專利名稱：單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂的制備方法以及單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液或凍干粉針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物藥物的制備方法，特別是涉及神經(jīng)節(jié)苷脂鈉的制備方法。本發(fā)明還涉及包含該神經(jīng)節(jié)苷脂鈉的制劑。
背景技術(shù)：
神經(jīng)節(jié)苷脂(ganliosides，GLS)又稱N物質(zhì)，是含有唾液酸殘基結(jié)構(gòu)復(fù)雜的膜糖 脂，是神經(jīng)細(xì)胞膜的主要脂質(zhì)成分之一，是細(xì)胞表面負(fù)電荷的主要來源，參與細(xì)胞表面識別 和信號傳導(dǎo)。神經(jīng)節(jié)苷脂是促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)損傷后修復(fù)的一種特效物質(zhì)，在神經(jīng)系統(tǒng) 發(fā)生、生長和分化過程中具有重要作用，對損傷后的神經(jīng)具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生、軸突生 長和突觸形成、恢復(fù)神經(jīng)支配功能；改善神經(jīng)傳導(dǎo)、促進(jìn)腦電活動及其它神經(jīng)電生理指標(biāo) 的恢復(fù)；保護(hù)細(xì)胞膜、促進(jìn)細(xì)胞膜各種酶活性恢復(fù)等作用。單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂(GMl)除 具有上述神經(jīng)節(jié)苷脂的共同作用外，還可以通過維持中樞神經(jīng)細(xì)胞膜上的Na+-K+-ATP酶 及Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性，起到維持細(xì)胞內(nèi)外離子平衡、減輕神經(jīng)細(xì)胞水腫、防止細(xì)胞內(nèi) Ca2+積聚的作用，具有對抗興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性作用和減少自由基對神經(jīng)細(xì)胞的損害 等作用。神經(jīng)節(jié)苷脂的分子組成包括兩個部分即疏水的神經(jīng)酰胺和親水的唾液酸寡糖 基團(tuán)，而神經(jīng)酰胺由氨基鞘胺醇與脂肪酸酯化而成。神經(jīng)酰胺一端嵌入細(xì)胞膜磷脂雙分子 層中，寡糖鏈和唾液酸部分游離于細(xì)胞膜表面。依據(jù)神經(jīng)節(jié)苷脂分子中所含唾液酸的數(shù)目 (單唾液酸、雙唾液酸、三唾液酸等)、糖殘基的數(shù)目、連接位置以及亞基的不同，分別被命 名為 GMl, GM2, GM3, GDla, GDlb, GTlb, GD3 等。GMl的分子結(jié)構(gòu)式如下 GMl-Gangliosidde單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉(GMl)是主要的神經(jīng)節(jié)苷脂之一，臨床上用于治療 中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變(包括腦脊髓創(chuàng)傷、腦血管意外)和帕金森氏病，療效確切，安全性高，已 在我國上市多年。
神經(jīng)節(jié)苷脂的制備一般分為提取和純化兩個步驟首先將細(xì)胞膜上的神經(jīng)節(jié)苷脂 用溶劑提取出來，得到粗提物或粗提液；再采用層析或其他生物技術(shù)手段進(jìn)行分離純化，得 到單一組分的某一種神經(jīng)節(jié)苷脂?，F(xiàn)有神經(jīng)節(jié)苷脂的提取方法均基于J. Folch等人的文獻(xiàn)(J. Folch. A simplemeyhod for the isolution and purification of total lipides from animal tissues. TheJournal of Biological Chemistry, 1957,226(1) :497 509)，其主要方法 是首先制備動物腦組織勻漿液，加入20倍組織重量的氯仿-甲醇混合溶液(2 1V/V)提 取總脂；加入0. 2倍體積的水或無機(jī)鹽水溶液于總脂提取液中使其分層，神經(jīng)節(jié)苷脂分配 到上層，虹吸上層溶液，得到神經(jīng)節(jié)苷脂的粗提液。后人在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了一些改進(jìn)，如先 用丙酮將組織勻漿液制成丙酮干粉，再用一定比例的氯仿、甲醇、水混合溶液進(jìn)行提取，萃 取分層后神經(jīng)節(jié)苷脂轉(zhuǎn)入水相，得到神經(jīng)節(jié)苷脂的粗提液。神經(jīng)節(jié)苷脂的純化一般采用層析技術(shù)，層析介質(zhì)可采用離子交換介質(zhì)、多孔硅膠 或大孔吸附樹脂等。例如中國專利CN 1814610A公開了采用大孔樹脂分離GMl的方法。 中國專利CN 1353112A公開一種從動物腦組織中分離純化高純度GMl的工藝方法。