專利名稱：黃芩素在制備預(yù)防和治療帕金森病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及黃芩素用于制備預(yù)防或治療帕金森病或以帕金森病相關(guān)癥狀為特征 的疾病的藥物。還涉及黃芩素與黃酮類化合物及其他物質(zhì)組合用于制備防治帕金森病的藥 物制劑，屬于制藥領(lǐng)域，
背景技術(shù)：
帕金森病(PD)目前已經(jīng)成為世界上繼阿爾茨海默病之后第二大常見的年齡相關(guān) 的神經(jīng)退行性疾病。全球60歲以上老人的發(fā)病率為1%，且隨年齡增長而發(fā)病率增加。在 我國，55歲以上老年人中約有170多萬帕金森病患者。目前對PD主要病理特征的認(rèn)識為黑 質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性缺失和死亡，使黑質(zhì)-紋狀體通路多巴胺(DA)釋放減少， 造成紋狀體DA含量顯著降低。臨床上以震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動徐緩、姿勢步態(tài)障礙為特征。目前對PD的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，臨床上還沒有最終可以逆轉(zhuǎn)、阻止或減緩PD病人 黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性過程的藥物。傳統(tǒng)的PD治療藥物主要有左旋多巴及其復(fù)方多巴 制劑、多巴胺受體激動劑、抗膽堿能藥物、單胺氧化酶抑制劑等。這些藥物通過不同途徑發(fā) 揮抑制帕金森病人癥狀的作用，能夠明顯改善帕金森病的癥狀，但不能延緩疾病的進(jìn)程，不 能預(yù)防多巴胺能神經(jīng)元的退變，且長期應(yīng)用有嚴(yán)重的毒副作用，甚至導(dǎo)致疾病的惡化。根據(jù) 目前藥物應(yīng)用情況分析可見，無論是改善癥狀或是抑制病情發(fā)展，預(yù)防疾病發(fā)生或是治療 帕金森病病的新型藥物都是臨床治療的需求。黃芩素(baicalein)是唇形科(Labiatase)植物黃芩(Scutellariabaicalensis Georgi)的干燥根中所含的黃酮類化合物，具有式(I)的結(jié)構(gòu)。 黃芩素具有多種藥理作用，已有文獻(xiàn)報道的藥理作用包括抗菌、抗病毒、抗炎、抗 變態(tài)反應(yīng)、抗氧化、清除氧自由基、抗腫瘤、抗凝、抗血栓形成和保護(hù)肝臟、心腦血管和神經(jīng) 元等作用。在中國專利CN 1556108A (公開號)中記載了中國藥科大學(xué)發(fā)明的“黃芩素的提取 工藝、藥用組合物及制劑制備工藝” [1]。其中，涉及了黃芩素及其藥物組合物在治療各種病 毒感染性疾病如肝炎、病毒性感冒、病毒感染引起的急性呼吸道綜合癥中的應(yīng)用。在中國專利CN 1608619A(公開號)中記載了車慶明發(fā)明的“黃芩素的藥物組 方”[2]。其中，涉及了黃芩素及其藥學(xué)上可接受的鹽類與中、西藥物配合組方，用于制備藥物的新用途，具體包括用于制備解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥物；用于制備抗菌、抗病毒藥物；用于制備兼 治解熱鎮(zhèn)痛抗炎和抗菌、抗病毒藥物。在中國專利CN 1606979A(公開號)中記載了車慶明發(fā)明的“黃芩素作為解熱、鎮(zhèn) 痛、抗炎、抗菌、抗病毒劑的作用” [3]。其中，涉及了黃芩素及其藥學(xué)上可接受的鹽類用于制 備解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、抗病毒的藥物。在中國專利CN 1939295A (公開號)中記載了天津市長征醫(yī)院發(fā)明的“黃芩素滴丸 劑及其制備方法” [4]。其中，涉及了將天然植物黃芩通過常規(guī)的提取和分離，采用新的藥用 輔料，研制成黃芩素滴丸，用于治療過敏性皮膚病。在中國專利CN 1559400A(公開號)中記載了杭州市第一人民醫(yī)院張喜平發(fā)明的 “一種黃芩素液的配制方法”[5]。其中，涉及了一種黃芩素液的配制方法，它在清除氧自由 基，減輕組織缺血再灌注損傷，調(diào)節(jié)免疫功能，保肝利膽，抗感染，抗腫瘤等方面均有一定的 作用，是多種中藥注射液、口服液、膠囊、飲片、丸散、膏丹的組成成分。在中國專利CN 1528289A (公開號)中記載了西安交通大學(xué)李宗芳等發(fā)明的“治療 急性胰腺炎的復(fù)方大黃素黃芩素注射液及其制備方法”[6]。其中，涉及了一種復(fù)方大黃素黃 芩素注射液的制備方法，它在治療急性胰腺炎中的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的要解決的技術(shù)問題是提供式⑴所示的黃芩素在制藥中的新用途，即黃 芩素在制備預(yù)防和治療帕金森病藥物中的應(yīng)用。 