專利名稱：：3,5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛在射線防護中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛的一種新用途。
背景技術(shù)：
：輻射防護藥物不但是防護核武器損傷的重要裝備藥物，也是當(dāng)前反核恐怖襲擊和應(yīng)對核突發(fā)公共事件的關(guān)鍵救治藥物和防護空間輻射對航天員損傷的藥物。核輻射能損傷DNA分子、引起造血組織功能障礙、外周血白細胞下降、免疫功能降低，以及遠后致癌等效應(yīng)，對機體危害極大。a粒子屬于高能輻射物質(zhì)，它對機體造成的復(fù)合損傷遠大于Y射線，防治難度更大。目前尚缺乏有效的針對a粒子輻射損傷的防護藥物。因此，尋找無毒或低毒、高效的a粒子輻射防護藥物具有重要意義。3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛(又名丁香醛，syringaldehyde)是化學(xué)合成的一個香蘭素衍生物，目前常被作為食品添加劑使用(中華人民共和國衛(wèi)生部公告2008年第27號)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的是提供3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛的一種新用途。本發(fā)明所提供的3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛的新用途，是3,5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛在a粒子射線防護中的應(yīng)用。其中，a粒子射線為高LET輻射a粒子射線。本發(fā)明的另一個目的是提供一種a粒子射線防護藥物。本發(fā)明所提供的a粒子射線防護藥物，其活性成份為3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛。本發(fā)明的另一個目的是提供3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛的另一種新用途。本發(fā)明所提供的3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛的另一種新用途，是3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛在Y射線防護中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個目的是提供一種Y射線防護藥物。本發(fā)明所提供的Y射線防護藥物，其活性成份為3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛。3,5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛在制備a射線防護藥物或在制備Y射線防護藥物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。在上述兩種新用途中，具體可以將3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛注入機體靜脈中，從而減少射線對機體的傷害。根據(jù)實際需要，可以在上述各藥物中加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體，如藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、黏合劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等，必要時還可以加入香味劑、甜味劑等。本發(fā)明的藥物可以制成注射劑、片劑、粉劑、粒劑膠囊、口服液、膏劑、霜劑等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。實驗表明，在細胞體外培養(yǎng)中，用a射線輻照細胞的實驗條件下，若在培養(yǎng)體系中添加了3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛，則細胞克隆形成率要明顯高于未添加藥物組，由輻照引起的基因突變效率也明顯低于未添加組；在Y射線輻照小鼠的試驗中，事先注射了3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛的小鼠與未注射的小鼠相比，其由輻射導(dǎo)致的小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)降低程度減輕，白細胞數(shù)目增多，小鼠血清的Cu/Zn-SOD活性也比較高，脾臟的白髓淋巴細胞減少程度顯著減輕，脾臟凋亡細胞數(shù)目少，骨髓細胞微核率減少。因此，3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛可減輕射線輻照引起的DNA損傷和基因突變，具有輻射防護作用。本發(fā)明的射線防護藥物，在a射線或Y射線防護中將有重要的應(yīng)用價值，對一些由射線輻照引起的基因組損傷和放射性疾病的預(yù)防和/或治療將有重要作用。圖1為3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛對小鼠胸腺指數(shù)及脾指數(shù)的影響示意圖。圖2為3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛對小鼠血清SOD的影響示意圖。圖3為3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛對小鼠脾臟形態(tài)學(xué)的影響示意圖。圖4為3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛對小鼠脾臟凋亡的影響示意圖。圖5為3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛對小鼠骨髓微核率影響示意圖。圖6為受3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛作用后，小鼠轉(zhuǎn)錄因子NF-kB的Westernblot結(jié)果圖譜。