專利名稱：飽和脂肪鏈酸His-Gly-AA三肽酰胺及其合成方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及飽和脂肪鏈酸三肽酰胺，尤其涉及一系列具有免疫抑制活性的飽和脂 肪鏈酸HiS-Gly-AA三肽酰胺，還涉及這些飽和脂肪鏈酸三肽酰胺的制備方法以及它們作 為免疫抑制劑的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
據(jù)統(tǒng)計，截至2002年底，全球共進(jìn)行各種器官移植935792例次，其中腎移植 585877例次、肝臟移植112153例次、心臟移植66559例次。此外，胰、肺、小腸等器官移植 及心_肺、胰-腎、肝-腎、肝-腸等多臟器聯(lián)合移植也都獲得成功并應(yīng)用于臨床。目前，腎 移植1年人/腎存活率達(dá)90 % 95 %，5年存活率超過70 %。臟器移植要形成移植耐受， 這就要求患者終身服用免疫抑制劑。器官移植的進(jìn)展在很大程度上取決于免疫抑制劑的進(jìn) 展。近幾十年，雖然新免疫抑制藥物使得器官移植在臨床取突飛猛進(jìn)發(fā)展，但它們的毒副作 用，例如腎毒性和骨髓抑制作用仍然是器官移植造必須面對的嚴(yán)重問題。環(huán)孢菌素A是目前臨床常用的免疫抑制劑。由于環(huán)孢菌素A的水溶性極差以及腎 毒性很強(qiáng)，所以無論是劑型還是療效都不盡人意。提高環(huán)孢菌素A制劑的水溶性，降低環(huán)孢 菌素A的腎毒性，一直是環(huán)孢菌素A研究的熱點(diǎn)。尿毒素肽具有免疫抑制活性。發(fā)明人認(rèn) 識到，把尿毒素肽與脂肪鏈酸綴合生成的酰胺具有自組裝性能，因而可以用作具有免疫抑 制活性的載藥材料。例如可以用來包裹環(huán)孢菌素A，達(dá)到提高環(huán)孢菌素A的水溶性和降低環(huán) 孢菌素A腎毒性的雙重目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是，將尿毒素三肽與脂肪鏈酸綴合，得到具有免疫抑制活性的 飽和脂肪鏈酸三肽酰胺綴合物。本發(fā)明的目的之一是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的通式I的12種具有免疫抑制活性的飽和脂肪鏈酸His-Gly-AA三肽酰胺CH3(CH2)n-CO-His-Gly-AA I其中，通式I 中的 AA 為 Glu 或 Lys，n 為 6、8、10、12、14 或 16。本發(fā)明的目的之二是，提供一種制備上述具有免疫抑制活性的飽和脂肪鏈酸 His-Gly-AA三肽酰胺的方法。本發(fā)明的目的之二是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一種制備通式I的12種具有免疫抑制活性的飽和脂肪鏈酸His-Gly-AA三肽酰胺 的方法，該方法包括(1)按照現(xiàn)有液相合成技術(shù)，通過逐步接肽合成的His-Gly-AA的保護(hù)中間體，其 中AA為谷氨酸或賴氨酸；(2)脫去His-Gly-AA的保護(hù)中間體的N端保護(hù)基；(3)將C端保護(hù)基保護(hù)的His-Gly-AA中間體與飽和脂肪酸縮合，所述飽和脂肪酸為 CH3 (CH2)nCOOH, η = 6、8、10、12、14 或 16 ；(4)脫去C端保護(hù)基得到目標(biāo)化合物。其中所述N端保護(hù)基是對多肽的N端進(jìn)行保護(hù)時常用的保護(hù)基團(tuán)，例如可以是叔 丁氧羰基(Boc)，芐氧羰基(Z)；所述C端保護(hù)基是對多肽的C端進(jìn)行保護(hù)時常用的保護(hù)基 團(tuán)，例如可以是芐氧基(OBzl)；所述液相合成技術(shù)及所述保護(hù)、縮合、脫保護(hù)的過程是本領(lǐng) 域的常規(guī)并公知的技術(shù)。當(dāng)AA為Glu時，所述飽和脂肪酸三肽綴合物的制備方法可以用圖1的路線概括， 具體的，所述方法包括(1)在(Boc)2O和NaOH存在下將甘氨酸轉(zhuǎn)化為N-叔丁氧羰基甘氨酸；(2)在(Boc)2O和三乙胺存在下將組氨酸轉(zhuǎn)化為N-叔丁氧羰基-Nim-叔丁氧羰 基_組氨酸；(3)在DCC、H0Bt、無水THF存在下將Y -芐酯-谷氨酸芐酯與N-叔丁氧羰基甘氨 酸縮合，生成N-叔丁氧羰基甘氨酰Y _芐酯-谷氨酸芐酯；(4)在氯化氫-乙酸乙酯中將N-叔丁氧羰基甘氨酰Y-芐酯-谷氨酸芐酯脫除叔 丁氧羰保護(hù)基，生成甘氨酰Y _芐酯-谷氨酸芐酯；(5)在無水THF中，在DCC和HOBt存在下將甘氨酰Y _芐酯-谷氨酸芐酯與N-叔 丁氧羰基-Nim-叔丁氧羰基_組氨酸縮合，生成N-叔丁氧羰基-Nim-叔丁氧羰基_組氨酰甘 氨酰Y-芐酯-谷氨酸芐酯；(6)在氯化氫-乙酸乙酯存在下將N-叔丁氧羰基-Nim-叔丁氧羰基_組氨酰甘氨 酰Y _芐酯_谷氨酸芐酯脫除叔丁氧羰基生成組氨酰甘氨酰Y _芐酯-谷氨酸芐酯；(7)在無水THF中，在DCC和HOBt存在下將組氨酰甘氨酰Y _芐酯-谷氨酸芐酯 與飽和脂肪酸縮合，生成飽和脂肪酸酰組氨酰甘氨酰Y _芐酯-谷氨酸芐酯；(8)在無水乙醇中，在Pd/C存在下將組氨酰甘氨酰Y-芐酯-谷氨酸芐酯氫解，生 成飽和脂肪酸酰組氨酰甘氨酰谷氨酸。