本發(fā)明中預(yù)防、緩解和/或治療帕金森病或癥狀包括解除疾病癥狀和預(yù)防、延緩 病情發(fā)展或逆轉(zhuǎn)病理發(fā)展過程。本專利發(fā)明的黃芩素可以有效緩解帕金森病人的癥狀；解除以震顫為主要特征的 帕金森癥狀；發(fā)明了黃芩素可以保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的病理性變化，有利于抑制帕金森病的發(fā)展， 促進(jìn)帕金森病的逆轉(zhuǎn)或恢復(fù)。所述預(yù)防、緩解和/或治療帕金森病或癥狀選自改善帕金森病的震顫癥狀和/或 運(yùn)動功能障礙癥狀。改善帕金森病的震顫癥狀主要是通過減少震顫的頻率、降低震顫的幅度實(shí)現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明黃芩素還可以制備用于預(yù)防、緩解和/或治療帕金森相關(guān)疾病的藥 物。所述的帕金森相關(guān)疾病是神經(jīng)細(xì)胞損傷、神經(jīng)退行性疾病和/或神經(jīng)遞質(zhì)代謝異 常相關(guān)的疾病。
根據(jù)本發(fā)明黃芩素還可以制備用于預(yù)防、緩解和/或治療震顫癥狀及其相關(guān)疾病 的藥物中的應(yīng)用。所述的震顫癥狀及其相關(guān)疾病是以肢體肌電活動頻繁為特征的。本發(fā)明還提供了一種預(yù)防、緩解和/或治療帕金森病或癥狀的藥物組合物，含有 預(yù)防或治療有效量的黃芩素，以及任選的藥學(xué)可接受的載體和/或輔料。黃芩素還可以與其他化合物組合用于制備防治帕金森病，特別是與黃酮類天然產(chǎn) 物組合制備的用于治療帕金森病藥物制劑。因此本發(fā)明的藥物組合物還可以含有其他黃酮化合物。優(yōu)選的黃酮化合物選自槲 皮素、蘆丁、木犀草素中至少一種。本發(fā)明的藥物組合物，根據(jù)施用途徑所述藥物組合物可呈選自如下的劑型溶液、 懸液、乳劑、丸劑、片劑、膠囊、粉末、控制釋放或持續(xù)釋放制劑。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)黃芩素具有如下藥理作用1.黃芩素能預(yù)防或治療帕金森病。本發(fā)明通過對黃芩素進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)證明其為預(yù)防和治療帕金森病的有效藥 物，通過建立6-羥多巴(6-0HDA)損毀大鼠腦功能的PD大鼠模型確定黃芩素對PD動物模 型運(yùn)動障礙等行為學(xué)指標(biāo)的改善作用，在MPTP誘導(dǎo)的C57BL小鼠帕金森病模型中，證明了 黃芩素可顯著改善MPTP所致的小鼠自發(fā)活動下降，縮短MPTP所致的小鼠爬桿時間延長。2.黃芩素能治療帕金森病的震顫癥狀。在6-0HDA損毀的大鼠模型中，黃芩素可明顯改善6-0HDA所致大鼠肌肉震顫表現(xiàn)， 降低震顫的頻率和幅度，并證明這種保護(hù)作用主要是改善帕金森病動物模型的中樞病理狀 態(tài)的結(jié)果，與外周神經(jīng)傳導(dǎo)無直接關(guān)系，是黃芩素對帕金森病治療的重要特點(diǎn)之一。3.黃芩素能調(diào)節(jié)帕金森病動物模型腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)。黃芩素可以改變帕金森病模型動物腦內(nèi)紋狀體等區(qū)域的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，氨基酸 等活性成分的代謝過程和濃度，可以提高紋狀體多巴胺、高香草酸與5-羥色氨的水平，增 加黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目和多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體數(shù)目，抑制氧化應(yīng)激與炎癥，從而發(fā)揮防治帕 金森病的作用。4.黃芩素能保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。本發(fā)明涉及黃芩素能濃度依賴性的減輕6-0HDA致SH-SY5Y細(xì)胞的活力下降，減輕 6-0HDA致SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡，提示黃芩素預(yù)防和治療帕金森病的作用與其抗凋亡、抗炎 與抗氧化作用有關(guān)。本發(fā)明還提供了黃芩素作為活性成份和常規(guī)藥物賦形劑或輔劑的藥物組合物。本發(fā)明化合物的藥物組合物可根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法制備，用于此目的時，如果 需要，可將本發(fā)明化合物與一種或多種固體或液體藥物賦形劑和/或輔劑結(jié)合，制成可作 為人藥或獸藥使用的適當(dāng)?shù)氖┯眯问交騽┝啃问?。