該方法 主要包括用有機(jī)溶劑混合物提取總神經(jīng)節(jié)苷脂，酸水解總神經(jīng)節(jié)苷脂，離子交換柱層析，反 相柱層析等四步，所得GMl純度大于98%。又如中國專利CN 1158295C公開了結(jié)合使用 超濾膜分離技術(shù)、Iatrobeads及DEAE Sephadex A_25柱層析、高效液相色譜層析技術(shù)，從 豬腦中提取、純化神經(jīng)節(jié)苷脂GM1，純度達(dá)95%以上。動物組織中的神經(jīng)節(jié)苷脂含量極低，每公斤腦組織約含有GM10.2g，上述公開的工 藝均需要使用大量有機(jī)溶劑(丙酮、氯仿和甲醇)。大量使用有機(jī)溶劑有很多弊端，如污染 環(huán)境，對操作人員的身體健康容易造成損害，易燃，有火災(zāi)隱患，要求有防爆設(shè)施，需要有回 收溶劑的設(shè)備，并且最終產(chǎn)品中需要對使用的有機(jī)溶劑進(jìn)行檢查等等。從理論上講，藥物制備過程中所使用的有機(jī)溶劑均有殘留的可能。程速遠(yuǎn)等人測 定了 GMl的進(jìn)口上市產(chǎn)品(阿根廷TRB Pharma 20011004, 20021005, 20011006)中有機(jī)溶 劑殘留量(程速遠(yuǎn)、徐康森.頂空毛細(xì)管氣相色譜法測定單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂中有機(jī)溶劑 殘留量，海峽藥學(xué)，2005，17(1) :33 35)，其甲醇、氯仿和丙酮的殘留量分別為0.054%、 0. 003%,0. 051%。人用藥物注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(International Conference onHarmon i ζ at i on of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals forHuman Use, ICH)頒布的殘留溶劑研究指導(dǎo)原則ICH Q3C中說明了第二類溶劑的危害 第二類溶劑是指有非遺傳毒性致癌(動物實(shí)驗(yàn))、或可能導(dǎo)致其他不可逆毒性(如神經(jīng)毒性 或致畸性)、或可能具有其他嚴(yán)重的但可逆毒性的有機(jī)溶劑。此類溶劑具有一定的毒性，但 和第一類溶劑相比毒性較小，建議限制使用，以防止對病人潛在的不良影響。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷 脂(GMl)的制備方法。本發(fā)明在單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂的提取過程中不使用有機(jī)溶 劑，且制備過程簡化，適于大規(guī)模生產(chǎn)，更加環(huán)保，并且可以降低生產(chǎn)成本和生產(chǎn)周期。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了采用上述方法制備的GMl為原料藥制造的制劑，特別是
4注射劑。由于如上所述，本發(fā)明在單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂的提取過程中不使用有機(jī)溶 劑，因此，所制備得到的單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂沒有有機(jī)溶劑殘留，且純度較高(能夠 達(dá)到98%以上)，從而能夠有效地提高臨床用藥的安全性。在本文中，有時將單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂簡稱為神經(jīng)節(jié)苷脂。由于神經(jīng)節(jié)苷脂主要存在于細(xì)胞膜，神經(jīng)酰胺一端嵌入細(xì)胞膜內(nèi)，寡糖鏈一端伸 出細(xì)胞膜外，因而提取神經(jīng)節(jié)苷脂的關(guān)鍵在于破壞其與細(xì)胞膜的作用力，使其釋放到溶液 中。本發(fā)明人在采用去垢劑溶液提取膜蛋白的試驗(yàn)過程中，偶然發(fā)現(xiàn)同時可以將神經(jīng)節(jié)苷 脂提取出來。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明人對去垢劑溶液提取神經(jīng)節(jié)苷脂的方法進(jìn)行研究，試驗(yàn)結(jié) 果表明，采用一定濃度的除垢劑溶液提取神經(jīng)節(jié)苷脂是可行的，并且提取率不低于原有方 法，可減少或完全不使用有機(jī)溶劑，避免了大量使用有機(jī)溶劑的各種弊端，該法目前未見報 道。從理論上講，藥物制備過程中所使用的有機(jī)溶劑均有殘留的可能。程速遠(yuǎn)等人測 定了 GMl的進(jìn)口上市產(chǎn)品(阿根廷TRB Pharma 20011004, 20021005, 20011006)中有機(jī)溶 劑殘留量(程速遠(yuǎn)、徐康森.頂空毛細(xì)管氣相色譜法測定單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂中有機(jī)溶劑 殘留量，海峽藥學(xué)，2005，17(1) :33 35)，其甲醇、氯仿和丙酮的殘留量分別為0.054%、 0. 