行形態(tài)學(xué)觀察，方法如下使用去離子水稀釋至柔紅霉素濃度為100μg/mL，用0.2μm微孔濾膜過濾，取10μL脂質(zhì)體溶液涂于硅片上，室溫干燥，用原子力顯微鏡進行測定。載藥脂質(zhì)體A1和載藥脂質(zhì)體C1的形態(tài)見圖3，圖3中，A載藥脂質(zhì)體A1；B載藥脂質(zhì)體C1。結(jié)果表明藥脂質(zhì)體A1表面呈光滑狀，載藥脂質(zhì)體C1表面可見小球結(jié)構(gòu)。實施例3、脂質(zhì)體體外雙重靶向作用評價鼠C6膠質(zhì)瘤細胞系購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物所；Ham’sF10培養(yǎng)基購自GIBCO/BRL公司(Germany)北京代理北京邁成科技有限公司；胎牛血清(FBS)購自中美合資蘭州民海生物工程有限公司；馬血清購自北京拜爾迪生物科技有限公司；SRB購自Sigma北京代理拜爾迪生物科技有限公司；辣根過氧化物酶(Horseradishperoxidase，HRP分子量為40000，酶活性＞250U·mg-1)、鼠腦內(nèi)皮細胞(brainmicrovascularendothelialcells，BMVEC)及其內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液(cndothclialcellculturemedium，ECCM)均購自中日友好醫(yī)院臨床研究所；酶標(biāo)儀(BIO-RADModel680，中國上海Bio-Rad實驗室設(shè)備公司)，細胞插入器(Corning，USA)；電阻測定儀，(EVOMk，WordPrecisionInstruments，USA)。采用實施例1制備的載藥脂質(zhì)體進行以下試驗。一、跨血腦屏障研究1、BMVEC細胞的培養(yǎng)鼠腦內(nèi)皮細胞在鼠腦內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液(其組成為DMEM，20％胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素，2mmol/Ll-谷胺酰胺，100μg/ml內(nèi)皮生長因子(ECGF)，40U/ml肝素)中傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5％二氧化碳。2、體外血腦屏障建立細胞插入器(Corning，NY，USA；0.4μm孔徑，12mm直徑，1.12cm2表面積)以2％的明膠包被后，每個細胞插入器中種37,500個鼠腦內(nèi)皮細胞，培養(yǎng)5天，每兩天更換一次培養(yǎng)液。3、體外血腦屏障模型評價(1)血腦屏障體外模型跨膜電阻的測定通過測定單層血腦屏障(BBB)的電阻來判斷BBB形成的緊密程度。電阻高于250Ωcm2可用于實驗。血腦屏障體外模型的跨膜電阻為276～282Ωcm2。(2)HRP含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立配制濃度為100μg·ml-1的HRP溶液，倍比稀釋得到濃度為12.5、6.25、3.125、1.56和0.78ng·ml-1的HRP的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，各取50μl加/入96孔板，依次加入50μl顯色液A和B(購于中日友好醫(yī)院臨床研究所)，顯色10min后加入2MH2SO4終止反應(yīng)，于450nm測定樣品的吸光度，建立HRP含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖4)。(3)BBB通透性測定血腦屏障形成后，細胞插入器的上池中加入含500ngHRP的培養(yǎng)基500μl，下池中加入1000μl的培養(yǎng)基，維持細胞插入器內(nèi)外池液面相平，于0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和24.0h時取50μl的下池液體，測定透過血腦屏障HRP的量，取樣后補充等體積的空白培養(yǎng)基，以維持內(nèi)外液面平衡，根據(jù)下式計算HRP的通透率。