例如黃芩素片劑的制備可以使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例 如稀釋劑與吸收劑，如淀粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、碳酸 鈣、白陶土、微晶纖維素、硅酸鋁等；濕潤劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀 粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、紫膠、甲基纖維 素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，例如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐藻淀粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖 維素等；崩解抑制劑，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；吸收促進(jìn)劑，例如季 銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤滑劑，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸鹽、硼酸、液體 石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進(jìn)一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣 片，或雙層片和多層片。黃芩素丸劑的制備可以使用本領(lǐng)域公知的各種載體，關(guān)于載體的例子是，例如稀 釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、高嶺土、滑石 粉等；粘合劑，如阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂 粉、干燥淀粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。黃芩素膠囊的制備可將黃芩素與上述的各種載體混合，并將由此得到的混合物置 于硬的明膠膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分本發(fā)明化合物制成微囊劑，混懸于水性介質(zhì) 中形成混懸劑，亦可裝入硬膠囊中或制成注射劑應(yīng)用。黃芩素注射用制劑的制備，如溶液劑、混懸劑溶液劑、乳劑、凍干粉針劑，這種制劑 可以是含水或非水的，可含一種和/或多種藥效學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、粘合劑、潤滑 劑、防腐劑、表面活性劑或分散劑。如稀釋劑可選自水、乙醇、聚乙二醇、1，3_丙二醇、乙氧基 化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，為了制備等滲注射 液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規(guī)的助溶 劑、緩沖劑、PH調(diào)節(jié)劑等。這些輔料是本領(lǐng)域常用的此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、甜味劑或 其它材料。給藥劑型可以是液體劑型、固體劑型。如液體劑型可以是真溶液類、膠體類、微粒 劑型、乳劑劑型、混懸劑型。其他劑型例如片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混 懸劑、乳劑、顆粒劑、栓劑、凍干粉針劑等。本發(fā)明化合物可以制成普通制劑、也可以是緩釋制劑、控釋制劑、靶向制劑及各種
微粒給藥系統(tǒng)。本發(fā)明還提供了通過給與黃芩素或其藥物組合物來預(yù)防、緩解和/或治療帕金森 病或癥狀的方法。為達(dá)到用藥目的，增強(qiáng)治療效果，本發(fā)明的藥物或藥物組合物可用任何公知的給 藥方法給藥。本發(fā)明化合物或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道 或非腸道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮膚、腹膜或直腸等。本發(fā)明化合物或含有它的藥物組合物的給藥途徑可為注射給藥。注射包括靜脈注 射、肌肉注射、皮下注射、皮內(nèi)注射和穴位注射等。本發(fā)明化合物藥物組合物的給藥劑量取決于許多因素，例如所要預(yù)防或治療疾病 的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，患者或動物的性別、年齡、體重、性格及個體反應(yīng)，給藥途徑、給藥次數(shù)、 治療目的，因此本發(fā)明的治療劑量可以有大范圍的變化。一般來講，本發(fā)明藥學(xué)成分的使用 劑量是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明化合物組合物中最后的制劑中所含有的 實(shí)際藥物數(shù)量，加以適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，以達(dá)到其治療有效量的要求，完成本發(fā)明的預(yù)防或治療目 的。
