專利名稱：洋地黃提取物及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種洋地黃提取物及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
洋地黃葉為玄參科植物紫花洋地黃Digitalis purpurea L.的干燥葉。目前已從紫 花洋地黃葉中分離出20余種強(qiáng)心甙，由三種不同的甙元即洋地黃毒甙元 (digitoxigenin)、羥基洋地黃毒甙元(gitoxigenin)和吉他洛武元(gitaloxigenin)與不 同的糖縮合而成。將從洋地黃中提取得到的有效成分應(yīng)用于臨床疾病治療的歷史悠 久，例如洋地黃毒苷用于治療充血性心力衰竭己有近百年的歷史。近年來，經(jīng)過 大量的研究發(fā)現(xiàn)洋地黃的某些有效成分可以用來治療眼部視疲勞。目前行業(yè)內(nèi)制備 洋地黃提取物的方法主要使用大量的毒性有機(jī)溶劑(例如氯仿)進(jìn)行萃取，收率低 而且污染重；并且得到的有效成分都是混合物，成分不明，機(jī)理不清，行業(yè)內(nèi)也沒 有精確的指紋圖譜，缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，重復(fù)性很低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種洋地黃提取物及其制備方法。 本發(fā)明所提供的洋地黃提取物是按照包括下述步驟的方法制備得到的
1) 將紫花洋地黃葉用乙醇水溶液進(jìn)行回流提取，過濾，收集提取液，然后除 去乙醇，得到粗提液；其中，所述乙醇水溶液中乙醇的體積百分含量為70%-90%;
2) 將所述粗提液用截留分子量為12K-16K的超濾柱進(jìn)行超濾，收集超濾液；
3) 將所述超濾液用含氯有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，收集有機(jī)層液體；將所述有機(jī)層 液體減壓蒸干，得到粗提物的干粉；其中，所述含氯有機(jī)溶劑的極性值為l一4;
4) 將所述粗提物的干粉加水溶解，得粗體物的水溶液；在所述水溶液中加入 體積為所述水溶液體積1/15、濃度為0.025-0.035mol/L的鹽酸溶液，于75"—85°C 酸解25-35分鐘，調(diào)pH值至中性，得到洋地黃提取物。
其中，步驟1)中所述乙醇水溶液與所述紫花洋地黃葉的配比可為8-12mL: lg。 步驟l)中所述提取的溫度具體可為75"C-85°C，所述提取的時間可為50—70 分鐘。
步驟l)中除去乙醇的方法可采用減壓蒸發(fā)法；所述減壓蒸發(fā)的壓力可為 0. 092—0. llMPa，溫度可為50-60。C。
3步驟3)所述萃取中所述超濾液與所述含氯有機(jī)溶劑的體積比具體可為1: l一 1: 1.3。可用于本發(fā)明的含氯有機(jī)溶劑具體可為氯苯、三氯甲烷等。
在本發(fā)明中為了提高洋地黃葉的提取效率，可將紫花洋地黃葉粉碎后再進(jìn)行提取。
所述方法還可包括將步驟4)得到的洋地黃提取物進(jìn)行干燥處理，得到洋地黃
提取物干粉的步驟。所述干燥的溫度具體可為6(TC。
本發(fā)明的另一個目的是提供所述洋地黃提取物在制備預(yù)防和/或治療眼部疾病 藥物中的應(yīng)用。
所述眼部疾病，具體可為眼部炎癥、視疲勞以及黃斑變性等。 本發(fā)明的再一個目的是提供一種預(yù)防和/或治療眼部疾病藥物。 本發(fā)明所提供的預(yù)防和/或治療眼部疾病藥物，其活性成分包括本發(fā)明所提供 的洋地黃提取物。
需要的時候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述 載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸 收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等，必要時還可以加入香味劑、甜味劑、 和著色劑等。
所述藥物可以制成口服制劑、注射劑或局部眼用制劑等多種形式。所述局部眼 用制劑包括滴眼劑、眼用凝膠、眼膏劑、眼用膜劑和透皮貼劑等。上述各種劑型 的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