當(dāng)AA為Lys時，所述飽和脂肪醇三肽綴合物的制備方法可以用圖2的路線概括， 具體的，所述方法包括(1)在(Boc) 20和NaOH存在下將甘氨酸轉(zhuǎn)化為N-叔丁氧羰基甘氨酸；(2)在(Boc)2O和三乙胺存在下將組氨酸轉(zhuǎn)化為N-叔丁氧羰基-Nim-叔丁氧羰 基_組氨酸；(3)在DCC、H0Bt、無水THF存在下將Ne -芐氧羰基賴氨酸芐酯與N-叔丁氧羰基甘 氨酸縮合，生成N-叔丁氧羰基甘氨酰Ne -芐氧羰基賴氨酸芐酯；(4)在氯化氫_乙酸乙酯中將N-叔丁氧羰基甘氨酰Ne -芐氧羰基賴氨酸芐酯脫 除叔丁氧羰保護(hù)基，生成甘氨酰Ne -芐氧羰基賴氨酸芐酯；(5)在無水THF中，在DCC和HOBt存在下將甘氨酰Ne-芐氧羰基賴氨酸芐酯與 N-叔丁氧羰基-Nim-叔丁氧羰基-組氨酸縮合，生成N-叔丁氧羰基-Nim-叔丁氧羰基-組 氨酰甘氨酰Nε-芐氧羰基賴氨酸芐酯；(6)在氯化氫-乙酸乙酯存在下將N-叔丁氧羰基-Nim-叔丁氧羰基_組氨酰甘氨酰 Ne-芐氧羰基賴氨酸芐酯脫除叔丁氧羰基，生成組氨酰甘氨酰Ne-芐氧羰基賴氨酸芐酯；(7)在無水THF中，在DCC和HOBt存在下將組氨酰甘氨酰Nε -芐氧羰基賴氨酸芐酯與飽和脂肪酸縮合，生成飽和脂肪酸酰組氨酰甘氨酰N、芐氧羰基賴氨酸芐酯；(8)在無水乙醇中，在Pd/C存在下將脂肪酸酰組氨酰甘氨酰Νε _芐氧羰基賴氨酸 芐酯氫解，生成飽和脂肪酸酰組氨酰甘氨酰賴氨酸。實(shí)驗結(jié)果表明本發(fā)明的12種具有免疫抑制活性的飽和脂肪鏈酸His-Gly-AA三肽 酰胺具有優(yōu)秀的免疫抑制作用，臨床上可作為免疫抑制劑應(yīng)用。并且本發(fā)明的飽和脂肪鏈 酸His-Gly-AA三肽酰胺水溶液中均能自組裝成粒經(jīng)穩(wěn)定在113-4720nm的納米球，可作為 制備微乳或脂質(zhì)體藥物載體的制劑材料，另外可作為制備微乳、脂質(zhì)體藥物載體的靶向制 劑材料。


圖1為當(dāng)通式I中AA為Glu時6種具有免疫抑制活性的飽和脂肪鏈酸 His-Gly-Glu三肽酰胺綴合物的合成路線。i)無水THF、DCC、H0Bt和NMM ;ii) 4N氯化氫-乙 酸乙酯溶液；iii)無水乙醇、Pd/C 禾口 H2 ；6a η = 6,6b η = 8,6c η = 10，6d η = 12，6e η =14,6f η = 16。圖2為當(dāng)通式I中AA為Lys時6種具有免疫抑制活性的飽和脂肪鏈酸 His-Gly-Lys三肽酰胺綴合物的合成路線。i)無水THF、DCC、H0Bt和NMM ;ii) 4N氯化氫-乙 酸乙酯溶液；iii)無水乙醇、Pd/C 和 H2 ；12a η = 6,12b η = 8，12c η = 10，12d η = 12， 12e η = 14，12f η = 16。為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實(shí)施例。這些實(shí)施例完全是例證性的，它 們僅用來對本發(fā)明進(jìn)行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對本發(fā)明的限制。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 制備 Boc-Gly-Glu (OBzl) -OBzl將3. 50g (20. OOmmo 1) Boc-Gly溶于200ml無水THF，冰浴下向得到的溶液中 加入2. 72g (20. OOmmol) N-羥基苯并三氮唑(HOBt)，并使其完全溶解。10分鐘后加 入4. 96g (24. OOmmol) 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)。得到反應(yīng)液(I)，待用。冰浴下把 10. 38g(20. OOmmol) TosH · Glu (OBzl)-OBzl 懸浮于 20ml 無水 THF 中，然后加入 Iml N-甲 基嗎啉(NMM)JfpH 8-9。攪拌35分鐘，得到反應(yīng)液(II)，待用。冰浴下把反應(yīng)液(I)加 入反應(yīng)液(II)中，冰浴條件下攪拌lh，再室溫攪拌12h，TLC(氯仿/甲醇，10 1)顯示 Boc-Gly-OH消失。濾除二環(huán)己基脲(D⑶)，減壓除去THF。殘留物用50ml乙酸乙酯溶解。 