通透率＝Ct，下池/C0，上池Ct，下池t時刻下池中HRP的濃度；C0，上池實驗開始時上池中HRP的濃度。HRP不同時間的通透率見圖5。4、各制劑透過血腦屏障能力的測定在18個細胞插入器上分別接種鼠腦內(nèi)皮細胞，當(dāng)電阻測定顯示均形成完整的緊密連接時，分成六組(每組3個細胞插入器)，每組的上池中均加入500μl的無血清DMEM培養(yǎng)基，下池中加入1000μl的無血清DMEM培養(yǎng)基。第一組的上池培養(yǎng)基做空白對照，第二組的上池中含有5μg游離柔紅霉素，第三組的上池中含有載藥脂質(zhì)體B1(含5μg柔紅霉素)，第四組的上池中含有載藥脂質(zhì)體D1(含5μg柔紅霉素)，第五組的上池中含有載藥脂質(zhì)體C1(含5μg柔紅霉素)，第六組的上池中含有載藥脂質(zhì)體A1(含5μg柔紅霉素)。細胞插入器置于12孔板上，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于0、2、4、8和24h取出孔內(nèi)的溶液0.5ml，再補入0.5ml新鮮培養(yǎng)液，HPLC測定樣品中柔紅霉素含量，根據(jù)下式計算柔紅霉素跨體外血腦屏障轉(zhuǎn)運率。Ct，下池t時刻下池中柔紅霉素的濃度；C0，上池實驗開始時上池中柔紅霉素的濃度。圖6為柔紅霉素跨體外血腦屏障轉(zhuǎn)運率。載藥脂質(zhì)體C1跨BBB能力是游離柔紅霉素的37.18倍，載藥脂質(zhì)體B1的1.50倍，載藥脂質(zhì)體D1的2.76倍，載藥脂質(zhì)體A1的2.94倍。結(jié)果表明，柔紅霉素脂質(zhì)體在經(jīng)過MAN和TF修飾后，大大提高了柔紅霉素的跨血腦屏障轉(zhuǎn)運能力。5、MAN競爭實驗在12個細胞插入器上分別接種鼠腦內(nèi)皮細胞，當(dāng)電阻測定顯示均形成完整的緊密連接時，分成四組(每組3個細胞插入器)，每組的上池中均加入500μl的無血清DMEM培養(yǎng)基，下池中加入1000μl的無血清DMEM培養(yǎng)基。第三組和第四組的上池中加入200μgMAN，以飽和GLUT1受體。MAN加入30分鐘后，在第一組和第三組分別加入載藥脂質(zhì)體B1(含5μg柔紅霉素)，在第二組和第四組分別加入載藥脂質(zhì)體C1(含5μg柔紅霉素)。細胞插入器置于12孔板上，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在0、2、4、8和24h時從下池中取500μl樣品，取樣后立即補入新鮮培養(yǎng)液500μl，HPLC法測定樣品中柔紅霉素的含量，計算柔紅霉素跨體外血腦屏障轉(zhuǎn)運率(公式同步驟4)。結(jié)果如圖7所示，加入MAN后，由于游離的MAN與GLUT1競爭性結(jié)合，使得載藥脂質(zhì)體B1、載藥脂質(zhì)體C1的跨血腦屏障能力大大降低。該結(jié)果證明MAN和TF修飾的柔紅霉素脂質(zhì)體通過MAN介導(dǎo)與GLUT1識別結(jié)合，從而跨血腦屏障轉(zhuǎn)運能力顯著提高。二、靶向C6膠質(zhì)瘤研究1、C6膠質(zhì)瘤細胞培養(yǎng)鼠C6膠質(zhì)瘤細胞生長在F10培養(yǎng)液(含5％胎牛血清、15％馬血清、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素)中，培養(yǎng)條件37℃、5％二氧化碳。2、C6膠質(zhì)瘤細胞細胞毒實驗①將鼠C6膠質(zhì)瘤細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔2500個(培養(yǎng)液體積為每孔180μL)，置二氧化碳培養(yǎng)箱中于37℃，相對濕度95％的條件下孵育24h。