專利名稱：一種流產(chǎn)布魯氏菌重組菌及其在制備疫苗中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種流產(chǎn)布魯氏菌重組菌及其在制備疫苗中的應(yīng)用。
技術(shù)背景布魯氏菌病是一種人畜共患的傳染病，也是大動(dòng)物傳染病中僅次于口蹄疫，具 有重要的政治、經(jīng)濟(jì)影響力的疾病，在世界各國(guó)的流行形勢(shì)十分嚴(yán)峻。長(zhǎng)期以來(lái)全 球防控布魯氏菌病的策略主要是檢疫-撲殺(發(fā)達(dá)國(guó)家)或免疫接種(發(fā)展中國(guó)家)， 前者通過(guò)檢疫撲殺患病牛、羊、豬等動(dòng)物為措施，耗資巨大、操作困難；后者通過(guò) 免疫接種并輔助撲殺措施，雖可阻止疾病在動(dòng)物群中的傳播，但免疫動(dòng)物和臨床患 病動(dòng)物難以鑒別，使患病動(dòng)物在自然群體中長(zhǎng)期存在，嚴(yán)重威脅人類和動(dòng)物群的健 康，阻礙動(dòng)物布魯氏菌病的根除和凈化。根據(jù)現(xiàn)在國(guó)際上及我國(guó)的使用來(lái)看，粗糙型疫苗株RB51和疫苗株S19都是弱 毒活疫苗，但S19的毒力強(qiáng)，接種母畜易引起流產(chǎn)，利用血清學(xué)方法不能與野生菌 株感染區(qū)分；而RB51的毒力相對(duì)較弱，雖然能夠進(jìn)行血清學(xué)的鑒別診斷，但RB51 的免疫效力備受爭(zhēng)議，在我國(guó)也沒(méi)有使用。所以安全標(biāo)記疫苗菌株是現(xiàn)在世界各國(guó) 對(duì)于布魯氏菌病防控的技術(shù)瓶頸。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的提供一種流產(chǎn)布魯氏菌重組菌及其在制備疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的重組菌株，是將是將流產(chǎn)布魯氏菌(5rwce^a Wor^s)菌株S19 中的莢膜多糖合成蛋白基因和羧基尿苷磷酸脫羧酶基因滅活得到的菌株。所述流產(chǎn)布魯氏菌菌株S19為現(xiàn)有流產(chǎn)布魯氏菌疫苗株。所述莢膜多糖合成蛋白可為任何來(lái)源于流產(chǎn)布魯氏菌r&7/"7h s力or^a^的 莢膜多糖合成蛋白，具體可為序列表的序列l(wèi)所示的莢膜多糖合成蛋白。所述莢膜 多糖合成蛋白的編碼序列具體可為序列表的序列2所示的核苷酸序列。所述羧基尿苷磷酸脫羧酶可為任何來(lái)源于流產(chǎn)布魯氏菌^"27/ceWa Wo/^m9 的羧基尿苷磷酸脫羧酶，具體可為序列表的序列3所示的羧基尿苷磷酸脫羧酶。所 述羧基尿苷磷酸脫羧酶的編碼序列具體可為序列表的序列4所示的核苷酸序列。可通過(guò)任何現(xiàn)有方法滅活所述莢膜多糖合成蛋白基因和羧基尿苷磷酸脫羧酶4列缺失、外源或內(nèi)源序列插入、同源重組、RNA干擾等。滅活莢膜多糖合成蛋白基因的同源重組可通過(guò)將DNA片段DA15導(dǎo)入流產(chǎn)布魯 氏菌菌株S19實(shí)現(xiàn)；所述DNA片段DA15自上游至下游依次為同源臂DA15-1和同源 臂DA15-2;所述同源臂DA15-1和同源臂DA15-2能與所述菌株基因組中的莢膜多糖 合成蛋白編碼序列的上游和下游相同序列發(fā)生同源重組，滅活所述莢膜多糖合成蛋 白基因。所述同源臂DA15-1和同源臂M15-2的長(zhǎng)度均為400-600bp。 所述同源臂DA15-1具體可為以流產(chǎn)布魯氏菌菌株S19的基因組DNA為模板， 用如下引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的DNA片段pWU0397 (上游引物)5 ， -GGAATTCTCMTGTAACCAACTTCA-3 ，(序列表的序列5); pWU0398 (下游引物)5' -AAGCTTAGAGGTCATACCTTCCTG-3 ，(序列表的序列6 )。 所述同源臂DA15-2具體可為以流產(chǎn)布魯氏菌菌株S19的基因組DNA為模板， 用如下引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的DNA片段pWU0399 (上游引物)5， -CCTCTMGCTTATCTGTTTGCTGATGCG-3，(序列表的序列7); pWU0400 (下游引物)5' -CGGGATCCGCGTTTCGGATAAGATG-3 ，(序列表的序列8 )。 滅活羧基尿苷磷酸脫羧酶基因的同源重組可通過(guò)將DNA片段DAT導(dǎo)入流產(chǎn)布魯 氏菌菌株S19實(shí)現(xiàn)；所述DNA片段DAT自上游至下游依次為同源臂DAT-1和同源臂 DAT-2;所述同源臂DAT-1和同源臂DAT-2能與所述菌株基因組中羧基尿苷磷酸脫 羧酶編碼序列的上游和下游相同序列發(fā)生同源重組，滅活所述羧基尿苷磷酸脫羧酶 基因。所述同源臂DAT-1和同源臂DAT-2的長(zhǎng)度均為400-600bp。所述同源臂DAT-1具體可為以流產(chǎn)布魯氏菌菌株S19的基因組DNA為模板，用如下引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的DNA片段pWU0659 (上游引物)5， -GGMTTCMGTCTTCTCACCCACATCC-3，(序列表的序列9); pWU0660 (下游引物)5， -MGCTTCGTCATCGTGCMTTCTG-3，(序列表的序列10)。 所述同源臂DAT-2具體可為以流產(chǎn)布魯氏菌菌株S19的基因組DNA為模板，用如下引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的DNA片段pWU0661 (上游引物)5， -TGACGMGCTTCGCTCGATTGGMGMGT-3'(序列表的序列11);pWU0662 (下游引物)5' -CGGGATTCCCGTTCGCCTGTMGGA-3，(序列表的序列12)。實(shí)驗(yàn)證明，該重組菌的毒力低于出發(fā)的母本菌株，免疫保護(hù)效力與現(xiàn)有疫苗株 相當(dāng)，并且具有臨床檢疫、診斷用免疫標(biāo)記。因此，該重組菌可用于制備布魯氏菌 疫苗。所述重組菌株可應(yīng)用于制備流產(chǎn)布魯氏菌病疫苗。本發(fā)明還保護(hù)一種流產(chǎn)布魯氏菌病疫苗，它的活性成為所述的重組菌株。 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，滅活莢膜多糖合成蛋白基因和羧基尿苷磷酸脫羧酶基因的粗糙型流產(chǎn)布魯氏菌疫苗穩(wěn)定突變株與原始母本菌株-國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)疫苗株S19相比，因脂多 糖合成障礙，其毒力相對(duì)降低，但免疫保護(hù)作用與原始菌株相似；最為重要的是該 菌株為粗糙型，在實(shí)際檢疫實(shí)踐中可以通過(guò)血清學(xué)技術(shù)簡(jiǎn)易地區(qū)別疫苗免疫動(dòng)物和 臨床野毒菌株感染動(dòng)物。本發(fā)明可應(yīng)用于布魯氏菌病疫苗的改造、診斷鑒別試劑的 研制，應(yīng)用于開(kāi)發(fā)布魯氏菌病疫苗和配套的鑒別診斷試劑，對(duì)促進(jìn)全球動(dòng)物布魯氏 菌病的根除和凈化具有十分重要的意義。


