專利名稱：流產(chǎn)布魯氏菌疫苗株s19標(biāo)記重組菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種流產(chǎn)布魯氏菌疫苗株S19標(biāo)記重組菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
布魯氏菌病是一種人畜共患的傳染病，也是大動物傳染病中僅次于口蹄疫，具 有重要的政治、經(jīng)濟(jì)影響力的疾病，在世界各國的流行形勢十分嚴(yán)峻。長期以來全 球防控布魯氏菌病的策略主要是檢疫-撲殺(發(fā)達(dá)國家)或免疫接種(發(fā)展中國家)， 前者通過檢疫撲殺患病牛、羊、豬等動物為措施，耗資巨大、操作困難；后者通過 免疫接種并輔助撲殺措施，雖可阻止疾病在動物群中的傳播，但免疫動物和臨床患 病動物難以鑒別，使患病動物在自然群體中長期存在，嚴(yán)重威脅人類和動物群的健 康，阻礙動物布魯氏菌病的根除和凈化。
根據(jù)現(xiàn)在國際上及我國的使用來看，粗糙型疫苗株RB51和疫苗株S19都是弱 毒活疫苗，但S19的毒力強(qiáng)，接種母畜易引起流產(chǎn)，利用血清學(xué)方法不能與野生菌 株感染區(qū)分；而RB51的毒力相對較弱，雖然能夠進(jìn)行血清學(xué)的鑒別診斷，但RB51 的免疫效力備受爭議，在我國也沒有使用。所以安全標(biāo)記疫苗菌株是現(xiàn)在世界各國 對于布魯氏菌病防控的技術(shù)瓶頸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種流產(chǎn)布魯氏菌疫苗株S19標(biāo)記重組菌及其應(yīng)用。
本發(fā)明提供的重組菌株，是將流產(chǎn)布魯氏菌疫苗菌株S19 (5rwce7hs^r^;s) S19中的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因滅活得到的菌株。
所述流產(chǎn)布魯氏菌菌株S19為現(xiàn)有流產(chǎn)布魯氏菌疫苗株。
所述葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶可為任何來源于流產(chǎn)布魯氏菌菌株r&7yce〃a Wor"sJ 的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，具體可如序列表的序列1所示。
所述葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的編碼序列具體可如序列表的序列2所示。
可通過任何現(xiàn)有方法滅活所述葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因，如基因組中該序列缺失、 外源或內(nèi)源序列插入、同源重組、RNA干擾等。
所述同源重組可通過將DNA片段DA6導(dǎo)入所述流產(chǎn)布魯氏菌菌株S19實(shí)現(xiàn)；所 述DNA片段DA6自上游至下游依次為同源臂DA6-1和同源臂DA6-2;所述同源臂DA6-1和同源臂DA6-2能與所述菌株基因組中的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶編碼序列的上游和
下游相同序列發(fā)生同源重組，滅活所述葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶。
所述同源臂DA6-1和同源臂DA6-2的長度均為400-600bp。
所述同源臂DA6-1具體可為以流產(chǎn)布魯氏菌菌株S19的基因組DNA為模板，用
如下引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的DNA片段
pWU0359 (上游引物)5, -GGMTTCATCGACGGCGGMCTGG-3'(序列表的序列3); pWU0360 (下游引物)5， -MGCTTCGCCTCGGTACTTMCTGG-3，(序列表的序列4)。 所述同源臂DA6-2具體可為以流產(chǎn)布魯氏菌菌株S19的基因組DNA為模板，用
如下引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的DNA片段
pWU0361(上游引物)5， -AGGCGMGCTTGGGCAGGGGCATGMTA-3，(序列表的序列5); pWU0362 (下游弓l物)5， -CGGGATCCAGCCGACGAGCAAATAGM-3，(序列表的序列6)。 實(shí)驗(yàn)證明，該重組菌的毒力低于出發(fā)的母本菌株，免疫保護(hù)效力與現(xiàn)有疫苗株
