專(zhuān)利名稱(chēng)：飽和脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺及其合成方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及飽和脂肪鏈胺三肽酰胺，尤其涉及一系列具有免疫抑制活性的飽和脂 肪鏈胺GlU-Asp-Gly三肽酰胺，還涉及這些飽和脂肪鏈胺三肽酰胺的制備方法以及它們作 為免疫抑制劑的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
據(jù)統(tǒng)計(jì)，截至2002年底，全球共進(jìn)行各種器官移植935792例次，其中腎移植 585877例次、肝臟移植112153例次、心臟移植66559例次。此外，胰、肺、小腸等器官移植 及心_肺、胰-腎、肝-腎、肝-腸等多臟器聯(lián)合移植也都獲得成功并應(yīng)用于臨床。目前，腎 移植1年人/腎存活率達(dá)90 % 95 %，5年存活率超過(guò)70 %。臟器移植要形成移植耐受， 這就要求患者終身服用免疫抑制劑。器官移植的進(jìn)展在很大程度上取決于免疫抑制劑的進(jìn) 展。近幾十年，雖然新免疫抑制藥物使得器官移植在臨床取突飛猛進(jìn)發(fā)展，但它們的毒副作 用，例如腎毒性和骨髓抑制作用仍然是器官移植造必須面對(duì)的嚴(yán)重問(wèn)題。環(huán)孢菌素A是目前臨床常用的免疫抑制劑。由于環(huán)孢菌素A的水溶性極差以及腎 毒性很強(qiáng)，所以無(wú)論是劑型還是療效都不盡人意。提高環(huán)孢菌素A制劑的水溶性，降低環(huán)孢 菌素A的腎毒性，一直是環(huán)孢菌素A研究的熱點(diǎn)。尿毒素肽具有免疫抑制活性。發(fā)明人認(rèn) 識(shí)到，把尿毒素肽與脂肪鏈胺綴合生成的酰胺具有自組裝性能，因而可以用作具有免疫抑 制活性的載藥材料。例如可以用來(lái)包裹環(huán)孢菌素A，達(dá)到提高環(huán)孢菌素A的水溶性和降低環(huán) 孢菌素A腎毒性的雙重目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是，將尿毒素三肽與脂肪鏈胺綴合，得到具有免疫抑制活性的 飽和脂肪鏈胺三肽酰胺綴合物。本發(fā)明的目的之一是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的通式I的6種具有免疫抑制活性的飽和脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺Glu-Asp-Gly-NH-CH2- (CH2) nCH3 I其中，通式I 中的 η = 6、8、10、12、14 或 16。本發(fā)明的目的之二是，提供一種制備上述具有免疫抑制活性的飽和脂肪鏈胺 Glu-Asp-Gly三肽酰胺的方法。本發(fā)明的目的之二是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的 一種制備通式I的6種具有免疫抑制活性的飽和脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺 的方法，該方法包括(1)將N端保護(hù)基保護(hù)的甘氨酸與飽和脂肪胺縮合，所述飽和脂肪胺為CH3(CH2) nCH2NH2, η = 6、8、10、12、14 或 16 ；(2)脫去N端保護(hù)基得到飽和脂肪胺甘氨酸酰胺；(3)按照現(xiàn)有液相合成技術(shù)，將飽和脂肪胺甘氨酸酰胺與天冬氨酸的保護(hù)中間體、谷氨酸的保護(hù)中間體逐步接肽合成保護(hù)基保護(hù)的飽和脂肪胺三肽綴合物；(4)依次脫去保護(hù)基保護(hù)的飽和脂肪胺三肽綴合物的N端保護(hù)基和C端保護(hù)基得 到目標(biāo)化合物。其中所述N端保護(hù)基是對(duì)多肽的N端進(jìn)行保護(hù)時(shí)常用的保護(hù)基團(tuán)，例如可以是叔 丁氧羰基(Boc)；所述C端保護(hù)基是對(duì)多肽的C端進(jìn)行保護(hù)時(shí)常用的保護(hù)基團(tuán)，例如可以是 芐氧基(OBzl)；所述液相合成技術(shù)及所述保護(hù)、縮合、脫保護(hù)的過(guò)程是本領(lǐng)域的常規(guī)并公 知的技術(shù)。該制備方法可以用圖1的路線(xiàn)概括，具體的，所述方法包括(1)在(Boc)2O和NaOH存在下將甘氨酸轉(zhuǎn)化為N-叔丁氧羰基甘氨酸；(2)在DCC、HOBt、無(wú)水THF存在下將N-叔丁氧羰基甘氨酸與飽和脂肪胺縮合，生 成飽和脂肪胺N-叔丁氧羰基甘氨酸酰胺；(3)在氯化氫-乙酸乙酯中將飽和脂肪胺N-叔丁氧羰基甘氨酸酰胺脫除叔丁氧羰 保護(hù)基，生成飽和脂肪胺甘氨酸酰胺；(4)在無(wú)水THF中，在DCC和HOBt存在下將飽和脂肪胺甘氨酸酰胺與N-叔丁氧 羰基-β -芐酯天冬氨酸縮合，生成飽和脂肪胺N-叔丁氧羰基_ β _芐酯天冬氨酰甘氨酸酰 胺；(5)在氯化氫_乙酸乙酯存在下將飽和脂肪胺N-叔丁氧羰基_ β _芐酯天冬氨酰 甘氨酸酰胺脫除叔丁氧羰基，生成飽和脂肪胺β _芐酯-天冬氨酰甘氨酸酰胺；(6)在無(wú)水THF中，在DCC和HOBt存在下將飽和脂肪胺β -芐酯天冬氨酰甘氨酸 酰胺與N-叔丁氧羰基_ Y _芐酯谷氨酸縮合，生成飽和脂肪胺N-叔丁氧羰基_ Y _芐酯谷 氨酰-β -芐酯天冬氨酰甘氨酸酰胺；(7)在氯化氫_乙酸乙酯中將飽和脂肪胺N-叔丁氧羰基_ Y _芐酯谷氨酰β _芐 酯天冬氨酰甘氨酸酰胺脫除叔丁氧羰基，生成飽和脂肪胺Y-芐酯谷氨酰芐酯天冬氨 酰甘氨酸酰胺；(8)在無(wú)水乙醇中，在Pd/C存在下將飽和脂肪胺Y-芐酯谷氨酰-β-芐酯天冬氨 酰甘氨酸酰胺氫解，生成飽和脂肪胺谷氨酰天冬氨酰甘氨酸酰胺。