圖1為DA15-1和DA15-2的PCR擴(kuò)增電泳圖。 圖2為DA15的PCR擴(kuò)增電泳圖。圖3為pEX18AP-DA15轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a后經(jīng)PCR擴(kuò)增的鑒定圖。 圖4為pEX18AP-DA15的BamHI和EcoRI雙酶切鑒定圖。 圖5為重組載體pEX18AP-DA15的構(gòu)建流程圖。 圖6為DAT-1和DAT-2的PCR擴(kuò)增電泳圖。 圖7為DAT的PCR擴(kuò)增電泳圖。圖8為pEX18AP-DAT轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a后經(jīng)PCR擴(kuò)增的鑒定圖。 圖9為pEX18AP-DAT的BamHI和EcoRI雙酶切鑒定圖。 圖10為重組載體pEX18AP-DAT的構(gòu)建流程圖。 圖11為重組菌RB15的PCR鑒定圖。 圖12為重組菌RB15T的PCR鑒定圖。圖13為重組菌RB15T接種后小鼠脾臟載菌量隨時(shí)間變化曲線。 圖14為重組菌RB15T接種小鼠的初步免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施方式
以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí) 驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊 說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中所用的菌株和質(zhì)粒如下流產(chǎn)布魯氏菌(5n/ce7Zg aZwrfys)菌株2308 (標(biāo)準(zhǔn)菌株)、流產(chǎn)布魯氏菌 (i race7h aybar&s)菌株S19 (疫苗菌株)均購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所菌種室；流產(chǎn) 布魯氏菌(5r"ce77a a力or^As)菌株RB51 (粗糙型疫苗菌株)來(lái)自美國(guó)產(chǎn)商業(yè)牛布 魯氏菌粗糙型疫苗的分離菌株；pEX18AP質(zhì)粒(構(gòu)建方法參見(jiàn)文獻(xiàn)TungT. Hoang， Gene 1998,212:77-86)。實(shí)施例1、重組菌株的構(gòu)建根據(jù)流產(chǎn)布魯氏菌基因組中的莢膜多糖合成蛋白基因(GenBank Accession Number: BAbS 19—104980)，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物， 一對(duì)引物用于擴(kuò)增同源臂DA15-1，另 一對(duì)引物用于擴(kuò)增DA15-2。同源臂DA15-1和同源臂DA15-2連接后形成序列DA15， 將序列DA15插入pEX18AP質(zhì)粒，得到重組載體pEX18AP-DA15。根據(jù)流產(chǎn)布魯氏菌 基因組中的羧基尿苷磷酸脫羧酶基因(GenBank Accession Number: BAbS 19_119940) 設(shè)計(jì)兩對(duì)引物， 一對(duì)引物用于擴(kuò)增同源臂DAT-1，另一對(duì)引物用于擴(kuò)增DAT-2。同 源臂DAT-1和同源臂DAT-2連接后形成序列DAT,將序列DAT插入pEX18AP質(zhì)粒， 得到重組載體pEX18AP-DAT。重組載體pEX18AP-DA15和pEX18AP-DAT與流產(chǎn)布魯氏 菌菌株S19發(fā)生同源重組即可得到滅活莢膜多糖合成蛋白基因和羧基尿苷磷酸脫羧 酶基因的重組菌株。一、重組載體pEX18AP-DA15的構(gòu)建構(gòu)建過(guò)程示意圖見(jiàn)圖5。1、布魯氏菌基因組的提取取15iU滅活的流產(chǎn)布魯氏菌菌株S19，加入lml TNE (每升含有l(wèi). 21g Tris，5. 84g NaCl，O. 37g EDTA)混勻，10000r/min離心，留沉淀?xiàng)壣锨?。之后加?135u 1 TNE重懸洗滌后的沉淀。再向其中加入135u 1含2% Triton X-IOO的TNE，混 勻。加30ul新鮮配制的溶菌酶(5mg/ml)，輕彈試管混勻。37。C水浴孵育30min， 之后加入15ul蛋白酶K (20mg/ml)，渦旋混勻。65。C水浴至少孵育2h。加入RNAse (使RNAse濃度達(dá)到10ug/ml)，瓊脂糖凝膠電泳鑒定后將提取的7基因組DNA于4'C保存?zhèn)溆谩?、 PCR擴(kuò)增莢膜多糖合成蛋白基因的上游片段DA15-1 (579bp)和下游片段 DA15-2 (505bp)擴(kuò)增上游片段的引物如下pWU0397 (上游引物)5， -GGAATTCTCAATGTMCCAACTTCA-3，； pWU0398 (下游引物)5， -AAGCTTAGAGGTCATACCTTCCTG-3，。 上游引物中加入EcoRI酶切位點(diǎn)，下游引物中加入HindIII酶切位點(diǎn)。 擴(kuò)增下游片段的引物如下pWU0399 (上游引物)5， -CCTCTAAGCTTATCTGTTTGCTGATGCG-3，； pWU0400 (下游引物)5, -CGGGATCCGCGTTTCGGATMGATG-3，。 上游引物中加入HindIII酶切位點(diǎn)，下游引物中加入BamHI酶切位點(diǎn)。 以步驟1得到的基因組DNA為模板，使用上述兩個(gè)引物對(duì)進(jìn)行降落PCR，參數(shù)是94。C預(yù)變性3 min; 94'C變性45 s ，退火溫度從65'C至50'C每降1'C運(yùn)行2個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)72'C延伸lmin;最后72'C終延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，見(jiàn)圖l。