每一種治療所需總劑量可分成多次或按一次劑量給藥。本發(fā)明的化合物或組合物 可單獨(dú)服用，或與其他治療藥物合并使用并調(diào)整劑量。


圖1.黃芩素對MPTP致帕金森病小鼠紋狀體單胺類遞質(zhì)的影響#P < 0. 05，##P < 0. 01 vs MPTP 模型組，*P < 0. 05，**P < 0. 01 vs 正常對照組.圖2.黃芩素對MPTP致帕金森病小鼠腦黑質(zhì)TH，DAT, GFAP的影響。#P < 0. 05，##P < 0. 01 vs MPTP 模型組，*P < 0. 05，**P < 0. 01 vs 正常對照組.圖3.黃芩素對6-0HDA偏側(cè)損傷大鼠震顫活動的影響。#P < 0. 05，##P < 0. 01 vs 6-0HDA 模型組，*P < 0. 05，**P < 0. 01 vs 假手術(shù)組 圖4.黃芩素對6-0HDA偏側(cè)損傷大鼠外周神經(jīng)傳導(dǎo)速度的影響。#P < 0. 05 vs 6-0HDA 模型組，*P < 0. 05 vs 假手術(shù)組.圖5.黃芩素對6-0HDA偏側(cè)損傷大鼠腦黑質(zhì)TH，GFAP的影響。#P < 0. 05，##P < 0. 01 vs 6-0HDA 模型組，*P < 0. 05，**P < 0. 01 vs 假手術(shù)組
圖6.黃芩素對6-0HDA致SH-SY5Y細(xì)胞損傷存活率的影響#P < 0. 05 vs 6-0HDA, *P < 0. 05 vs 空白組.圖7.細(xì)胞核染色法檢測黃芩素對6-0HDA致SH-SY5Y細(xì)胞調(diào)亡的影響(a 空白組；b :6-0HDA組；c 黃芩素低劑量組；d 黃芩素中劑量組；e 黃芩素高 劑量組)圖8.流式細(xì)胞儀檢測黃芩素對6-0HDA致SH-SY5Y細(xì)胞調(diào)亡的影響。#P < 0. 05 vs 6-0HDA, *P < 0. 05，**P < 0. 01 vs 空白組.術(shù)語和簡稱MPTP 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶6-0HDA :6_羥基多巴胺
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例具體顯示本發(fā)明的應(yīng)用。但本實(shí)施例不限定本發(fā)明的使用范圍。實(shí)施例1、黃芩素對MPTP誘導(dǎo)PD小鼠行為學(xué)的改善作用模型建立與分組C57BL/6小鼠隨機(jī)分為3組，分別為正常對照組、MPTP模型組、黃芩素給藥組 (200mg/kg)，每組12只。對照組和模型組預(yù)先給予灌喂生理鹽水，給藥組給予上述劑量的 藥物，連續(xù)灌胃給藥一周后，在第8天模型組和給藥組腹腔注射MPTP (30mg/kg)，每天一次， 連續(xù)5天，第13天觀察小鼠的行為學(xué)指標(biāo)檢測。行為學(xué)檢測1.自發(fā)活動實(shí)驗(yàn)使用小鼠自主活動儀(ZIL-2型小鼠自主活動儀，中國醫(yī)學(xué)科學(xué) 院藥物研究所)測定小鼠自發(fā)活動并計(jì)數(shù)，將小鼠放入自主活動箱中(高13cm，直徑25cm， 每次同時測定4只小鼠，每個活動箱中1只)，由記錄儀自動記錄小鼠活動，測定前每只小鼠 先自由活動3分鐘，然后測定每只小鼠5min內(nèi)的活動次數(shù)。2.爬桿實(shí)驗(yàn)將一直徑為2. 5cm的軟木小球固定于一根長50cm直徑1cm的木桿頂端，木桿上纏以紗布以防打滑，作為實(shí)驗(yàn)爬桿。實(shí)驗(yàn)期間，每天引導(dǎo)小鼠從桿頂爬到桿底，每 天2次。測試時將被測小鼠置于軟木小球上，記錄小鼠爬到桿底所需要的時間并作統(tǒng)計(jì)學(xué) 分析，超過60s的以60s計(jì)。在給藥前先測定所有小鼠爬桿時間，并在末次腹腔注射MPTP 后lh，再次測定其爬桿時間，每只小鼠測3次取平均值。以末次爬桿時間減去給藥前爬桿時 間的差值，作為衡量小鼠因MPTP引起肢體協(xié)調(diào)能力下降程度的指標(biāo)。MPTP可明顯的降低小鼠的自發(fā)活動次數(shù)和延長小鼠爬竿時間，而黃芩素可顯著改 善MPTP所致的小鼠自發(fā)活動下降，縮短小鼠爬桿時間的延長，這顯示黃芩素能明顯改善PD 模型小鼠的肢體協(xié)調(diào)能力，并增加小鼠的運(yùn)動(表1、2)。表1黃芩素對MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠自發(fā)活動的影響 注#P< 0. 05 vs. MPTP 模型組，*P < 0. 05 vs.