003%,0. 051%。采用本發(fā)明方法可以完全避免有機(jī)溶劑的使用，制備的神經(jīng)節(jié)苷脂殘留有機(jī)溶劑 檢測氣相色譜圖見附圖3，可見產(chǎn)品中未檢出殘留有機(jī)溶劑。甲醇、氯仿為中國藥典2005版中規(guī)定應(yīng)限制使用的第二類有機(jī)溶劑，丙酮為第三 類有機(jī)溶劑，中國藥典2005版對甲醇、氯仿和丙酮的殘留量有明確的要求，分別為0. 3%, 0. 006%和 0. 5%o去垢劑水溶液和有機(jī)溶劑兩者相比較，去垢劑水溶液的作用較溫和，得到的提取 液中含有相對較少的雜質(zhì)，從而在后繼的純化過程中可以得到純度更高的GM1，例如，純度 大于97%，優(yōu)選彡98. 0%，更優(yōu)選為98% 99. 5%，最優(yōu)選為98% 99%。本發(fā)明產(chǎn)品與上市產(chǎn)品的純度檢測色譜圖見附圖1、2，從中可見上市產(chǎn)品施捷因 的純度為96. 09%，本發(fā)明產(chǎn)品的純度為98. 45%。本發(fā)明中，GMl的純度提高表明有效成分的含量提高，雜質(zhì)的含量減少，可以減少 或避免由于雜質(zhì)而引起的與治療無關(guān)的其他作用，如副作用，從而能夠有效地提高臨床用 藥的安全性。根據(jù)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了一種單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂GMl)的制備 方法，其包括以下步驟1)稱取動物腦組織，勻漿，用去垢劑的水溶液作為提取溶劑，攪拌提取，除去沉淀， 得到提取液；2)將所述提取液濃縮，得單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂粗提液。上述制備方法可以進(jìn)一步包括以下步驟將所述單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂粗提液制成干粉，即為神經(jīng)節(jié)苷脂粗提物。動物腦組織可以選自牛腦、豬腦、羊腦、馬腦等，優(yōu)選牛腦和豬腦等，最優(yōu)選豬腦。上述動物腦組織為離體的動物腦組織。在上述步驟中，在用去垢劑水溶液提取動物腦組織之前，一般應(yīng)先去除雜質(zhì)。所述作為提取溶劑的去垢劑水溶液應(yīng)當(dāng)具有適宜的濃度，例如重量百分比為 10%，優(yōu)選 5%。勻漿后的動物腦組織與提取溶劑的體積比應(yīng)當(dāng)能夠保證提取的順利進(jìn)行，優(yōu)選 為1 0.5 5。用含有一定濃度去垢劑的水溶液為提取溶劑，充分破壞細(xì)胞膜。在適宜 溫度條件下，攪拌提取。所采用的溫度根據(jù)所選擇去垢劑的不同而進(jìn)行適宜的調(diào)整，一般在 4°C 60°C的范圍內(nèi)。例如，當(dāng)采用Triton x_100作為提取溶劑時，一般溫度控制在4°C 20°C的范圍內(nèi)。除去沉淀的方法可以采用常規(guī)的去沉淀方法，例如離心或過濾。沉淀可同 法進(jìn)行多次提取，直至神經(jīng)節(jié)苷脂提取完全。合并多次提取液，濃縮至小體積，得到神經(jīng)節(jié) 苷脂粗提液，其神經(jīng)節(jié)苷脂含量按唾液酸計(jì)為0. lmg/ml 10mg/ml?；蜻M(jìn)一步制備成干粉， 即為神經(jīng)節(jié)苷脂粗提物。粗提物中神經(jīng)節(jié)苷脂含量按唾液酸計(jì)為0.1% 25% (重量百分 比)。上述制備方法可以進(jìn)一步包括以下步驟將所述單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂粗提液或粗提物進(jìn)一步純化，獲得純度大于 95 %，優(yōu)選98 %的單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂。所述純化方法可以為現(xiàn)有技術(shù)中已知的純化方法，例如，采用T.Momoi等人報道 的 DEAE-Sephadex A—25 及多孑L娃膠 Iatrobeads 純化技術(shù)(T. Momoi. High resolution preparative column chromatographic system for gangliosides usingDEAE-Sephadex and a new porus silica, Iatrobeads. Biochim Biophys Acta. 1976,441 (3) :488 497。)，得到純度大于97%的GMl ；也可以采用其他方法進(jìn)行分離純化，如夏霞娟等人報 道的方法(夏霞娟等.水牛腦神經(jīng)節(jié)苷脂的分離純化.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展.1985， 12(5) 27 31)得到 GMl。在本發(fā)明中，所述去垢劑也被稱作表面活性劑，是一類既具有親水基又具有疏水 基的物質(zhì)，一般具有乳化、分散、和增溶作用，按其在水溶液中顯示表面活性的離子基團(tuán)，可 分為非離子型去垢劑、離子型去垢劑以及兼性離子型去垢劑等多種類型。