相當(dāng)，并且具有臨床檢疫、診斷用免疫標(biāo)記。因此，該重組菌可用于制備布魯氏菌疫苗。
所述重組菌株可應(yīng)用于制備流產(chǎn)布魯氏菌病疫苗。
本發(fā)明還保護(hù)一種流產(chǎn)布魯氏菌病疫苗，它的活性成為所述的重組菌株。 本發(fā)明通過對流產(chǎn)布魯氏菌疫苗菌株S19基因組中的功能基因進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn) 葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因的滅活可以改變菌株免疫動物血清中的抗體組成，接種動 物不產(chǎn)生脂多糖抗體。本發(fā)明通過將流產(chǎn)布魯氏菌疫苗菌株S19的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶 基因滅活，得到了新的重組菌株，無需滅活就可以作為疫苗免疫動物，與出發(fā)菌株 相比，該重組菌株的毒力較小，而且可使免疫接種動物和臨床患病動物通過血清學(xué) 技術(shù)進(jìn)行鑒別。使用本發(fā)明的菌株免疫小鼠，小鼠體內(nèi)能夠產(chǎn)生與標(biāo)準(zhǔn)菌株、現(xiàn)有 疫苗菌株不同的免疫反應(yīng)狀態(tài)，通過動物血清的免疫學(xué)檢測能夠?qū)⒒疾游飶拿庖?動物群體中鑒別出來。本發(fā)明可應(yīng)用于布魯氏菌病疫苗的改造、診斷鑒別試劑的研 制，應(yīng)用于開發(fā)布魯氏菌病疫苗和配套的鑒別診斷試劑，對促進(jìn)全球動物布魯氏菌 病的根除和凈化具有十分重要的意義。


圖1為DA6-1和DA6-2的PCR擴(kuò)增電泳圖。 圖2為DA6的PCR擴(kuò)增電泳圖。
圖3為pEX18AP-DA6轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a后經(jīng)PCR擴(kuò)增的鑒定圖。圖4為pEX18AP-DA6的BamHI和EcoRI雙酶切鑒定圖。 圖5為重組載體pEX18AP-DA6的構(gòu)建流程圖。 圖6為重組菌RB6的PCR鑒定圖。
圖7為重組菌RB6接種后小鼠脾臟載菌量隨時間變化曲線。 圖8為重組菌RB6接種小鼠的初步免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí) 驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊 說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。
以下實(shí)施例中所用的菌株和質(zhì)粒如下
流產(chǎn)布魯氏菌菌株2308 (5raceWss力orz^s) 2308 (標(biāo)準(zhǔn)菌株)、流產(chǎn)布魯氏 菌("27/ceWa a力or^/s)菌株S19 (疫苗菌株)均購自中國獸藥監(jiān)察所菌種室；流 產(chǎn)布魯氏菌(5race7Za Worz^s)菌株RB51 (粗糙型疫苗菌株)來自美國產(chǎn)商業(yè)牛 布魯氏菌粗糙型疫苗的分離菌株；pEX18AP質(zhì)粒(構(gòu)建方法參見文獻(xiàn)TungT. Hoang, Gene 1998,212:77-86)。
實(shí)施例1、滅活葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因的重組菌株的構(gòu)建
根據(jù)流產(chǎn)布魯氏菌基因組中的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因(GenBank Accession Number: BAbS19_I09300)，設(shè)計(jì)兩對引物， 一對引物用于擴(kuò)增同源臂DA6-1，另一 對引物用于擴(kuò)增DA6-2。同源臂DA6-1和同源臂DA6-2連接后形成序列DA6，將序 列DA6插入pEX18AP質(zhì)粒，得到重組載體pEX18AP-DA6。重組載體pEX18AP-DA6與 流產(chǎn)布魯氏菌菌株S19發(fā)生同源重組即可得到滅活葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因的重組菌 株。
一、重組載體pEX18AP-DA6的構(gòu)建 構(gòu)建過程示意圖見圖5。 1、布魯氏菌基因組的提取