圖1中，1: DA15-1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2: DA15-2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；3: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果表明，成功擴(kuò)增出了目的片段。3、 DA15片段的獲得通過(guò)PCR擴(kuò)增將上游片段DA15-1和下游片段DA15-2連接，得到片段即為DA15 片段。PCR擴(kuò)增所用的引物如下pWU0397 (上游引物)5， -GGAATTCTCAATGTMCCAACTTCA-3，； pWU0400 (下游引物)5， -CGGGATCCGCGTTTCGGATMGATG-3，。 PCR擴(kuò)增體系DA15-l片段1 ulDA15-2片段1 uldNTP (2. 5 mM)1 ulTaq酶2 ul10XTaq buffer5 ulpWUM397 (20pmol/u 1)1 ulpW麗OO (20pmol/u 1)1 ul雙蒸水補(bǔ)足至50 ul38 ul擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，見(jiàn)圖2。圖2中，1: PCR產(chǎn)物；2: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。 結(jié)果表明，成功獲得了將DA15-1和DA15-2連接的DAT片段。 4、 pEX18AP-DA15質(zhì)粒的構(gòu)建提取含有AMP抗性、SacB基因和lac-Z基因以及含有多克隆位點(diǎn)的pEX18AP質(zhì)粒。將經(jīng)BaraHI和EcoRI雙酶切后的pEX18AP質(zhì)粒與相同雙酶切的步驟3的DA15片段進(jìn)行連接。將得到的重組質(zhì)粒命名為pEX18AP-DA15。用pEX18AP-DA15轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 a ，然后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取陽(yáng)性菌株的單菌落進(jìn)行搖菌培養(yǎng)，先進(jìn)行PCR鑒定，鑒定引物如下pWU0397 (上游引物)5， -GGAATTCTCAATGTAACCAACTTCA-3，； pWU0400 (下游引物)5， -CGGGATCCGCGTTTCGGATMGATG-3，。 結(jié)果見(jiàn)圖3。圖3中，1: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；2: pEX18AP-DA15轉(zhuǎn)化陽(yáng)性菌株的PCR產(chǎn)物。然后提取質(zhì)粒并進(jìn)行BamHI和EcoRI雙酶切鑒定。酶切鑒定的結(jié)果見(jiàn)圖4。圖 4中，1: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；2:陽(yáng)性菌株中重組質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物。 將得到的含有重組質(zhì)粒的菌株增殖，保存在-8(TC備用。 二、重組載體pEX18AP-DAT的構(gòu)建 構(gòu)建過(guò)程示意圖見(jiàn)圖10。 1、布魯氏菌基因組的提取取15y 1滅活的流產(chǎn)布魯氏菌菌株S19，加入lml TNE (每升含有1.21g Tris，5.84g NaCl，0.37g EDTA)混勻，10000r/min離心，留沉淀?xiàng)壣锨濉Ｖ蠹尤?135ul TNE重懸洗滌后的沉淀。再向其中加入135111含2% Triton X-100的TNE，混 勻。加30ul新鮮配制的溶菌酶(5mg/ml)，輕彈試管混勻。37r水浴孵育30min，之后加入15ul蛋白酶K (20mg/ml)，渦旋混勻。65'C水浴至少孵育2h。加入RNAse (使RNAse濃度達(dá)到10ug/ml)，瓊脂糖凝膠電泳鑒定后將提取的 基因組DNA于4'C保存?zhèn)溆谩?、 PCR擴(kuò)增羧基尿苷磷酸脫羧酶基因的上游片段DAT-1 (403bp)和下游片段 DAT-2 (鄉(xiāng)bp)擴(kuò)增上游片段的引物如下pWU0659 (上游引物)5， -GGAATTCAAGTCTTCTCACCCACATCC-3，； pWU0660 (下游引物)5， -AAGCTTCGTCATCGTGCMTTCTG-3，。 上游引物中加入EcoRI酶切位點(diǎn)，下游引物中加入HindIII酶切位點(diǎn)。 擴(kuò)增下游片段的引物如下pWU0661 (上游引物)5' -TGACGAAGCTTCGCTCGATTGGAAGAAGT-3，； pWU0662 (下游引物)5， -CGGGATTCCCGTTCGCCTGTMGGA-3'。 上游引物中加入Hindin酶切位點(diǎn)，下游引物中加入BamHI酶切位點(diǎn)。 以步驟1得到的基因組DNA為模板，使用上述兩個(gè)引物對(duì)進(jìn)行降落PCR，參數(shù)是94。C預(yù)變性3 min; 94。C變性45 s ，退火溫度從65。C至5CTC每降1。C運(yùn)行2個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)72-C延伸lmin;最后72'C終延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，見(jiàn)圖6。圖1中，1: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；2: DAT-1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；3: DAT-2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果表明，成功擴(kuò)增出了目的片段。3、 DAT片段的獲得通過(guò)PCR擴(kuò)增將上游片段DAT-1和下游片段DAT-2連接，得到片段即為DAT片 段。PCR擴(kuò)增所用的引物如下pWU0659 (上游引物)5， -GGAATTCAAGTCTTCTCACCCACATCC-3，； pWU0662 (下游引物)5， -CGGGATTCCCGTTCGCCTGTAAGGA-3，。 PCR擴(kuò)增體系10DAT-1片段1 ulDAT-2片段1 uld證(2.5 mM)1 ulTaq酶2 ul10XTaq buffer5 ulP翻659 (20pmol/u 1)1 ulpW腿62 (20pmol/u 1)1 ul雙蒸水補(bǔ)足至50 ul38 ul擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，見(jiàn)圖7。