②將培養(yǎng)板上的細胞分成5組，每組設(shè)置5個濃度，每個濃度設(shè)四個復(fù)孔。第1組細胞貼壁生長后，在細胞培養(yǎng)孔中分別加入20μL無血清培養(yǎng)液配制的游離柔紅霉素，柔紅霉素的終濃度分別為0.25、0.5、1、2.5、5μg/L。第2組細胞貼壁生長后，在細胞培養(yǎng)孔中分別加入20μL無血清培養(yǎng)液配制的載藥脂質(zhì)體B1，柔紅霉素的終濃度分別為0.25、0.5、1、2.5、5μg/L。第3組細胞貼壁生長后，在細胞培養(yǎng)孔中分別加入20μL無血清培養(yǎng)液配制的載藥脂質(zhì)體D1，柔紅霉素的終濃度分別為0.25、0.5、1、2.5、5μg/L。第4組細胞貼壁生長后，在細胞培養(yǎng)孔中分別加入20μL無血清培養(yǎng)液配制的載藥脂質(zhì)體C1，柔紅霉素的終濃度分別為0.25、0.5、1、2.5、5μg/L。第5組細胞貼壁生長后，在細胞培養(yǎng)孔中分別加入20μL無血清培養(yǎng)液配制的載藥脂質(zhì)體A1，柔紅霉素的終濃度分別為0.25、0.5、1、2.5、5μg/L。另設(shè)溶劑對照孔(4個復(fù)孔)。③將細胞培養(yǎng)板置二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育48小時。孵育完畢后，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入10％三氯乙酸100μL，然后在4℃冰箱中放置1h固定細胞。培養(yǎng)板各孔用去離子水洗滌5遍，去除三氯乙酸。在空氣中干燥后，每孔加0.4％SRB(以1％醋酸配制)100μL，室溫下放置15min，棄去各孔內(nèi)液體后用1％乙酸洗滌5遍，去除未結(jié)合染料?？諝庵懈稍锖?，用100μLpH10.5、10mmol/L的Tris堿溶解，在平板振蕩器上振蕩10min，置酶標(biāo)儀中測定每孔吸收度OD值(540nm)。不同處理后，細胞的存活率見圖8。存活率測定結(jié)果顯示，在柔紅霉素的不同制劑中，載藥脂質(zhì)體C1在各個濃度下均表現(xiàn)出最強的抗C6膠質(zhì)瘤細胞增殖的作用。計算抑制率(抑制率＝給藥組細胞吸光度540nm/對照組細胞吸光度540nm)，并使用SPSS軟件計算50％抑制濃度(IC50)。IC50計算結(jié)果見表5。表5不同載藥脂質(zhì)體的IC50值a，與游離柔紅霉素處理組相比，P＜0.05；b，載藥脂質(zhì)體A1處理組與載藥脂質(zhì)體D1處理組相比，P＜0.05；c，載藥脂質(zhì)體C1處理組與載藥脂質(zhì)體A1處理組相比P＜0.01。載藥脂質(zhì)體C1的IC50值比游離柔紅霉素的IC50值低1.39倍。各載藥脂質(zhì)體之間，載藥脂質(zhì)體C1的IC50值分別比載藥脂質(zhì)體A1低3.47倍，比載藥脂質(zhì)體B1低3.22倍，比載藥脂質(zhì)體D1低3.08倍。MAN和TF修飾的柔紅霉素脂質(zhì)體表現(xiàn)出最強的抗C6膠質(zhì)瘤細胞增殖的作用。3、C6膠質(zhì)瘤細胞攝取鼠C6膠質(zhì)瘤細胞接種于6孔板中(5×105個細胞/孔)(分成五組，每組設(shè)4個復(fù)孔)；培養(yǎng)24h后，第一組加入游離柔紅霉素(柔紅霉素終濃度為10μg/mL)，第二組加入載藥脂質(zhì)體B1(柔紅霉素終濃度為10μg/mL)，第三組加入載藥脂質(zhì)體D1(柔紅霉素終濃度為10μg/mL)，第四組加入載藥脂質(zhì)體C1(柔紅霉素終濃度為10μg/mL)，第五組加入載藥脂質(zhì)體A1(柔紅霉素終濃度為10μg/mL)；在37℃孵育2h。孵育完畢后用冷的PBS洗三次，經(jīng)0.25％胰酶消化后用PBS吹打成細胞懸液，用流式細胞儀測定與細胞結(jié)合的柔紅霉素?zé)晒鈴姸?測定的激發(fā)波長為488nm，測定波長為550nm)。每次分析所用的細胞數(shù)不少于105個，收集的細胞數(shù)為10000個。