取15 n 1滅活的流產(chǎn)布魯氏菌菌株S19，加入lml TNE(每升含有l(wèi). 21g Tris， 5. 84g NaCl，0.37g EDTA)混勻，10000r/min離心，留沉淀?xiàng)壣锨濉Ｖ蠹尤?35ul TNE 重懸洗滌后的沉淀。再向其中加入1351!1含2% Triton X-100的TNE，混勻。加30ul 新鮮配制的溶菌酶(5mg/ml)，輕彈試管混勻。37T:水浴孵育30min，之后加入15y 1蛋白酶K (20mg/ml)，渦旋混勻。65。C水浴至少孵育2h。
加入RNAse (使RNAse濃度達(dá)到10ug/ml)，瓊脂糖凝膠電泳鑒定后將提取的 基因組DNA于4'C保存?zhèn)溆谩?br> 2、 PCR擴(kuò)增葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因的上游片段DA6-1 (554bp)和下游片段 DA6-2(477bp)
擴(kuò)增上游片段的引物如下
pWU0359 (上游引物)5， -GGMTTCATCGACGGCGGAACTGG-3，； pWU0360 (下游引物)5， -AAGCTTCGCCTCGGTACTTAACTGG-3，。 上游引物中加入EcoRI酶切位點(diǎn)，下游引物中加入HindIII酶切位點(diǎn)。 擴(kuò)增下游片段的引物如下
pWU0361 (上游引物)5， -AGGCGAAGCTTGGGCAGGGGCATGAATA-3，； pWU0362 (下游引物)5' -CGGGATCCAGCCGACGAGCAAATAGAA-3'。 上游引物中加入HindIII酶切位點(diǎn)，下游引物中加入BamHI酶切位點(diǎn)。 以步驟1得到的基因組DNA為模板，使用上述兩個引物對進(jìn)行降落PCR，參數(shù)
是94。C預(yù)變性3 min; 94。C變性45 s ，退火溫度從65。C至5(TC每降1。C運(yùn)行2
個循環(huán)，每個循環(huán)72。C延伸lmin;最后72。C終延伸10 min。
擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，見圖1。圖1中，1: DA6-1的PCR擴(kuò)增
產(chǎn)物；2: DA6-2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；3: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果表明，成功擴(kuò)增出了
目的片段。
3、 DA6片段的獲得
通過PCR擴(kuò)增將上游片段DA6-1和下游片段DA6-2連接，得到片段即為DA6片 段。PCR擴(kuò)增所用的引物如下
pWU0359 (上游引物)5， -GGAATTCATCGACGGCGGAACTGG-3，； pWU0362 (下游引物)5， -CGGGATCCAGCCGACGAGCAAATAGAA-3，。
PCR擴(kuò)增體系DA6-1片段1 ul
DA6-2片段1 ul
dNTP (2. 5 mM)1 ul
Taq酶2 ul
10XTaq buffer5 ul
pWU0359 (20pmol/ul)1 ul
pWU0362 (20pmol/u 1)1 ul
雙蒸水補(bǔ)足至50 ul38 ul
擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，見圖2。圖2中，1: PCR產(chǎn)物；2: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。 結(jié)果表明，成功獲得了將M6-l和DA6-2連接的DA6片段。 4、 pEX18AP-DA6質(zhì)粒的構(gòu)建
提取含有AMP抗性、SacB基因和lac-Z基因以及含有多克隆位點(diǎn)的pEX18AP
質(zhì)粒。將經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切后的pEX18AP質(zhì)粒與相同雙酶切的步驟3的DA6
片段進(jìn)行連接。將得到的重組質(zhì)粒命名為pEX18AP-DA6。
用pEX18AP-DA6轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a ，然后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取陽性菌株的
單菌落進(jìn)行搖菌培養(yǎng)，先進(jìn)行PCR鑒定，鑒定引物如下
pWU0359 (上游引物)5， -GGAATTCATCGACGGCGGAACTGG-3，； pWU0362 (下游引物)5， -CGGGATCCAGCCGACGAGCAAATAGAA-3，。 結(jié)果見圖3。圖3中，1: pEX18AP-DA6轉(zhuǎn)化陽性菌株的PCR產(chǎn)物；2: DNA分子