所述去垢劑可以為選自非離子型去垢劑、離子型去垢劑以及兼性離子型去垢劑的 一種或多種。所述去垢劑可以為兩種或兩種以上相同或不同類型去垢劑的混合物。所述非離子型去垢劑可以選自但不限于:bigCHAP((3a,5b,7a,12a)-N, N-雙 [3-(D-葡萄糖酰氨基)丙基]_3，7，12-三羥基膽留烷-24-胺)、Bri j35 (聚氧乙烯月桂 醚)、C12E8 (辛乙烯二醇單正十二烷基酯)、C12E9 (聚乙二醇單月桂酸酯)、葵基-β -葡 萄糖苷、葵基-β _麥芽糖苷、毛地黃皂苷、十二烷基_葡萄糖苷、十二烷基麥芽糖苷、辛 基-β -葡萄糖苷、辛基_ β _麥芽糖苷、Triton X-100 (曲拉通X-100)、Tween-20 (吐溫20 或聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯),Tween-80 (吐溫80或聚山梨酯80或聚氧乙烯脫水山梨 醇單油酸酯)等。所述離子型去垢劑可以選自但不限于膽酸鹽、脫氧膽酸鹽、十二烷基硫酸鹽、 CTAB(即十六烷基三甲基溴化胺，別名溴化十六烷基三甲基胺，鯨臘基三甲基溴化胺)等。所述兼性離子型去垢劑可以選自但不限于CHAPS(3[(3膽酰氨基丙基)二甲氨 基]丙磺酸鹽)、CHAPS0(3-[ (3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-2_羥基-1-丙磺酸)、 Zwittergent (烷基磺酸甜菜堿)等。優(yōu)選離子型去垢劑，因?yàn)槠渑R界膠束濃度適當(dāng)，膠束分子量一般較小，容易通過超 濾或透析的方法除去。
在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案1)取動物腦組織，除去雜質(zhì)，用含有一定濃度去垢劑的水溶液為提取溶劑，充分破 壞細(xì)胞膜。在適宜溫度條件下，攪拌提取，離心或過濾除去沉淀，沉淀可同法進(jìn)行多次提取， 直至神經(jīng)節(jié)苷脂提取完全。合并多次提取液，濃縮至小體積，得到神經(jīng)節(jié)苷脂粗提液，或進(jìn) 一步制備成干粉，即為神經(jīng)節(jié)苷脂粗提物。2)神經(jīng)節(jié)苷脂粗提液或粗提物，可以采用T. Momoi等人報道的DEAE-S印hadex A-25 及多孑L娃膠 Iatrobeads 純化技術(shù)(T. Momoi. Highresolution preparative column chromatographic system for gangliosides usingDEAE—Sephadex and a new porus silica, Iatrobeads. Biochim Biophys Acta. 1976，441 (3) :488 497。)，得到純度大于 96%的GMl ；也可以采用其他方法進(jìn)行分離純化，如夏霞娟等人報道的方法(夏霞娟等.水 牛腦神經(jīng)節(jié)苷脂的分離純化.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展.1985，12 (5) :27 31。)得到GM1。由上述方法制備得到的GMl可以進(jìn)一步制備成合適的制劑，優(yōu)選注射劑，例如注 射液或凍干粉針制劑。該注射劑包含由本發(fā)明的制備方法制備得到的單唾液酸四己糖神經(jīng) 節(jié)苷脂以及適宜種類和用量的藥用輔料，例如緩沖鹽、凍干賦形劑等。本發(fā)明中，GMl的純度提高表明有效成分的含量提高，雜質(zhì)的含量減少。當(dāng)采用該 沒有有機(jī)溶劑殘留且純度提高的GMl制備注射劑時，可以減少或避免由于雜質(zhì)而引起的與 治療無關(guān)的其他作用，如副作用，從而能夠有效地提高臨床用藥的安全性。為了更好地理解本發(fā)明的本質(zhì)，下面通過對本發(fā)明較佳實(shí)施方式的描述，詳細(xì)說 明但不限制本發(fā)明。


圖1 由本申請實(shí)施例10制得的GMl的純度檢查高效液相色譜圖。圖2 進(jìn)口上市產(chǎn)品施捷因的純度檢測液相色譜圖。圖3 本發(fā)明制得的GMl殘留有機(jī)溶劑檢測氣相色譜圖。圖4 由本申請實(shí)施例11制得的GMl的純度檢查高效液相色譜圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所用試驗(yàn)材料，如無特別說明，均為市售購買產(chǎn)品。實(shí)施例中的動物腦組織 收購于定點(diǎn)屠宰廠，冷凍保存。其他試劑均為市售產(chǎn)品。實(shí)施例1 7為神經(jīng)節(jié)苷脂的提取方法舉例，實(shí)施例8、9為神經(jīng)節(jié)苷脂粗提液濃 縮干燥方法舉例，實(shí)施例10、11為GMl分離純化方法舉例，實(shí)施例12 18為GMl制劑方 法舉例，實(shí)施例19為GMl純度檢測方法，實(shí)施例20為GMl定性檢測法一唾液酸與間苯二 酚-鹽酸反應(yīng)。神經(jīng)節(jié)苷脂的提取方法實(shí)施例1取豬腦組織，除去雜質(zhì)后稱重，加等量純化水制備勻漿，勻漿液加入2倍量(V/ V) 2% Triton X-100溶液，4 20°C攪拌提取15小時，離心除去沉淀，沉淀用2倍量_) 的2% Triton X_100溶液再提取1次，提取時間5小時，合并提取液，用截留分子量為IOKD 的超濾膜進(jìn)行濃縮，濃縮至原體積的五分之一左右，得到神經(jīng)節(jié)苷脂粗提液。