圖7中，1: PCR產(chǎn)物；2: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。 結(jié)果表明，成功獲得了將DAT-1和DAT-2連接的DAT片段。 4、 pEX18AP-DAT質(zhì)粒的構(gòu)建提取含有AMP抗性、SacB基因和lac-Z基因以及含有多克隆位點(diǎn)的pEX18AP質(zhì)粒。將經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切后的pEX18AP質(zhì)粒與相同雙酶切的步驟3的DAT片段進(jìn)行連接。將得到的重組質(zhì)粒命名為pEX18AP-DAT。用pEX18AP-DAT轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 a ，然后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取陽(yáng)性菌株的單菌落進(jìn)行搖菌培養(yǎng)，先進(jìn)行PCR鑒定，鑒定引物如下pWU0659 (上游引物)5， -GGAATTCAAGTCTTCTCACCCACATCC-3，； pWU0662 (下游引物)5， -CGGGATTCCCGTTCGCCTGTAAGGA-3，。 結(jié)果見(jiàn)圖8。圖8中，1: pEX18AP-DAT轉(zhuǎn)化陽(yáng)性菌株的PCR產(chǎn)物；2: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。然后提取質(zhì)粒并進(jìn)行BamHI和EcoRI雙酶切鑒定。酶切鑒定的結(jié)果見(jiàn)圖9。圖 9中，1:陽(yáng)性菌株中重組質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物；2: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。 將得到的含有重組質(zhì)粒的菌株增殖，保存在-8(TC備用。 三、重組菌株的獲得的獲得 1、重組菌株的獲得RB15的獲得在含有20mlTSB培養(yǎng)基的離心管中接種50ul流產(chǎn)布魯氏菌菌株S19， 37。C培養(yǎng) 24小時(shí)后，離心菌體并用預(yù)冷的三蒸水懸浮并轉(zhuǎn)入預(yù)冷的1. 5ml離心管中，繼續(xù) 離心洗滌3-4次。然后，加入適量的冷三蒸水懸浮菌液，取87ul菌液和3ul重組 質(zhì)粒pEX18AP-DA15加入lmm的電極杯，將電極杯放入BI0RAD電穿孔儀中，調(diào)整儀 器至Agr程序后，按Pulse鈕進(jìn)行電擊。查詢電擊參數(shù)為2.22KV。電擊后，向電極杯中加入lml S0C培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管，室溫下靜置10rain,置于37'C搖 床復(fù)蘇12-18h。將轉(zhuǎn)化復(fù)蘇后的菌液涂布于TSB (含100ug/ul的氨節(jié)青霉素)。 5-8天后長(zhǎng)出單個(gè)菌落。挑取單菌落至TSB液體培養(yǎng)基(無(wú)抗生素)37C增殖48h， 再將該菌液稀釋10-100倍后，取100ul涂布于含有5y。蔗糖的TSA平板培養(yǎng)基。經(jīng) 過(guò)3-5天后長(zhǎng)出單菌落，將陽(yáng)性菌落進(jìn)行PCR鑒定。 PCR鑒定的引物如下pWU0397 (上游引物)5， -GGAATTCTCMTGTAACCAACTTCA-3，； pWU0400 (下游引物)5， -CGGGATCCGCGTTTCGGATAAGATG-3，。 重組菌株RB15的PCR鑒定結(jié)果見(jiàn)圖11。圖11中，1: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；2:重組菌株RB15; 3:流產(chǎn)布魯氏菌菌株S19。結(jié)果表明，通過(guò)雙交換獲得了滅活莢膜多糖合成蛋白的流產(chǎn)布魯氏菌菌株，將其命名為重組菌株RB15。2、重組菌株RB15T的獲得按照步驟l的程序，以獲得的重組菌株RB15為母本，通過(guò)電轉(zhuǎn)化技術(shù)將重組 質(zhì)粒pEX18AP-DAT導(dǎo)入，篩選陽(yáng)性菌落進(jìn)行PCR鑒定。 PCR鑒定的引物如下pWU0659 (上游引物)5， -GGAATTCAAGTCTTCTCACCCACATCC-3，； pWU0662 (下游引物)5， -CGGGATTCCCGTTCGCCTGTAAGGA-3，。 重組菌株RB15T的PCR鑒定結(jié)果見(jiàn)圖12。圖12中，1: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；2:流產(chǎn)布魯氏菌菌株S19; 3:重組菌株RB15T。結(jié)果表明，獲得了通過(guò)雙交換滅活莢膜多糖合成蛋白基因和羧基尿苷磷酸脫羧酶基因的流產(chǎn)布魯氏菌菌株，將其命名為重組菌株RB15T。實(shí)施例2、重組菌株RB15T的應(yīng)用試驗(yàn)動(dòng)物4-6周齡SPF級(jí)Balb/C雌鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有 限公司，許可證編號(hào)為SCXK(京)2007-0001。 一、毒力鑒定將小鼠隨機(jī)分為四組，每組30只。具體接種方案如下 第一組(試驗(yàn)組)接種實(shí)施例1制備的重組菌株RB15T，每只小鼠腹腔接種 劑量O. lml，內(nèi)含107細(xì)菌。第二組(對(duì)照組l):接種流產(chǎn)布魯氏菌菌株2308，每只小鼠腹腔接種劑量 0. lml，內(nèi)含107細(xì)菌。
第三組(對(duì)照組2):接種流產(chǎn)布魯氏菌菌株S19，每只小鼠腹腔接種劑量0. lml， 內(nèi)含107細(xì)菌。
第四組(對(duì)照組3):接種流產(chǎn)布魯氏菌粗糙型疫苗菌株RB51，每只小鼠腹腔 接種劑量O. lml，內(nèi)含107細(xì)菌。
分別于接種后第l、 3、 4、 6和10周從每組小鼠中選5只，進(jìn)行脾臟載菌量和 血清學(xué)檢測(cè)評(píng)價(jià)。