量標(biāo)準(zhǔn)。
然后提取質(zhì)粒并進(jìn)行BamHI和EcoRI雙酶切鑒定。酶切鑒定的結(jié)果見圖4。圖
4中，1: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；2:陽性菌株中重組質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物。
將得到的含有重組質(zhì)粒的菌株增殖，保存在-8(TC備用。 二、重組菌株的獲得
在含有20ml TSB培養(yǎng)基的離心管中接種50ul流產(chǎn)布魯氏菌菌株S19， 37。C培 養(yǎng)24小時后，離心菌體并用預(yù)冷的三蒸水懸浮并轉(zhuǎn)入預(yù)冷的1. 5ml離心管中，繼 續(xù)離心洗滌3-4次。然后，加入適量的冷三蒸水懸浮菌液，取87ul菌液和3ul質(zhì) 粒(pEX18AP-DA6)加入lmm的電極杯，將電極杯放入BI0RAD電穿孔儀中，調(diào)整儀器 至Agr程序后，按Pulse鈕進(jìn)行電擊。査詢電擊參數(shù)為2. 22KV。電擊后，向電極杯 中加入lml S0C培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管，室溫下靜置10min，置于37。C搖床復(fù)蘇12-18h。將轉(zhuǎn)化復(fù)蘇后的菌液涂布于TSB (含100ug/ul的氨芐青霉素)。5-8 天后長出單個菌落。挑取單菌落至TSB液體培養(yǎng)基(無抗生素)37'C增殖48h，再 將該菌液稀釋10-100倍后，取100ul涂布于含有5y。蔗糖的TSA平板培養(yǎng)基。經(jīng)過 3-5天后長出單菌落，將陽性菌落進(jìn)行PCR鑒定。 PCR鑒定用的引物如下pWU0359 (上游引物)5' -GGAATTCATCGACGGCGGMCTGG-3，；pWU0362 (下游引物)5' -CGGGATCCAGCCGACGAGCAAATAGAA-3，。重組菌株RB6的PCR鑒定結(jié)果見圖6。圖6中，1:電轉(zhuǎn)化得到的重組菌株RB6;2:流產(chǎn)布魯氏菌菌株S19; 3: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果表明，通過雙交換獲得了滅活葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的流產(chǎn)布魯氏菌菌株，將其命名為重組菌株RB6。實(shí)施例2、重組菌株RB6的應(yīng)用試驗(yàn)動物4-6周齡SPF級Balb/C雌鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有 限公司，許可證編號為SCXK(京)2007-0001。 一、毒力鑒定將小鼠隨機(jī)分為四組，每組30只。具體接種方案如下第一組(試驗(yàn)組)接種實(shí)施例1制備的重組菌株RB6，每只小鼠腹腔接種劑 量O. lml，內(nèi)含107細(xì)菌。第二組(對照組l):接種流產(chǎn)布魯氏菌菌株2308，每只小鼠腹腔接種劑量 0. lml，內(nèi)含107細(xì)菌。第三組 (對照組2):接種流產(chǎn)布魯氏菌菌株S19，每只小鼠腹腔接種劑量0. lml， 內(nèi)含107細(xì)菌。第四組(對照組3):接種流產(chǎn)布魯氏菌粗糙型疫苗菌株RB51，每只小鼠腹腔 接種劑量O. lml，內(nèi)含107細(xì)菌。分別于接種后第l、 3、 4、 6和10周從每組小鼠中選5只，進(jìn)行脾臟載菌量和 血清學(xué)檢測評價。脾臟載菌量隨時間的變化見圖7。圖7中，WT表示接種菌株2308的實(shí)驗(yàn)結(jié)果， S19表示接種菌株S19的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，RB6表示接種重組菌株RB6的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，RB51 表示接種菌株RB51的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果表明重組菌株RB6接種后，小鼠的脾臟載菌量隨時間延長逐漸降低，在體內(nèi)的清除速度與RB51相似。同時顯示該菌株在小 鼠體內(nèi)的持續(xù)時間可能較疫苗菌株S19還要短，相對毒力較小。