以唾液酸量計(jì)算，神經(jīng)節(jié)苷脂含量為0. 83mg/ml。實(shí)施例2取牛腦組織，除去雜質(zhì)后稱重，加等量純化水制備勻漿，勻漿液用1倍量(V/V) 的5% Tween-80溶液，40°C攪拌提取10小時，過濾除去沉淀，沉淀用1倍量(W/W)的5% Tween-80溶液再提取1次，提取時間4小時，合并提取液，減壓濃縮至原體積的八分之一左 右，得到神經(jīng)節(jié)苷脂粗提液。以唾液酸量計(jì)算，神經(jīng)節(jié)苷脂含量為3.02mg/ml。實(shí)施例3取豬腦組織，除去雜質(zhì)后稱重，加等量純化水制備勻漿，勻漿液，用4倍量(V/V)的 1% Brij35溶液，60°C攪拌提取4小時，離心除去沉淀，沉淀用2倍量(W/W)的Brij35 溶液再提取2次，提取時間分別為2小時和1小時，合并提取液，用截留分子量為IOKD的超 濾膜進(jìn)行濃縮，至原體積的四分之一左右，得到神經(jīng)節(jié)苷脂粗提液。以唾液酸量計(jì)算，神經(jīng) 節(jié)苷脂含量為0.31mg/ml。實(shí)施例4取豬腦組織，除去雜質(zhì)后稱重，加等量純化水制備勻漿，勻漿液用0. 5倍量(V/V) 的2%脫氧膽酸鈉溶液，4 20°C攪拌提取20小時，離心除去沉淀，沉淀用0. 5倍量(W/W) 的2%脫氧膽酸鈉溶液再提取1次，提取時間10小時，合并提取液，用截留分子量為IOKD 的超濾膜進(jìn)行濃縮，濃縮至原體積的十分之一左右，得到神經(jīng)節(jié)苷脂粗提液。以唾液酸量計(jì) 算，神經(jīng)節(jié)苷脂含量為5. 64mg/ml。實(shí)施例5取牛腦組織，除去雜質(zhì)后稱重，加等量純化水制備勻漿，勻漿液用3倍量(V/V)的 4%十二烷基硫酸鈉溶液，45°C攪拌提取12小時，離心除去沉淀，沉淀用2倍量(W/W)的4% 十二烷基硫酸鈉溶液再提取1次，提取時間6小時，合并提取液，減壓濃縮至原體積的四分 之一左右，得到神經(jīng)節(jié)苷脂粗提液。以唾液酸量計(jì)算，神經(jīng)節(jié)苷脂含量為0. 15mg/ml。實(shí)施例6取羊腦組織，除去雜質(zhì)后稱重，加等量純化水制備勻漿，勻漿液用1倍量(V/V)的 2% CHAPS溶液，55°C攪拌提取8小時，離心除去沉淀，沉淀用1倍量(W/W)的2% CHAPS溶 液再提取2次，提取時間分別為4小時和2小時，合并提取液，用截留分子量為IOKD的超濾 膜進(jìn)行濃縮，濃縮至原體積的八分之一左右，得到神經(jīng)節(jié)苷脂粗提液。以唾液酸量計(jì)算，神 經(jīng)節(jié)苷脂含量為1. 33mg/ml。實(shí)施例7取馬腦組織，除去雜質(zhì)后稱重，加等量純化水制備勻漿，勻漿液加入1倍量(V/V) 的含2% Triton X-100U % Bri j35的溶液，50°C攪拌提取10小時，離心除去沉淀，沉淀用 1倍量(W/W)的上述溶液同法再提取1次，提取時間為4小時，合并提取液，用截留分子量 為IOKD的超濾膜進(jìn)行濃縮，濃縮至原體積的八分之一左右，得到神經(jīng)節(jié)苷脂粗提液。以唾 液酸量計(jì)算，神經(jīng)節(jié)苷脂含量為2. 14mg/ml。神經(jīng)節(jié)苷脂耜提液的濃縮干燥方法實(shí)施例8取實(shí)施例1得到的神經(jīng)節(jié)苷脂粗提液，進(jìn)行噴霧干燥，得到神經(jīng)節(jié)苷脂粗提物，其 神經(jīng)節(jié)苷脂含量為7. 6% (重量百分比)。
實(shí)施例9取實(shí)施例4得到的神經(jīng)節(jié)苷脂粗提液，對40倍體積的水透析三次，每次12小時， 取透析后的神經(jīng)節(jié)苷脂粗提液裝入料盤中，置于凍干機(jī)內(nèi)，進(jìn)行冷凍干燥，得到GMl粗提 物，其GMl含量為24.6% (重量百分比)。GMl的分離純化方法實(shí)施例10GM1的純化方法離子交換層析將DEAE-S^hadex A-25懸于5倍體積的氯仿/甲醇/0. 8mor/L NaAc (30 60 8，V/V)溶液中，用力振搖片刻，放置30分鐘，過濾。上述過程再重復(fù)3次。 將如上活化的樹脂過濾，再以氯仿/甲醇/水(30 60 8，V/V溶液A)溶液洗3次，以除 去過剩的Ac-離子。將活化的樹脂懸于A液中，加到層析柱中。將按照實(shí)施例1所述方法 制備得到的GMl粗提液對溶液A充分透析，離心除去少許不溶物，得到上樣液，將此上樣液 流加到柱上；再以3倍柱體積的溶液A流洗，除去未被吸附的中性脂類，再以1倍體積的甲 醇洗柱；最后用醋酸銨甲醇溶液進(jìn)行線性梯度洗脫，收集含有GMl的組分。吸附層析將離子交換層析得到的含有GMl的組分對去離子水充分透析，冷凍干燥 后溶于氯仿/甲醇/水(60 40 2V/V溶液B)溶液中，將此溶解液流加到用溶液B平衡 的Iatrobeads層析柱上，然后用3倍柱體積的溶液B洗去未吸附的雜質(zhì)，再用溶液B和氯 仿/甲醇/水(30 70 4V/V溶液C)進(jìn)行線性梯度洗脫。收集含有GMl的組分，對去離 子水透析后除菌過濾，濾液冷凍干燥得到GMl純品。經(jīng)HPLC法測定純度大于96 %。每IKg腦組織可以得到GMl約120mg。