得到的溶液依次用飽和NaHCO3水溶液洗、飽和NaCl水溶液洗、5% KHSO4水溶液洗和飽和 NaCl水溶液洗。有機(jī)相用無水Na2SO4干燥、過濾、濾液減壓濃縮至干，得到8.91g(92%)標(biāo) 題化合物，為米黃色油狀物。ESI-MS(m/z) :485[M+H] +。實(shí)施例2 制備 HCl · Gly-Glu(OBzl)-OBzl將8. 91g(18. 38mmol)Boc-Gly-Glu(OBzl)-OBzl 溶解在 200ml 4mol/l 氯化氫-乙 酸乙酯溶液中，室溫攪拌2小時，TLC(氯仿甲醇，5 1)顯示原料點(diǎn)消失，減壓濃縮除去 乙酸乙酯，殘留物反復(fù)加少量乙醚進(jìn)行減壓濃縮以除去氯化氫氣。最后加少量乙醚將殘留 物研磨成6. 94g(90% )標(biāo)題化合物，為無色固體粉末，直接用于下一步反應(yīng)。ESI-MS (m/z) 385[M+H]+。
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實(shí)施例3 制備 Boc-His (Boc) -Gly-Glu (OBzl) -OBzl按照實(shí)施例1 的方法由 5. 42g (7. 63mmol) Boc-His (Boc)和 6. 94g (15. 26mmol) HCl · Gly-Glu(OBzl)-OBzl得米黃色油狀物。所得化合物經(jīng)硅膠柱層析純化得無色油狀 物目標(biāo)8. 24g，純化條件氯仿甲醇=100 1，收率為75%。ESI-MS(m/z) :722[M+H]+， [α ]20d = -25. 2 (c = 1· 0，CH3OH)。實(shí)施例4 制備 HCl · His-Gly-Glu (OBzl) -OBzl按照實(shí)施例2 的方法 8. 24g(ll. 42mmol)Boc-His (Boc) -Gly-Glu (OBzl) -OBzl 制得 6. 05g(95% )標(biāo)題化合物，為米黃色固體。ESI-MS(m/z) :522[M+H] +。實(shí)施例5 制備 CH3 (CH2) 6C0-His-Gly-Glu (OBzl)-OBzl按照實(shí)施例1 的方法由 0. 26g(l. 79mmol)CH3(CH2)6CO2H 和 1. OOg(1. 79mmol) HCl · His-Gly-Glu(OBzl)-OBzl制得標(biāo)題化合物，為黃色固體。所得化合物經(jīng)硅膠柱層析 純化得無色固體粉末846mg，純化條件氯仿甲醇=50 1，收率為73%。ESI-MS (m/z) 648 [M+H]+，[a J20d = -7. 2 (c = 1. O, CH3OH)，Μ. p. 65. 3-65. 8 "C。實(shí)施例6 制備 CH3 (CH2)8CO-His-Gly-Glu (OBzl)-OBzl按照實(shí)施例1 的方法由 0. 31g(l. 79mmol)CH3(CH2)8CO2H 和 1. OOg(1. 79mmol) HCl · His-Gly-Glu(OBzl)-OBzl制得標(biāo)題化合物，為黃色固體。所得化合物經(jīng)硅膠柱層析 純化得無色固體粉末810mg，純化條件氯仿甲醇=50 1，收率為67%。ESI_MS(m/Z) 676 [M+H]+，[a J20d = -4. 5 (c = 1. O, CH3OH)，Μ. p. 67. 2-68. 9 "C。實(shí)施例7 制備 CH3 (CH2) 10CO-HiS-Gly-Glu (OBzl) -OBzl按照實(shí)施例1 的方法由 0. 36g(l. 79mmol)CH3(CH2) 10C02H 和 1. OOg(1. 79mmol) HCl 'His-Gly-Glu (OBzl)-OBzl制得標(biāo)題化合物，為淡黃色固體。所得化合物經(jīng)硅膠柱層析 純化得無色固體粉末868mg，純化條件氯仿甲醇=50 1，收率為69%。ESI-MS (m/z) 704 [M+H]+，[a J20d = -9. 7 (c = 1. 0, CH3OH)，Μ. p. 68. 9-70. 4 "C。實(shí)施例8 制備 CH3 (CH2) 12C0-His_Gly-Glu (OBzl) -OBzl按照實(shí)施例1 的方法由 0. 41g(l. 79mmol)CH3(CH2) 12C02H 和 1. OOg(1. 79mmol) HCl · His-Gly-Glu(OBzl)-OBzl制得標(biāo)題化合物，為黃色固體。所得化合物經(jīng)硅膠柱層析 純化得無色固體粉末955mg，純化條件氯仿甲醇=50 1，收率為73%。ESI_MS(m/Z) 732 [M+H]+，[a J20d = -3. 2 (c = 1. 0, CH3OH)，Μ. p. 68. 9-69. 9°C。