血清學(xué)檢測結(jié)果表明接種流產(chǎn)布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株2308和流產(chǎn)布魯氏菌疫苗 菌株S19的小鼠血清通過布魯氏菌虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制 造，批號200801)檢測時，均能夠在2分鐘內(nèi)出現(xiàn)明顯的凝集反應(yīng)，通過試管凝集 試驗(yàn)抗原(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制造，批號200603)檢測到的抗體效價達(dá)到1: 100 以上，而接種重組菌株RB6和RB51小鼠血清的檢測結(jié)果為陰性。二、疫苗效力評價將上述健康小鼠隨機(jī)分為四組，每組15只。四組小鼠分別注射重組菌株RB6、 流產(chǎn)布魯氏菌菌株S19、流產(chǎn)布魯氏菌菌株RB51和PBS，具體如下第一組(試驗(yàn)組)接種實(shí)施例1制備的重組菌株RB6，每只小鼠腹腔接種劑 量O. lml，內(nèi)含107細(xì)菌。第二組(疫苗對照組)接種流產(chǎn)布魯氏菌菌株S19，每只小鼠腹腔接種劑量 0. lml，內(nèi)含107細(xì)菌。第三組(粗糙型菌株對照組)接種流產(chǎn)布魯氏菌菌株RB51，每只小鼠腹腔接 種劑量O. lml，內(nèi)含107細(xì)菌。第四組(空白對照組)接種0.01M pH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)，每只小鼠 腹腔接種劑量0. lml。上述菌株接種后，將每組小鼠再分成三個小組(每個小組5只)，分別于接種 后第12周、16周和20周用流產(chǎn)布魯氏菌菌株2308 (5n/ce"3肋orz^s)攻毒， 劑量為106CFU/ml。兩周后采血并剖殺各組小鼠，取脾臟稱重量并計(jì)算脾臟載菌量 變化，評價免疫效力。試驗(yàn)設(shè)置三次重復(fù)，結(jié)果取平均值。脾臟的平均載菌量變化結(jié)果如圖8所示。圖8中，PBS表示空白對照組的實(shí)驗(yàn) 結(jié)果，S19表示疫苗對照組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，RB6表示試驗(yàn)組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，RB51表示粗 糙型菌株對照組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。小鼠體內(nèi)攻毒結(jié)果表明，該重組菌株RB6的免疫保護(hù) 效力優(yōu)于菌株RB51，但比母本菌株S19稍差，但是該重組菌株RB6具有免疫診斷標(biāo) 記，接種動物與臨床感染動物能夠通過血清學(xué)反應(yīng)進(jìn)行鑒別。9序列表<110> 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)〈120〉流產(chǎn)布魯氏菌疫苗株S19標(biāo)記重組菌及其應(yīng)用〈130> CGGNARY92322<160> 6〈210〉 1 〈211> 410 <212〉 PRT〈213〉 流產(chǎn)布魯氏菌(A潔e仏 <400> 1Met Ala Pro Arg His lie Thr Val lie Leu Pro Val Lys Tyr Arg Gly15 10 15Gly Ser Leu Arg Val Thr Lys Asn lie Val Arg Met Leu Leu Lys Gly20 25 30Ser Gin Asn Tyr Gly Glu Gin Cys Gin Val Arg Leu Ala Val Arg Ala35 40 45Asp Thr Tyr Asp lie Gly Glu Glu Phe Arg Asp Leu lie Asp Asn Gly50 55 60Val Glu Val Arg Glu lie Ser Phe Lys Glu Val Pro Pro Glu Asp Val 65 70 75 80Asn Asn Ala Asn Tyr Phe Gin Gly Arg Asn lie Asp Leu Gin Ser Arg85 90 95Thr Tyr Trp Leu Met Glu Asp Gly Gin Asn Asn Cys Ala Asp Ser Asp 100 105 110Leu Trp Leu Val Val Ser Tyr Ser Val Glu Tyr Pro 115Thr Leu lie PheArgPro 