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明的6種具有免疫抑制活性的飽和脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽 酰胺具有優(yōu)秀的免疫抑制作用，臨床上可作為免疫抑制劑應(yīng)用。并且本發(fā)明的飽和脂肪鏈 胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺水溶液中均能自組裝成粒經(jīng)穩(wěn)定在38. 9-1030nm的納米球，可作 為制備微乳或脂質(zhì)體藥物載體的制劑材料，另外可作為制備微乳、脂質(zhì)體藥物載體的靶向 制劑材料。


圖1為通式I的6種具有免疫抑制活性的飽和脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺的 合成路線(xiàn)。i)無(wú)水THF、DCC、HOBt和NMM ；ii)4N氯化氫-乙酸乙酯溶液；iii)無(wú)水乙醇、 Pd/C 和 H2 ；7a η = 6,7b η = 8,7c η = 10，7d η = 12，7e η = 14，7f η = 16。為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實(shí)施例。這些實(shí)施例完全是例證性的，它 們僅用來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
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具體實(shí)施例方式實(shí)施例IBoc-Gly-NHCH2 (CH2) 6CH3 的制備將0. 80g (4. 57mmol) Boc-Gly溶于20ml無(wú)水THF，冰浴下往得到的溶液中 加入0. 62g(4. 57mmol)N-羥基苯并三氮唑(HOBt)，并使完全溶解。10分鐘后加入 1. 13g(5. 48mmol) 二環(huán)己基羰二亞胺(DCC)，得到反應(yīng)液(I)。冰浴下把0. 72g(4. 57mmol) 脂肪胺CH3(CH2)6CH2NH2懸浮于20ml無(wú)水THF中，然后加入Iml N-甲基嗎啉(NMM)，調(diào)pH 8-9。攪拌35分鐘，得到反應(yīng)液(II)。冰浴下把反應(yīng)液⑴加入反應(yīng)液(II)中，先冰浴下攪 拌lh，再室溫?cái)嚢?2h，TLC (氯仿/甲醇，10 1)顯示Boc-Lys (Z)消失。濾除二環(huán)己基脲 (D⑶)，減壓除去THF。殘留物用50ml乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用飽和NaHCO3水溶 液洗、飽和NaCl水溶液洗、5% KHSO4水溶液洗和飽和NaCl水溶液洗。有機(jī)相用無(wú)水Na2SO4 干燥、過(guò)濾、濾液減壓濃縮至干，得到1. 24g(95% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色油狀物。ESI-MS(m/ ζ) :287[M+H]+。實(shí)施例 2Boc-Gly-NHCH2 (CH2) 8CH3 的制備按照實(shí)施例1 的方法由 0. 80g (4. 57mmol) Boc-Gly 和 0. 72g(4. 57mmol) CH3(CH2)8CH2NH2 制得 1. 35g(94% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/z) :315[M+H] +。實(shí)施例3Boc-Gly-NHCH2 (CH2) 10CH3 的制備按照實(shí)施例1 的方法由 0. 80g (4. 57mmol) Boc-Gly 和 0. 85g(4. 57mmol) CH3(CH2)ltlCH2NH2 制得 1. 47g(94% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/z) :343[M+H] +。實(shí)施例4Boc-Gly_NHCH2 (CH2) 12CH3 的制備按照實(shí)施例1 的方法由 0. 80g (4. 57mmol) Boc-Gly 和 0. 98g(4. 57mmol) CH3(CH2)12CH2NH2 制得 1. 6Ig(95% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS (m/z) :371[M+H] +。實(shí)施例5Boc-Gly-NHCH2 (CH2) 14CH3 的制備按照實(shí)施例1 的方法由 0. 80g (4. 57mmol) Boc-Gly 和 1. IOg (4. 57mmol) CH3(CH2) I4CH2NH2 制得 1. 76g(97% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/z) :399[M+H] +。實(shí)施例6Boc-Gly-NHCH2 (CH2) 16CH3 的制備按照實(shí)施例1 的方法由 0. 80g (4. 57mmol) Boc-Gly 和 1. 23g(4. 57mmol) CH3(CH2)16CH2NH2 制得 1. 75g(90% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/z) :427[M+H] +。