實(shí)施例9 制備 CH3 (CH2) 14C0-His_Gly-Glu (OBzl) -OBzl按照實(shí)施例1 的方法由 0. 44g(l. 7ImmoDCH3(CH2)14CO2H 和 1. OOg(1. 71mmol) HCl · His-Gly-Glu(OBzl)-OBzl制得標(biāo)題化合物，為黃色固體。所得化合物經(jīng)硅膠柱層析 純化得無色固體粉末802mg，純化條件氯仿甲醇=50 1，收率為59%。ESI-MS (m/z) 760 [M+H]+，[a J20d = -12. 5 (c = 1. 0，CH3OH)，Μ. p. 71. 5-72. 9 "C。實(shí)施例10 制備 CH3 (CH2) 16C0-His_Gly-Glu (OBzl) -OBzl按照實(shí)施例1 的方法由 0. 51g(l. 79mmol)CH3(CH2)16CO2H 和 1. OOg(1. 79mmol) HCl · His-Gly-Glu(OBzl)-OBzl制得標(biāo)題化合物，為黃色固體。所得化合物經(jīng)硅膠柱層析 純化得無色固體粉末874mg，純化條件氯仿甲醇=50 1，收率為62%。ESI-MS (m/z) 788 [M+H]+，[a J20d = -20. 9 (c = 1. 0，CH3OH)，Μ. p. 71. 5-73. 4°C。實(shí)施例11 制備 CH3 (CH2)6CO-His-Gly-Glu (6a)
將700mg(l. 08mmol) CH3 (CH2) 6C0-His-Gly-Glu (OBzl) -OBzl 置于 IOOml 茄形瓶中、 用乙醇溶解、加35mgPd/C(約5% )、通H2(0. 02Mba)，室溫攪拌至原料點(diǎn)消失。濾除Pd/C、濾 液減壓濃縮至干，殘留物反復(fù)用石油醚研磨，制得444mg(88% )標(biāo)題化合物，為無色固體。 ESI-MS (m/z) :465[Μ-ΗΓ，[α ]20D = -3. 0 (c = 1· 0，CH3OH)，Μ· ρ· : 126. 0—127. 8°C。實(shí)施例12 制備 CH3 (CH2)8CO-His-Gly-Glu (6b)將800mg(l. 19mmol) CH3 (CH2) 8C0-His-Gly-Glu (OBzl) -OBzl 置于 100ml 茄形瓶中、 用乙醇溶解、加40mgPd/C(約5% )、通H2(0. 02Mba)，室溫攪拌至原料點(diǎn)消失。濾除Pd/C、濾 液減壓濃縮至干，殘留物反復(fù)用石油醚研磨，制得462mg(79% )標(biāo)題化合物，為無色固體。 ESI-MS (m/z) :493[Μ-ΗΓ ;[α ]20D =-8. l(cl，CH3OH) ；Μ. p. 119. 5—120. 5°C。實(shí)施例13 制備 CH3 (CH2) 10CO-His-Gly-Glu (6c)將800mg (1. 14mmol) CH3 (CH2) 10CO-His-Gly-Glu (OBzl) -OBzl 置于 100ml 茄形瓶中、 用乙醇溶解、加40mgPd/C(約5% )、通H2(0. 02Mba)，室溫攪拌至原料點(diǎn)消失。濾除Pd/C、濾 液減壓濃縮至干，殘留物反復(fù)用石油醚研磨，制得456mg(77% )標(biāo)題化合物，為無色固體。 ESI-MS (m/z) :521[Μ-ΗΓ，[α ]20D = -18. 0(c = 1. 0，CH3OH)，Μ· p. : 123. 6—125. 2°C。實(shí)施例14 制備 CH3 (CH2) 12C0-His_Gly-Glu (6d)將900mg (1. 23mmol) CH3 (CH2) 12C0-His_Gly-Glu (OBzl) -OBzl 置于 100ml 茄形瓶中、 用乙醇溶解、加45mgPd/C(約5% )、通H2(0. 02Mba)，室溫攪拌至原料點(diǎn)消失。濾除Pd/C、濾 液減壓濃縮至干，殘留物反復(fù)用石油醚研磨，制得472mg(70% )標(biāo)題化合物，為無色固體。 ESI-MS (m/z) :549[Μ-ΗΓ，[α ]20D = -17. 7 (c = 1· 0，CH3OH)，Μ· ρ· : 131. 2—132. 3°C。實(shí)施例15 制備 CH3 (CH2) 14C0-His_Gly-Glu (6e)將800mg (1. 05mmol) CH3 (CH2) 14C0-His_Gly-Glu (OBzl) -OBzl 置于 100ml 茄形瓶中、 用乙醇溶解、加40mgPd/C(約5% )、通H2(0. 02Mba)，室溫攪拌至原料點(diǎn)消失。濾除Pd/C、濾 液減壓濃縮至干，殘留物反復(fù)用石油醚研磨，制得504mg(83%)標(biāo)題化合物，為無色固體。 ESI-MS (m/z) :577[Μ-ΗΓ，[α ]20D = -4. 