數(shù)據(jù)使用FCSExpressV3軟件進行分析。結(jié)果見圖9。圖9中，A1載藥脂質(zhì)體A1；A2載藥脂質(zhì)體B1；A3載藥脂質(zhì)體D1；A4載藥脂質(zhì)體C1；controlC6膠質(zhì)瘤細胞。峰的右移表明應(yīng)用不同的載藥脂質(zhì)體，C6膠質(zhì)瘤細胞攝取柔紅霉素的情況。與載藥脂質(zhì)體D1，載藥脂質(zhì)體B1，載藥脂質(zhì)體A1相比，載藥脂質(zhì)體C1顯示出最強的C6膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)攝取能力。4、C6細胞表面TF受體競爭實驗鼠C6膠質(zhì)瘤細胞接種于6孔板中(5×105個/孔)(分成四組，每組設(shè)4個復(fù)孔)，培養(yǎng)24h后，在第三組和第四組分別加入游離的TF(500μg)以飽和細胞表面TF受體；TF加入30分鐘后，在第一組和第三組分別加入載藥脂質(zhì)體D1(柔紅霉素終濃度為10μg/mL)，在第二組和第四組分別加入載藥脂質(zhì)體C1(柔紅霉素終濃度為10μg/mL)；在37℃孵育2h。孵育完畢后用冷的PBS洗三次，經(jīng)0.25％胰酶消化后用PBS吹打成細胞懸液，用流式細胞儀測定細胞內(nèi)柔紅霉素?zé)晒鈴姸?測定的激發(fā)波長為488nm，測定波長為550nm)。每次分析所用的細胞數(shù)不少于105，收集的細胞數(shù)為10000個。數(shù)據(jù)使用FCSExpressV3軟件進行分析。結(jié)果見圖10。圖10中，B1TF預(yù)飽和30min后應(yīng)用載藥脂質(zhì)體D1；B2直接應(yīng)用載藥脂質(zhì)體D1；B3TF預(yù)飽和30min后應(yīng)用載藥脂質(zhì)體C1；B4直接應(yīng)用載藥脂質(zhì)體C1；controlC6膠質(zhì)瘤細胞。峰的左移表明膠質(zhì)瘤細胞表面有大量的TF受體。預(yù)先用游離的TF與膠質(zhì)瘤細胞C6孵育，C6膠質(zhì)瘤細胞對載藥脂質(zhì)體C1，載藥脂質(zhì)體D1的攝取量顯著性減少。該結(jié)果說明脂質(zhì)體經(jīng)轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾后能夠增加C6膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)吞作用。MAN和TF修飾的柔紅霉素脂質(zhì)體組能夠觀察到最強的內(nèi)吞作用。5、共聚焦顯微鏡研究激光共聚焦法檢測細胞對游離柔紅霉素，載藥脂質(zhì)體B1，載藥脂質(zhì)體D1，載藥脂質(zhì)體C1以及載藥脂質(zhì)體A1的攝取及其在細胞內(nèi)的分布行為。鼠C6膠質(zhì)瘤細胞接種于玻底培養(yǎng)皿中，貼壁生長至60％匯集；設(shè)置五組，分別加入游離柔紅霉素(柔紅霉素終濃度為5μg/mL)、載藥脂質(zhì)體B1(柔紅霉素終濃度為5μg/mL)、載藥脂質(zhì)體D1(柔紅霉素終濃度為5μg/mL)、載藥脂質(zhì)體C1(柔紅霉素終濃度為5μg/mL)、載藥脂質(zhì)體A1(柔紅霉素終濃度為5μg/mL)；置二氧化碳培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)3小時，依次用冷PBS緩沖液漂洗三次，4％多聚甲醛固定10min，然后用Hoechst33258(激發(fā)波長352nm，檢測波長461nm)進行細胞核染色7分鐘。用激光共聚焦顯微鏡(LEICATCSSP2)以488nm波長的激光束激發(fā)柔紅霉素(激發(fā)波長488nm，檢測波長560nm)進行圖像分析。結(jié)果見圖11。