130 lielieAsp 145Ala Phe LeuTrp ArgProArg Leu Asp Ala 180 MetGin 165 liePro 150 SerAla 135 ArgSer 120 Thrlie Ala Pro lie 125Arg Tyr Val ProAsp Ser Tyr Glu Phe AspAsp Phe lie Gin 140Pro Gly Glu Gly Asp Ala Glu Ala Leu 155 160 Gly Val Leu Ala Thr Thr Pro His Thr 170 175 Leu Pro Ala Ser Lys Val TyrLeu Ala Pro 195Lys Val Lys GluValAla 225 GlyValAlaLysSer 210His Lys Asn HisAlaPro 200 TyrGly 185Thr Phe Leu AspPheLys Arg TyrAla 230 LysPro 215Lys Ala PhelieLeu Lys Gly 245Pro Ser HisMetAsp 260Lys Ser Val ArgVal 275Asn Val Glu PheSer 290Leu Leu Ala SerLysArgGlu 280 GlyThrLeu Trp Pro 220Gin Ala Leu235 Lys lie Val 250Gin Ala LysSer Lys 190Arg Tyr Arg Ser 205Thr Asn Pro AsnAsp Leu Gly ValTrp 265lie Val Ala GlyTyrSer 255 AsnTyr 240 SerLysGlu 305Asn Gly Thr PheLeu Ser Asn Asp 340Ala 310 AlaAla 325Tyr Pro Gin MetAla Gly Glu Val Ala Asp 295 300 Cys Phe Leu Trp His Pro Thr Leu 315Val Glu Ala Ala Tyr Met Gly Cys 330Tyr lie SerTyr Glu 270Leu Asp Asn Leu 285Lys GluArg 345■Asn Arg 350TyrAlaPro 335 PheAlaAsp 320 ThrGlu11lie Pro Met Gin Tyr Phe Asn Ala Arg Ser Val Lys Glu Met Ala Ser355 360 365Ala Leu Lys Gin Met Glu Glu Thr Pro lie Asp Val Gly Leu Leu Pro370 375 380Ser Arg Glu Thr Leu Ser Leu His Ser Trp Glu Ala His Ala Ser Glu 385 390 395 400Tyr Trp Asp Val lie Val Arg Ala Ala Ala 405 410〈210> 2 〈211〉 1233 <212> DNA〈213〉 流產(chǎn)布魯氏菌(5race77a a6ar ^s)〈400> 2atggctccgagacatattacagttatcctaccagttaagtaccgaggcggaagtcttcga60gttacgaagaatatcgttcgaatgcttttgaagggaagtc3g3attatggtgaacagtgt120caagttagattggcagtacgtgccgatacctacgatattggggaggagtttcgtgatctt180atcgataatggtgt卿ggttcgggaaatatcattcaaagaagttcctccagaagatgtt240aacaatgctsactatttccaaggtagaaatatcgacctacagtcgaga^cctattggcta300atggaggatggccaaaacaactgtgccgatagtgacctttggctagttgtatcctactct360gtagagteitcctattgccccgat犯ggccgacactgatatttgccaccgatttcattcaa420aggtacgtacctga/tattatttggccaccacggcccggtgagggggatgctgaggctctt480gcgttcttacgacaatcagacggcgtactagctacaacaccacacacgcggctggatgcg540atttcatacgctggcttacctgcgtccaaagtttatcttgctccgatggagtttgacccg600acgtttttggatcgttaccggtcagtgtctaaggttaaggaaccctatttcctttggcca660accaacccaaatgctcacaaaaaccatgcaaaagcgtttcaagcgctagacctatattac720ggcaaactaaagggta卿taaagacaaagatagtcggtgtgagtagtgtgcggatggac780cca/tcccatcgatggcaggccaagtacgaa肌t犯ggcttatgtgsaatctgt3Cggg朋840attgUgcgggtctcgacaacctgaaaagcaatgttgagttcgctggtgaggttgcggac900aaggagtatg