2 (c = 1· 0，CH3OH)，Μ· ρ· : 158. 1—160. 0°C。實(shí)施例16 制備 CH3 (CH2) 16C0-His_Gly-Glu (6f)將900mg (1. 14mmol) CH3 (CH2) 16C0-His-Gly-Glu (OBzl) -OBzl 置于 100ml 茄形瓶中、 用乙醇溶解、加45mgPd/C(約5% )、通H2(0. 02Mba)，室溫攪拌至原料點(diǎn)消失。濾除Pd/C、濾 液減壓濃縮至干，殘留物反復(fù)用石油醚研磨，制得561mg(81%)標(biāo)題化合物，為無色固體。 ESI-MS (m/z) :605[Μ-ΗΓ，[α ]20D = -5. 7 (c = 1· 0，CH3OH)，Μ· ρ· : 159. 7—161. 4°C。實(shí)施例17 制備 Boc-Gly-Lys(Z)-OBzl將0. 88g(5. OmmoDBoc-Gly溶于200ml無水THF，冰浴下向得到的溶液中加入 0. 68g(5mmol)N-羥基苯并三氮唑(HOBt)，并使其完全溶解。10分鐘后加入1. 24g(6mmol) 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)。得到反應(yīng)液(III)，待用。冰浴下把2.81g(5.0mmol) Tos · Lys(Z) -OBzl (5mmol)懸浮于20ml無水THF中，然后加入Iml N-甲基嗎啉(NMM)，調(diào) PH 8-9。攪拌35分鐘，得到反應(yīng)液(IV)，待用。冰浴下把反應(yīng)液(III)加入反應(yīng)液(IV) 中，冰浴條件下攪拌lh，再室溫攪拌12h，TLC (氯仿/甲醇，10 1)顯示Boc-Gly消失。濾 除二環(huán)己基脲(D⑶)，減壓除去THF。殘留物用50ml乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用飽 和NaHCO3水溶液洗、飽和NaCl水溶液洗、5% KHSO4水溶液洗和飽和NaCl水溶液洗。有機(jī) 相用無水Na2SO4干燥、過濾、濾液減壓濃縮至干，得到2. 32g(88% )標(biāo)題化合物，為米黃色
7固體。ESI-MS(m/z) :528[M+H] +。實(shí)施例18 制備 HCl · Gly-Lys (Z) -OBzl將2. 32g(4. 40mmol) Boc-Gly-Lys (Z) -OBzl 溶解在 100ml 4mol/l 氯化氫-乙酸 乙酯溶液中，室溫攪拌2小時，TLC(氯仿甲醇，5 1)顯示原料點(diǎn)消失，減壓濃縮除去乙 酸乙酯，殘留物反復(fù)加少量乙醚進(jìn)行減壓濃縮以除去氯化氫氣。最后加少量乙醚將殘留物 研磨成1.94g(95% )標(biāo)題化合物，為無色固體粉末，直接用于下一步反應(yīng)。ESI-MS(m/z) 428[M+H]+。實(shí)施例I9 制備 Boc-His (Boc) -Gly-Lys (Z) -OBzl按照實(shí)施例17 的方法由 1. 49g(4. 18mmol) Boc-His (Boc)和 1. 94g(4. 18mmol) HCl 'Gly-Lys(Z)-OBzl得米黃色油狀物。所得化合物經(jīng)硅膠柱層析純化得無色油狀物目標(biāo) 1. 87g，收率為 58. 47%。ESI-MS (m/z) 765 [Μ+Η][ α ]2°D = 27. 4 (c = 1· 0，CH3OH)。實(shí)施例20 制備 HCl · His-Gly-Lys (Z) -OBzl按照實(shí)施例18 的方法由 1. 87g(2. 45mmol)Boc-His (Boc) -Gly-Lys (Z) -OBzl 制得 1.41g(95% )標(biāo)題化合物，為米黃色固體。ESI-MS(m/z) :565[M+H] +。實(shí)施例21 制備 CH3 (CH2) 6C0-His-Gly-Lys (Z) -OBzl按照實(shí)施例17 的方法由 0. 41g (2. 82mmol) CH3 (CH2) 6C02H 和 1. 41g (2. 35mmol) HCl · His-Gly-Lys(Z)-OBzl制得標(biāo)題化合物，為黃色固體。所得化合物經(jīng)硅膠柱層析純 化得無色固體粉末794mg，純化條件氯仿甲醇=50 1，收率為49%。ESI_MS(m/Z) 691 [M+H]+，[a J20d = -12. 6 (c = 1. 0，CH3OH)，Μ. p. 88. 5-89. 6 "C。實(shí)施例22 制備 CH3(CH2)8CO-His-Gly-Lys(Z)-OBzl按照實(shí)施例17 的方法由 0. 49g (2. 82mmol) CH3 (CH2) 8C02H 和 1. 41g (2. 