實(shí)施例 7HC1 · Gly-NHCH2 (CH2) 6CH3 的制備將1. 24g (4. 33mmol) Boc-Gly-OCH2 (CH2) 6CH3 溶解在 80ml 4N 氯化氫-乙酸乙酯溶 液中，室溫?cái)嚢?小時(shí)，TLC (氯仿甲醇，5 1)顯示Boc-Gly-OCH2 (CH2) 6CH3消失，減壓濃 縮除去乙酸乙酯，殘留物反復(fù)加少量乙醚進(jìn)行減壓濃縮以除去氯化氫。最后加少量乙醚將 殘留物研磨成0.92g(95% )標(biāo)題化合物，為米黃色油狀物。ESI-MS(m/z) :187[M+H] +。實(shí)施例8HC1 · Gly-NHCH2 (CH2) 8CH3 的制備按照實(shí)施例7 的方法，從 1. 35g(4. 29mmol) Boc-Gly-NHCH2 (CH2) 8CH3 制得 1.03g(96% )標(biāo)題化合物，為米黃色油狀物。ESI-MS(m/z) :215[M+H] +。實(shí)施例9HC1 · Gly-NHCH2 (CH2) 10CH3 的制備按照實(shí)施例7 的方法，從 1. 47g(4. 29mmol) Boc-Gly-NHCH2 (CH2) 10CH3 制得 1. 15g(96% )標(biāo)題化合物，為米黃色油狀物。ESI-MS(m/z) :243[M+H] +。實(shí)施例IOHCl · Gly-NHCH2 (CH2) 12CH3 的制備
按照實(shí)施例7 的方法，從 1. 61g(4. 35mmol)Boc-Gly-NHCH2(CH2) 12CH3 制得 1. 31g(98% )標(biāo)題化合物，為米黃色固體。ESI-MS(m/z) :271[M+H] +。實(shí)施例1 IHCl · Gly-NHCH2 (CH2) 14CH3 的制備按照實(shí)施例7 的方法，從 1. 76g(4. 42mmol) Boc-Gly-NHCH2 (CH2) 14CH3 制得 1. 35g(91% )標(biāo)題化合物，為米黃色固體。ESI-MS(m/z) :299[M+H] +。實(shí)施例 12HC1 · Gly-NHCH2 (CH2) 16CH3 的制備按照實(shí)施例7 的方法，從 1. 75g(4. 11 匪ol) Boc-Gly-NHCH2 (CH2) 16CH3 制得 1.40g(94% )標(biāo)題化合物，為米黃色固體。ESI-MS(m/z) :327[M+H] +。實(shí)施例I3Boc-Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 6CH3 的制備按照實(shí)施例1 的方法由 1.33g(4. 13mmol) Boc-Asp (OBzl)和 0.92g(4. 13mmol) HCl · Gly-NHCH2(CH2)6CH3 制得 1.93g(95% )標(biāo)題化合物，為淡黃色油狀物。ESI-MS(m/z) 492 [M+H]+，[a J20d = -15. 2 (c = 1. 0，CH3OH)。實(shí)施例14Boc-Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 8CH3 的制備按照實(shí)施例1 的方法由 1. 33g(4. llmmol) Boc-Asp (OBzl)和 1. 03g(4. llmmol) HCl · Gly-NHCH2(CH2)8CH3 制得 1.94g(91% )標(biāo)題化合物，為淡黃色油狀物。ESI-MS(m/z) 520 [M+H]+，[a J20d = -16. 2 (c = 1. 0，CH3OH)。實(shí)施例I5Boc-Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 10CH3 的制備按照實(shí)施例1 的方法由 1. 33g(4. 13mmol) Boc-Asp (OBzl)和 1. 15g(4. 13mmol) HCl · Gly-NHCH2(CH2)ltlCH3 制得 2. 17g(96% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色油狀物。ESI-MS(m/z) 548 [Μ+Η]+, [α ]20d = -15. 8 (c = 1. O, CH3OH)。實(shí)施例I6Boc-Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 12CH3 的制備按照實(shí)施例1 的方法由 1. 38g(4. 27mmol) Boc-Asp (OBzl)和 1. 31g(4. 27mmol) HCl .Gly-NHCH2 (CH2)12CH3 制得 2.09g (85% )標(biāo)題化合物，為淡黃色油狀物。