本發(fā)明提供了一種從紫花洋地黃葉中提取洋地黃提取物的方法。該方法優(yōu)化了 現(xiàn)有的提取方法，不再使用大量的毒性有機(jī)溶劑(如氯仿)進(jìn)行萃取，降低了對環(huán) 境的污染，提高了產(chǎn)品的純度，并且制定了穩(wěn)定可行的指紋圖譜，使通過該方法得 到的產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定可控。以本發(fā)明方法制備得到的洋地黃提取物單獨(dú)作為活性成分 或與其它藥用物質(zhì)混合可以制成治療眼部炎癥、視疲勞以及黃斑變性的眼部用藥。 動物實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明所提供的洋地黃提取物能明顯緩解由酸堿燒傷引起的非特異 性炎癥，加快創(chuàng)傷愈合。


圖1為實(shí)施例1制備的洋地黃提取物的高效液相色譜圖。
圖2為實(shí)施例2制備的洋地黃提取物的高效液相色譜圖。 圖3為實(shí)施例3制備的洋地黃提取物的高效液相色譜圖。 圖4為對比例1制備的洋地黃提取物的高效液相色譜圖。 圖5為對比例2制備的洋地黃提取物的高效液相色譜圖。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和材料， 如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。 實(shí)施例1、制備洋地黃提取物
1) 取紫花洋地黃葉300g粉碎，加入2400ml體積百分含量為70Q/。的乙醇水溶 液，在75"C回流提取50分鐘，過濾后得到提取液；利用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將所述提 取液，在50。C， 0.092MPa的條件下減壓除乙醇至無醇味，得到粗提液約670ml。
2) 將粗提液經(jīng)過截留分子量為12k的中空纖維超濾柱(美國MILLIPORE公司， 規(guī)格型號PyrogardD)超濾后，得超濾液約640ml。
3) 在超濾液中加入等體積的氯苯萃取，棄水層保留氯苯層(萃取液)；萃取 液在60'C、 0.09MPa條件下蒸干，回收氯苯和乙醇，得到粗提取的干粉92.17mg。
4) 將所述干粉溶于1500ml水中，得干粉的水溶液，再向所述水溶液中加入 100ml濃度為0.025mol/L鹽酸溶液，75'C酸解25分鐘，調(diào)pH值至中性。
5) 將上述水溶液60。C蒸干，即得洋地黃提取物92.30 mg，為樣品1。 高效液相色譜(HPLC)檢測
色譜條件如下
采用十八垸基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱(200mmx4.6mm, 5|im) 以水-乙腈為流動相(水與乙腈的體積比為15: 1) 流速1 ml/min檢測波長220 nm
將lmg樣品l用10ml水溶解，配成濃度為O. lmg/ml的溶液，取10pl進(jìn)樣，在上述 色譜條件下進(jìn)行分析，所得色譜圖見圖l。
由圖可知，在該色譜條件下，在保留時間10—30分鐘之間，有峰面積占總面 積超過10%的有6個色譜峰。
實(shí)施例2、制備洋地黃提取物
1) 取紫花洋地黃葉300g粉碎，加入3000ml體積百分含量為80。/。的乙醇水溶 液，在80。C回流提取1小時，過濾后得到提取液；利用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將所述提取 液，在55。C， O.lMPa的條件下減壓除乙醇至無醇味，得到粗提液約900ml。
2) 將粗提液經(jīng)過截留分子量為14k的中空纖維超濾柱(美國MILLIPORE公司) 超濾后，得超濾液約880ml。
3) 在超濾液中加入1.15倍體積的氯苯萃取，棄水層保留氯苯層(萃取液)； 萃取液在6(TC、0.09MPa條件下蒸干，回收氯苯和乙醇，得到粗提取的干粉97.24mg。
54) 將所述干粉溶于1500ml水中，得干粉的水溶液，再向所述水溶液中加人 100ml濃度為0.03mol/L鹽酸溶液，8(TC酸解30分鐘，調(diào)pH值至中性。
5) 將上述水溶液6(TC蒸干，即得洋地黃提取物97.27 mg，為樣品2。 高效液相色譜(HPLC)檢測