cggagcttct tgcttcagct aacggaactt ttgctgcggt 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1、流產(chǎn)布魯氏菌重組菌株，是將流產(chǎn)布魯氏菌(Brucella abortus)菌株S19中的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因滅活得到的菌株。
2、 如權(quán)利要求1所述的重組菌株，其特征在于所述葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶如序列表 的序列1所示。
3、 如權(quán)利要求2所述的重組菌株，其特征在于所述葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的編碼序 列如序列表的序列2所示。
4、 如權(quán)利要求1至3中任一所述的重組菌，其特征在于所述滅活是通過同源 重組實(shí)現(xiàn)的。
5、 如權(quán)利要求4所述的重組菌株，其特征在于所述同源重組是將DNA片段DA6 導(dǎo)入所述流產(chǎn)布魯氏菌菌株S19實(shí)現(xiàn)的；所述DNA片段DA6自上游至下游依次包括同 源臂DA6-1和同源臂DA6-2;所述同源臂DA6-1和同源臂DA6-2能與所述葡萄糖基轉(zhuǎn) 移酶編碼序列的上游和下游序列發(fā)生同源重組，滅活所述葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因。
6、 如權(quán)利要求5所述的重組菌株，其特征在于所述同源臂DA6-1和同源臂DA6-2 的長度均為400-600bp。
7、 如權(quán)利要求6所述的重組菌株，其特征在于所述同源臂DA6-1是以流產(chǎn)布 魯氏菌菌株S19的基因組DNA為模板，用序列3和序列4組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增 得到的DNA片段;所述同源臂DA6-2是以流產(chǎn)布魯氏菌菌株S19的基因組DNA為模板， 用序列5和序列6組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的DNA片段。
8、 權(quán)利要求1至7中任一所述重組菌株在制備流產(chǎn)布魯氏菌病疫苗中的應(yīng)用。
9、 一種流產(chǎn)布魯氏菌病疫苗，其活性成為權(quán)利要求1至7中任一所述的流產(chǎn)布 魯氏菌重組菌株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種流產(chǎn)布魯氏菌疫苗株S19標(biāo)記重組菌及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的流產(chǎn)布魯氏菌重組菌株，是將流產(chǎn)布魯氏菌菌株S19中的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因滅活得到的菌株。本發(fā)明得到的重組菌株毒力較小，無需滅活就可以作為疫苗免疫動物。使用本發(fā)明的菌株免疫小鼠，接種動物不產(chǎn)生脂多糖抗體，通過血清學(xué)反應(yīng)能夠區(qū)別強(qiáng)毒菌株感染動物和新型疫苗菌株免疫動物。本發(fā)明有助于布魯氏菌病疫苗的改造、診斷鑒別試劑的研制，有利于開發(fā)布魯氏菌疫苗和配套的鑒別診斷試劑，對促進(jìn)全球動物布魯氏菌病的根除和凈化具有十分重要的意義。
文檔編號A61K39/10GK101575589SQ200910085858
公開日2009年11月11日 申請日期2009年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月3日
發(fā)明者婕 任, 劉文娟, 劉文曉, 吳清民, 張春燕, 羽 楊, 牛建蕊, 真 王 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)