具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明均為常規(guī)方法。下述實施例中所使用的試劑如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。人正常皮膚成纖維細胞HFS(Tichota-LeeJ,Jaqua-StewartMJ,BenfieldD，Simmons幾，JaquaRA.EffectofageonthesensitivityofcellculturestoClostridiumdifficiletoxin.DiagnMicrobiolInfectDis.1987，8(4):203-214.)(中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所)；人正常淋巴母細胞AHH-1(ZhouPK，Rigaud0.Down-regulationofthehumanCDC16genefollowingionizingradiation:apossibleroleintheradioadaptiveresponse.RadiationResearch,2001，155(1):43-49)(中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所)；DMEM培養(yǎng)基(12100-061)購自Gibco公司；RPMI-1640培養(yǎng)基(31800-022)購自Gibco公司；新生牛血清購自北京元亨金馬生物技術(shù)開發(fā)有限公司；香蘭素購自Sigma公司；3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛購自浙江衢州市瑞爾豐化工有限公司。實施例l、3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛的防護a粒子輻射損傷作用一、細胞預(yù)培養(yǎng)將人正常皮膚成纖維細胞HFS接種于細胞培養(yǎng)基中，再置于5%二氧化碳、37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至指數(shù)生長期；其中，細胞培養(yǎng)基的組成如下向DMEM培養(yǎng)基中添加新生牛血清、青霉素和鏈霉素，使新生牛血清在培養(yǎng)基中的終濃度為10%(體積百分含量)、青霉素的終濃度為100U/ml、鏈霉素的終濃度為100ug/ml。其中，DMEM培養(yǎng)基的組成及濃度完全相同于常規(guī)細胞培養(yǎng)條件，根據(jù)Gibco公司的指南配制。二、輻照細胞設(shè)以下5組實驗實驗組l:向2ml/培養(yǎng)瓶指數(shù)生長期的HFS細胞溶液中，添加3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛，使3,5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛在細胞溶液中的終濃度為5uM;實驗組2:向2ml/培養(yǎng)瓶指數(shù)生長期的HFS細胞溶液中，添加3,5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛，使3,5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛在細胞溶液中的終濃度為20uM;實驗組3:向2ml/培養(yǎng)瓶指數(shù)生長期的HFS細胞溶液中，添加3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛，使3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛在細胞溶液中的終濃度為40uM;對照組l:2ml/培養(yǎng)瓶指數(shù)生長期的HFS細胞溶液，不添加3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛；對照組2:2ral/培養(yǎng)瓶指數(shù)生長期的HFS細胞溶液，不添加3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛；對于實驗l-3組添加3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛后，將細胞繼續(xù)放在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2h，再在室溫下對每個培養(yǎng)皿中的細胞給予0.1Gy的238Pu02照射(a粒子射線輻照)，然后繼續(xù)如下步驟三的實驗；對于對照組2:按照實驗組1-3中的方法進行238PU02照射；對于對照組l:不經(jīng)過23卞1102照射。三、繼續(xù)培養(yǎng)并統(tǒng)計細胞克隆形成率及突變克隆率1、克隆形成率統(tǒng)計分別取步驟二獲得的每組細胞按如下方法進行實驗棄去培養(yǎng)液，用胰酶快速消化細胞后收集細胞，將細胞重懸于上述細胞培養(yǎng)基中，精確計數(shù)，然后將細胞接種于裝有上述細胞培養(yǎng)基的60cm直徑的培養(yǎng)皿中，每組平行接種3皿，在5%二氧化碳、37X:恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天(其中第5天更換一次細胞培養(yǎng)液)后固定，Giemsa染色，計數(shù)細胞克隆數(shù)，并計算克隆形成率。克隆形成率的計算公式如下克隆形成率=(細胞克隆數(shù)+接種細胞數(shù))X100%。2、HPRT基因突變率分別取步驟二獲得的每組細胞按如下方法進行實驗棄去培養(yǎng)液，在原培養(yǎng)皿中不用胰酶消化細胞直接更換上述新鮮的細胞培養(yǎng)基，在5%二氧化碳、37"C恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2天；用胰酶快速消化細胞后收集細胞，更換新鮮的細胞培養(yǎng)基，在如上條件下培養(yǎng)3天(第一次傳代)；如此，再進行二次傳代，使細胞hprt基因突變固定下來；用胰酶快速消化細胞后收集細胞，將細胞重懸于上述細胞培養(yǎng)基中，精確計數(shù)，然后將細胞接種于裝有上述細胞培養(yǎng)基的100cm直徑的培養(yǎng)皿，每組平行接種3皿，接種后加入6-TG(美國SIGMA)溶液，皿中6-TG的終濃度為18mg/L細胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)14-18天后用PBS沖洗，固定，Giemsa染色，統(tǒng)計具有6-TG抗性的HFS細胞克隆數(shù)，并計算HPRT基因突變率。