35mmol) HCl · His-Gly-Lys(Z)-OBzl制得標(biāo)題化合物，為黃色固體。所得化合物經(jīng)硅膠柱層析純 化得無色固體粉末726mg，純化條件氯仿甲醇=50 1，收率為43%。ESI_MS(m/Z) 719 [M+H]+，[a J20d = -28. O (c = 1. 0，CH3OH)，Μ. p. 89. 7-90. 1°C。實(shí)施例23 制備 CH3 (CH2) 10CO-His-Gly-Lys (Z) -OBzl按照實(shí)施例17 的方法由 0. 57g (2. 82mmol) CH3 (CH2) 10C02H 和 1. 41g (2. 35mmol) HCl · His-Gly-Lys(Z)-OBzl制得標(biāo)題化合物，為黃色固體。所得化合物經(jīng)硅膠柱層析純 化得無色固體粉末1.03g，純化條件氯仿甲醇=50 1，收率為59%。ESI-MS(m/z) 747 [M+H]+，[a J20d = -14. 6 (c = 1. 0，CH3OH)，Μ. p. 89. 1-91. 0°C。實(shí)施例24 制備 CH3 (CH2) 12C0-His-Gly-Lys (Z) -OBzl按照實(shí)施例17 的方法由 0. 65g (2. 82mmol) CH3 (CH2) 12C02H 和 1. 41g (2. 35mmol) HCl · His-Gly-Lys(Z)-OBzl制得標(biāo)題化合物，為黃色固體。所得化合物經(jīng)硅膠柱層析純 化得無色固體粉末854mg，純化條件氯仿甲醇=50 1，收率為47%。ESI_MS(m/Z) 775 [M+H]+，[a J20d = -20. 8 (c = 1. 0，CH3OH)，Μ. p. 88. 6-90. 4 "C。實(shí)施例25 制備 CH3 (CH2) 14C0-His-Gly-Lys (Z) -OBzl按照實(shí)施例17 的方法由 0. 72g (2. 82mmol) CH3 (CH2) 14C02H 和 1. 41g (2. 35mmol) HCl · His-Gly-Lys(Z)-OBzl制得標(biāo)題化合物，為黃色固體。所得化合物經(jīng)硅膠柱層析純 化得無色固體粉末998mg，純化條件氯仿甲醇=50 1，收率為53%。ESI_MS(m/Z) 803[M+H]+，[a J20d = -23. 4(c = 1. 0，CH3OH)，Μ. p. 86. 4-87. 1°C。
實(shí)施例26 制備 CH3 (CH2) 16C0-His-Gly-Lys (Z) -OBzl按照實(shí)施例17 的方法由 0. 80g (2. 82mmol) CH3 (CH2) 16C02H 和 1. 41g (2. 35mmol) HCl · His-Gly-Lys(Z)-OBzl制得標(biāo)題化合物，為黃色固體。所得化合物經(jīng)硅膠柱層析純 化得無色固體粉末858mg，純化條件氯仿甲醇=50 1，收率為44%。ESI_MS(m/Z) 831 [M+H]+，[a J20d = -22. 3 (c = 1. 0，CH3OH)，Μ. p. 84. 5-86. 5 "C。實(shí)施例27 制備 CH3 (CH2) 6C0-His-Gly-Lys (12a)將691mg(Immol) CH3 (CH2)6C0-His-Gly-Lys (Z)-OBzl 置于 IOOml 茄形瓶中、用乙 醇溶解、加35mg Pd/C(約5% )、通H2(0. 02Mba)，室溫攪拌至原料點(diǎn)消失。濾除Pd/C、濾 液減壓濃縮至干，殘留物反復(fù)用石油醚研磨，制得376mg(79%)標(biāo)題化合物，為無色固體。 ESI-MS (m/z) :464[Μ-ΗΓ，[α ]20D = -3. 5 (c = 1· 0，CH3OH)，Μ· ρ· : 127. 1—128. 7°C。實(shí)施例28 制備 CH3 (CH2) 8C0-His-Gly-Lys (12b)將526mg(0. 73mmol) CH3 (CH2)8C0-His-Gly-Lys (Z) -OBzl 置于 100ml 茄形瓶中、用 乙醇溶解、加30mg Pd/C(約5% )、通H2 (0. 02Mba)，室溫攪拌至原料點(diǎn)消失。濾除Pd/C、濾 液減壓濃縮至干，殘留物反復(fù)用石油醚研磨，制得263mg(73%)標(biāo)題化合物，為無色固體。 ESI-MS (m/z) :492[Μ-ΗΓ ;[α ]20D =-4. 6(cl，CH3OH) ；Μ. p. 132. 3-133. 5°C。實(shí)施例29 制備 CH3 (CH2) 10CO-His-Gly-Lys (12c)將747mg(Immol) CH3 (CH2)ltlCO-His-Gly-Lys (Z)-OBzl 置于 100ml 茄形瓶中、用乙 醇溶解、加40mg Pd/C (約5 % )、通H2 (0. 