色譜條件同實(shí)施例l，所得色譜圖見圖2。
實(shí)施例3、制備洋地黃提取物
1) 取紫花洋地黃葉300g粉碎，加入3600ml體積百分含量為90。/。的乙醇水溶 液,在85"C回流提取70分鐘，過濾后得到提取液；利用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將所述提取 液，在60。C, O.llMPa的條件下減壓除乙醇至無醇味，得到粗提液約1200ml。
2) 將粗提液經(jīng)過截留分子量為14k的中空纖維超濾柱(美國MILLIPORE公司 生產(chǎn))超濾后，得超濾液約1185 ml。
3) 在超濾液中加入1.3倍體積的氯苯萃取，棄水層保留氯苯層(萃取液)；萃 取4液在60。C、0.09MPa條件下蒸干，回收氯苯和乙醇，得到粗提取的干粉103.36mg。
4) 將所述干粉溶于1500ml水中，得干粉的水溶液，再向所述水溶液中加入 100ml濃度為0.035mol/L鹽酸溶液，85。C酸解35分鐘，調(diào)pH值至中性。
5) 將上述水溶液60。C蒸干，即得洋地黃提取物103.4 mg，為樣品3。 高效液相色譜(HPLC)檢測
色譜條件同實(shí)施例l，所得色譜圖見圖3。
對比例1、制備洋地黃提取物
1) 取紫花洋地黃葉300g粉碎，加入3000ml體積百分含量為80%的乙醇水溶 液，在8(TC回流提取1小時，過濾后得到提取液；利用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將所述提取 液，在55'C， O.lMPa的條件下減壓除乙醇至無醇味，得到粗提液約900ml。
2) 在粗提液中加入等體積的氯苯萃取，棄水層保留氯苯層(萃取液)；萃取 液在6(TC、 0.09MPa條件下蒸干，回收氯苯和乙醇，得到粗提取的干粉121.10mg。
3) 將所述干粉溶于1500ml水中，得干粉的水溶液，再向所述水溶液中加入 100ml濃度為0.03mol/L鹽酸溶液，80。C酸解30分鐘，調(diào)pH值至中性。
4) 將上述水溶液6(TC蒸干，即得洋地黃提取物121.17 mg，為樣品4。 高效液相色譜(HPLC)檢測
色譜條件同實(shí)施例1，所得色譜圖見圖4。對比例2、制備洋地黃提取物
1) 取紫花洋地黃葉300g粉碎，加入3000ml體積百分含量為80%的乙醇水溶 液，在8(TC溫度回流提取1小時，過濾后得到提取液；利用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將所述 提取液，在55。C， O.lMPa的條件下減壓除乙醇至無醇味，得到粗提液約900ml。
2) 將粗提液經(jīng)過截留分子量為14k的中空纖維超濾柱(美國MILLIPORE公司 生產(chǎn))超濾后，得超濾液約880ml，將超濾液蒸干，得到粗提取的干粉99.24mg。
3) 將所述干粉溶于1500ml水中，得干粉的水溶液，再向所述水溶液中加入 10Oml濃度為0.03mol/L鹽酸溶液，8(TC酸解25分鐘，調(diào)pH值至中性。
4) 將上述水溶液6(TC蒸干，即得洋地黃提取物l 15.63 mg，為樣品5。 高效液相色譜(HPLC)檢測
色譜條件同實(shí)施例1，所得色譜圖見圖5。
對比例3、制備洋地黃提取物 (1)取紫花洋地黃葉300g粉碎，加入3000ml體積百分含量為80Q/。的乙醇水 溶液，在8(TC回流提取1小時，過濾后得到提取液；利用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將所述提 取液，在55'C， O.lMPa的條件下減壓除乙醇至無醇味，得到粗提液約900ml。
2) 將粗提液經(jīng)過截留分子量為14k的中空纖維超濾柱(美國MILLIPORE公司 生產(chǎn))超濾后，得超濾液約880ml。
3) 在超濾液中加入等體積的氯苯萃取，棄水層保留氯苯層(萃取液)；萃取 液在60。C、 0.09MPa條件下蒸干，回收氯苯和乙醇，得到粗提取的干粉99.29mg， 為樣品6。
高效液相色譜(HPLC)檢測
色譜條件同實(shí)施例l，樣品堵塞色譜柱，無法得到圖譜。
實(shí)施例4、洋地黃提取物治療眼部炎癥的藥效試驗(yàn)
1、 供試品制備
分別取樣品l一6各lmg，用50ml水稀釋，制成0. 02mg/ml的水溶液作為供試