HPRT基因突變率的計算公式如下HPRT基因突變率:6-TG抗性細胞克隆數(shù)+接種細胞數(shù)X細胞克隆形成率。實驗設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果如表l所示。結(jié)果表明，與不添加3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛但經(jīng)過相同輻射的對照組相比，添加3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛后可以提高輻照后的HFS細胞的克隆形成率，并可降低經(jīng)輻照引起的HPRT基因突變細胞率，以40uM的添加終濃度效果最佳。表l、3,5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛對體外細胞的ct粒子輻射損傷的防護作用<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例2、3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛對Y射線照射動物(小鼠)的防護作用以成年昆明種小白鼠為實驗對象，雌雄各半，體重為18-21g。將試驗用的昆明種小白鼠隨機分為六個組，每組8只，5.5Gy照射前2小時腹腔給藥一次實驗組l(小劑量)(Dl):按照lmg/kg的劑量向小鼠腹腔注射3,5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛；進行輻照；實驗組2(中劑量)(D10):按照10mg/kg的劑量向小鼠腹腔注射3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛；進行輻照；實驗組3(大劑量)(D100):按照100rag/kg的劑量向小鼠腹腔注射3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛；進行輻照；對照組l(香蘭素VIOO):按照100mg/kg的劑量向小鼠腹腔注射香蘭素；進行對照組2(單純輻射對照)不注射任何香蘭素或3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛;進行輻照；對照組3(正常對照)不注射任何香蘭素或3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛；不進行輻照；照射前2小時，分別按照如上各組的注射劑量給小鼠進行腹腔注射；然后對實驗組l-3及對照組l-2的小鼠進行全身6。CoY射線輻照一次，輻射劑量率為188.2cGy/min，每只小鼠輻照劑量為5.5Gy;照射后進行普通喂養(yǎng)，分別于6h、12h尾靜脈取血(每只10pl)，做血清超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測。12h或24h后頸椎脫臼法處死小鼠，然后進行各項指標的檢測(1)檢測小鼠胸腺和脾指數(shù)(結(jié)果為圖l):胸腺指數(shù)的定義為胸腺占體重的比重；檢測方法為取出臟器用電子天平稱量。脾臟指數(shù)的定義為脾臟占體重的比重；檢測方法為取出臟器用電子天平稱量。(2)檢測小鼠血清的Cu/Zn-SOD活性(結(jié)果為圖2)血清的Cu/Zn-SOD活性方法采用黃嘌呤氧化法測定血清中Cu/Zn-SOD活性。(3)檢測脾臟病理形態(tài)學(xué)改變(結(jié)果為圖3)方法受照射后12h處置動物后即取小塊脾臟，固定在10%中性甲醛中，制作病理切片，HE染色后普通光學(xué)顯微鏡下觀察病理變化。(4)脾臟凋亡細胞數(shù)目(結(jié)果為圖4)方法釆用末端標記法(TUNEL)檢測細胞凋亡。受照射后12h處置動物后即取小塊脾臟，固定在10%中性甲醛中，石蠟包埋切片。玻片預(yù)先用多聚賴氨酸處理。切片常臘入水。新鮮配制的3%H202，室溫處理10min。蒸餾水洗滌2rain共3次。玻片加O.OlMTBS按l:200稀釋ProteinaseK，37。C消化10min，0.01MTBS洗2min共3次。玻片上加標記緩沖液20ul，以保持切片濕潤。按每張切片加TdT和DIG-d-UTP各lul，加入18ul標記緩沖液中，混勻。20ul/片。置于濕盒中，37。C標記2h。TBS洗2min共3次。加封閉液50ul/片，室溫30min，去封閉液，加l:IOO稀釋的生物素化抗DIG抗體，50ul/片。置于濕盒中，37。C標記30min。TBS洗3次。加l:IOO稀釋的SABC，50ixl/片。置于濕盒中，37。C標記30min。TBS洗5min共4次。DAB顯色和蘇木素復(fù)染，中性樹脂封片。光鏡下觀片并攝像。(5)骨髓細胞微核的變化(結(jié)果為圖5)細胞微核的定義細胞微核是細胞遺傳(基因組DNA)損傷的一種表現(xiàn)形式，是指細胞中出現(xiàn)游離于主核的核結(jié)構(gòu)，體積小于主核的1/3。方法采用流式細胞術(shù)檢測小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率。具體步驟1)取10ul全血加入80ul肝素生理鹽水中；2)取步驟l)得到的樣品加入一8(TC預(yù)冷的2ml甲醇中，置一80。C中24h以上；3)往步驟2)得到的樣品中加入8ml4。C預(yù)冷的Na跳緩沖液(0.9%NaCl，5.3mmol/LNaHC03，pH=7.5);4)離心(3000轉(zhuǎn)/min，10min)去上清，加入250u1NaHC03緩沖液，4"C保存(2h內(nèi))；5)取步驟4)得到的樣品12ul加入10u1RNA酶(10mg/ml，需沸水滅活15min)、0.3uLFITC標記的CD71抗體、70u1NaHC03緩沖液，置4。Cl2h后37。C溫育45min;6)加300ul4。