脾臟載菌量隨時(shí)間的變化見(jiàn)圖13。圖13中，WT表示接種菌株2308的實(shí)驗(yàn)結(jié) 果，S19表示接種菌株S19的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，RB15T表示接種重組菌株RB15T的實(shí)驗(yàn)結(jié) 果，RB51表示接種菌株RB51的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果表明重組菌株RB15T接種后，小 鼠的脾臟載菌量隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低，在體內(nèi)的清除速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于S19和RB51，證 明該菌株在小鼠體內(nèi)的持續(xù)時(shí)間可能較疫苗菌株S19要短許多。
血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明，接種流產(chǎn)布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和流產(chǎn)布魯氏菌疫苗菌株 S19的小鼠血清通過(guò)布魯氏菌虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制造， 批號(hào)200801)檢測(cè)時(shí)，均能夠在2分鐘內(nèi)出現(xiàn)明顯的凝集反應(yīng)，通過(guò)試管凝集試驗(yàn) 抗原(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制造，批號(hào)200603)檢測(cè)到的抗體效價(jià)達(dá)到l: 100以 上，而重組菌株RB15T的小鼠血清的檢測(cè)結(jié)果為陰性，而接種重組菌株RB6和RB51 小鼠血清的檢測(cè)結(jié)果為陰性。
二、疫苗效力評(píng)價(jià)
將上述健康小鼠隨機(jī)分為四組，每組15只。四組小鼠分別注射重組菌株RB15T、 流產(chǎn)布魯氏菌疫苗菌株S19、流產(chǎn)布魯氏菌菌株RB51和PBS，具體如下
第一組(試驗(yàn)組)接種實(shí)施例1制備的重組菌株RB15T，每只小鼠腹腔接種 劑量O. lml，內(nèi)含107細(xì)菌。
第二組(疫苗對(duì)照組)接種流產(chǎn)布魯氏菌菌株S19，每只小鼠腹腔接種劑量 0. lml，內(nèi)含107細(xì)菌。
第三組(粗糙型菌株對(duì)照組)接種流產(chǎn)布魯氏菌粗糙型疫苗菌株RB51，每只 小鼠腹腔接種劑量O. lral，內(nèi)含107細(xì)菌。
第四組(空白對(duì)照組)接種0.01M pH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)，每只小鼠 腹腔接種劑量0. lml。上述菌株接種后，將每組小鼠分成三個(gè)小組(每個(gè)小組5只)，分別于接種后第 12周、16周和20周用流產(chǎn)布魯氏菌菌株2308 (5race77a a6orz^s)攻毒，劑量為 106CFU/ml。兩周后采血并剖殺各組小鼠，取脾臟稱重量并計(jì)算脾臟載菌量變化，評(píng) 價(jià)免疫效力。試驗(yàn)設(shè)置三次重復(fù)，結(jié)果取平均值。
脾臟的平均載菌量變化結(jié)果如圖14所示。圖14中，PBS表示空白對(duì)照組的實(shí) 驗(yàn)結(jié)果，S19表示疫苗對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，RB15T表示試驗(yàn)組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，RB51表 示粗糙型菌株對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。小鼠體內(nèi)攻毒結(jié)果表明，該重組菌株RB15T的免 疫保護(hù)效力優(yōu)于菌株RB51，與母本疫苗菌株S19類似，且該重組菌株RB15T具有免 疫診斷標(biāo)記，接種動(dòng)物與臨床感染動(dòng)物能夠通過(guò)血清學(xué)反應(yīng)進(jìn)行鑒別。序列表
〈110〉 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 〈120〉 一種流產(chǎn)布魯氏菌重組菌及其在制備疫苗中的應(yīng)用
<130> CGGNARY92323
〈160〉 12
〈210〉 1 〈211> 622 〈212〉 PRT
〈213〉 流產(chǎn)布魯氏菌("潔e仏a力orto) <400〉 1
Met Ser Leu Lys Tyr Pro Trp Gin Arg Leu Ala Leu Leu Pro Arg lie
15 10 15
Ser Lys Gin lie lie Leu Val Leu Ser Asp Cys Leu Leu Leu Leu Ala
20 25 30
Ser Ala Tyr Leu Ala Phe Val Val Arg Phe Gly Phe Val Phe Val Pro
35 40 45
Asn Leu Ala Gin Leu Phe Leu lie Leu lie Ala Pro Leu Leu Ala lie
50 55 60
Pro Val Phe lie Arg Phe Gly Leu Tyr Arg Ala lie lie Arg Tyr Leu 65 70 75 80
Ala Glu Arg Ala lie Trp Ser lie Phe Gin Ala Thr Ala Val Ala Ala
85 90 95
Leu Phe Trp Val Ala Leu Val Phe Leu Met Glu Leu Tyr Gly Ser Thr 100 105 110Gly Leu Pro Arg Ser Val Pro Leu Leu
115 120 Phe lie Ser Ala Ser Arg Phe Gly
Glu 145 Glu
Glu
Gin 225 Asn
lie 130 His
Pro
Ala
Tyr Lys
Asp Ala
Lys Arg
Leu Val Val
lie lie Gly 195 Tyr
Arg
Gin 165 Phe
Gly 180
Leu Arg Val
Asn 210 Lys
Gly lie Lys Arg
Thr Arg lie
Glu Arg Gin
Leu Val Ser Ala 260 Pro
Leu 245 Leu
Pro
Ser Pro Val 275
lie Met lie Thr
Arg
Arg 290
Leu Thr lie Ala
Cys 305
Ser Ser Glu Phe
Ala Ser Cys Thr 340
Phe 135
Thr Ser Ser Ala
Trp Trp
Tyr 150
Leu Ala Thr Ala
Leu
Leu 140 lie
Leu Ser Thr Val 125 Leu