(=1
叩o
2、 動物模型及分組
本實(shí)驗(yàn)采用日本大耳白家兔(遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號遼實(shí)動質(zhì) 證字038號)56只，體重為2. 5 3. 5Kg，雌雄兼用，健康無眼病。用1%地卡因表 面麻醉。將浸有0.5mol/L NaOH溶液的直徑為8mm的濾紙片，置角膜表面中央，維持lmin取下，用滅菌生理鹽水連續(xù)沖洗2min，制成堿燒傷模型。將每只兔右側(cè) 角膜堿燒傷后，將動物隨機(jī)均分成7組，前6組分別為供試品l-6組，第7組為生 理鹽水對照組。 3、實(shí)驗(yàn)方法
給藥方法為患眼每次l滴，每天4次，連續(xù)2周，觀察供試品緩解堿燒傷造成 的炎癥和水腫，促進(jìn)角膜上皮愈合的效果；計算角膜上皮愈合率來評價各樣品的治 療效果。計算角膜上皮愈合率采用熒光染色方法用20%熒光素鈉無菌溶液一滴， 滴入兔結(jié)膜囊內(nèi)，使其被動閉眼5min，然后稍停片刻，如果眼內(nèi)仍有較多的染料， 可用生理鹽水溶液沖洗除去之，分別于傷后0、 1、 2、 3、 5、 7、 10、 14天進(jìn)行裂 隙燈檢査，熒光素染色照相，照片經(jīng)計算機(jī)圖象分析系統(tǒng)處理，計算其角膜上皮愈 合率。
o天著色面積—觀察時著色面積
角膜上皮愈合率=-xioo%
o天著色面積
4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
表l、角膜上皮損傷面積(mm2, X±SD)
組 別o夭第l天第2天第3天第5天第7天第io天第14天
150.26±0.2034.45±1.7434.15±2.333.71士2.1830.44±1.5925.78士3.6118.11±2.0716.8±0.33
249.93±0.2635.73±2.3735.71±2.533.29±1-628.77士1.2525.68±3.8117.95±1.3416.67±0.44
350.17±0.2134.72±1.6934.24±2.233.71±2.1829.94±1.4726.01±3.5418.20±2.0416.81±0.29
450.12±0.1536.62±1.4236.48±1.8735.87±3.333.17±3.1932.5±2.524.67±1.9122.57士3.32
550.24±0.1635.98±2.0235.82士1.8535.52±2.332.92±1.4630.21±5.2123.8±2.7321.7土0.93
650.58±0.3537.82±1.3537.70±0.4237.29±1.0833.16±1.1031.26±3.5024.25±1.4222.23土0.36
750.37±0.1647.62士1.4439.47±3.539.17±3.2135.5±2.534.57±3.3231.69±1.91
表2、角膜上皮細(xì)胞愈合率(％)
8組別0天第l天第2天第3天第5天第7天第10天第14天
1031.532.132.939.448.764.066.6
2028.428.433.342.448.664.066.6
3030.831.832.840.348.263.766.5
4026.927.228,433,835.250.854.0
5028.428.729.234.539.952.656.8
6025.225.526.334.438.252,156.0
705-517.621.622.229.531.437.1
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，第1、 2、 3組角膜上皮愈合率沒有明顯差距，第4、 5、 6組角膜上皮愈合率明顯低于第1、 2、 3組；第7組(對照組)愈合率明顯低于治 療組(前6組)，尤其在前三天差距更為明顯，我們分析認(rèn)為造模初期炎癥和水腫 嚴(yán)重，治療組藥物能夠緩解炎癥和水腫，因此初期愈合效果明顯。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過實(shí)施例l、 2、 3獲得的產(chǎn)品在相同條件下得到的色譜圖無 明顯差別，得到的產(chǎn)品對緩解眼角膜炎癥和水腫、促進(jìn)角膜愈合的療效無明顯差別。