實(shí)施例11 GMl的純化方法DEAE-Spharose瓊脂糖層析層析柱垂直固定在支架上，預(yù)先加入 1500ml0. 02mol/L pH 7.4 Tris-HCl起始緩沖液排除管道中的氣泡，接上恒流泵。將用 0. 02mol/L pH 7.4 Tris-HCl起始緩沖液平衡好的DEAE-Spharose凝膠平分為兩份。取一 份凝膠攪勻后，沿著層析柱內(nèi)壁緩緩加入，待層析柱下端凝膠沉積2cm高時，打開恒流泵， 將流速調(diào)至15ml/min，均勻地將第二份凝膠加至膠面高度達(dá)45cm處停止裝柱。沿柱壁緩慢 加入上述緩沖液，注意保持液面平整，安裝好上蓋，以每分鐘15ml的速度平衡10小時以上。取按照實(shí)施例2所述方法制備得到的GMl粗提液，對起始緩沖液透析3次后攪拌 均勻，即可上樣，控制流速15ml/min，直至全部進(jìn)樣完成，再將進(jìn)液管接至起始緩沖液，用3 倍柱體積洗去未吸附的雜質(zhì)。用含有1. Omol/LNaCl的起始緩沖液進(jìn)行直線梯度洗脫，洗脫 速度同上。記錄分離組分，用唾液酸與間苯二酚鹽酸反應(yīng)法對分離組分進(jìn)行定性檢測，收集 陽性反應(yīng)組分。合并陽性組分于透析袋內(nèi)用水透析3次除鹽即為GMl初步純化液，冰箱保 存?zhèn)溆谩EAE-Sephadex 葡聚糖層析層析柱垂直固定在支架上，預(yù)先加入1500ml 0. 02mol/L pH 7. 4Tris_HCl起始緩 沖液排除管道中的氣泡，接上恒流泵。將平衡好的凝膠平分為兩份，分別置于兩個抽氣瓶 中。第一瓶加入起始緩沖液200ml，第二瓶加入起始緩沖液350ml，分別抽氣20min。取一份 凝膠攪勻后，沿著層析柱內(nèi)壁緩緩加入，待層析柱下端凝膠沉積2cm高時，打開恒流泵，將 流速調(diào)至1. Oml/min，均勻地將第二瓶凝膠加至膠面高度達(dá)160cm處停止裝柱。沿柱壁緩慢 加入起始緩沖液，注意保持液面平整，安裝好上蓋，以每分鐘Iml的速度平衡50小時以上。將冰箱備存的GMl初步純化液裝入截留分子量IOKD的透析袋，用聚乙二醇作為反滲透劑 濃縮至約500ml。對起始緩沖液透析三次，攪拌均勻。上樣，控制流速1.5ml/min，直至全部 進(jìn)樣完成，用滅菌注射用水配制的起始緩沖液進(jìn)行平衡洗脫，流速每分鐘1.5ml。再用含有
1.Omol/L NaCl滅菌注射用水配制的起始緩沖液進(jìn)行直線梯度洗脫，洗脫速度同上。用紫外 吸收儀監(jiān)測并記錄分離組分，用唾液酸與間苯二酚鹽酸反應(yīng)法進(jìn)行定性檢測，收集陽性反 應(yīng)組分于透析袋內(nèi)用水透析3次除鹽即為GMl精制純化液，再用聚乙二醇濃縮至約1500ml 左右，冰箱保存?zhèn)溆?。取上述GMl濃縮液，除菌過濾后，分裝，冷凍干燥，即得單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷 脂原料藥。每IKg腦組織可以得到GMl約200mg，經(jīng)HPLC法檢測純度大于98 %。GMl的制劑方法實(shí)施例12 GMl注射液的制備(2ml 20mg)取實(shí)施例10制備的GM1，檢驗(yàn)合格后，稱取21. 5g，加入NaH2PO4 · H202. 56g， Na2HPO4O. 48g,NaCl 17. 2g，加注射用水至2150ml，攪拌溶解后除菌過濾，濾液分裝入棕色安 瓿瓶中，每只裝2. 15ml，熔封后于121°C濕熱滅菌15分鐘。檢驗(yàn)合格后即為GMl注射液。實(shí)施例13 GMl注射液的制備(5ml 50mg)取實(shí)施例11制備的GMl,檢驗(yàn)合格后，稱取53. Og,加入NaH2PO4 · H206. 31g， Na2HPO4L 18g,NaCl 42. 4g，加注射用水至5300ml，攪拌溶解后除菌過濾，濾液分裝入棕色安 瓿瓶中，每只裝5. 30ml，熔封后于121°C濕熱滅菌15分鐘。檢驗(yàn)合格后即為GMl注射液。實(shí)施例14 GMl注射液的制備(IOml IOOmg)取實(shí)施例11制備的GMl，檢驗(yàn)合格后，稱取105g，加入NaH2PO4 · H2012. 5g，Na2HPO4
2.34g，NaCl 84. 0g，加注射用水至10500ml，攪拌溶解后除菌過濾，濾液分裝入棕色安瓿瓶 中，每只裝10. 5ml，熔封后于121°C濕熱滅菌15分鐘。檢驗(yàn)合格后即為GMl注射液。實(shí)施例15GM1注射液的制備(20ml 200mg)取實(shí)施例10制備的GMl，檢驗(yàn)合格后，稱取206g，加入NaH2PO4 ·Η2024· 53g, Na2HPO4 4. 60g,NaCl 164. 8g，加注射用水至20600ml，攪拌溶解后除菌過濾，濾液分裝入棕色安瓿瓶 中，每只裝20. 6ml，熔封后于121°C濕熱滅菌15分鐘。檢驗(yàn)合格后即為GMl注射液。實(shí)施例16GM1凍干粉針的制備(20mg)取實(shí)施例11制備的GM1，檢驗(yàn)合格后，稱取20g，加入凍干賦形劑(如乳糖、蔗糖、 葡聚糖、甘露糖醇、低分子右旋糖苷、水解明膠等)30g，加注射用水至1000ml，攪拌溶解后 除菌過濾，濾液分裝入管制抗生素瓶中，每只裝1ml，置于冷凍干燥機(jī)隔板上進(jìn)行冷凍干燥， 凍干結(jié)束后壓塞，扎蓋。檢驗(yàn)合格后即為注射用GMl。實(shí)施例17GM1凍干粉針的制備(50mg)取實(shí)施例11制備的GM1，檢驗(yàn)合格后，稱取50g，加入凍干可接受的賦形劑(如乳 糖、蔗糖、葡聚糖、甘露糖醇、低分子右旋糖苷、水解明膠等)100g，加注射用水至2500ml，攪 拌溶解后除菌過濾，濾液分裝入管制抗生素瓶中，每只裝2. 5ml，置于冷凍干燥機(jī)隔板上進(jìn) 行冷凍干燥，凍干結(jié)束后壓塞，扎蓋。檢驗(yàn)合格后即為注射用GM1。實(shí)施例18GM1凍干粉針的制備(IOOmg)取實(shí)施例10制備的GM1，檢驗(yàn)合格后，稱取100g，加入凍干可接受的賦形劑(如乳