lie
Leu 155
Arg Ser His Ser
Arg Thr Ala Gly
lie Asp Pro
Asp Tyr
Leu 170
Gly Gin Leu Ala
Ala 185
Thr Glu Glu lie
lie
Asp 175 Met
Gly 160 Thr
Asp
Arg 200
Val Val Val Ser
Gly 190
Ser Leu lie
Gin 215
Phe Ala Arg Leu
Glu 230
Pro Pro lie Ala
Arg Asn Val Asp
Thr
Thr 280 Ala
Glu 265 Leu
Gly
Gly 295
Trp Asn Pro
Gin 310
Leu Tyr Gin lie
Asp 250 lie
Leu
Gly
Ala
Leu 235 Leu
Asp
Arg
Ser
Glu 220 Gly
Pro 205
Pro Ala Leu Glu
Arg Leu Pro Ala
Thr Ala Gly
Asp Glu
Leu
Leu 270 Val
Lys 255 Gly
Glu
Val 240 Tyr
Arg
Gly
Val 285
Gly Ser Gin Leu
lie 300
lie Val Leu Phe
Ala 325
Val Val Pro Val
Ala 315
Arg Gin Leu Arg
Leu 345
Asp 330
Gly Ser Val Arg
Asp 350
Gin 335 Arg
Glu 320 Phe
AlaCys
Cys
Gly 385 Leu
Val Glu Lys 355
Ala Tyr Phe Asn Asn Thr Asp
Ala 370 lie
Pro lie Arg Asp His Ser lie Asp Thr Val Tyr His 360 365
Pro Leu Val Glu Arg Asn Pro Leu Val 380
Gly Thr Leu Glu Val Ala Glu Ala Ala
395 400
lie Ser Ser Asp Lys Ala
Lys His Val 375 Phe
Asn
Val 390
Glu Arg Met Val
Val Arg Pro Thr 420 Tyr
Val Glu Arg Met Val Leu 405 410 Asn Val Met Gly Ala Thr
Val lie Tyr 435 Tyr
Ala
Ser
Tyr Val
Phe 450
Val Pro Leu Phe
Val 465
Leu Thr His Glu
Gly
Arg
Arg 470 Met
Asp 485
Val Gin Ser
Ala Thr Lys Arg Trp Ala 425 430
Arg Leu Ala Glu Gin Ala Gly Lys
440 445
Phe Gly Asn Val Leu Gly Ser Asn
455 460
Glu Gin lie Ala Asn Gly Gly Pro 475
Met Ser lie Lys
Thr Arg Tyr
Ala Glu Leu lie 500
Glu Met Gly Glu
Arg Gly
Val Leu Leu 515
lie Leu Leu Ala
Ala 505 Val
Phe 490 lie
Lys 415 Glu
Lys
Gly
Val
Glu 495 Asp
Leu
Lys
Ser
Thr 480 Ala
Thr
Asn
Gin 545 Met
Met 530 Gly
Asp Glu
His Pro Lys
Tyr Glu Glu
lie 580
lie Ala lie 550
Phe Tyr Asp Pro
Leu 565
Met Arg Ala Pro
Ala Gin Ser Gly 510
Pro Val Lys lie Arg Asp Leu Ala Glu 520 525 Gly Leu Thr Val Arg Asn Glu Glu Asn Pro 535 540 Glu Val Thr Gly lie Arg Glu Gly Glu 555
Leu Ala Gin Arg
Gin 585
Ser 570 Gly
Ser Lys Ala Val 590
Thr 575 Val
Lys 560 Arg
Asplie Gin Glu
Ser
Leu Ala Val Leu Arg Thr Ala
Met Glu Lys Glu Asp
595
600
605
lie Glu Met
Val
Arg Lys Val Leu Phe Glu Val
lie Ala Ser
610
615
620
<210> 2
<211> 1869
<212〉 DNA
〈213> 流產(chǎn)布魯氏菌(5n/ce7Za Wor^s)
<400> 2
atgagtttaaaatatccttggcaaagattggcgcttctgccgcgcatcagcaaacagatc60
attctggtgttgagcgattgcctgttgctgcttgcaagcgcctatctagcttttgtcgtc120
cgtttcggtttcgtcttcgtacccaatctggcgcagcttttcctgatcctgattgcgccg180
cttctggccattccggtcttcatccgttttgggctttaccgcgccatcattcgttatctg240
gccgagcgcgccatctggtcgatcttccaggccaccgcagtcgccgccttgttctgggtg300
gcgctggtgttcctgatggagctttacggcagcaccggcctgccgcgttctgttccgctt360
ctttattggctcctgagtacggttttcatttccgcaagccgcttcggcgcaaaatggctg420
ctacgcactgccgaac3cg3caagcggtataccagttcagccctgataatcggcattggc480
g認(rèn)cggcgcgtcagcttgcgacggcccttcgcagccatagcgatacgttggtggtgggt540
tttatcgatcctgccgggcaactggccggaatggacattattggcctgcgtgtctatcgc600
8cggaagaaattccaagcctgatcgaaaattacggtatca3gC3ggttgtcgtttcagaa660
cccgcgctggagcsg肌ggagcgccaggagtttgcgcgccttttggggcgcctgccggtc720
aatacgcgceittcttccgcccattgctgatctcacggccgggaaatatctcgtteigtgcg780
ctgcgcaatgtcgagatcgatgatcttttggggcgttcgccggttccgcctgatacaacg840
cttctgcgtgaggtcgtggaggggcggcgcatcatgataaccggcgcgggcggttccatc900