正常對照組 N = 12. (mean士 S. D)表2黃芩素對MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠爬竿時間的影響 注#P< 0. 05 vs. MPTP 模型組，*P < 0. 05 vs.正常對照組 N = 12. (mean士 S. D)實(shí)施例2、黃芩素對MPTP誘導(dǎo)PD小鼠腦紋狀體內(nèi)單胺類遞質(zhì)的影響模型建立與分組同上。每組取6只小鼠進(jìn)行取材，斷頭開顱取腦，冰盤上分離兩側(cè) 黑質(zhì)和紋狀體，凍存于液氮。取一側(cè)紋狀體進(jìn)行神經(jīng)遞質(zhì)的測定。取紋狀體稱重、記錄，冰 浴中于0. 2ml勻漿液中勻漿40s，80%超聲能量，cycle = 0. 7 A°C 12000rpm離心30min， 取上清液用高效液相電化學(xué)的方法檢測多巴胺(DA)及其代謝產(chǎn)物二羥苯乙酸(D0PAC)、高 香草酸(HVA)，5-羥色胺(5-HT)及其代謝產(chǎn)物5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)的水平，每次進(jìn)樣 20 ill。流動相0. lmol/1 NaH2P04 水溶液含 0. 85mmol/l 0SA、0. 5mmol/l EDTANa2 禾口 11% 甲醇，用濃磷酸調(diào)pH至3. 25，0.45 iim微孔濾膜抽濾脫氣；固定相:Hypersil C185iim填充 不銹鋼柱。工作電壓+0. 75mV，柱溫35°C，流速0. 8ml/min。與正常對照組相比，小鼠連續(xù)腹腔注射MPTP 5天后，紋狀體中的DA及其代謝產(chǎn)物 D0PAC、HVA含量均顯著下降。用黃芩素預(yù)處理后，DA和HVA含量均顯著增加，但D0PAC的含 量無明顯變化(圖1A)。MPTP也可導(dǎo)致紋狀體中的5-HT含量顯著的下降，但對5-HI從的 含量沒有顯著的影響。用黃芩素預(yù)處理后，紋狀體中5-HT的含量可顯著增加(圖1B)。實(shí)施例3、黃芩素對MPTP誘導(dǎo)PD小鼠腦黑質(zhì)酪氨酸羥化酶(TH)，多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(DAT)，膠質(zhì)源性纖維蛋白(GFAP)表達(dá)的影響模型建立與分組同上。每組取6只行免疫組化檢測。用4%水合氯醛麻醉固定， 打開胸腔，分別用生理鹽水和4%多聚甲醛灌注固定，開顱取腦。置于4%多聚甲醛中后固 定1天，再換入含30%蔗糖的0. 01M PBS中。待腦組織下沉后用冰凍切片機(jī)切取20 y m厚 冠狀平面的腦片。腦片用PBST(PH = 7. 4)振蕩漂洗3次，每次lOmin ；再用3%的H202處 理lOmin，PBST振蕩漂洗3次，每次lOmin ；用封閉液孵育lh ；加入一抗(TH，1 500 ；DAT, 1 200 ；GFAP, 1 400)，4°C孵育過夜。PBST振蕩漂洗3次，每次lOmin后，分別與生物素 標(biāo)記的二抗(1 300)室溫孵育lh;PBST振蕩漂洗3次，每次lOmin后，與卵白素-生物素 復(fù)合物(ABC)室溫孵育2h ；再次PBST振蕩漂洗3次，每次lOmin。DAB顯色，鏡下觀察，適時 用PBS終止反應(yīng)。免疫組化對照組不加一抗，用PBS代替，其余步驟同前。貼片，晾干，乙醇 梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察并攝片。免疫組化切片采用IPP5. 1圖像 分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，所有切片均采用同一放大倍數(shù)(X200)。每只小鼠選取3張切片， 分別累計(jì)左側(cè)和右側(cè)黑質(zhì)的免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元數(shù)目并計(jì)算其均數(shù)。MPTP腹腔連續(xù)注射5天后，黑質(zhì)TH免疫陽性神經(jīng)元和DAT免疫陽性神經(jīng)元的數(shù)目 顯著下降，預(yù)先給予黃芩素可分別使TH陽性神經(jīng)元數(shù)目和DAT陽性神經(jīng)元數(shù)目有一定程度 的增加，說明黃芩素具有一定的神經(jīng)元保護(hù)作用。另外，MPTP可使黑質(zhì)內(nèi)GFAP免疫陽性星 形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目顯著增加，而黃芩素可顯著降低GFAP免疫陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目，說明 黃芩素可以通過抑制膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生來抑制炎癥反應(yīng)(圖2)。實(shí)施例4、黃芩素對MPTP誘導(dǎo)PD小鼠腦超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化 物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量的影響模型建立與分組同上。