9
權(quán)利要求
1、一種洋地黃提取物的制備方法，包括下述步驟1)將紫花洋地黃葉用乙醇水溶液進(jìn)行回流提取，過濾，收集提取液，然后除去乙醇，得到粗提液；其中，所述乙醇水溶液中乙醇的體積百分含量為70％-90％；2)將所述粗提液用截留分子量為12K-16K的超濾柱進(jìn)行超濾，收集超濾液；3)將所述超濾液用含氯有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，收集含氯有機(jī)溶劑層；將所述含氯有機(jī)溶劑層液體蒸干，得到粗提物的干粉；其中，所述含氯有機(jī)溶劑的極性值為1-4；4)將所述粗提物的干粉加水溶解，得粗體物的水溶液；在所述水溶液中加入體積為所述水溶液體積1/15的濃度為0.025-0.035mol/L鹽酸溶液，75℃-85℃酸解25-35分鐘，調(diào)pH值至中性，得到洋地黃提取物。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟l)中所述乙醇水溶液與所 述紫花洋地黃葉的配比為8-12mL: lg。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟l)中所述提取的溫度 為75-85°C，所述提取的時間為50_70分鐘。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l-3中任一所述的方法，其特征在于步驟l)中除去乙醇的 方法為減壓蒸發(fā)；所述減壓蒸發(fā)的壓力為0. 092—0. llMPa，溫度可為50-6(TC。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l-4中任一所述的方法，其特征在于步驟3)所述萃取中所 述超濾液與含氯有機(jī)溶劑的體積比為1: l一l: 1.3;所述含氯有機(jī)溶劑為氯苯或三 氯甲烷。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述方法還可包括將 步驟4)得到的洋地黃提取物進(jìn)行干燥處理的步驟。
7、 權(quán)利要求1-6中任一所述方法制備得到的洋地黃提取物。
8、 權(quán)利要求7所述的洋地黃提取物在制備預(yù)防和/或治療眼部疾病藥物中的應(yīng)用。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述眼部疾病包括眼部炎癥、 視疲勞和黃斑性變性。
10、 一種預(yù)防和/或治療眼部疾病藥物，其活性成分包括權(quán)利要求7所述的洋 地黃提取物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種洋地黃提取物及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的洋地黃提取物是按照下述方法制備得到的1)將紫花洋地黃葉用乙醇水溶液進(jìn)行提取，過濾，收集提取液，然后除去乙醇，得到粗提液；所述乙醇水溶液中乙醇的體積百分含量為70％-90％；2)將所述粗提液用截留分子量為12K-16K的超濾柱進(jìn)行超濾，收集超濾液；3)將所述超濾液用含氯有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，收集有機(jī)層液體；將所述有機(jī)層液體蒸干，得到粗提物的干粉；4)將所述粗提物的干粉加水溶解，得粗體物的水溶液；加鹽酸酸解25-35分鐘，調(diào)pH值至中性，得到洋地黃提取物。本發(fā)明方法克服了現(xiàn)有提取方法中使用大量的毒性有機(jī)溶劑(如氯仿)進(jìn)行萃取的缺點(diǎn)，降低了對環(huán)境的污染，提高了產(chǎn)品的純度，并且得到的產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定可控。
文檔編號A61K36/80GK101623377SQ20091009033
公開日2010年1月13日 申請日期2009年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月5日
發(fā)明者張桂萍, 星 李, 菁 楊, 王洪新 申請人:錦州奧鴻藥業(yè)有限責(zé)任公司