ggcagccagctttgcctcacgattgcgcaatggaacccggctgcgattgttctctttgaa960
tcgagtgagtttgcattataccagatcgacaggcagcttcgccagtttgcctcttgcacg1020
gtggtgccggtccttggctccgtgcgtgaccgcgcctgcgtggaaaaaccgatccgcgat1080
cattccatcgatacggtttatcactgtgcggcttacaeigcatgtgccgctggtggagagg1140
18aacccgctggtcggcattttca3caatgtattcggcacgc tggaggtggc cgaggcagcg1200
ttgaacacgg3tgtggaacgcatggtgctgatctcttccg acaaggccgt gcgccccacc1260
aatgtcatgggcgcgaccaagcggtgggcggaactggtta tctattatta cggacggctg1320
gctgagcaggccggcaagaaaaaagctttctattccgtcc gttttggcaa tgtgcttggc1380
tccaacggttcggtagtgccgcttttccgcgagcagattg caaatggcgg ccccgttacg1440
ctgacgcatgaagacatgax:gcgctatttcatgtccatca aggaggcggc ggaactgatc1500
gtgcagtccggcgcgattgcccaatccggtgataccgttc ttttggaaat gggtgagccg1560
gtgaaaatccgcgatctggccgaaaacatgatcctgctcg cgggactcac cgtgcgcaac1620
gaggaaaaccCgC3gggCg3tatcgccattgaggtgacgg gtattcgcg3 aggcgagaag1680
atgtatgaagagcttttctacgatccttcgctcgcccagc gcacccgtca tccgaaaatc1740
atgcgtgcgccccagggcagcaaggccgtggtagatattc aggaaagcct ggcggtactg1800
cggaccgccatggaaaaggaggatatcgaaatggtccgca aggtgctttt cgaggtcata1860
gcttcctga1869
〈210> 3
〈211〉 238
〈212〉 PRT
〈213〉流產(chǎn)布魯氏菌
〈400〉 3
Met Thr Thr Glu Leu 1 5 Leu Asp Val Pro Thr 20
Gly Asn Ala Val Ser 35
Gly Gly Leu Asp Phe 50
Phe Leu Asp Met Lys 65
19
(Brucella abortus)
His Asp Asp Ala Ser Gly Arg Leu lie Val Gly
10 15 lie Ala Glu Ala Glu Lys Val Val Glu Glu Leu
25 30 Phe Tyr Lys lie Gly Tyr Gin Leu Val Phe Ala
40 45 Ala Lys Ser Leu Val Ala Ala Arg Lys Lys Val
55 60 Leu Leu Asp lie Asp Asn Thr lie Ala Lys Gly 70 75 80Val Glu Asn Val Ala Lys Met Gly Val Ser Met Leu Thr Leu His Ala
85 90 95
Tyr Pro Lys Ala Met Arg Ala Ala Val Glu Ala Ala Arg Gly Ser Asp
100 105 110
Leu Cys Leu Leu Gly Val Thr Val Leu Thr Ser Met Asp Asn Ala Asp
115 120 125
Uu Arg Glu Ala Gly Tyr Phe Asp Asn Ala Glu Thr Leu Val Leu Lys
130 135 140
Arg Ala Arg Gin Ala His Glu Ala Gly Met Gly Gly lie Val Ala Ser 145 150 155 160
Ala Val Glu Ala Gin Ala lie Arg Gin Ala Val Arg Pro Asp Met Ala
165 170 175
lie Val Thr Pro Gly lie Arg Pro Ala Gly Ser Glu Lys Gly Asp Gin
180 185 190
Lys Arg Val Met Thr Pro Ala Asp Ala Leu Arg Ala Gly Ala Ser His
195 200 205
Leu lie Val Ala Arg Pro lie Val Gly Ala Pro Asp Arg Lys Ala Ala
210 215 220
Ala Leu Ala lie Leu Lys Glu Met Arg Ser lie Gly Arg Ser 225 230 235
<210> 4 <211> 717 <212〉 DNA
〈213〉 流產(chǎn)布魯氏菌(Brucella abortus) <400> 4
atgacgacag aattgcacga tgacgcatcc gggcgcctga tcgtgggcct tgacgtgccg 60 acaattgccg aggcggaaaa ggtggtcgaa gaactgggca atgctgtttc cttctacaag 120 atcggctatc agcttgtttt tgccggtggg cttgatttcg ccaaaagcct tgtggcggcg 180
20cgcaaaaaeig gtggeiaeieitg atgcgtgcgg ctgacctcca ctggtgctgei gcggtggagg ggcatccgcc gccttgaggg cgcaaggcgg
tcttcctcga tcgcgaeigat cggtgg呵c tggacaatgc aacgtgcccg cgcaggccat
CggC3ggg3g
ccggtgcgag cagcccttgc
catgaagctg ctcgatatcg acaacacgat tgccaaaggc
gggtgtttcc atgctcacgc ttcatgccta tccgaaggca
cgccagaggg tcggacctat gccttttggg cgtgacggtc
cgatcttcgg gaagccggtt atttcgacaa tgcggaaacg
tcaggcgcat gaggccggta tgggcggcat tgtcgcctcg
tcgccaggcg gttcgccccg atatggccat cgtcacaccg