圖11中，C載藥脂質(zhì)體A1，D載藥脂質(zhì)體B1，E載藥脂質(zhì)體D1，F(xiàn)載藥脂質(zhì)體C1；C1-F1藍色表示經(jīng)Hochest33258染色的C6膠質(zhì)瘤細胞的核；C2-F2紅色表示應(yīng)用柔紅霉素脂質(zhì)體后藥物在C6膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)的分布；C3-F3疊加圖像顯示應(yīng)用柔紅霉素脂質(zhì)體后藥物分布在C6膠質(zhì)瘤細胞核。結(jié)果表明，藥物經(jīng)C6膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)吞后主要分布在細胞核中，載藥脂質(zhì)體C1組細胞內(nèi)柔紅霉素分布量最多。三、體外雙重靶向研究---BMVEC/C6共培養(yǎng)實驗設(shè)置六組試驗(每組3個細胞插入器)。鼠腦內(nèi)皮細胞種入細胞插入器上層第四天后，在底池種入鼠C6膠質(zhì)瘤細胞(10000個/孔)，培養(yǎng)液是兩種細胞培養(yǎng)液各一半，共培養(yǎng)24h；第一組的上池培養(yǎng)基做空白對照，第二組的上池中含有5μg游離柔紅霉素，第三組的上池中含有載藥脂質(zhì)體B1(含5μg柔紅霉素)，第四組的上池中含有載藥脂質(zhì)體D1(含5μg柔紅霉素)，第五組的上池中含有載藥脂質(zhì)體C1(含5μg柔紅霉素)，第六組的上池中含有載藥脂質(zhì)體A1(含5μg柔紅霉素)；繼續(xù)培養(yǎng)48h。孵育完畢后，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入10％三氯乙酸2mL，然后在4℃冰箱中放置1h固定細胞。培養(yǎng)板各孔用去離子水洗滌5遍，去除三氯乙酸。在空氣中干燥后，每孔加0.4％SRB(以1％醋酸配制)1mL，室溫下放置20min，棄去各孔內(nèi)液體后用1％乙酸洗滌5遍，去除未結(jié)合染料?？諝庵懈稍锖笥?ml、pH10.5、10mmol/LTris堿溶解，在平板振蕩器上振蕩10min，置酶標(biāo)儀中測定每孔吸收度OD值(540nm)，計算抑制率(抑制率＝給藥組細胞吸光度540nm/對照組細胞吸光度540nm)，做統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果見圖12。制劑在跨過血腦屏障后對C6膠質(zhì)瘤細胞的抑制率分別為載藥脂質(zhì)體C1(64.0±0.7％)＞載藥脂質(zhì)體B1(58.6±0.7％)＞載藥脂質(zhì)體A1(46.0±1.0％)≥游離柔紅霉素(45.5±0.7％)＞載藥脂質(zhì)體D1(41.3±0.7％)。結(jié)果表明，MAN和TF修飾的柔紅霉素脂質(zhì)體顯示出“二級靶向作用”(P＜0.01)，即跨過血腦屏障，然后靶向C6膠質(zhì)瘤細胞。四、膠質(zhì)瘤細胞球?qū)嶒炘O(shè)置六組試驗，每組3個復(fù)孔。①用2％瓊脂糖(用無血清培養(yǎng)液配置，80℃下加熱30min)40μl包被96孔板，再將鼠C6膠質(zhì)瘤細胞接種在96孔板中(2000個細胞/孔)，37℃孵育24小時。②分別用無血清培養(yǎng)液配置游離柔紅霉素、載藥脂質(zhì)體B1、載藥脂質(zhì)體D1、載藥脂質(zhì)體C1、載藥脂質(zhì)體A1。③給藥分別將20μl步驟②得到的載藥脂質(zhì)體(或游離柔紅霉素)加入步驟①的96孔板中，柔紅霉素的終濃度均為10μg/孔，以無血清培養(yǎng)液為空白對照。④于給藥后第0、1、2、3、5天于倒置顯微鏡下觀察細胞球的形態(tài)、球核是否有壞死，并用目鏡測微尺測定直徑。計算腫瘤體積腫瘤球體積率＝(體積天i/體積天0)×100％，體積天i是指給藥后第i天C6膠質(zhì)瘤細胞球體積，體積天0是指給藥前C6膠質(zhì)瘤細胞球體積，結(jié)果見圖13。游離柔紅霉素只在開始的幾天里能微弱的抑制C6膠質(zhì)瘤細胞球在體積上的增加。載藥脂質(zhì)體C1處理組C6膠質(zhì)瘤細胞球在大小和體積上產(chǎn)生顯著性的減小。