鼠斷頭開顱，取腦組織標(biāo)本，以濾紙吸干表面殘血，去處嗅 球、腦干、小腦。腦組織標(biāo)本分別置于玻璃勻漿器，用冰生理鹽水按質(zhì)量與體積比為1 9 的比例冰浴下制備成10%的腦組織勻漿，立即放入-40°C冰箱保存待測。實(shí)驗(yàn)前以考馬斯 亮藍(lán)法測定腦組織蛋白定量。按南京建成生物工程研究所試劑盒說明書要求，用Spectra Max M5酶標(biāo)儀分別測定腦組織中SOD、GSH-Px活性和MDA含量。MPTP腹腔注射5天可導(dǎo)致腦組織中MDA水平顯著升高，GSH-Px水平顯著降低，而 S0D含量未見明顯變化，黃芩素可顯著降低腦組織中MDA水平，增加S0D活性與GSH-Px水平 (表3)，表現(xiàn)出明顯的抗氧化活性。表3黃芩素對MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠腦組織SOD、GSH-Px活性和MDA水平的影響 注#P< 0. 05 vs. MPTP 模型組，*P < 0. 05 vs.正常對照組，N = 6. (mean士S. D)實(shí)施例5、黃芩素對6-0HDA偏側(cè)損傷大鼠震顫活動的改善作用模型制備 健康雄性SD大鼠隨機(jī)分成2組，分別為假手術(shù)組和模型組。3%戊巴比妥鈉 (50mg/kg)腹腔注射麻醉，常規(guī)皮膚消毒后，將大鼠頭部固定在立體定位儀上，暴露顱骨后參照Paxinos和Watson鼠腦立體定位圖譜，在左側(cè)相當(dāng)于MFB區(qū)的顱骨表面鉆孔，直徑約 2.5cm。清理腦膜后，在三維推動器的引導(dǎo)下行MFB兩點(diǎn)注射6-0HDA(4mg/ml)。坐標(biāo)如下 (1)TB -2. 3mm, AP -4. 4mm, ML 1. 2mm, V :_7. 8mm ； (2)TB :+3. 4mm, AP :_4. 0mm, ML :0. 8mm, V :-8. 0mm。兩點(diǎn)注射6-0HDA的量均為3 yl，注射速度控制在1 y 1/min，每次注射后留針 lOmin后緩慢出針。術(shù)后連續(xù)3d肌注青霉素20萬U/d以防感染。假手術(shù)組大鼠注射等量 的生理鹽水。于術(shù)后第14天測試阿樸嗎啡(AP0，皮下注射，0.2mg/kg)誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)行為。 AP0注射后，動物向注射6-0HDA的對側(cè)做旋轉(zhuǎn)運(yùn)動，每運(yùn)動360°，作為一次旋轉(zhuǎn)。選取轉(zhuǎn) 速> 240r/40min的大鼠作為成功PD模型大鼠。將成功PD模型大鼠隨機(jī)分為3組，每組 12只，分別為模型組，黃芩素組(baicalein，200mg/kg)，陽性藥美多芭組(madopar，50mg/ kg)。另外取假手術(shù)組12只作為對照，每天給予生理鹽水一次，于造模后第三周進(jìn)行大鼠震 顫活動的測定。震顫活動的檢測將雙記錄電極插在大鼠臀部肌肉上，參考電極接地。使用BL-420E生物信號采集 器對清醒大鼠后肢進(jìn)行震顫活動測定，評價其震顫頻率和震顫幅度。刺激信號選擇1毫伏 (mv),0. 015毫秒(ms)，掃描速度為0. 01秒(s)，10kHz濾波。分別記錄3個1分鐘內(nèi)大鼠 震顫的頻率和幅度，取平均值。測試結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，6-0HDA損傷組的震顫頻率和震顫幅度具有有顯 著的增加；與模型組相比，黃芩素和美多芭可明顯改善6-0HDA所致帕金森病模型大鼠的震 顫活動，減少震顫頻率，降低震顫幅度(圖3)。實(shí)施例6、黃芩素對6-0HDA偏側(cè)損傷大鼠外周神經(jīng)傳導(dǎo)速度的影響模型制備與分組同上。大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉腹腔麻醉，俯臥固定。刺激電極為雙針 電極，插入坐骨神經(jīng)窩處坐骨神經(jīng)干附近，引導(dǎo)電極為雙針電極，插入腓腸肌肌腹，兩電極 相距約2cm。設(shè)備采用BL-420E生物信號采集器，刺激信號選擇0. 6毫伏(mv)，0. 02毫秒 (ms)，單刺激，掃描速度為0. 01秒(s)，1kHz濾波，引導(dǎo)信號放大50倍，每分鐘刺激一次，共 刺激六次。計(jì)算神經(jīng)肌肉動作電位潛伏期，傳導(dǎo)速度計(jì)算公式為V =刺激電極到引導(dǎo)電極的距離(mm)/潛伏期(ms)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，6-0HDA模型組大鼠外周神經(jīng)傳導(dǎo)速度較假手術(shù)組明顯增快，黃芩 素對外周神經(jīng)傳導(dǎo)速度無明顯的抑制作用(圖4)，這提示黃芩素對6-0HDA損毀大鼠模型的 保護(hù)作用與外周神經(jīng)傳導(dǎo)無直接關(guān)系。