cgagaagggc gaccagaagc gcgtgatgac gccagccgat
ccatctcatc gtggcgcgcc cgatcgtggg cgcaccggat
catcctgaag gaaatgcgct cgattggaag aagttag
〈210〉 5
〈211> 25
〈212> DNA <213>人工序列
〈220>
<223>
<400> 5
ggaattctca atgtaaccaa cttca
〈210〉 6
〈211〉 24
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
〈220>
<223>
240 300 360 420 480 540 600 660 717
25
21〈400〉 6
肪gctt3gag gtcatscctt cctg 24
〈210> 7
〈211> 28
<212> 醒 <213〉人工序列
〈220〉
〈223>
〈400> 7
cctctaagct tatctgtttg ctgatgcg 28
〈210> 8
〈211〉 25
〈212〉 薩 〈213〉人工序列
〈220>
〈223>
〈400〉 8
cgggatccgc gtttcggata agatg 25
<210> 9
〈211> 27
22<212〉 DNA 〈213>人工序列
〈220>
〈223>
<400> 9
ggaattcaag tcttctcacc cacatcc 27
〈210〉 10
<211〉 24
〈212> DNA 〈213>人工序列
〈220>
〈223〉
<400〉 10
aagcttcgtc atcgtgcaat tctg 24
〈210> 11
〈211> 29
<212> DNA 〈213〉人工序列
〈220〉
〈223〉<400〉 11
tgacgaagct tcgctcgatt ggaagaagt 29
〈210〉 12
<211〉 25
<212> 腿 〈213>人工序列
〈220〉
〈223〉
<400> 12
cgggattccc gttcgcctgt aagga 2權(quán)利要求
1、流產(chǎn)布魯氏菌重組菌株，是將流產(chǎn)布魯氏菌(Brucella abortus)菌株S19中的莢膜多糖合成蛋白基因和羧基尿苷磷酸脫羧酶基因滅活得到的菌株。
2、 如權(quán)利要求1所述的重組菌株，其特征在于所述莢膜多糖合成蛋白如序列 表的序列1所示；所述羧基尿苷磷酸脫羧酶如序列表的序列3所示。
3、 如權(quán)利要求2所述的重組菌株，其特征在于所述莢膜多糖合成蛋白的編碼 序列如序列表的序列2所示；所述羧基尿苷磷酸脫羧酶的編碼序列如序列表的序列4 所示。
4、 如權(quán)利要求1至3中任一所述的重組菌株，其特征在于所述滅活是通過(guò)同源重組實(shí)現(xiàn)的。
5、 如權(quán)利要求4所述的重組菌株，其特征在于所述滅活所述莢膜多糖合成蛋白基因的同源重組是將DNA片段DA15導(dǎo)入所述流 產(chǎn)布魯氏菌菌株S19實(shí)現(xiàn)的;所述DNA片段DA15自上游至下游依次包括同源臂DA15-1 和同源臂DA15-2;所述同源臂DA15-1和同源臂DA15-2能與所述菌株基因組中莢膜多 糖合成蛋白編碼序列的上游和下游相同序列發(fā)生同源重組，滅活所述莢膜多糖合成蛋 白基因；所述滅活所述羧基尿苷磷酸脫羧酶基因的同源重組是將DNA片段DAT導(dǎo)入所述流 產(chǎn)布魯氏菌菌株S19實(shí)現(xiàn)的；所述DNA片段DAT自上游至下游依次包括同源臂DAT-1 和同源臂DAT-2;所述同源臂DAT-1和同源臂DAT-2能與所述菌株基因組中羧基尿苷 磷酸脫羧酶編碼序列的上游和下游相同序列發(fā)生同源重組，滅活所述羧基尿苷磷酸脫 羧酶基因。
6、 如權(quán)利要求5所述的重組菌株，其特征在于所述同源臂DA15-1和同源臂 DA15-2的長(zhǎng)度均為400-600bp;所述同源臂DAT-1和同源臂DAT-2的長(zhǎng)度均為 400-600bp。
7、 如權(quán)利要求6所述的重組菌株，其特征在于所述同源臂DA15-1是以流產(chǎn)布 魯氏菌菌株S19的基因組DNA為模板，用序列5和序列6組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增 得到的DNA片段；所述同源臂DA15-2是以流產(chǎn)布魯氏菌菌株S19的基因組DNA為模 板，用序列7和序列8組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的DNA片段。
8、 如權(quán)利要求6或7所述的重組菌，其特征在于所述同源臂DAT-1是以流產(chǎn) 布魯氏菌菌株S19的基因組DNA為模板，用序列9和序列10組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增得到的DNA片段；所述同源臂DAT-2是以流產(chǎn)布魯氏菌菌株S19的基因組DNA為模板，用序列11和序列12組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的DNA片段。
9、 權(quán)利要求1至8中任一所述重組菌株在制備流產(chǎn)布魯氏菌病疫苗中的應(yīng)用。
10、 一種流產(chǎn)布魯氏菌病疫苗，其活性成為權(quán)利要求1至8中任一所述的流產(chǎn)布 魯氏菌重組菌株。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種流產(chǎn)布魯氏菌重組菌及其在制備疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明的重組菌株，是將流產(chǎn)布魯氏菌菌株S19中的莢膜多糖合成蛋白基因和羧基尿苷磷酸脫羧酶基因滅活得到的菌株。本發(fā)明得到的菌株的毒力較小，無(wú)需滅活就可以作為疫苗免疫，接種動(dòng)物不產(chǎn)生脂多糖抗體，通過(guò)血清學(xué)反應(yīng)能夠區(qū)別強(qiáng)毒菌株感染動(dòng)物和重組菌株免疫動(dòng)物。本發(fā)明有助于布魯氏菌病疫苗的改造、診斷鑒別試劑的研制，有利于開(kāi)發(fā)布魯氏菌疫苗和配套的鑒別診斷試劑，對(duì)促進(jìn)全球動(dòng)物布魯氏菌病的根除和凈化具有十分重要的意義。
文檔編號(hào)A61P31/04GK101575587SQ200910085859
公開(kāi)日2009年11月11日 申請(qǐng)日期2009年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月3日
發(fā)明者婕 任, 劉文娟, 劉文曉, 吳清民, 張春燕, 羽 楊, 牛建蕊, 真 王 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)