ESI-MS (m/z) 576[M+H]+，[a J20d = -14. 1 (c = 1. 0，CH3OH)。實(shí)施例I7Boc-Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 14CH3 的制備按照實(shí)施例1 的方法由 1. 31g (4. 04mmol) Boc-Asp (OBzl)和 1. 35g(4. 04mmol) HCl · Gly-HNCH2(CH2)14CH3 制得 2. 17g(89% )標(biāo)題化合物，為淡黃色固體。ESI-MS (m/z) 604[Μ+Η]+, [α ]20d = -5. 4(c = 1. O, CH3OH)。實(shí)施例I8Boc-Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 16CH3 的制備按照實(shí)施例1 的方法由 1. 25g (3. 86mmol) Boc-Asp (OBzl)和 1. 40g(3. 86mmol) HCl · Gly-NHCH2(CH2)16CH3 制得 2. 09g(86% )標(biāo)題化合物，為淡黃色固體。ESI-MS (m/z) 632[M+H]+，[a ]20d = -1. 3(c = 1. 0，CH3OH)。實(shí)施例I9HCl · Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 6CH3 的制備按照實(shí)施例7 的方法，從 1. 93g (3. 93mmol) Boc-Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 6CH3 制 得 1.68g(91% )標(biāo)題化合物，為米黃色固體。ESI-MS (m/z) 392 [Μ+Η]+, [ α J20d = 4. O (c = 1. O, CH3OH)。實(shí)施例2OHCl · Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 8CH3 的制備按照實(shí)施例7 的方法，從 1. 94g (3. 74mmol) Boc-Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 8CH3 制 得 1. 64g(96% )標(biāo)題化合物，為米黃色固體。ESI-MS (m/z) 420 [Μ+Η]+, [ α J20d = 2. 8 (c =
61. 0，CH3OH)。實(shí)施例2IHCl · Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 10CH3 的制備按照實(shí)施例7 的方法，從 2. 17g (3. 97mmol) Boc-Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 10CH3 制 得 1. 77g(92% )標(biāo)題化合物，為米黃色固體。ESI-MS (m/z) 448 [Μ+Η]+, [ α J20d = 15. 8 (c = 1· 0，CH3OH)。實(shí)施例22HCl · Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 12CH3 的制備按照實(shí)施例7 的方法，從 2. 09g (3. 63mmol) Boc-Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 12CH3 制 得 1. 76g(94% )標(biāo)題化合物，為米黃色固體。ESI-MS(m/z) 476 [Μ+Η]+, [ α J20d = 2. 8 (c = 1. O, CH3OH)。實(shí)施例23HCl · Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 14CH3 的制備按照實(shí)施例7 的方法，從 2. 17g (3. 60mmol) Boc-Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 14CH3 制 得 185g(95% )標(biāo)題化合物，為米黃色固體。ESI-MS(m/z) :504[Μ+Η]+，[α ]20D = 3. O (c = 1. O, CH3OH)。實(shí)施例24HC1 · Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 16CH3 的制備按照實(shí)施例7 的方法，從 2. 09g (3. 31mmol) Boc-Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 16CH3 制 得 1. 82g(97% )標(biāo)題化合物，為米黃色固體。ESI-MS(m/z) 532[Μ+Η]+, [ α J20d = 2. 4(c = 1. O, CH3OH)。實(shí)施例25Boc-Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 6CH3 的制備按照實(shí)施例1 的方法由 1. 32g(3. 93mmol)Boc-Glu(OBzl)和 1. 68g(3. 