第5天時的C6膠質(zhì)瘤細胞球體積變化率分別是游離柔紅霉素為74.6±5.1％，載藥脂質(zhì)體A1為71.7±5.2％，載藥脂質(zhì)體B1為73.5±3.9％，載藥脂質(zhì)體D1為67.7±3.1％，載藥脂質(zhì)體C1為54.7±2.4％。實施例4、脂質(zhì)體體內(nèi)靶向作用評價使用200-250g的雄性SD大鼠進行試驗。采用實施例1制備的載藥脂質(zhì)體進行以下試驗。一、腦膠質(zhì)瘤大鼠模型的建立1、準(zhǔn)備C6細胞取處于對數(shù)生長期的鼠C6膠質(zhì)瘤細胞，稀釋為5×105細胞/10μl的細胞懸液。將細胞懸液放入37℃水浴保存。2、接種處理1)稱重2)麻醉、固定與消毒大鼠用20％烏拉坦(0.6ml/100g)腹腔注射麻醉后，去頭頂毛發(fā)約1.0cm×1.5cm，固定于定向儀上，酒精消毒。3)切口與鉆孔位置沿內(nèi)眥連線中點向后縱向切開大鼠頭皮1cm，暴露顱骨。根據(jù)大鼠腦立體定向圖譜前囟后0.4mm，矢狀縫旁側(cè)3.5mm的顱骨上以牙科鉆鉆孔，牙科鉆外帶塑料套管，僅允許鉆頭鉆透顱骨深1.0-1.5mm(以防止刺破硬腦膜)。4)C6細胞右腦尾狀核接種使用20uL微量注射器吸入10μLC6細胞懸液，垂直進針深5mm(距硬腦膜)，以1μl/min速率將細胞懸液注入尾狀核內(nèi)。注射完畢后留針5min，緩慢拔針，骨孔立即用無菌骨蠟封閉，術(shù)野用生理鹽水沖洗，切口用4號線逢合，2針打結(jié)，可明顯減少頭皮下腫瘤生長。5)術(shù)后腹腔注射青霉素，40000U/只。二、脂質(zhì)體體內(nèi)靶向作用評價將模型大鼠隨機分成6組，每組9只。術(shù)后第8天開始尾靜脈給藥，每組的給藥情況如下，給藥量指的是柔紅霉素的給藥量第1組(柔紅霉素)每周給藥三次，給藥量為5mg/kg，連續(xù)給藥一周；第2組(載藥脂質(zhì)體D1)每周給藥三次，給藥量為5mg/kg，連續(xù)給藥一周；第3組(載藥脂質(zhì)體B1)每周給藥三次，給藥量為5mg/kg，連續(xù)給藥一周；第4組(載藥脂質(zhì)體C1)每周給藥三次，給藥量為5mg/kg，連續(xù)給藥一周；第5組(載藥脂質(zhì)體A1)每周給藥三次，給藥量為5mg/kg，連續(xù)給藥一周；第6組(生理鹽水)用生理鹽水代替給藥，作為對照。采用4％PBS多聚甲醛液固定解剖出腫瘤，用游標(biāo)卡尺測量病理解剖腫瘤最大層面直徑，以最大長寬高直徑計算腫瘤體積(mm3)腫瘤體積抑制率＝試驗組的腫瘤體積/生理鹽水對照組的腫瘤體積×100％。給藥一周后腫瘤體積抑制率見圖14。游離柔紅霉素為13.0±2.4％，載藥脂質(zhì)體A1為14.2±6.2％，載藥脂質(zhì)體B1為25.3±3.3％，載藥脂質(zhì)體D1為22.8±4.1％，載藥脂質(zhì)體C1為37.4±1.0％。與其它組相比，MAN和TF修飾的柔紅霉素脂質(zhì)體組動物顯示出腫瘤體積顯著性的減小，并且生理鹽水組對腫瘤體積的抑制沒有效果。記錄動物死亡時間，繪制卡普蘭-邁耶存活曲線，結(jié)果見圖15。載藥脂質(zhì)體C1組大鼠的平均存活時間為22天，顯著性的長于生理鹽水組(13天，P＝0.001)、游離柔紅霉素組(17天，P＝0.001)、載藥脂質(zhì)體A1組(18天，P＝0.005)，載藥脂質(zhì)體B1組(19天，P＝0.038)和載藥脂質(zhì)體D1組(18天，P＝0.034)。權(quán)利要求1.一種靶向脂質(zhì)體，由脂質(zhì)體和其表面的修飾物組成，其特征在于所述脂質(zhì)體表面的修飾物為p-aminophenyl-α-D-manno-pyranoside和轉(zhuǎn)鐵蛋白。2.如權(quán)利要求1所述的靶向脂質(zhì)體，其特征在于所述脂質(zhì)體的表面具有氨基和羧基；所述p-aminophenyl-α-D-manno-pyranoside連接于所述脂質(zhì)體的氨基上；所述轉(zhuǎn)鐵蛋白連接于所述脂質(zhì)體的羧基上。3.