02Mba)，室溫攪拌至原料點(diǎn)消失。濾除Pd/C、濾 液減壓濃縮至干，殘留物反復(fù)用石油醚研磨，制得400mg(77% )標(biāo)題化合物，為無色固體。 ESI-MS (m/z) :520[Μ-ΗΓ，[α ]20D = -8. 3 (c = 1· 0，CH3OH)，Μ· ρ· : 133. 8-135. 3°C。實(shí)施例30 制備 CH3 (CH2) 12C0-His-Gly-Lys (12d)將654mg(0. 84mmol) CH3 (CH2) 12C0-His-Gly-Lys (Z) -OBzl 置于 100ml 茄形瓶中、用 乙醇溶解、加35mg Pd/C(約5% )、通H2 (0. 02Mba)，室溫攪拌至原料點(diǎn)消失。濾除Pd/C、濾 液減壓濃縮至干，殘留物反復(fù)用石油醚研磨，制得361mg(78%)標(biāo)題化合物，為無色固體。 ESI-MS (m/z) :548[Μ-ΗΓ，[α ]20D = -37. 1 (c = 1· 0，CH3OH)，Μ· ρ· : 146. 0—147. 2°C。實(shí)施例31 制備 CH3 (CH2) 14C0-His_Gly-Lys (12e)將700mg(0. 87mmol) CH3 (CH2) 14C0-His-Gly-Lys (Z) -OBzl 置于 100ml 茄形瓶中、用 乙醇溶解、加35mg Pd/C(約5% )、通H2 (0. 02Mba)，室溫攪拌至原料點(diǎn)消失。濾除Pd/C、濾 液減壓濃縮至干，殘留物反復(fù)用石油醚研磨，制得406mg(81% )標(biāo)題化合物，為無色固體。 ESI-MS (m/z) :576[Μ-ΗΓ，[α ]20D = -8. 4(c = 1. 0，CH3OH)，Μ· p. : 134. 5—135. 1°C。實(shí)施例32 制備 CH3 (CH2) 16C0-His-Gly-Lys(12f)將688mg(0. 83mmol) CH3 (CH2) 16C0-His-Gly-Lys (Z) -OBzl 置于 100ml 茄形瓶中、用 乙醇溶解、加35mg Pd/C(約5% )、通H2 (0. 02Mba)，室溫攪拌至原料點(diǎn)消失。濾除Pd/C、濾 液減壓濃縮至干，殘留物反復(fù)用石油醚研磨，制得350mg(70%)標(biāo)題化合物，為無色固體。 ESI-MS (m/z) :604[Μ-ΗΓ，[α ]20D = -3. 6 (c = 1· 0，CH3OH)，Μ· ρ· :109· 1-110. 9°C。試驗例1飽和脂肪鏈酸His-Gly-AA三肽酰胺對小鼠脾淋巴細(xì)胞絲裂原增殖的抑 制作用脫頸處死小鼠，無菌取脾，用200目鋼網(wǎng)和注射器芯研磨，用HANK’ S液洗兩次， 1500轉(zhuǎn)/分條件下離心10分鐘，計數(shù)后用完全RPMI-1640培養(yǎng)液配成5X 106/ml個脾淋
9巴細(xì)胞，加100 μ 1細(xì)胞懸液于96孔培養(yǎng)板中(每孔含5Χ106個細(xì)胞)。每孔加20 μ 1 ConA (ConA終濃度為5 μ g/ml)，該96孔培養(yǎng)板置于體積分?jǐn)?shù)為0. 05的CO2飽和濕度的培養(yǎng) 箱內(nèi)37°C培養(yǎng)4h。4h后分別加入不同濃度飽和脂肪鏈酸His-Gly-AA三肽酰胺(1X10_4M、 8X 1(Γ5Μ、5Χ 1(Γ5Μ、3Χ 1(Γ5Μ、1Χ 1(Γ5Μ、8Χ 1(Γ6Μ、5Χ ICT6M 和 IX I(T6M)，每個濃度 3 個復(fù)孔。 同時設(shè)不含化合物對照孔和只含同量培養(yǎng)液無ConA的細(xì)胞空白孔。各個孔均重復(fù)3次(η =3)。培養(yǎng)48h后用MTT法檢測化合物對脾淋巴細(xì)胞的抑制作用。按照公式“抑制率=(D對照-D含藥)/D對照X100%”計算不同濃度飽和脂肪 鏈酸His-Gly-AA三肽酰胺對脾淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用，根據(jù)細(xì)胞相對生存率和化合物 的濃度繪制細(xì)胞生長曲線，利用該生長曲線求得半數(shù)抑制率(dxIC5ci)。結(jié)果列入表1。結(jié)果 表明本發(fā)明的飽和脂肪鏈酸His-Gly-AA三肽酰胺對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖有明確的抑制作 用。表1飽和脂肪鏈酸His-Gly-AA三肽酰胺對小鼠脾淋巴細(xì)胞絲裂原增殖的抑制作 用
試驗例2飽和脂肪鏈酸His-Gly-AA三肽酰胺對巨噬細(xì)胞吞噬的抑制作用 將生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的Ana-I小鼠巨噬細(xì)胞以1 X IO5個/mL的密度