93mmol) HCl · Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 6CH3制得，所得化合物經(jīng)硅膠柱層析純化得無(wú)色透明油狀 物 1.90g，純化條件氯仿甲醇=100 1，收率為 68%。ESI-MS (m/z) 711 [Μ+Η]+, [ α J20d =-19. l(c = 1. 0，CH3OH)。實(shí)施例26Boc-Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 8CH3 的制備按照實(shí)施例1 的方法由 1. 21g(3. 60mmol)Boc-Glu(OBzl)禾Π 1. 64g(3. 60mmol) HCl · Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 8CH3制得，所得化合物經(jīng)硅膠柱層析純化得無(wú)色透明油狀 物 1.81g，純化條件氯仿甲醇=100 1，收率為 68%。ESI-MS (m/z) 739 [Μ+Η]+, [ α J20d =-36. 4 (c = 1. 0，CH3OH)。實(shí)施例27Boc-Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 10CH3 的制備按照實(shí)施例1 的方法由 1. 23g(3. 66mmol)Boc-Glu(OBzl)和 1. 77g(3. 66mmol)HC 1 · Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 10CH3制得，所得化合物經(jīng)硅膠柱層析純化得無(wú)色透明油狀物 1. 71g，純化條件氯仿甲醇=100 1，收率為 61%。ESI-MS(m/z) :767[Μ+Η]+，[α ]20D =-24. 6 (c = 1. 0，CH3OH)。實(shí)施例28Boc-Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 12CH3 的制備按照實(shí)施例1 的方法由 1. 16g(3. 44mmol)Boc-Glu(OBzl)禾Π 1. 76g(3. 44mmol)HC 1 · Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 12CH3制得，所得化合物經(jīng)硅膠柱層析純化得無(wú)色透明油狀物 1. 78g，純化條件氯仿甲醇=100 1，收率為 65%。ESI-MS(m/z) :795[Μ+Η]+，[α ]20D =-31. 8 (c = 1. 0，CH3OH)。實(shí)施例29Boc-Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 14CH3 的制備按照實(shí)施例1 的方法由 1. 16g(3. 43mmol)Boc-Glu(OBzl)和 1. 85g(3. 43mmol)HC
71 · Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 14CH3制得，所得化合物經(jīng)硅膠柱層析純化得無(wú)色透明油狀物 2. 00g，純化條件氯仿甲醇=100 1，收率為 71%。ESI-MS(m/z) :823[Μ+Η]+，[α ]20D =-13. 4 (c = 1. 0，CH3OH)。實(shí)施例3OBoc-Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 16CH3 的制備按照實(shí)施例1 的方法由 1. 08g(3. 21mmol)Boc-Glu(OBzl)和 1. 82g(3. 21mmol)HC 1 · Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 16CH3制得，所得化合物經(jīng)硅膠柱層析純化得無(wú)色透明油狀物 1.88g，純化條件氯仿甲醇=100 1，收率為 69%。ESI-MS(m/z) :851[Μ+Η]+，[α ]20D =-3. 0(c = 1. 0，CH3OH)。實(shí)施例31HC1 · Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 6CH3 的制備按照實(shí)施例7 的方法，從 1. 51g(2. 13mmol)Boc-Glu (OBzl)-Asp (OBzl)-Gly-NHCH2 (CH2)6CH3 制得 1. 28g(93% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS (m/z) :611[M+H] +。實(shí)施例32HC1 · Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 8CH3 的制備按照實(shí)施例7 的方法，從 1. 41mg(l. 91mmol)Boc-Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH 2(CH2)8CH3 1. 16g(90% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/z) :641[M+H]+。