如權(quán)利要求2所述的靶向脂質(zhì)體，其特征在于所述脂質(zhì)體的氨基由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH2提供；所述脂質(zhì)體的羧基由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-COOH提供。4.如權(quán)利要求3所述的靶向載體，其特征在于所述脂質(zhì)體是用卵磷脂、膽固醇、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH2和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-COOH作為原料制備得到的；卵磷脂、膽固醇、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH2和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-COOH的質(zhì)量比為(104.5-105.5)∶(44.5-45.5)∶(28-28.5)∶(3.4-3.6)∶(3.4-3.6)；所述靶向脂質(zhì)體中，所述轉(zhuǎn)鐵蛋白與所述脂質(zhì)體的質(zhì)量比為(4-5)∶15，所述p-aminophenyl-α-D-manno-pyranoside與所述脂質(zhì)體的質(zhì)量比為(1.5-2)∶15。5.一種靶向脂質(zhì)體的制備方法，包括如下步驟1)以卵磷脂、膽固醇、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-NH2和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-COOH為原料制備表面具有氨基和羧基的脂質(zhì)體；2)將p-aminophenyl-α-D-manno-pyranoside與步驟1)制備的脂質(zhì)體的氨基連接；將轉(zhuǎn)鐵蛋白與步驟1)制備的脂質(zhì)體的羧基連接；得到靶向脂質(zhì)體脂質(zhì)體。6.權(quán)利要求1至4中任一所述的靶向脂質(zhì)體在制備藥物載體中的應(yīng)用。7.一種藥物載體，它的活性成分為權(quán)利要求1至4中任一所述的靶向脂質(zhì)體。8.一種載藥脂質(zhì)體，是用權(quán)利要求1至4中任一所述的靶向脂質(zhì)體包載藥物得到的。9.一種治療腦腫瘤的藥物，它的活性成分是權(quán)利要求8所述的載藥脂質(zhì)體；所述載藥脂質(zhì)體包載的藥物為柔紅霉素。10.權(quán)利要求8所述的載藥脂質(zhì)體在制備治療腦腫瘤的藥物中的應(yīng)用；所述載藥脂質(zhì)體包載的藥物為柔紅霉素。全文摘要本發(fā)明公開了一種雙重靶向脂質(zhì)體及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供的靶向脂質(zhì)體，由脂質(zhì)體和其表面的修飾物組成，脂質(zhì)體表面的修飾物為p-aminophenyl-α-D-manno-pyranoside和轉(zhuǎn)鐵蛋白。本發(fā)明還保護一種載藥脂質(zhì)體，是用所述的靶向脂質(zhì)體包載柔紅霉素得到的。本發(fā)明得到的靶向脂質(zhì)體具有良好的跨血腦屏障的能力，并且靶向腦膠質(zhì)瘤，可作為藥物載體。本發(fā)明得到的載藥脂質(zhì)體，能夠使藥物在跨過血腦屏障后靶向到腦膠質(zhì)瘤部位，從而腫瘤部位的藥物濃度大大增加，提高化療的效果。本發(fā)明為腦膠質(zhì)瘤化療提供了一個新的對策，并有助于對腦膠質(zhì)瘤的非侵入性治療的研究，具有重要的理論意義與臨床意義。文檔編號A61P35/00GK101816629SQ200910078359公開日2010年9月1日申請日期2009年2月26日優(yōu)先權(quán)日2009年2月26日發(fā)明者呂萬良,應(yīng)雪,溫禾,杜舉申請人:北京大學(xué)