10糖、蔗糖、葡聚糖、甘露糖醇、低分子右旋糖苷、水解明膠等)250g，加注射用水至5000ml，攪 拌溶解后除菌過濾，濾液分裝入管制抗生素瓶中，每只裝5ml，置于冷凍干燥機(jī)隔板上進(jìn)行 冷凍干燥，凍干結(jié)束后壓塞，扎蓋。檢驗(yàn)合格后即為注射用GM1。GMl的純度檢測實(shí)施例19GM1的純度檢測-HPLC法色譜條件用氨基鍵合的硅膠為填充劑，以乙腈-四氫呋喃-0. lmol/L磷酸溶液 (66 8 34)為流動相；流速為1. Oml/min ；進(jìn)樣量20 μ 1 ；檢測波長為205nm。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)量取對照品溶液(1)、對照品溶液(2)、對照品溶液(3)和供試品 溶液等量混合，搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液，精密量取40 μ 1注入液相色譜儀，記錄色譜圖。 按照單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷酯峰計(jì)，理論板數(shù)不得低于1000 ；主峰與前后相鄰雜質(zhì)峰的 分離度均應(yīng)大于1.5。有關(guān)物質(zhì)對照品溶液精密稱取唾液酸對照品適量，加水溶解并稀釋制成每Iml 含IOyg的溶液，搖勻即得有關(guān)物質(zhì)對照品溶液(1)；精密稱取雜質(zhì)1(簡稱GDla)對照品 適量，加水溶解并稀釋制成每Iml含40μ g的溶液，搖勻即得有關(guān)物質(zhì)對照品溶液(2)；精 密稱取雜質(zhì)2 (簡稱GD3)對照品適量，加水溶解并稀釋制成每Iml含20 μ g的溶液，搖勻即 得有關(guān)物質(zhì)對照品溶液(3)。供試品溶液取供試品，精密稱定，加水制成每Iml中含GM12mg的溶液。有關(guān)物質(zhì)對照溶液精密量取供試品溶液2ml，置于50ml量瓶中，加水稀釋至刻 度，搖勻(每Iml中含GMl 80 μ g)。測定法量取有關(guān)物質(zhì)對照溶液20 μ 1，注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主成 分峰高為滿量程的20 30%。再精密量取供試品溶液、有關(guān)物質(zhì)對照品溶液各20μ 1，分 別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主峰保留時間的5倍。在供試品溶液記錄的色譜圖中如 出現(xiàn)保留時間與有關(guān)物質(zhì)對照品溶液(1)、(2)、(3)主峰保留時間一致的峰，其主峰峰面積 不得大于如下規(guī)定有關(guān)物質(zhì)對照品溶液(1)游離唾液酸不得過0. 5%，有關(guān)物質(zhì)對照品溶 液(2)⑶Ia不得過2.0%，有關(guān)物質(zhì)對照品溶液(3)⑶3不得過1. 0%；且上述各雜質(zhì)峰(溶 劑峰不計(jì))面積總和不得大于有關(guān)物質(zhì)對照溶液主峰面積(4. 0% )。圖1為實(shí)施例10得到的GMl的純度檢查高效液相色譜圖。圖2為進(jìn)口上市產(chǎn)品 施捷因的純度檢測液相色譜圖。從中可見上市產(chǎn)品施捷因的純度為96. 09%，本發(fā)明產(chǎn)品的 純度為98. 45%。GMl的定性檢測實(shí)施例20GM1定性檢測法-鹽酸間苯二酚反應(yīng)取供試品約2. Oml，加入間苯二酚_鹽酸試液(取2%間苯二酚溶液IOml、2. 5%硫 酸銅溶液0. 25ml、鹽酸80ml，加水至100ml) 2ml，搖勻，置沸水浴中反應(yīng)15分鐘出現(xiàn)藍(lán)色反 應(yīng)。圖4為實(shí)施例11得到的GMl的純度檢查高效液相色譜圖。以上對本發(fā)明較佳實(shí)施方式的描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本 發(fā)明作出各種改變或變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的范圍。
權(quán)利要求
一種單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂的制備方法，包括以下步驟1)稱取動物腦組織，勻漿，用去垢劑的水溶液作為提取溶劑，攪拌提取，除去沉淀，得到提取液；2)將所述提取液濃縮，得到單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂粗提液。