實(shí)施例33HC1 · Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 10CH3 的制備按照實(shí)施例7 的方法，從 1. 60mg(2. 09mmol) Boc-Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH 2(CH2)ltlCH3 制得 1. 36g(93% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI_MS(m/z) :669[M+H] +。實(shí)施例34HC1 · Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 12CH3 的制備按照實(shí)施例7 的方法，從 1. 52mg(l. 91mmol) Boc-Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH 2(CH2)12CH3 制得 1. 20g(86% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI_MS(m/z) :697[M+H] +。實(shí)施例35HC1 · Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 14CH3 的制備按照實(shí)施例7 的方法，從 1. 65g(2. Olmmol) Boc-Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2)14CH3 制得 1. 37g(90% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/z) :725[M+H]+。實(shí)施例36HC1 · Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 16CH3 的制備按照實(shí)施例7 的方法，從 1. 56g(l. 84mmol)Boc-Glu (OBzl)-Asp (OBzl)-Gly-NHCH2 (CH2)16CH3 制得 1. 27g(88% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/z) :751[M+H]+。實(shí)施例 37Glu-Asp-Gly-NHCH2 (CH2) 6CH3 (7a)的制備將1. 28g(l. 98mmol)HCl .Glu (OBzl)-Asp (OBzl)-Gly-NHCH2 (CH2)6CH3 用乙醇溶解、 加入適量Pd/C(約5% )、通H2(0. 02Mba)，室溫?cái)嚢柚猎宵c(diǎn)消失。濾除Pd/C、濾液減壓 濃縮至干。制得751mg(82% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI_MS(m/Z) :429[Μ_ΗΓ，[a]20D =-9. 6 (c = 1. 0，CH3OH)，Μ. p. 104. 7—106. 4°C。實(shí)施例38Glu-Asp-Gly_NHCH2 (CH2) 8CH3 (7b)的制備將1. 08g(l. 60mmol)HCl .Glu (OBzl)-Asp (OBzl)-Gly-NHCH2 (CH2)8CH3 用乙醇溶解、 加入適量Pd/C(約5% )、通H2(0. 02Mba)，室溫?cái)嚢柚猎宵c(diǎn)消失。濾除Pd/C、濾液減壓 濃縮至干。制得699mg(80% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI_MS(m/Z) :457[Μ_ΗΓ，[a]20D =-6. l(c = 1. 0，CH3OH)，Μ. ρ. :89· 7-90. 1°C。實(shí)施例39Glu-Asp-Gly_NHCH2 (CH2) 10CH3 (7c)的制備將1. OOmg(1. 44mmol)HCl · Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 10CH3 用乙醇溶 解、加入適量Pd/C(約5% )、通H2(0. 02Mba)，室溫?cái)嚢柚猎宵c(diǎn)消失。濾除Pd/C、濾液減壓
8濃縮至干。制得853mg(84% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI_MS(m/Z) :485[Μ_ΗΓ，[a]20D =-5. 5(c = 1. 0，CH3OH)，Μ. ρ. :87· 4-89. 1°C。實(shí)施例40Glu-Asp-Gly_NHCH2 (CH2) 12CH3 (7d)的制備將1. 30g(l. 78mmol)HCl · Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 12CH3 用乙醇溶 解、加入適量Pd/C(約5% )、通H2(0. 02Mba)，室溫?cái)嚢柚猎宵c(diǎn)消失。濾除Pd/C、濾液減壓 濃縮至干。制得844mg(86% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI_MS(m/Z) :513[Μ_ΗΓ，[a]20D =-2· 8 (c = 1· 0，CH3OH)，Μ. ρ. :84· 7-85. 7°C。實(shí)施例41Glu-Asp-Gly_NHCH2 (CH2) 14CH3 (7e)的制備將1. 