C預(yù)冷的PI(1.33ug/ml)，混勻后置4"C染色30min，流式檢測。實驗設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果如圖2-圖5所示將添加3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛組的結(jié)果與添加香蘭素組的結(jié)果進行比較，結(jié)果如下中劑量(D10)的3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛，可抑制輻射致小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的降低，其效果與100mg/kg的香蘭素接近(圖l，與單純照射對照組比，A為p<0.05;*為p<0.01);小劑量(Dl)的3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛，可提升白細胞數(shù)目，增加小鼠血清的Cu/Zn-SOD活性；效果與100mg/kg的香蘭素接近(圖2，與單純照射對照組比，A為p<0.05;*為p<0.01);中劑量(D10)的3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛，就使輻射誘發(fā)脾臟白髓淋巴細胞減少的程度減輕，未見明顯壞死，且保護效果優(yōu)于10(^g/kg香蘭素保護組(圖3);中劑量(D10)到大劑量(D100)的3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛，使輻射誘發(fā)脾臟凋亡細胞數(shù)目減少(圖4);中劑量(D10)效果與100mg/kg的香蘭素接近；中劑量(D10)和大劑量(D100)的3,5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛，使骨髓細胞微核率明顯減少，保護效果優(yōu)于100mg/kg的香蘭素保護組(P〈0.01，圖5)。實施例3、3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛的輻射防護作用的相關(guān)機理將人T淋巴母細胞系A(chǔ)HH-l接種于含終濃度為10%(體積百分含量)的新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，待細胞生長至70%-80%接觸密度時，將細胞分為2組第一組向5個處理中分別添加3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛，使其在AHH-1培養(yǎng)液中的終濃度分別為OuM、5uM、10uM、20uM、40uM，靜置2h后，予4Gy6°Coy射線照射(室溫下照射，劑量率為2.1Gy/min)，照射后再靜置6h，收集細胞。第二組設(shè)不加3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛且不進行輻照(0Gy)的AHH-1細胞為對照組1;添加3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛、使3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛終濃度為10nM且不進行輻照(0Gy)的Affil-l細胞為對照組2。然后對各組中各種處理的細胞分別進行細胞核蛋白及細胞漿蛋白提取，定量后進行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜和免疫雜交反應(yīng)。以NFkB(p65)(購自中山公司)作為Westernblot的第一抗體，以羊抗鼠IgG為二抗。以檢測P-actin蛋白(抗P-actin抗體購自中山公司)表達作為上樣樣品量對照。Western雜交結(jié)果如圖6所示，表明3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛可以增加輻射后細胞NFicB的核易位，從而抑制細胞凋亡。權(quán)利要求1、3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛在α射線防護中的應(yīng)用。2、一種a射線防護藥物，其活性成份為3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛。3、3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛在制備a射線防護藥物中的應(yīng)用。4、3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛在Y射線防護中的應(yīng)用。5、一種Y射線防護藥物，其活性成份為3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛。6、3,5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛在制備Y射線防護藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛的新用途。該新用途是3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛在防護α粒子射線損傷中的應(yīng)用。實驗表明，在細胞體外培養(yǎng)并用α粒子射線輻照細胞的實驗中，培養(yǎng)體系中添加了3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛的細胞，輻照后其克隆形成率要明顯高于未添加藥物的細胞，由輻照引起的基因突變率也明顯低于未添加的細胞。因此，3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛可減輕射線輻照引起的基因組DNA損傷和基因突變，具有輻射防護作用。文檔編號A61P39/00GK101536999SQ20091008384公開日2009年9月23日申請日期2009年5月7日優(yōu)先權(quán)日2009年5月7日發(fā)明者周平坤,徐勤枝,林王,蓓甄申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所