實(shí)施例7、黃芩素對6-0HDA偏側(cè)損傷大鼠腦黑質(zhì)酪氨酸羥化酶(TH)，膠質(zhì)源性纖 維蛋白(GFAP)表達(dá)的影響模型建立與分組同上。每組取6只行免疫組化檢測。用4%水合氯醛麻醉固定，打 開胸腔，分別用生理鹽水和4%多聚甲醛灌注固定，開顱取腦。置于4%多聚甲醛中后固定1 天，再換入含30%蔗糖的0. 01M PBS中。待腦組織下沉后用冰凍切片機(jī)切取20 iim厚冠狀平 面的腦片。腦片用PBST (PH = 7. 4)振蕩漂洗3次，每次lOmin ；再用3%的H202處理lOmin， PBST振蕩漂洗3次，每次lOmin ；用封閉液孵育lh ；加入一抗(TH，1 500 ；GFAP, 1 400)， 4°C孵育過夜。PBST振蕩漂洗3次，每次lOmin后，分別與生物素標(biāo)記的二抗(1 300)室 溫孵育lh ；PBST振蕩漂洗3次，每次lOmin后，與卵白素-生物素復(fù)合物(ABC)室溫孵育 2h ；再次PBST振蕩漂洗3次，每次lOmin。DAB顯色，鏡下觀察，適時用PBS終止反應(yīng)。免疫組化對照組不加一抗，用PBS代替，其余步驟同前。貼片，晾干，乙醇梯度脫水，二甲苯透 明，中性樹膠封片，光鏡下觀察并攝片。免疫組化切片采用IPP5. 1圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像 分析，所有切片均采用同一放大倍數(shù)(X200)。每只大鼠選取3張切片，分別累計(jì)左側(cè)和右 側(cè)黑質(zhì)的免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元數(shù)目并計(jì)算其均數(shù)。6-0HDA腦定位注射后，黑質(zhì)TH免疫陽性神經(jīng)元數(shù)目顯著下降，預(yù)先給予黃芩素可使 TH陽性神經(jīng)元數(shù)目有一定程度的增加，說明黃芩素具有一定的神經(jīng)元保護(hù)作用。另外，6-0HDA 可使黑質(zhì)內(nèi)GFAP免疫陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目顯著增加，而黃芩素可顯著降低GFAP免疫陽性星 形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目，說明黃芩素可以通過抑制膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生來抑制炎癥反應(yīng)(圖5)。實(shí)施例8、黃芩素對6-0HDA損傷細(xì)胞活力的影響細(xì)胞的培養(yǎng)與處理SH-SY5Y細(xì)胞以完全RMPI1640培養(yǎng)基(含10 %胎牛血清，100U/ml青霉素， 100 u g/ml鏈霉素，1 %谷氨酰胺)，于37°C，5% C02飽和濕度條件下培養(yǎng)。每2_3天換一次 液。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1X105個/ml，接種至96孔培養(yǎng) 板，每孔200ia，培養(yǎng)24h至亞融合狀態(tài)。換用無血清培養(yǎng)基，同時加入黃芩素(終濃度5， 0. 5,0. 05 u g/ml)孵育lh后，再加入6-0HDA(終濃度100 y M)，24h后進(jìn)行測定。細(xì)胞活力的測定加入無血清培養(yǎng)基配制的MTT 200111，終濃度為0.51^/1111，371繼續(xù)培養(yǎng)411后， 移走M(jìn)TT，加入二甲亞砜200iU溶解細(xì)胞染色的晶體，在570nm處讀取吸收值。以正常對照 組細(xì)胞存活率為100%，計(jì)算不同處理組細(xì)胞存活率。MTT檢測結(jié)果顯示，lOOiiM 6-0HDA作用SH-SY5Y細(xì)胞24h可導(dǎo)致細(xì)胞活力顯著下 降，而預(yù)先給予黃芩素(0.5，5i!g/ml)可顯著提高細(xì)胞的存活能力，結(jié)果以細(xì)胞存活率表 示(圖6)。實(shí)施例9、黃芩素對6-0HDA損傷細(xì)胞調(diào)亡形態(tài)學(xué)的影響細(xì)胞的培養(yǎng)與處理同上。藥物作用結(jié)束后，吸盡培養(yǎng)液，用PBS洗一遍。加入 200iU固定液，固定lOmin。棄去固定液，加入含Hoechest 33258 (終濃度10 y g/ml)的 PBS液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育5min，于熒光顯微鏡下觀察，以紫外光激發(fā)，同時拍照。Hoechest染色結(jié)果顯示，正常培養(yǎng)的對照組細(xì)胞的細(xì)胞核多數(shù)為大小較一致、染 色均勻的圓形核，偶見固縮濃染核；而經(jīng)6-0HDA處理12h的細(xì)胞不僅細(xì)胞數(shù)減少，且出現(xiàn)凋 亡的細(xì)胞核增多，染色質(zhì)發(fā)生固縮，細(xì)胞核致密濃染，形狀不規(guī)則，呈顆粒、小塊狀。