接種于96孔板，每孔100μ 1，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時，按預(yù)設(shè)的濃度梯度加入 經(jīng)滅菌處理的飽和脂肪鏈酸His-Gly-AA三肽酰胺(1 X 10_4M、8 X 10_SM、5 X 10_5M、3 X 10_5M、 1 X 10_5M、8X 10_6M、5X ΙΟ—Μ和1 X I(T6M)，每個濃度3個復(fù)孔，對照組加入等體積的溶解樣 品的溶媒。繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，吸棄上清液，每孔加入100 μ 10. 的中性紅溶液，置于 37°C孵育30分鐘。吸棄中性紅溶液，并用PBS緩沖溶液洗滌2-3次(除去未被巨噬細(xì)胞吞 噬的中性紅)，加入細(xì)胞溶解液(乙醇乙酸=1 1)100 μ 1，4°C過夜，酶標(biāo)儀檢測吸光度 值，波長540nm。各個孔均重復(fù)3次(η = 3)。 按照公式“抑制率=(D對照-D含藥)/D對照Χ100%”計算不同濃度的化合物 對巨噬細(xì)胞的吞噬能力的抑制作用，根據(jù)細(xì)胞相對生存率和化合物的濃度繪制細(xì)胞生長曲 線，利用該生長曲線求得半數(shù)抑制率(dxIC5ci)。結(jié)果列入表2。結(jié)果表明本發(fā)明的飽和脂肪 鏈酸His-Gly-AA三肽酰胺對Ana-I小鼠巨噬細(xì)胞吞噬有明確的抑制作用。
表2飽和脂肪鏈酸His-Gly-AA三肽酰胺對Ana-I小鼠巨噬細(xì)胞吞噬的抑制作用 化合物名稱IC5Q(IO-5M) 化合物名稱IC5G(IO-5M) 試驗例3飽和脂肪鏈酸His-Gly-AA三肽酰胺在納米水平的自組裝將飽和脂肪鏈酸His-Gly-AA三肽酰胺配置成1 μ mol/ml的水溶液，在激光納米粒 度儀上25°C測定粒徑。連續(xù)測定8天，記錄其粒徑。結(jié)果列入表3。數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明的飽 和脂肪鏈酸His-Gly-AA三肽酰胺水溶液中均能自組裝成粒經(jīng)穩(wěn)定在113-4720nm的納米 球。表3飽和脂肪鏈酸His-Gly-AA三肽酰胺在水中自組裝的納米球粒徑
權(quán)利要求
通式I的12種具有免疫抑制活性的飽和脂肪鏈酸His Gly AA三肽酰胺CH3(CH2)n CO His Gly AA I通式I中的AA為Glu或Lys，n＝6、8、10、12、14或16。
2. 一種制備權(quán)利要求1的飽和脂肪鏈酸His-Gly-AA三肽酰胺的方法，包括(1)按照現(xiàn)有液相合成技術(shù)，通過逐步接肽合成的His-Gly-AA的保護(hù)中間體，其中AA 為谷氨酸或賴氨酸；(2)脫去His-Gly-AA的保護(hù)中間體的N端保護(hù)基；(3)將C端保護(hù)基保護(hù)的His-Gly-AA中間體與飽和脂肪酸縮合，所述飽和脂肪酸為 CH3(CH2)nCOOH, η = 6、8、10、12、14 或 16 ；(4)脫去C端保護(hù)基得到目標(biāo)化合物。
3.權(quán)利要求1的12種飽和脂肪鏈酸His-Gly-AA三肽酰胺在制備免疫抑制劑類藥物中 的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1的12種飽和脂肪鏈酸His-Gly-AA三肽酰胺作為制備微乳或脂質(zhì)體藥物 載體的制劑材料的用途。
5.權(quán)利要求1的12種飽和脂肪鏈酸His-Gly-AA三肽酰胺作為制備微乳、脂質(zhì)體藥物 載體的靶向制劑材料中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及通式I的12種具有免疫抑制活性的飽和脂肪鏈酸His-Gly-AA三肽酰胺綴合物，其中AA為Glu或Lys，飽和脂肪鏈酸中n＝6、8、10、12、14或16，涉及它們的制備方法以及作為免疫抑制劑的應(yīng)用。這些飽和脂肪鏈酸His-Gly-AA三肽酰胺對脾淋巴細(xì)胞絲裂原增殖反應(yīng)的抑制作用，以及對巨噬細(xì)胞吞噬活性的抑制作用的實(shí)驗結(jié)果表明，本發(fā)明的化合物具有優(yōu)秀的免疫抑制作用，臨床上可作為免疫抑制劑應(yīng)用。CH3(CH2)n-CO-His-Gly-AA I
文檔編號A61K9/107GK101899088SQ200910085320
公開日2010年12月1日 申請日期2009年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月26日
發(fā)明者彭師奇, 趙明, 趙淑銳 申請人:首都醫(yī)科大學(xué)