26g(l. 66mmol)HCl · Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 14CH3 用乙醇溶 解、加入適量Pd/C(約5% )、通H2(0. 02Mba)，室溫?cái)嚢柚猎宵c(diǎn)消失。濾除Pd/C、濾液減壓 濃縮至干。制得882mg(81% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI_MS(m/Z) :541[Μ_ΗΓ，[a]20D =-2· 2 (c = 1· 0，CH3OH)，Μ. ρ. :78· 3-79. 5°C。實(shí)施例42Glu-Asp-Gly-NHCH2 (CH2) 16CH3 (7f)的制備將1. 17g(l. 48mmol)HCl · Glu (OBzl) -Asp (OBzl) -Gly-NHCH2 (CH2) 16CH3 用乙醇溶 解、加入適量Pd/C(約5% )、通H2(0. 02Mba)，室溫?cái)嚢柚猎宵c(diǎn)消失。濾除Pd/C、濾液減壓 濃縮至干。制得828mg(79% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI_MS(m/Z) :569[Μ_ΗΓ，[a]20D =-2· 9 (c = 1· 0，CH3OH)，Μ. ρ. :79· 4-80. 8°C。試驗(yàn)例1飽和脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞絲裂原增殖的抑 制作用脫頸處死小鼠，無(wú)菌取脾，用200目鋼網(wǎng)和注射器芯研磨，用HANK’ S液洗兩次， 1500轉(zhuǎn)/分條件下離心10分鐘，計(jì)數(shù)后用完全RPMI-1640培養(yǎng)液配成5X106/ml個(gè)脾淋 巴細(xì)胞，加100 μ 1細(xì)胞懸液于96孔培養(yǎng)板中(每孔含5Χ106個(gè)細(xì)胞)。每孔加20 μ 1 ConA (ConA終濃度為5 μ g/ml)，該96孔培養(yǎng)板置于體積分?jǐn)?shù)為0. 05的CO2飽和濕度的培養(yǎng) 箱內(nèi)37°C培養(yǎng)4h。4h后分別加入不同濃度飽和脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺(1X10_4M、 8X 1(Γ5Μ、5Χ 1(Γ5Μ、3Χ 1(Γ5Μ、1Χ 1(Γ5Μ、8Χ 1(Γ6Μ、5Χ ICT6M 和 IX I(T6M)，每個(gè)濃度 3 個(gè)復(fù)孔。 同時(shí)設(shè)不含化合物對(duì)照孔和只含同量培養(yǎng)液無(wú)ConA的細(xì)胞空白孔。各個(gè)孔均重復(fù)3次(η =3)。培養(yǎng)48h后用MTT法檢測(cè)化合物對(duì)脾淋巴細(xì)胞的抑制作用。按照公式“抑制率=(D對(duì)照-D含藥)/D對(duì)照X 100%”計(jì)算不同濃度飽和脂肪鏈 胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用，根據(jù)細(xì)胞相對(duì)生存率和化合物的 濃度繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)，利用該生長(zhǎng)曲線(xiàn)求得半數(shù)抑制率(dxIC5ci)。結(jié)果列入表1。結(jié)果表明 本發(fā)明的飽和脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖有明確的抑制作用。表1飽和脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞絲裂原增殖的抑制作 用 9 試驗(yàn)例2飽和脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬的抑制作用將生長(zhǎng)狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Ana-I小鼠巨噬細(xì)胞以1 X IO5個(gè)/mL的密度 接種于96孔板，每孔100 μ 1，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)，按預(yù)設(shè)的濃度梯度加入經(jīng) 滅菌處理的飽和脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺(1 X 10_4M、8X 10_5M、5X 10_5M、3X 10_5M、 1 X 10_5M、8X 10_6M、5X ΙΟ—Μ和1 X I(T6M)，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組加入等體積的溶解樣 品的溶媒。繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，吸棄上清液，每孔加入100 μ 10. 的中性紅溶液，置于 37°C孵育30分鐘。吸棄中性紅溶液，并用PBS緩沖溶液洗滌2-3次(除去未被巨噬細(xì)胞吞 噬的中性紅)，加入細(xì)胞溶解液(乙醇乙酸=1 1)100 μ 1，4°C過(guò)夜，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度 值，波長(zhǎng)540nm。