給予黃 芩素可顯著改善上述凋亡相關(guān)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變(圖7)。實(shí)施例10、黃芩素對6-0HDA損傷細(xì)胞調(diào)亡率的影響藥物作用結(jié)束后收集細(xì)胞，以PBS洗兩遍。收集的細(xì)胞沉淀加入70%乙醇混勻， 4°C固定過夜，lOOOrpm離心5min，棄去固定液。3mlPBS重懸沉淀5min，用400目鋼絲網(wǎng)過 濾，4°C，1500rpm離心lOmin，棄上清。在沉淀中加入lml PBS，加入PI(終濃度100 u g/ml)。 4°C避光30min，用流式細(xì)胞儀檢測10000個細(xì)胞，激發(fā)波長為488nm，發(fā)射波長為630nm，并
計(jì)算凋亡百分率。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率結(jié)果表明，正常情況下細(xì)胞凋亡率小于5%，而 100 ii M的6-0HDA作用于SH-SY5Y細(xì)胞12h可明顯增加細(xì)胞凋亡率，給予0. 5，5 y g/ml的黃 芩素可顯著抑制細(xì)胞凋亡(圖8)。
權(quán)利要求
如通式(I)所示的黃芩素在制備用于預(yù)防、緩解和/或治療帕金森病或癥狀的藥物中的應(yīng)用F2009100815798C0000011.tif
2.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其特征在于，所述預(yù)防、緩解和/或治療帕金森病或癥狀選 自改善帕金森病的震顫癥狀和/或運(yùn)動功能障礙癥狀。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的應(yīng)用，其特征在于，所述的改善帕金森病的震顫癥狀是減少震顫 的頻率、降低震顫的幅度。
4.如通式(I)所示的黃芩素在制備用于預(yù)防、緩解和/或治療帕金森相關(guān)疾病的藥物 中的應(yīng)用
5.根據(jù)權(quán)利要求4的應(yīng)用，其特征在于，所述的帕金森相關(guān)疾病是神經(jīng)細(xì)胞損傷、神經(jīng) 退行性疾病和/或神經(jīng)遞質(zhì)代謝異常相關(guān)的疾病。
6.如通式(I)所示的黃芩素在制備用于預(yù)防、緩解和/或治療震顫癥狀及其相關(guān)疾病 的藥物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的應(yīng)用，其特征在于，所述的震顫癥狀及其相關(guān)疾病是以肢體肌電 活動頻繁為特征的。
8.一種預(yù)防、緩解和/或治療帕金森病或癥狀的藥物組合物，其特征在于，含有預(yù)防或 治療有效量的黃芩素，以及任選的藥學(xué)可接受的載體和/或輔料。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物還含有其他黃酮化 合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的藥物組合物，其特征在于，所述的黃酮化合物選自槲皮素、蘆丁、木犀草素中至少一種。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的藥物組合物，其特征在于，根據(jù)施用途徑所述藥物組合物可呈選 自如下的劑型溶液、懸液、乳劑、丸劑、片劑、膠囊、粉末、控制釋放或持續(xù)釋放制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種如通式(I)所示黃芩素(化學(xué)名5，6，7-三羥基黃酮；英文名Baicalein)在制備預(yù)防和治療帕金森病藥物中的應(yīng)用；本發(fā)明涉及黃芩素能夠降低帕金森病震顫的頻率和幅度，改善和治療帕金森病癥狀；涉及黃芩素能夠保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元免受損傷，可有效地預(yù)防和治療帕金森的病理變化和帕金森病的發(fā)展；黃芩素通過抗凋亡、抗炎、抗氧化發(fā)揮保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元的作用和通過對神經(jīng)系統(tǒng)的作用發(fā)揮抑制帕金森癥狀的作用。本發(fā)明涉及由黃芩素在制備防治帕金森藥物時單獨(dú)使用和與其他物質(zhì)合用制成的各種制劑。
文檔編號A61K31/352GK101856350SQ200910081579
公開日2010年10月13日 申請日期2009年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月13日
發(fā)明者何國榮, 呂揚(yáng), 李曉秀, 杜冠華, 楊寧, 穆鑫 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所