2.權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，進(jìn)一步包括以下步驟將所述單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂粗提液制成干粉，即為單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂 粗提物。
3.權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，在所述單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂粗提 液中，單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂含量按唾液酸計(jì)為0. lmg/ml 10mg/ml。
4.權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，在所述單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂粗提 物中，單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂含量按唾液酸計(jì)為重量百分比0. 1 % 25%。
5.權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，勻漿后的動物腦組織與提取溶劑的體積 比為1 0. 5 5。
6.權(quán)利要求1或3所述的制備方法，其特征在于，進(jìn)一步包括以下步驟將所述單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂粗提液進(jìn)一步純化，獲得純度大于97%的單唾液酸 四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂。
7.權(quán)利要求2或4所述的制備方法，其特征在于，進(jìn)一步包括以下步驟將所述單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂粗提物進(jìn)一步純化，獲得純度大于97%的單唾液酸 四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂。
8.權(quán)利要求1 5之一所述的制備方法，其特征在于，所述去垢劑的水溶液的濃度為重 量百分比 10%。
9.權(quán)利要求1 5之一所述的制備方法，其特征在于，所述去垢劑為選自非離子型去垢 劑、離子型去垢劑以及兼性離子型去垢劑的一種或多種。
10.權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于，所述非離子型去垢劑為選自bigCHAP、 Brij35、C12E8、C12E9、葵基-β -葡萄糖苷、葵基-β -麥芽糖苷、毛地黃皂苷、十二烷 基-β -葡萄糖苷、十二烷基麥芽糖苷、辛基_葡萄糖苷、辛基_麥芽糖苷、Triton X-100、Tween-20、以及 Tween-80 的一種或多種。
11.權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于，所述離子型去垢劑為選自膽酸鹽、脫氧 膽酸鹽、十二烷基硫酸鹽、以及CTAB的一種或多種。
12.權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于，所述兼性離子型去垢劑為選自CHAPS、 CHAPS0、以及Zwittergent的一種或多種。
13.權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于，所述去垢劑為離子型去垢劑。
14.一種注射劑，包含由權(quán)利要求1 13之一所述的制備方法制備得到的單唾液酸四 己糖神經(jīng)節(jié)苷脂。全文摘要
本發(fā)明提供了一種單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂的制備方法，包括以下步驟1)稱取動物腦組織，用去垢劑的水溶液作為提取溶劑，攪拌提取，除去沉淀，得到提取液；2)將所述提取液濃縮，得到單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂粗提液。本發(fā)明還提供了包含該單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉的制劑。本發(fā)明在單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂的提取過程中不使用有機(jī)溶劑，且制備過程簡化，適于大規(guī)模生產(chǎn)，更加環(huán)保，并且可以降低生產(chǎn)成本和生產(chǎn)周期。本發(fā)明還提供了一種包含由上述方法制備得到的單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂的注射劑，其具有較高的純度，且不含有機(jī)溶劑，可提高臨床用藥的安全性。
文檔編號A61P25/28GK101899074SQ20091008559
公開日2010年12月1日 申請日期2009年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月26日
發(fā)明者姜桂榮, 宋夢薇, 王天燕, 馬骉 申請人:北京賽生藥業(yè)有限公司