各個(gè)孔均重復(fù)3次(η = 3)。按照公式“抑制率=(D對(duì)照-D含藥)/D對(duì)照Χ100%”計(jì)算不同濃度的化合物 對(duì)巨噬細(xì)胞的吞噬能力的抑制作用，根據(jù)細(xì)胞相對(duì)生存率和化合物的濃度繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲 線(xiàn)，利用該生長(zhǎng)曲線(xiàn)求得半數(shù)抑制率(dxIC5ci)。結(jié)果列入表2。結(jié)果表明本發(fā)明的飽和脂肪 鏈胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺對(duì)Ana-I小鼠巨噬細(xì)胞吞噬有明確的抑制作用。表2飽和脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺對(duì)Ana-I小鼠巨噬細(xì)胞吞噬的抑制作用 試驗(yàn)例3飽和脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺在納米水平的自組裝將飽和脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺配置成1 μ mol/ml的水溶液，在激光納米 粒度儀上25°C測(cè)定粒徑。連續(xù)測(cè)定8天，記錄其粒徑。結(jié)果列入表3。數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明的 飽和脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺水溶液中均能自組裝成粒經(jīng)穩(wěn)定在38. 9-1030nm的納 米球。表3飽和脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺在水中自組裝的納米球粒徑
權(quán)利要求
通式I的6種具有免疫抑制活性的飽和脂肪鏈胺Glu Asp Gly三肽酰胺Glu Asp Gly NH CH2 (CH2)nCH3 I通式I中的n＝6、8、10、12、14或16。
2.一種制備權(quán)利要求1的脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺的方法，包括(1)將N端保護(hù)基保護(hù)的甘氨酸與飽和脂肪胺縮合，所述飽和脂肪胺為CH3(CH2) nCH2NH2, η = 6、8、10、12、14 或 16 ；(2)脫去N端保護(hù)基得到飽和脂肪胺甘氨酸酰胺；(3)按照現(xiàn)有液相合成技術(shù)，將飽和脂肪胺甘氨酸酰胺與天冬氨酸的保護(hù)中間體、谷氨 酸的保護(hù)中間體逐步接肽合成保護(hù)基保護(hù)的飽和脂肪胺三肽綴合物；(4)依次脫去保護(hù)基保護(hù)的飽和脂肪胺三肽綴合物的N端保護(hù)基和C端保護(hù)基得到目 標(biāo)化合物。
3.權(quán)利要求1的6種飽和脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺在制備免疫抑制劑類(lèi)藥物中 的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1的6種飽和脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺作為制備微乳或脂質(zhì)體藥物 載體的制劑材料的用途。
5.權(quán)利要求1的6種飽和脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺作為制備微乳、脂質(zhì)體藥物 載體的靶向制劑材料中的用途。全文摘要
本發(fā)明涉及通式I的6種具有免疫抑制活性的飽和脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺綴合物，在飽和脂肪鏈胺中n＝6、8、10、12、14或16，涉及它們的制備方法以及作為免疫抑制劑的應(yīng)用。這些飽和脂肪鏈胺Glu-Asp-Gly三肽酰胺對(duì)脾淋巴細(xì)胞絲裂原增殖反應(yīng)的抑制作用，以及對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬活性的抑制作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的化合物具有優(yōu)秀的免疫抑制作用，臨床上可作為免疫抑制劑應(yīng)用。Glu-Asp-Gly-NH-CH2-(CH2)nCH3 I
文檔編號(hào)A61K47/42GK101899087SQ20091008532
公開(kāi)日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2009年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月26日
發(fā)明者彭師奇, 趙明, 趙淑銳 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)